Ảnh hưởng của Phytohormone tới sự phát triển chòi, rễ của phong lan Vanda (Vanda sp) in vitro và một số đặc điểm sinh lí của cây trước và sau giai đoạn ra ngôi

--- TRẦN THỊ KIM NHUNG ẢNH HƯỞNG CỦA PHYTOHORMONE TỚI SỰ PHÁT SINH CHỒI, RỄ CỦA PHONG LAN VANDA Vanda sp in vitro VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH LÍ CỦA CÂY CON TRƯỚC VÀ SAU GIAI ĐOẠN RA NGÔ

-

TRẦN THỊ KIM NHUNG

ẢNH HƯỞNG CỦA PHYTOHORMONE TỚI SỰ PHÁT SINH CHỒI, RỄ CỦA PHONG LAN VANDA

(Vanda sp) in vitro VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH LÍ CỦA

CÂY CON TRƯỚC VÀ SAU GIAI ĐOẠN RA NGÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn “Ảnh

hưởng của phytohormone tới sự phát sinh chồi, rễ của phong lan Vanda (Vanda sp) in vitro và một số đặc điểm sinh lí của cây trước và sau giai đoan

ra ngôi” là trung thực, đầy đủ, rõ nguồn gốc và chưa được sử dụng để bảo vệ

một học vị nào Các thông tin, tài liệu tham khảo sử dụng trong luận văn này đều đã được chỉ rõ nguồn gốc Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này

đã được cảm ơn

Tôi xin chịu trách nhiệm trước Hội đồng bảo vệ luận văn, Khoa Sinh - KTNN, Phòng Quản lý đào tạo sau đại học và Nhà trường về các thông tin, số liệu trong đề tài

Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2016

Tác giả luận văn

Trần Thị Kim Nhung

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của các tổ chức, cá nhân trong và ngoài trường

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS Cao Phi Bằng người thầy đã tận tình dìu dắt và hướng dẫn chuyên môn cho tôi trong thời gian tiến hành nghiên cứu đề tài khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Sư Phạm

Hà Nội 2 cùng các thầy cô giáo trong Khoa Sinh - KTNN trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2, các cán bộ phòng sau đại học trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện

đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, các bạn trong lớp K18 – Sinh học thực nghiệm , các sinh viên đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành đề tài này

Mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng luận văn không tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế Vì vậy, tôi mong nhận được sự quan tâm đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày 25 tháng 11 năm 2016

Học viên

Trần Thị kim Nhung

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

4 Những đóng góp mới của đề tài 2

PHẦN 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Tổng quan về lan Vanda 3

1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.3 Đặc điểm sinh thái và chế độ chăm sóc 5

1.1.3.1 Nhiệt độ, ẩm độ, sự tưới nước 5

1.1.3.2 Ánh sáng 6

1.1.3.3 Nhu cầu phân bón 6

1.1.3.4 Giá thể trồng lan 6

1.1.3.5 Thay chậu và nhân giống 7

1.1.3.6 Sâu bệnh 7

1.2 Phương pháp nhân giống in vitro 7

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

1.2.2 Các giai đoạn nuôi cấy 8

1.2.2.1 Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ 8

1.2.2.2 Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động 9

1.2.2.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh 9

1.2.2.4 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh 10

1.2.2.5 Giai đoạn 5: Đưa cây mô ra ngoài vườn ươm 10

1.2.3 Các điều kiện nuôi cấy in vitro 11

1.2.4 Môi trường nuôi cấy in vitro 12

1.2.5 Chất điều hòa sinh trưởng 13

1.2.5.1.Auxin 13

1.2.5.2 Cytokinin 13

1.3 Các nghiên cứu nhân giống in vitro lan Vanda 14

1.3.1 Trên thế giới 14

1.3.2.Trong nước 17

1.4 Các nghiên cứu về giai đoạn ra ngôi 18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 21

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 21

2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

2.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của phytohormone tới sự phát sinh chồi và rễ 21

2.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý 26

2.3.2.1 Xác định hàm lượng sắc tố quang hợp (diệp lục, carotenoid) 26

2.3.2.2 Xác định hoạt độ catalase 27

2.3.2.3 Xác định hoạt độperoxidase 28

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống hạt lan 29

3.2 Ảnh hưởng của kinetin và BAP đến đường hướng phát sinh hình thái của hạt nảy mầm 31

3.3 Ảnh hưởng của kinetin và BAP đến chiều cao chồi nảy mầm từ hạt 33

3.4 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi 34

3.5 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến chiều cao chồi trong quá trình nhân nhanh 36

3.6 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến động thái ra lá của cây 37

3.7 Ảnh hưởng của NAA và IAA đến khả năng ra rễ của cây 37

3.8 Huấn luyện cây con giai đoạn ra ngôi 40

3.8.1 Ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây trong ống nghiệm 40

3.8.2 Ảnh hưởng của loại giá thể trồng đến cây lan con 41

3.8.4 Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến sự sinh trưởng của cây 42

3.9 Hàm lượng sắc tố quang hợp 43

3.10 Hoạt độ catalase 46

3.11 Hoạt độ peroxidase 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

1 Kết luận 49

2 Kiến nghị 49

NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

NADPH Nicotinamide cidenin dinucleotide photphate hydro

TDZ 1-phenyl-3-1,2,3-thiadiarol-5yl

2,4 D 2,4- Dichloro phenoxy acetic acid

ngôi ex vitro 44

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hoa lan Vanda 3

Hình 3.1 Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến khả năng nảy mầm của hạt lan 30

Hình 3.2 Sự nảy mầm của hạt lan Vanda 30

Hình 3.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến đường hướng phát sinh hình thái của hạt lan Vanda 32

Hình 3.4 Sự phát sinh hình thái của hạt lan Vanda 33

Hình 3.5 Ảnh hưởng của kinetin và BAP đến chiều cao chồi mới phát sinh 34

Hình 3.6 Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi lan Vanda 35

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến chiều cao chồi 36

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến động thái ra lá của cây 37

Hình 3.9 Ảnh hưởng của NAA và IAA đến số rễ TB/cây 38

Hình 3.10 Ảnh hưởng của NAA và IAA đến chiều dài rễ 39

Hình 3.11 Sự hình thành rễ lan Vanda 39

Hình 3.12 Ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây trong ống nghiệm đến tỷ lệ sống của cây 40

Hình 3.13.Hàm lượng sắc tố quang hợp trong mô lá phong lanVanda thời kì ra ngôi ex vitro 44

