Nghiên Cứu Phân Lập Và Tuyển Chọn Giống Vi Sinh Vật Nội Sinh Từ Vùng Sinh Thải Đất Chua Mặn Phục Vụ Cho Sản Xuất Nông Nghiệp Và Bảo Vệ Môi Trường

Vì vậy, việc phát triển ngành nông nghiệp hữu cơ bền vững với việc tăng cường sử dụng chế phẩm sinh học và phân bón hữu cơ trong canh tác cây trồng nhằm đảm bảo an toàn sinh học và bảo v

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA MÔI TRƯỜNG -oOo -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ơ

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN

GIỐNG VI SINH VẬT NỘI SINH TỪ VÙNG SINH THÁI

ĐẤT CHUA MẶN PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT

NÔNG NGHIỆP VÀ BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG

Người thực hiện : ĐINH THỊ THU NGA

Người hướng dẫn : TS NGUYỄN THỊ MINH

HÀ NỘI, 2016

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA MÔI TRƯỜNG -oOo -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ơ

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN

GIỐNG VI SINH VẬT NỘI SINH TỪ VÙNG SINH THÁI

ĐẤT CHUA MẶN PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT

NÔNG NGHIỆP VÀ BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG

Người thực hiện : ĐINH THỊ THU NGA

Người hướng dẫn : TS NGUYỄN THỊ MINH

Địa điểm thực tập : Học viện Nông nghiệp Việt Nam

HÀ NỘI, 2016

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan mọi kết quả trong bài viết này là hoàn toàn chân thực

và chưa từng được công bố trong một nghiên cứu nào trước đó

LỜI CÁM ƠN

Trong quá trình học tập tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, được sự giúp đỡ của các thầy cô, các đoàn thể, đặc biệt được bộ môn VSV – Khoa Môi trường tạo điều kiện, đến nay, em đã hoàn thành khóa học và thực hiện xong khóa luận của mình Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô Nguyễn Thị Minh đã tận tình hướng dẫn em hoàn thành tốt nghiên cứu của mình Cảm

ơn các thầy và các cô, các anh chị ở Phòng thí nghiệm Bộ môn vi sinh – Khoa môi trường và phòng thí nghiệm Jica – Khoa Quản lý đất đai đã tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành nghiên cứu này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè, thầy cô và gia đình đã giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tạitrường

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Đinh Thị Thu Nga

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

Em xin cam đoan mọi kết quả trong bài viết này là hoàn toàn chân thực và chưa từng được công bố trong một nghiên cứu nào trước đó i

LỜI CÁM ƠN ii

Em xin chân thành cảm ơn! ii

Sinh viên thực hiện ii

2.4.Phương pháp nghiêncứu 28

2.4.7 Xác định tính đối kháng của chủng giống VSVtheo phương pháp cấy vạch 32

Các chủng giống được đánh giá tính đối kháng theo từng cặp theo phương pháp đường vuông góc Cross-Streak Các chủng VSV được cấy thành cặp theo các đường giao nhau Nếu xuất hiện vòng đối kháng (các chủng mọc cách nhau) thì các chủng đó đối kháng nhau và không thể phối trộn chúng vào cùng chất mang 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Giá trị sản xuất nông lâm thủy sản quý 1 năm 2016 6

Bảng 1.2 Liều lượng bón phân đạm và sự tích lũy NO3- 7

trong nước ngầm, nước mặt 7

Bảng 1.3 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật ở Việt Nam và ước tính số lượng vỏ bao bì thải 8

Bảng 1.4 Dư lượng HCBVTV trong một số loại rau 10

Bảng 3.1 So sánh giữa tầng chứa vật liệu sinh phèn theo tiêu chuẩn của FAO và trên đất phèn huyện Kiến Thụy 36

Bảng 3.2 So sánh một số tính chất của đất phèn 36

huyện Kiến Thụy Hải Phòng với đất phèn Nam Bộ 36

Bảng 3.3 Kết quả phân tích đất ở khu vực lấy mẫu tại Hải Phòng 37

Bảng 3.4 Kết quả phân lập các chủng giống VSV 38

Bảng 3.5.Kết quả đánh giá khả năng phân giải xenlulozo, lân và khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng của các chủng giống 47