Hình 3.14 Hoạt độ catalase phong lan Vanda thời kì ra ngôi ex vitro 46

Hình 3.15 Hoạt độ peroxidase phong lan Vanda thời kì ra ngôi ex vitro 48

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong những năm gần đây kinh tế nước ta đang ngày càng phát triển, đời sống của người dân không ngừng được cải thiện và nhu cầu chơi cây cảnh cũng được chú ý đến nhiều Nhu cầu sử dụng hoa nói chung và hoa lan nói riêng cũng tăng nhanh Hoa lan thực sự trở thành sản phẩm nông nghiệp có giá trị kinh tế cao, nó thúc đẩy ngành sản xuất kinh doanh phát triển mạnh mẽ: Thái Lan, Singapore, Malaysia, Indonesia trong đó Thái Lan có kim ngạch xuất khẩu hoa lan cắt cành năm 1987 là 21 triệu USD, năm 1990 26 triệu USD, năm 1991 là 30 triệu USD, Singapore thu lợi nhuận từ hoa cắt cành mỗi năm

Để đáp ứng được nhu cầu của con người với số lượng lớn, việc nhân

giống loài lan này bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) là

một biện pháp cần được tính đến Trên thế giới, có một số ít công trình nghiên

cứu xây dựng quy trình nhân giống một số loài lan thuộc giống Vanda đã

được báo cáo [10; 18; 20; 29; 44] Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu một cách có hệ thống về sự phát sinh cơ quan của lan Vanda dưới

ảnh hưởng của phytohormone được công bố Bên cạnh đó, đối với công nghệ nhân giống in vitro, giai đoạn ra ngôi (huấn luyện cây con để chuyển từ giai

đoạn ống nghiệm ra môi trường tự nhiên) đóng vai trò rất quan trọng Trong quá trình này, cây con phải thích nghi với sự thay đổi của môi trường sống từ

nhân tạo đến tự nhiên trong một thời gian ngắn Do đó, có thể cơ thể chúng sẽ có những biến đổi về hình thái, giải phẫu cũng như sinh lý rất đáng chú ý để có thể

thích nghi với môi trường mới [11; 31; 34; 35] Tuy nhiên, những nghiên cứu về

những động thái trên ở thực vật còn ít được thực hiện, đăc biệt với giống lan

Vanda Những kết quả nghiên cứu về các những biến đổi hình thái, giải phẫu và

sinh lý của lan Vanda giai đoạn ra ngôi có ý nghĩa lớn, cung cấp các thông tin khoa học bổ ích, đồng thời giúp con người đề ra các biện pháp kĩ thuật để luyện cây một cách có hiệu quả

Từ những lí do trên, chúng tôi đề xuất đề tài nghiên cứu với tên gọi “Ảnh

hưởng của phytohormone tới sự phát sinh chồi, rễ của phong lan Vanda (Vanda sp) in vitro và một số đặc điểm sinh lí của cây trước và sau giai đoan

ra ngôi”

2 Mục đích nghiên cứu

- Đánh giá ảnh hưởng của auxin và cytokinin tới sự phát sinh chồi và rễ của

phong lan Vanda (Vanda sp) in vitro

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh lí của cây lan Vanda in vitro trước và

sau giai đoan ra ngôi

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số phytohormone (auxin, cytokinin) tới sự

phát sinh chồi và rễ của phong lan Vanda in vitro

- Nghiên cứu động thái sinh lý của cây lan Vanda có nguồn gốc in vitro

trong giai đoạn ra ngôi

4 Những đóng góp mới của đề tài

Đánh giá ảnh hưởng của phytohormone tới sự phát sinh chồi và rễ của

phong lan Vanda (Vanda sp) in vitro

Cung cấp các thông tin khoa học về một số đặc điểm sinh lí của cây trước và

sau giai đoan ra ngôi, góp phần xây dựng quá trình nuôi cấy in vitro lan Vanda

PHẦN 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tổng quan về lan Vanda

Hình 1.1 Hoa lan Vanda

Thông thường người ta dùng từ ngữ Hy lạp để đặt tên cây lan, nhưng trong

trường hợp này lại dùng chữ Vanda (Sankrit dùng để chỉ tên cây V tessellata) Thế nhưng năm 1819 Robert Brown lại dùng chữ Vanda để đặt tên cho cây V

roxburghii đã nở hoa tại Anh quốc để vinh danh William Roxburgh, Giám đốc

vườn thảo mộc Calcutta

Ở Việt Nam có 7 loài Vanda rừng được biết là: V concolor, V liouvillei,

V lilacina, V denisonaliana, V fuscoviridis, V bidupensis và Vanda pumila

Cả 3 loài sau đều là lan vùng mát có nhiều ở Lâm Đồng Vanda có sự biến đổi rất lớn về tính chất thực vật và sự xuất hiện của hoa, nhưng hầu hết chúng đều

là những cây lan có giá trị vì có chồi loa dài mang nhiều hoa to [1]

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Lan Vanda có thân hình trụ với các lóng khá dài, không có giả hành Lá hình trụ hoặc tròn dẹp phẳng Lá dẹp thẳng ở tận cùng thường có răng nhọn không đều Phát hoa đứng thẳng và không bằng nhau, phân nhánh Hoa khá lớn và khá bền Lá đài và cánh hoa gần như nhau, bờ mép hơi cong vào Môi gắn chặt vào trụ ngắn, vách hoặc cục u Môi có 3 thùy, thùy giữa có sọc dọc

và 2 cục có nắp che hai phấn khối với vĩ phấn ngắn to và gót đĩa lớn Quả lan thuộc quả nang, nở ra theo 3 - 6 đường nứt dọc Quả có dạng cải dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa Khi chín, quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc Hạt lan rất nhiều, hạt liti Hạt chỉ cấu tạo bởi một lớp chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí Hạt trưởng thành sau 2 - 18 tháng

Dựa vào đặc điểm của lá, chia Vanda thành 2 nhóm lớn:

- Nhóm có hình trụ tròn, đòi hỏi có ánh sáng nhiều nên phải trồng ở nơi sáng hoàn toàn, không che chắn, thuận tiện cho vùng nóng

- Nhóm có lá dẹp phẳng, đòi hỏi ánh sáng ít hơn nên có thể trồng ở những vùng ôn đới có khí hậu lạnh

Cây lai giữa 2 dạng này cho ra dạng lá thay đổi từ hình lòng máng đến hình chữ U, cần ánh sáng cao hơn lá dẹp phẳng nhưng thấp hơn lá trụ tròn

Lan Vanda có nhiều màu sắc sặc sỡ, hình dáng vừa tròn, vừa dày Lan Vanda có đài hoa luôn lớn hơn hoặc bằng cánh hoa, đồng thời cánh hoa rất mỏng nhưng độ bền của hoa thì ở thời gian dài Hoa lan Vanda thường tươi lâu từ 4 đến 8 tuần, tùy theo khí hậu và giống Có vài loại lan Vanda tỏa mùi

thơm như V amesiana, V denisonianum, V cristata và V dearei Có loại có vân như V coerulea hoặc đốm như V tricolor hay V sanderiana Lan Vanda

có thể ra hoa 2 hoặc 3 lần trong một năm nếu được chăm bón đủ điều kiện.Trồng lan Vanda không khó, nếu ta trồng đúng cách và tạo đủ điều kiện thích hợp cho cây phát triển thì cây sẽ sống lâu và ra hoa thường xuyên [8]

1.1.3 Đặc điểm sinh thái và chế độ chăm sóc

Lan Vanda là loài lan đẹp, nó sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ

25-30oC, độ ẩm cao và thoáng khí Trong năm Vanda thường xuyên tăng trưởng không ngừng nghỉ, vì vậy cần cung cấp lượng nước và chất dinh dưỡng đầy

đủ cho cây, không để cây bị khô hạn bất chợt dễ gây nên hậu quả không tốt cho cây Có thể cung cấp lượng nước cần thiết cho cây tùy thuộc vào từng mùa

và từng thời điểm thích hợp Lan Vanda là loại lan nở hoa phụ thuộc vào nhiệt

độ, nó có thể trổ hoa quanh năm, đặc biệt vào mùa nắng, khi nhiệt độ trong không khí tăng cao [8]

1.1.3.1 Nhiệt độ, ẩm độ, sự tưới nước

Ở Việt Nam Vanda rừng là một loại lan vùng mát, nhưng các Vanda lại

là một loài lan của của vùng nóng, sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ 25ºC-30ºC, các loài Vanda cần được trồng trong vườn với độ ẩm cao, nhưng

ẩm độ cục bộ trong chậu phải thoáng Cây tăng trưởng suốt năm không có mùa nghỉ vì thế không nên để cây bị khô bất cứ thời điểm nào trong năm Bị khô hạn bất chợt sẽ gây cho cây mất ổn định về ẩm độ và hậu quả là cây bị tuột lá, yếu đi Vì thế đối với các loài thuộc giống này ta phải tưới nước thường xuyên 2 lần/ngày từ đầu tháng 5 đến cuối tháng 11 và 3 lần/ngày từ

tháng 7 đến cuối tháng 4 Khác với một số giống lan khác, nguyên nhân chủ yếu quyết định sự ra hoa các loài thuộc giống Vanda là điều kiện nhiệt độ Chính vì thế các loài thuộc giống này có thể trổ hoa suốt năm Nhưng ở thành phố Hồ Chí Minh, mùa trổ hoa nhiều nhất vẫn là mùa nắng, vào tháng 2, khi nhiệt độ trong không khí cao nhất trong năm [8]

1.1.3.2 Ánh sáng

Vanda là giống ưa sáng, có những loài thuộc giống này cây trổ hoa lý tưởng khi được phơi bày ra ánh sáng hoàn toàn Vanda trổ hoa khi được trồng dưới điều kiện gần 100% ánh sáng Tuy nhiên đa số loài chỉ cần 60% ánh sáng, tức giàn che 40% ánh sáng là đủ Do đó độ biến động về cường độ ánh sáng thay đổi tới 30.000 - 40.000 m/m² [8]

1.1.3.3 Nhu cầu phân bón

Vanda là một trong những giống có nhu cầu về phân bón khá cao và chúng dễ dàng sử dụng bất cứ một dạng phân bón loại nào, phân bò khô có thể là loại phân tốt hoặc có thể dùng phân bánh dầu phọng, nhưng hữu hiệu hơn hết vẫn là phân hóa học với công thức 3-10-10 tưới 2 ngày/lần với nồng

độ 1 muỗng cà phê/4 lít nước Sở dĩ ta dùng phân bón với chu kỳ cách nhật vì Vanda không có giả hành nên không dự trữ được dưỡng liệu, ngoài ra giá thể của Vanda là giá thể thông thoáng đến mức cực đoan chỉ gồm chậu gạch nung hay giỏ gỗ với các cục than thật to Do đó sự lưu lại của dưỡng liệu trong giá thể là không đáng kể cho việc hấp thụ của lan trong thời gian ngắn Tốt nhất

là dùng phân bón với dạng phun sương, vì loài này là loài phụ sinh và có rất nhiều rễ trên không [8]

1.1.3.4 Giá thể trồng lan

Vanda là một loại lan không có mùa nghỉ, một biến cố khô hạn rất dễ làm các loài giống này rụng hết phần lá gần gốc, mà giới chơi lan Việt Nam thường gọi là “chuồn lá” Tuy nhiên, ẩm độ cục bộ trong chậu quá cao dễ làm

cho các rễ bị thối Vì thế, cấu tạo giá thể thật thoáng cho các loài thuộc giống Vanda Việc duy trì ẩm độ ổn định là cố gắng của các nhà vườn thông qua sự tưới hàng ngày [8]

1.1.3.5 Thay chậu và nhân giống

Sự thay chậu các loài thuộc giống Vanda, thường chỉ do nguyên nhân duy nhất là cây phát triển quá lớn gây ra sự mất cân đối giữa cây và chậu Việc thay chậu có thể thực hiện suốt năm nhưng đầu mùa mưa vẫn là thời điểm lý tưởng cho việc thay chậu

Cách nhân giống tương tự Hồ điệp Khoảng 3 tháng 1 lần, ta phun một dung dịch NAA với nồng độ 0,1 phần triệu (ppm) để kích thích sự mọc rễ Đối với loài Vanda, mỗi lần bạn phun kích thích tố rễ sẽ mọc tăng lên 1 bậc Như vậy, sau một thời gian cây lan Vanda sẽ có một bộ rễ thật mạnh đủ đáp ứng các yêu cầu cần thiết [8]

1.1.3.6 Sâu bệnh

Vanda thường bị loài rệp dính màu vàng tấn công, chúng thường nằm trên

bề mặt lá Loại này cũng thường hút nhựa các lá của giống Dendrobium, cách trừ cũng là các loại thuốc sát trùng, serpa phun sương lên lá Bệnh thối đọt tỏ ra nguy hiểm cho các loài thuộc giống Vanda, khi có hiện tượng này xảy ra, dùng kéo cắt bỏ đọt lan, sau đó bôi vôi vào vết cắt, phần ngọn được khử trùng trước khi sử dụng để cắt cây lan khác Nếu không bệnh sẽ lan truyền trong toàn bộ vườn lan Tốt nhất nên ngừa bệnh thường xuyên bằng cách phun các loại thuốc ngừa nấm Topsin, Zineb, Benomyl nồng độ 1/400, nửa tháng 1 lần [8]

1.2 Phương pháp nhân giống in vitro

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

* Tính toàn năng của tế bào

Theo Haberlandt (1902), mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Theo

quan niệm sinh học hiện đại thì: “Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh” Đó chính là tính toàn năng của tế bào, cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật [2]

* Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

“Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể” Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là sự phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất

là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào Kĩ thuật nuôi cấy

mô tế bào xét cho đến cùng là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo, vô trùng) một cách định hướng dựa và sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật [2]

1.2.2 Các giai đoạn nuôi cấy

1.2.2.1 Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là phải chuẩn bị được nguồn nguyên liệu thực vật cho quá trình nuôi cấy Khâu đầu tiên của giai đoạn này có thể coi như một bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy Cây mẹ (là cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ động nguồn mẫu trong công tác nhân giống Cây mẹ phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virut và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Thông thường, cây mẹ là

cây có những tính trạng tốt, đạt tiêu chuẩn của các nhà chọn giống hoặc là những đối tượng đang có nguy cơ tuyệt chủng Trong trường hợp cần thiết có thể làm trẻ hoá vật liệu giống [9]

1.2.2.2 Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Khi đã có

nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu và xử lý mẫu cấy trong những điều kiện vô trùng Khi lấy mẫu cần chọn loại mẫu cấy phù hợp: đúng loại

mô, đúng giai đoạn phát triển: người ta thường lấy chồi đỉnh hay chồi nách để

nuôi cấy in vitro Ngoài ra cũng có thể sử dụng đoạn thân, mảnh lá, để tiến

hành nuôi cấy Người ta thường sử dụng một số loại hoá chất như: HgCl20,1%, cồn 700, H2O2, Ca(OCl)2 để khử trùng mẫu cấy Để tăng tính linh động của hóa chất diệt khuẩn, người ta thường sử dụng thêm các chất làm giảm sức căng bề mặt như tween 20, tween 80, teepol .Mẫu sau khi được khử trùng được cấy vào môi trường nuôi cấy khởi động

Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt [9]

1.2.2.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro so

với các phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao Vì vậy giai đoạn nhân nhanh được coi là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống Giai đoạn này sẽ kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh

số lượng thông qua các con đường: Hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính Phải xác định được môi trường dinh dưỡng và môi trường vật lý phù hợp để đạt hiệu quả cao nhất Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng, chất phụ gia (nước dừa, khoai tây, ) là đặc biệt quan trọng Tăng cường chiếu sáng (16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu 1000 lux, ánh sáng tím) là yếu tố quan

trọng kích thích mô phân hoá mạnh Bảo đảm chế độ nhiệt 20 - 300C Yêu cầu cần đạt được trong giai đoạn này là tạo được hệ số nhân cao [9]

1.2.2.4 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn các chồi đã đạt kích thước nhất định và được chuyển từ môi trường ở công đoạn 3 sang môi trường nuôi cấy tạo rễ để hình thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này môi trường cần giảm lượng cytokinin và tăng lượng auxin để rễ phát triển Các chất α - NAA, IBA, IAA thường được sử dụng ở nồng độ 1 - 5 mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loài cây trồng Từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Lúc này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động của lá và rễ mới sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng Yêu cầu cần đạt được trong giai đoạn này: Cây con tạo ra đủ tiêu chuẩn (chiều cao, số lá, số rễ) [9]

1.2.2.5 Giai đoạn 5: Đưa cây mô ra ngoài vườn ươm

Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài trời để tạo điều kiện cho cây con tự dưỡng hoàn toàn và thích nghi dần với môi trường tự nhiên Khi cây đủ tiêu chuẩn cứng cáp thì mang trồng Để đưa cây từ ống nghiệm ra môi trường bên ngoài đạt tỷ lệ sống cao cần đảm bảo một số yêu cầu: Cây trong ống nghiệm đạt những tiêu chuẩn về hình thái

nhất định: chiều cao cây, số lá, số rễ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích

hợp: giá thể tơi xốp, thoát nước, sạch bệnh Phải giữ ẩm cho cây khi mới đưa cây từ ống nghiệm ra, cần duy trì độ ẩm trên 50% để cây con không mất nước đặc biệt trong 2 - 3 tuần lễ đầu, tránh ánh sáng quá mạnh gây cháy lá, tránh nhiễm khuẩn và nấm gây hiện tượng thối nhũn Điều kiện môi trường trong giai đoạn này là rất quan trọng, cần tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển, cứng cáp và phòng bệnh cho cây Đây được xem là công đoạn quyết định khả năng ứng dụng quy trình này trong thực tiễn sản xuất [9]

1.2.3 Các điều kiện nuôi cấy in vitro

* Điều kiện vô trùng

Đây là điều kiện tiên quyết đối với thành công của quá trình nuôi cấy mô

tế bào Nếu không mẫu bị nhiễm nấm, khuẩn sẽ thối và chết

Vô trùng dụng cụ và môi trường: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các thao tác mẫu cấy được tiến hành trong tủ cấy vô trùng Để vô trùng dụng cụ

và môi trường nuôi cấy, có thể sử dụng một trong các phương pháp khử trùng khô (các dụng cụ bằng kim loại, thuỷ tinh, các dụng cụ có tính chịu nhiệt), khử trùng ướt (môi trường và các dụng cụ nuôi cấy), màng lọc (môi trường

mà thành phần của nó bị phân huỷ ở nhiệt độ cao)

Vô trùng mẫu cấy: với các loại mẫu cấy khác nhau hoặc cùng loại mẫu cấy nhưng ở các vị trí khác nhau thì phương pháp khử trùng mẫu cấy là khác nhau Phương pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hoá chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật

Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại, nồng độ, thời gian xử lý hoá chất khử trùng Một hoá chất được lựa chọn để vô trùng phải đảm bảo 2 thuộc tính: có khả năng diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu thực vật Các hoá chất hay được sử dụng đó là: hypoclorit canxi (nồng độ 5-15% w/v), hypoclorit natri (nồng độ 10- 20% v/v), oxy già (nồng độ 10-12% v/v), thuỷ ngân clorua (nồng độ 0,1-1% w/v), chất kháng sinh (50-100 mg/l) Để tăng tính linh động của hoá chất diệt khuẩn,người ta thường sử dụng thêm các chất làm tăng sức căng bề mặt như Tween 20, Tween 80, fotoflo, teepol hoặc có thể phối hợp xử lý với cồn 700 [3]

* Ánh sáng và nhiệt độ

Các mẫu nuôi cấy thường được đặt trong những phòng nuôi ổn định về ánh sáng và nhiệt độ Tất cả các trường hợp nuôi cấy đều cần có ánh sáng trừ một số trường hợp nuôi cấy tạo mô sẹo, nhưng quá trình nhân giống của

chúng cũng cần có ánh sáng Nhiệt độ của các phòng nuôi cây thường được duy trì từ 25 - 280C nhờ các máy điều hoà nhiệt độ [3]