Bảng 3.6 Khả năng tích thích ứng pH của các chủng VSV nội sinh 52

Bảng 3.7 Khả năng thích ứng nhiệt độ của các chủng VSV nội sinh 55

Bảng 3.8 Khả năng phân giải tinh bột của các chủng VSV nội sinh 56

Bảng 3.9 Đặc điểm sinh học của các chủng VSV được tuyển chọn 60

Bảng 3.10 Chất lượng của chế phẩm dinh dưỡng vi sinh 63

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của CPDDVS đến dự sinh trưởng và 64

Phát triển của cây mồng tơi 64

Bảng 3.12 Tính chất đất trước và sau thí nghiệm (sau 30 ngày) 65

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tăng trưởng của đất nông nghiệp hữu cơ theo châu lục 4

2005-2013 4

Hình 1.2 Phát triển về số lượng các nước sản xuất nông nghiệp hữu cơ 5

Hình 3.1 Một số chủng vi sinh vật nội sinh được phân lập 42

Hình 3.2 Vòng phân giải xenlulo của một số chủng VSV 51

Hình 3.3 Vòng phân giải lân của một số chủng VSV 51

Hình 3.4 Khả năng thích ứng pH của chủng 3RC3 54

Hình 3.5 Vòng phân giải tinh bột của chủng 3RXC3 và chủng 8LC 57

Hình 3.6 Tính đối kháng giữa các chủng tuyển chọn 58

Hình 3.7.Các ống giống chứa 8 chủng VSV đã chọn 59

Hình 3.8 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng 3RXC3 61

Hình 3.9 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng 3TC2 61

Hình 3.10 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng 3TKT2 61

Hình 3.11 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng 3RC2 61

Hình 3.12 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng 3TXC3 62

Hình 3.13 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng 3LC2 62

Hình 3.14 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng YLD2 62

Hình 3.15 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng 3LDQ2 62

Hình 3.16 Thí nghiệm chậu vại trên cây mồng tơi 65

DANH MỤC VIẾT TẮT

CPDDVS Chế phẩm dinh dưỡng vi sinh

FiBL Viện nghiên cứu và truyền thông nông nghiệp hữu cơIAA Indole – 3 – axetic acid

IFOAM Hiệp hội nông nghiệp hữu cơ quốc tế

HCBVTV Hóa chất bảo vệ thực vât

NNHC Nông nghiệp hữu cơ

MỞ ĐẦU Đặt vấn đề

Nông nghiệp là một trong những ngành mũi nhọn của nền kinh tế Việt Nam.Thế nên, tập trung phát triển nông nghiệp là ưu tiên hàng đầu hiện nay.Tuy nhiên, trên lãnh thổ Việt Nam, có không ít vùng đất không màu mỡ, tiêu biểu là nhóm đất phèn.Việc phá rừng, đốt rừng, làm nương rẫy cùng với biến đổi khí hậu toàn cầu làm ảnh hưởng đến hệ sinh thái cây trồng và gây hậu quả lớn cho con người về sau này.Chính vì thế mà việc cải tạo và sử dụng lại các vùng đất phèn được xem là biện pháp tốt nhất, thích ứng với biến đổi khí hậu

Ngành nông nghiệp nước ta đang phụ thuộc quá nhiều vào phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật Điều này đang gây ra tình trạng thoái hóa đất, mất cân bằng sinh thái, gây ô nhiễm môi trường và tồn dư các chất độc hại trong nông sản phẩm còn cao Vì vậy, việc phát triển ngành nông nghiệp hữu cơ bền vững với việc tăng cường sử dụng chế phẩm sinh học và phân bón hữu cơ trong canh tác cây trồng nhằm đảm bảo an toàn sinh học và bảo vệ môi trường mà vẫn đảm bảo năng suất và chất lượng nông sản đang là yêu cầu của tái cơ cấu nền nông nghiệp Việt Nam