1.2.4 Môi trường nuôi cấy in vitro

* Thành phần hóa học của môi trường

Thành phần vô cơ: Bao gồm các muối khoáng (đa lượng và vi lượng) được bổ sung vào môi trường nuôi cấy

Thành phần hữu cơ: Vitamin, aminoaxit, amit, myo-inositol, thành phần hữu

cơ phức hợp, dịch chiết hoa quả, củ, nước ép cà chua, nước ép cam, nước ép chuối xanh, nước dừa

Các chất điều hoà sinh trưởng: Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu được trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng

trong phát sinh hình thái thực vật in vitro Hiệu quả tác động của chất điều

hoà sinh trưởng phụ thuộc vào loại và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy

Nguồn cacbon: Các mẫu nuôi cấy thực vật nói chung không thể quang

hợp hoặc quang hợp nhưng ở cường độ rất thấp Vì vậy phải đưa thêm những hợp chất hydratcacbon vào thành phần môi trường nuôi cấy Loại hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đường saccarozơ với hàm lượng từ 2 - 6% (w/v) Những loại đường khác như fructose, glucose, maltose, sorbitol, rất ít dùng Hàm lượng đường thấp được sử dụng cho nuôi cấy tế bào trần, ngược lại hàm lượng đường cao cần cho nuôi cấy hạt phấn và phôi

Tác nhân tạo gel: quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy Chất tạo gen được sử dụng phổ biến là agar (thạch) Hàm lượng agar sử dụng từ 0,5-

10 % (w/v) tuỳ theo chất lượng của chúng và môi trường sử dụng

Than hoạt tính: được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Trong trường hợp những chất đó có tác

dụng gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu Mặt khác, khi bổ sung vào môi trường, than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng [3]

* pH của môi trường

pH của đa số các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5 -6,0 pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 agar có thể rất cứng Nếu trong môi trường có GA3 thì phải điều chỉnh giá trị

pH trong phạm vi nói trên vì ở pH kiềm hoặc quá axit thì GA3 sẽ chuyển sang dạng không có hoạt tính [3]

1.2.5 Chất điều hòa sinh trưởng

1.2.5.1.Auxin

Tác dụng kích thích phân chia và kéo dài tế bào Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ức chế sinh trưởng chồi bên khi kết hợp với etylen Kích thích sự mọc rễ ở cành giâm, kích thích sự phát sinh chồi phụ trong nuôi cấy mô Có vai trò khác nhau trong sự rụng lá, quả, đậu quả, sự chín của quả Có vai trò trong quá trình tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus), kích thích tạo chồi bất định

ở nồng độ thấp Nồng độ thường sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào 0,1- 5mg/l Auxin gồm hai nhóm tự nhiên: IAA (3-indoleacetic acid) và nhân tạo: IBA (3-indolebutiric acid), NAA (Napthaleneacetic acid), 2,4-D (2,4-D-Dichlorophenoxyacetic acid) [3]

1.2.5.2 Cytokinin

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormon liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6- benzyladenin (BA), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6- amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino) purine (zeatin) Zeatin là cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo [3]

1.3 Các nghiên cứu nhân giống in vitro lan Vanda

có phát sinh mô sẹo đạt 40% từ đỉnh sinh trưởng [20]

Năm 2004, Sinha và Roy nhân giống lan bản địa V teres (Roxb.) Lindl qua nuôi cấy in vitro từ hạt Sử dụng môi trường VW (Vacin and Went) bổ dung 1,0

mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA, 2% sucrose và 2 g/l peptone Tỷ lệ nảy mầm tốt nhất đạt được trong môi trường có bổ sung 10% nước dừa Rễ phát triển dài nhất trong môi trường bổ sung 2 g/l bột chuối và 100 mg/l carein Cây trồng ngoài tự nhiên sau 2 đến 3 năm cho hoa nở [46]

Năm 2006, Nguyễn Thị Lạng và Ngô Thị Hằng sử dụng phương pháp công nghệ sinh học để nhân giống lan Vanda Đầu rễ và các mẩu lá được nuôi trong môi trường 1/4MS bổ sung 1-phenyl-3-(1,2,3- thiadiazol- 5yl) –urea (TDZ, 0,1-3mg/l), 2,4 D , 3-10mg/l) trong 4 tuần Các mô sẹo được cấy duy trì trong cùng môi trường, sau hai tháng tỷ lệ mô sống đạt 90% [32]

Năm 2010, Kaur và Bhutani thực hiện nhân giống in vitro V testacea

(Lindl.) Reichb.f một loại lan quý hiếm có giá trị dược liệu cao Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự ra rễ và tỷ lệ sống sót của cây con Kết quả cho thấy môi trường Mitra có bổ sung 1,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA và than hoạt tính cho hệ số nhân chồi cao và cây con phát triển tốt Cây con trồng trong giá thể chứa 1 than : 1 gạch : 1 sơ dừa, tỷ lệ cây sống đạt 75% [29]

Năm 2009, Rahman và cộng sự tiến hành nhân giống in vitro lan V tessellata L từ chồi cây nuôi cấy mô Thí nghiệm tiến hành trên môi trường

MS với nồng độ auxin và cytokinin khác nhau Kết quả cho thấy môi trường

MS có bổ sung 1,5 mg/l NAA và 1,0 mg/l BAP cho hệ số nhân chồi cao nhất cũng như chiều dài chồi tốt nhất Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA

và 1,0 mg/l IBA cây ra rễ tốt nhất Cây con được trồng trong giá thể chứa sơ dừa, đá, than củi và gạch theo tỷ lệ 2:1:1:1 [38]

Năm 2010, Jawan và cộng sự nuôi cấy in vitro lan V dearei, nghiên cứu

ảnh hưởng của môi trường, chất phụ gia và nguồn đường lên sự phát sinh protocorm của lan Kết quả cho thấy protocorm phát sinh trên cả 3 loại môi trường thí nghiệm là ½ MS tiếp đến là Knudson và phát sinh tốt nhất trên môi trường VW Các môi trường có bổ sung 0,2% (w/v) cao nấm men làm tăng khả năng phát sinh protocorm Sự tạo thành lá và rễ tốt hơn khi nồng độ đường trong môi trường giảm, nồng độ thích hợp là 2% (w/v) và sử dụng đường sucrose là tốt nhất Khi nồng độ đường tăng lên 4% (w/v) tạo thành cây có kích thước lớn [26]

Năm 2011, Manners và cộng sự nhân giống in vitro lan Vanda coerolea

bằng hạt 10 đến 11 tháng Kết quả cho thấy trong môi trường Murashige và Skoog (MS) tỷ lệ hạt nảy mầm đạt 71,8%, trong môi trường MS có bổ sung 5

µM BAP hoặc 5 µM IAA tỷ lệ hạt nảy mầm tăng lên đạt 94,4% và 92,6% Trong môi trường MS có bổ sung 5 µM BAP và 15 µM IAA hệ số nhân chồi đạt 13,2 chồi và số rễ trung bình đạt 5,1 rễ [33]

Năm 2012, Islam và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết khoai

tây đến sự nảy mầm và phát sinh chồi của hạt lan V roxburgii cho thấy dịch

chiết khoai tây tăng cường khả năng nảy mầm và phát triển chồi của hạt lan Nồng độ dịch chiết 200 ml/l làm tăng sự nảy mầm của hạt từ 17,2% lên 74,28% Đặc biệt sự phát sinh chồi, chiều dài chồi, số lượng rễ và chiều dài

của rễ cũng được tăng cường trong môi trường có bổ sung thêm 100 ml/l dịch chiết khoai tây [23].Năm 2013, Prakash và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của

pH đến quá trình nhân giống hạt lan V tessellata (Roxb.) Hook.Ex.G Thí

nghiệm được tiến hành trên môi trường MS với các giá trị pH khác nhau Kết quả cho thấy tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất tại giá trị pH 5,5 đạt 95% [37]

Năm 2014, Islam và cộng sự sử dụng công nghệ in vitro để nhân giống V roxburghii từ hạt Sử dụng môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l NAA và 15%

nước dừa hạt nảy mầm và phát triển tốt nhất Sử dụng môi trường này thời gian nảy mầm cũng được rút ngắn từ 35 ngày xuống 22 ngày so với đối chứng [24]

Năm 2015, David và cộng sự cải tiến môi trường nhân giống in vitro lan

V helvola Blume bằng việc thêm các nguồn hữu cơ khác nhau vào môi

trường Sử dụng quả lan 120 ngày tuổi để nhân giống trong 3 loại môi trường

MS, Knudson và VW, kết quả cho thấy hạt nảy mầm tốt nhất trong môi trường Knudson, tỷ lệ nảy mầm đạt 66,4% Các nguồn hữu cơ khác nhau được bổ sung vào môi trường Knudson như: nước ép cà chua, nước dừa, peptone, cao nấm men với các nồng độ khác nhau Sau 90 ngày nuôi cấy cho thấy 90% hạt nảy mầm trong môi trường có bổ sung 10% đến 15% nước ép cà chua Môi trường trên kết hợp với 0,1% peptone kích thích hạt nảy mầm sớm hơn, sau 90 ngày cây đạt trung bình 3 lá và 2 rễ [14]

Năm 2015, Sachin nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự tạo

thành protocorm của V tessellata (Roxb.) Hook ex G.Don Thí nghiệm được

tiến hành trong giải nhiệt độ (15°C, 20°C, 25°C, 30°C) và pH (4.5, 5.5, 6.5,7.5) Kết quả cho thấy protocorm được tạo thành và phát triển tốt nhất trong môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng ở nhiệt độ 20°C và pH 5,5 Các điều kiện nhiệt độ và pH khác sự tạo thành protocorm kém hơn [41]

1.3.2.Trong nước

Việt Nam, có khí hậu thích hợp và có nhiều nguyên liệu tốt cho lan sinh trưởng và phát triển Chính vì vậy công nghệ nuôi cấy mô cũng đã được nghiên cứu khá lâu, đến nay đã thu được một số kết quả tiêu biểu đó là:

Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam bước đầu cũng đã có những thành công trong việc nuôi cấy mô tạo giống phong lan theo công nghệ được chuyển giao từ Thái Lan Các Viện, các Trung tâm nghiên cứu về hoa cây cảnh và giống cây trồng, các trường đại học hoạt động trong lĩnh vực Nông Lâm nghiệp đều có trung tâm nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào thực vật và phát triển một số loài hoa lan quý hiếm Một số địa phương khác như Sa Pa, Phú Yên bước đầu đã khảo sát và nghiên cứu phương pháp nhân giống, hoàn thiện quy trình sản xuất phong lan Tuy nhiên các nghiên cứu thường tập trung vào các loại lan có giá trị về dược liệu đặc trưng của nước ta, còn giống Vanda ít được nhân giống trong nước mà chủ yếu nhập cây con từ nước ngoài

để đáp ứng được nhu cầu thị tường tiêu thụ ngày càng cao

Năm 2011, Nguyễn Văn Song và cộng sự tiến hành nhân nhanh in vitro lan Kim điệp Dendrobium chrysotosum, một loài lan rừng có nguy cơ tuyệt

chủng Sử dụng hạt quả lan 3 tháng tuổi làm thí nghiệm Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường thích hợp cho nảy mầm, phát sinh protocorm của hạt và nhân nhanh protocorm là MS có bổ sung: 20 g/l sucrose, 15% nước dừa, 2 mg/l BAP và 8 g/l agar Môi trường thích hợp nhất cho tái sinh chồi là MS bổ sung 30 g/l sucrose, 15% nước dừa, 8 g/l agar, 1g/l than hoạt tính, 2 mg/l BAP

và 1,0 mg/l NAA Môi trường thích hợp cho tạo rễ của chồi là MS bổ sung 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 1 mg/l NAA [5]

Năm 2012, Nguyễn Quang Thạch và Phí Thị Cẩm Miện nhân giống in vitro loài lan Kim tuyến bảo tồn nguồn dược liệu quý Dùng thể chồi và các

mắt đốt ngang thân để đưa vào các môi trường nền khác nhau (MS, Knudson

và Knudson cải tiến) Kết quả cho thấy, Môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngang thân là Knudson cải tiến + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l αNAA + 20 g/l sucrose + 0,5 g/l than hoạt tính +

7 g/l agar cho hệ số nhân chồi là 6,55 chồi/mẫu Các chồi có chiều cao từ 3-4

cm được sử dụng để ra rễ in vitro Tỷ lệ ra rễ là 100% và số rễ/chồi (4,21

rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi trường có bổ sung 1 mg/l α-NAA [7]

Năm 2012, Nguyễn Thị Sơn và cộng sự nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan D fimbriatum Hook (Hoàng thảo long nhãn) Mục đích bảo tồn và phát triển

nguồn gen quý, đang đe dọa tuyệt chủng Quả lan 3 tháng tuổi sử dụng làm thí nghiệm Kết quả nghiên cứu cho thấy, môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là môi trường MS bổ sung 100 ml/l nước dừa, 10 g/l sucrose, 6,0 g/l agar Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là môi trường

KC 100 ml/l nước dừa, 10 g/l sucrose, 60 g/l khoai tây và 6,0 g/l agar Môi trường MS + 100ml ND + 20g sucrose + 60g chuối chín + 6,0g agar/lít môi

trường là thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi in vitro; Môi trường tạo cây hoàn

chỉnh là RE + 10g sucrose + 1g than hoạt tính + 6,0g agar/lít [6]