Vi sinh vật(VSV) nội sinh là VSV sống trong mô thực vật được tìm thấy ở vùng rễ, rễ, thân, lá và quả của thực vật Theo Zinniel và cộng sự (2002), vi khuẩn nội sinh được tìm thấy trong rất nhiều loại cây trồng ở Hoa

Kỳ, chúng không gây hại hay cạnh tranh dinh dưỡng với cây chủ; trái lại chúng xúc tiến sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng Vi khuẩn nội sinh còn thúc đẩy các quá trình chuyển hóa trong cây cũng như sự phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ (Harari và cộng sự, 1988) Vi khuẩn nội sinh thường giúp tăng cường sự sinh trưởng của cây bằng cách tổng hợp kích thích tố auxin (IAA) (Barbieri và cộng sự, 1986)

VSV nội sinh được xem là một trong những đối tượng quan trọng được phân lập và sàng lọc để sản xuất chế phẩm sinh học ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp và bảo vệ môi trường Lợi dụng đặc tính VSV sống nội sinh trong tế bào mô thực vật đã rút ngắn được thời gian thích nghi của chế phẩm sinh học VSV nội sinh có thể tạo nhiều chất kháng sinh đối với nấm bệnh, kích thích sự sinh trưởng cho cây và đồng thời không ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe cộng đồng.

Xuất phát từ thực tế trên, nhằm mục đích phục vụ cho sản xuất nông

nghiệp và bảo vệ môi trường, tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn giống VSV nội sinh từ vùng sinh thái đất chua mặn phục vụ cho sản xuất nông nghiệp và bảo vệ môi trường.”

Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn được các giống VSV nội sinh có nguồn gốc bản địa từ đất phèn, có tác dụng phân giải và chuyển hóa chất hữu cơ, tạo dinh dưỡng dễ tiêu, chống chịu cao với điều kiện bất lợi, hạn chế bệnh hại, tăng cường sinh trưởng phát triển của cây trồng,…phục vụ cho sản xuất nông nghiệp và bảo vệ môi trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hiện trạng phát triển nông nghiệp trên thế giới và Việt Nam

1.1.1 Hiện trạng phát triển nông nghiệp trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới có nhiều phương thức canh tác nông nghiệp nhằm đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, tạo ra sản phẩm có lợi cho sức khỏe con người đồng thời giảm thiểu tác động xấu đối với môi trường, theo

đó nhiều tiêu chuẩn canh tác đang được áp dụng như tiêu chuẩn GAP (Good Agriculture Practice) dựa theo tiêu chuẩn này từng khu vực khác nhau ban hành tiêu chuẩn riêng cho từng khu vực và lãnh thổ (Tống Khiêm, 2009)

Sản xuất nông nghiệp trên Thế giới hiện nay đang phát triển theo xu hướng nông nghiệp hữu cơ vẫn đảm bảo năng suất mà nâng cao chất lượng nông sản cũng như phát triển bền vững và bảo vệ môi trường

Theo hiệp hội nông nghiệp hữu cơ (NNHC) Quốc tế (Internation Federration of Organic Agriculture Movements IFOAM) năm 2007, NNHC là một hệ thống sản xuất bền vững với sức khoẻ của đất, hệ sinh thái và con người

Hệ thống dựa trên những tiến trình sinh thái, sự đa dạng sinh học và những chu

kỳ thích nghi với điều kiện địa phương hơn là việc sử dụng những đầu vào có tác động trái ngược Nông nghiệp hữu cơ kết hợp truyền thống, sự hiện đại và khoa học để chia sẻ với môi trường, thúc đẩy những quan hệ công bằng và tạo chất lượng tốt cho cuộc sống và tất cả những gì liên quan