1.4 Các nghiên cứu về giai đoạn ra ngôi

Các nghiên cứu về các đặc điểm hình thái, sinh lí, hóa sinh của cây trồng trước những biến đổi của khí hậu, điều kiện nuôi trồng cũng được quan tâm

sâu sắc Gần đây, những đặc điểm này của cây trong giai đoạn ra ngôi ex vitro

các cây có nguồn gốc nuôi cấy mô cũng được quan tâm

Hofman nghiên cứu giai đoạn ra ngôi ở đối tượng cây thuốc lá: khi

chuyển từ trạng thái in vitro sang ex vitro sau 35 ngày có sự biến đổi về hàm

lượng diệp lục, khả năng quang hợp và hàm lượng tinh bột [22]

Tương tự, cây phong lan Doritaenopsis in vitro cũng có những sự thay

đổi về đặc điểm của hệ sắc tố quang hợp (tăng tỉ lệ carotenoid), hình thái lá

sau 30 ngày ra ngôi exvitro [28] Trên phương diện hóa sinh,Van

Huylenbroeck nghiên cứu trên cây Spathiphyllumthấy có sự giảm hoạt tính

enzyme sucrose-p-synthase và sự hoạt hóa ADPG pyrophosphorylase sau giai đoạn ra ngôi [48]

Nghiên cứu của Pospóšilová trên cây thuốc lá, ở loài này, số lượng lá

tăng ngay khi chuyển cây ra môi trường ex vitro, trong điều kiện in vitro cây

thuốc lá có 6,7 lá; sau ra ngôi 17 ngày và 45 ngày số lượng lá lần lượt là 13,3

lá và 22,7 lá [36].Trong một số nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng khi

chuyển cây từ điều kiện in vitro ra ngoài môi trường tự nhiên, độ dày lớp biểu

bì, lớp cutin có xu hướng tăng lên[19; 49]

Nghiên cứu hàm lượng nước giai đoạn ra ngôi trên cây Malus pumila của

Díaz-Pérez, hàm lượng nước của cây này giảm sau 10 ngày ra ngôi và được

phục hồi tương đương với hàm lượng nước cây in vitro ở thời kì sau ra ngôi,hàm

lượng chất khô của cây này tăng sau 10 ngày ra ngôi và thời kì sau ra ngôi hàm

lượng chất khô tương đương với thời điểm cây trong điều kiện in vitro [16]

Nghiên cứu của các tác giả Sciutti và Morini trên cây Prunus cerasifera,

cây trong ống nghiệm với độ ẩm tương đối là 100% sẽ bị mất nhiều nước hơn

so với cây được trồng ở độ ẩmtương đối từ 70% đến 80% [43]; theo Khan et

al, cây Quercus robur trong bình thủy tinh mất nước mạnh hơn so với cây

ngoài tự nhiên trong thời gian 30 phút đến 90 phút thí nghiệm[30]; nghiên

cứu của tác giả Romano & Martins-Loucao cho thấy cây in vitro mất nước nhiều hơn so với cây ex vitro, mất tới 53% và 14% trong 30 phút thí nghiệm [40].Theo một số nghiên cứu trước đây, khi chuyển cây in vitro ra ngoài môi

trường tự nhiên, lớp biểu bì, lớp cutin có xu hướng dày lên cùng với sự giảm

số lượng khí khổng bề mặt lá và hoạt động đóng mở khí khổng hiệu quả hơn

Do vậy, khi đưa cây ra ngoài sẽ xảy ra hoạt động bất thường của khí khổng là nguyên nhân làm cho cường độ thoát hơi nước ở lá diễn ra mạnh hơn [47] Chỉ số Fv/Fmở một số loài, trong thời kì đầu ra ngôi lá bị mất nước

nhanh, chỉ số Fv/Fm giảm xuống nhanh chóng như cây thuốc lá [22], cây khoai lang được trồng vào môi trường nhân tạo có bổ sung 40g sucrose /lít

môi trường [12] hay cây Doritaenopsis khi được đặt ở điều kiện độ ẩm không khí dưới 70% hoặc nhiệt độ môi trường bằng 15°C, 20°C hoặc 35°C [27]

Hoạt độ catalase của cây Đầu đài Ấn Độ tăng lên trong thời kì đầu ra

ngôi ex vitro, sau đó hoạt độ enzyme này giảm vào cuối thời kì ra ngôi [17]

hoặc cây Tam phỏng [25]

Chakrabarty nghiên cứu trên cây Cúc đồng tiền, hoạt độ catalase giảm

mạnh khi đưa cây ra môi trường ex vitro được 5 ngày và hoạt độ enzyme này

tiếp tục giảm vào các thời điểm ngày thứ 10, 15, 20 và 25 ra ngôi [13]

Silva Junior và cộng sự nghiên cứu về giải phẫu rễ của cây L purpurata, cây được đưa ra ngoài trồng trong môi trường có chứa 75% urê

cho thấy sự thay đổi trong cấu trúc giải phẫu rễ, đặc biệt có sự gia tăng diệp lục a và b với cây được xử lý 50, 75 và 100% urê so với cây trong ống nghiệm[45] và nghiên cứu giải phẫu lá cây Yến Mạch của Aracama và cộng

sự trong giai đoạn ra ngôi [11]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng được chọn nghiên cứu trong đề tài này là Phong lan Vanda

(Vanda sp) in vitro thuộc họ phong lan (Orchidaceae) giống Vanda có nguồn gốc

từ Trung tâm nghiên cứu Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Hùng Vương

Các chất điều hòa sinh trưởng BAP và NAA ở các nồng độ khác nhau

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Các đặc điểm thân, rễ cây lan vanda và những biến đổi về sinh lý của lan

Vanda có nguồn gốc in vitro giai đoạn ra ngôi

2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian tiến hành: từ tháng 11/2015 đến 8/2016

- Địa điểm: Trung tâm nghiên cứu CNSH, khoa Khoa học Tự nhiên - Trường Đại học Hùng Vương – Việt Trì, Phú Thọ và - Khoa Sinh học – KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống của hạt

- Nghiên cứu môi trường tạo protocorm và phát sinh chồi in vitro

- Nghiên cứu đặc điểm chồi (thân) của lan vanda ở các môi trường khác nhau

- Nghiên cứu đặc điểm rễ của lan vanda ở các môi trường khác nhau

- Nghiên cứu huấn luyện cây con giai đoạn ra ngôi

- Nghiên cứu những biến đổi sinh lí của cây sau giai đoạn ra ngôi

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của phytohormone tới sự phát sinh chồi và rễ

Các công thức thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức (CT) thí nghiệm lặp lại ba lần

Các thí nghiệm đều được tiến hành trên môi trường nền là MS có bổ sung 10% nước dừa, 30 g/l khoai tây, 5 g/l agar và 0,5 g/l than hoạt tính tại

pH 5,6 được ký hiệu là MSo với các chất điều hòa sinh trưởng nghiên cứu theo các nồng độ khác nhau, sử dụng phối hợp hoặc riêng rẽ

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng oxi già (H2O2) nồng độ 15% và Natri hypochlorit (NaOCl) nồng độ 2,5% đến tỷ lệ sống của mẫu nuôi cấy Các CT được bố trí như sau:

Công thức Hóa chất, nồng độ Thời gian xử lý

 Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu nảy mầm và tỷ lệ mẫu chết

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Σ số mẫu nhiễm x 100

Σ số mẫu cấy vào

Tỷ lệ mẫu nảy mầm (%) = Σ số mẫu nảy mầm x 100

Σ số mẫu cấy vào

Qua đó đánh giá hiệu quả của công thức khử trùng đối với từng giống

- Thời gian đánh giá: Sau 4 tuần nuôi cấy

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của kinetin và BAP đến đường hướng phát sinh

hình thái của hạt nảy mầm

Công thức Môi trường CT7 MS + 0,1 mg/l α-NAA + 0,1 mg/l Ki CT8 MS + 0,1 mg/l α-NAA + 0,3 mg/l Ki CT9 MS + 0,1 mg/l α-NAA + 0,5 mg/l Ki CT10 MS + 0,1 mg/l α-NAA + 1,0 mg/l Ki CT11 MS + 0,1 mg/l α-NAA + 0,1 mg/l BAP CT12 MS + 0,1 mg/l α-NAA + 0,5 mg/l BAP CT13 MS + 0,1 mg/l α-NAA + 1,0 mg/l BAP CT14 MS + 0,1 mg/l α-NAA + 1,5 mg/l BAP

Chỉ tiêu đánh giá: sau 4 tuần

Số mẫu phát sinh hình thái, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi, chiều cao chồi phát sinh TB

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro

CT15 MS + 0,2 mg/l α-NAA + 0,1 mg/l BAP CT16 MS + 0,2 mg/l α-NAA + 0,5 mg/l BAP CT17 MS + 0,2 mg/l α-NAA + 1,0 mg/l BAP CT18 MS + 0,2 mg/l α-NAA + 1,5 mg/l BAP

Chỉ tiêu đánh giá: Sau 4 tuần

Hệ số nhân chồi = Σ số chồi đạt được

Σ số chồi cấy ban đầu

+ Đặc điểm của chồi: Chiều cao chồi, số lá/chồi, màu sắc chồi

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của α-NAA và IAA đến khả năng ra rễ

CT19 1/2MS + 0,1 mg/l α-NAA CT20 1/2MS + 0,5 mg/l α-NAA CT21 1/2MS + 1,0 mg/l α-NAA CT22 1/2MS + 0,1 mg/l IAA CT23 1/2MS + 0,5 mg/l IAA CT24 1/2MS + 1,0 mg/l IAA Chỉ tiêu đánh giá:

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây trong ống nghiệm

- Vật liệu nghiên cứu: bình cây đã hoàn thành giai đoạn ra rễ

- Công thức thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí trên các công thức: H1: Bình cây để trong nhà lưới 2 tuần, không mở nắp

H2: Bình cây để trong nhà lưới 1 tuần, không mở nắp

H3: Bình cây để trong nhà lưới 1 tuần, mở nắp

H4: Cây con và để trải trên bề mặt báo 1 tuần Phun ẩm 5 lần/ngày

- Chỉ tiêu đánh giá:

Tỷ lệ cây sống (%) = Σ số cây sống x 100

Σ số thí nghiệm

- Thời điểm đánh giá: Sau 4 tuần trồng cây

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của loại giá thể trồng đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây lan con

Giá thể là điểm tựa, đồng thời cũng là nơi cung cấp nước và một phần chất dinh dưỡng cho cây Trong nghiên cứu này được chúng tôi bố trí trên 3 công thức:

G1: Giá thể 100% rêu

G2: Giá thể 100% dớn cọng G3: 50% rêu + 50% dớn cọng

- Chỉ tiêu đánh giá : Tỷ lệ cây sống, số rễ/mẫu, chiều dài rễ/mẫu, số lá/mẫu, chiều dài lá/mẫu

- Thời điểm đánh giá: sau 1, 2, 3 tháng trồng cây

Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến sự sinh trưởng của cây

Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chế độ che sáng (25%, 50%) so với ánh sáng tự nhiên lên cây lan con mô đến sự sinh trưởng của cây lan con

mô sau khi trồng ngoài nhà lưới Thí nghiệm được bố trí trên các công thức: CS1 : Che 25% ánh sáng tự nhiên

- Thời điểm đánh giá: sau 1, 2, 3 tháng tuổi

2.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý

Cây phong lan Vanda được sử dụng trong các TN nghiên cứu về chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh ở các giai đoạn:

+ D0: Cây trong bình TN có nguồn gốc in vitro(8 tuần nuôi cấy)

+ D14: Cây từ D7 cho ra ngoài môi trường, đặt trên giá 7 ngày từ thời điểm D0

+ D56 Cây trồng trong giá thể ở nhà lưới 56 ngày từ thời điểm D0

Ở mỗi giai đoạn dùng 3 cây khác nhau để lặp lại thí nghiệm

2.3.2.1 Xác định hàm lượng sắc tố quang hợp (diệp lục, carotenoid) [4]

Hàm lượng sắc tố quang hợp được đo bằng máy quang phổ hấp phụ UV-VIS GENESYS 10UV(Thermo Electron Corporation, Mỹ)

Cân 0,2g lá cây đem nghiền trong cối xứ với 5ml axeton 80% Sau khi

lá đã được nghiền nhuyễn, thêm 5ml axeton 80% vào tiếp tục nghiền Sau đó

đổ dung dịch nghiền được sang ống đong, cho thêm axeton 80% vào tráng cối, rồi lại đổ vào ống đong đó làm sao cho đạt được đủ10ml

Sau đó chuyển dung dịch từ ống đong sang ống li tâm để li tâm với tốc

độ 4000vòng/phút trong thời gian 5 phút Sau khi li tâm, chuyển dung dịch nổi sang ống nghiệm đo OD của dịch chiết ở các bước sóng 663nm, 647nm và 470nm trên máy quang phổ hấp phụ UV-VIS GENESYS 10UV(Thermo Electron Corporation, Mỹ)

Nồng độ sắc tố quang hợp được tính theo công thức (Mac – Kinney, 1941):

Ca = 12,7.E663 – 2,69.E647

Cb = 22,9.E647 – 4,68.E663

Ca+b = 8,02.E663 + 20,3.E647

Cx+c = (1000.E470 - 1,82.Ca - 85,02.Cb)/198