Nông nghiệp hữu cơ, theo định nghĩa của Liên Hiệp Quốc, là hệ thống canh tác và chăn nuôi tự nhiên, không sử dụng hóa chất làm phân bón và thuốc trừ sâu, giúp giảm thiểu ô nhiễm, bảo đảm sức khỏe cho người và vật nuôi Thực phẩm hữu cơ từ lâu được xem là thị trường nhỏ, và xa xỉ chỉ dành cho giới trung và thượng lưu Tuy nhiên, các nhà khoa học cho rằng sự chuyển dịch phần lớn nền nông nghiệp sang phương thức cách tác hữu cơ vừa

có thể giúp hạn chế tình trạng đói nghèo trên thế giới vừa góp phần cải thiện

môi trường Tại Hội nghị Liên hợp quốc về “Nông nghiệp hữu cơ và An ninh lương thực” vừa diễn ra ở Rome (Italia), các chuyên gia Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp và thực phẩm hữu cơ Đan Mạch nhận định an ninh lương thực cho vùng cận sa mạc Sahara (châu Phi) sẽ được bảo đảm nếu từ nay đến năm 2020, 50% diện tích đất nông nghiệp trong những vùng chuyên canh xuất khẩu ở đây được chuyển sang sản xuất theo công nghệ hữu cơ (Tạp chí Nông thôn mới, 2006).

Theo số liệu (FiBL và IFOAM, 2012) của viện nghiên cứu và truyền thông NNHC (Communication, Research Intitute of Organic Agriculture FiBL) và IFOAM, năm 2010, thị trường nông sản hữu cơ vẫn tăng trưởng doanh thu đạt 54,9 tỷ USD (gấp 3 lần năm 2008) Tính trên toàn doanh thu thì thị trường lớn nhất là Mỹ, Đức, Pháp, còn tính theo đầu người thì lớn nhất là Đan Mạch, Thụy Sĩ và Áo Kể từ năm 1990, thị trường thực phẩm hữu cơ và các sản phẩm khác đã phát triển nhanh chóng, đạt 63 tỷ USD trên toàn thế giới vào năm 2012 (IFOAM, 2013)

Hình 1.1 Tăng trưởng của đất nông nghiệp hữu cơ theo châu lục

2005-2013

(Nguồn: FiBL-IFOAM survey, 2015)

Hình 1.2 Phát triển về số lượng các nước sản xuất nông nghiệp hữu cơ

(Nguồn:FiBL-IFOAM-SOEL survey, 1999-2016)

1.1.2 Hiện trạng phát triển nông nghiệp tại Việt Nam

Kinh tế Việt Nam gồm công nghiệp, nông nghiệp, thương mại, dịch vụ nhưng nông nghiệp là ngành có sức lan tỏa lớn nhất, có tính kết nối rất cao với nhiều ngành kinh tế Nông nghiệp cung cấp đầu vào cho công nghiệp chế biến thực phẩm, chế biến xuất khẩu; đồng thời, sử dụng sản phẩm của các ngành công nghiệp và dịch vụ, như: nhiên liệu, phân bón, hóa chất, máy móc

cơ khí, năng lượng, tín dụng, bảo hiểm Ngoài ra, nông nghiệp còn liên quan mật thiết đến sức mua của dân cư và sự phát triển thị trường trong nước Nông nghiệp Việt Nam đã đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong việc đảm bảo an ninh lương thực, tạo việc làm và thu nhập cho trước hết là khoảng 70% dân cư, là nhân tố quyết định xóa đói giảm nghèo, góp phần phát triển kinh tế đất nước và ổn định chính trị - xã hội của đất nước Gần đây, tình hình kinh tế

có khó khăn do bị tác động của khủng hoảng và suy thoái kinh tế thế giới, nông nghiệp Việt Nam ngày càng rõ vai trò là trụ đỡ của nền kinh tế, tiếp tục

ổn định và có mức tăng trưởng(Nguyễn Duy Vĩnh, 2013)

Bảng 1.1 Giá trị sản xuất nông lâm thủy sản quý 1 năm 2016

Đơn vị: Tỉ đồng

Quý 12015

Ước tính quý 1

2016 2016/2015%Toàn ngành

nông lâm thủy sản

(Nguồn: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2016)

Từ bảng 1.1 ta thấy, giá trị sản xuất toàn ngành nông lâm thủy sản quý

1 năm 2016 có xu hướng giảm so với năm 2015 (giảm 1,32%) Quý 1 năm

2016, ngành nông nghiệp giảm 2,55% so với năm 2015 trong khi ngành lâm nghiệp tăng 6,32% và ngành thủy sản tăng 2,34%

Nông nghiệp nước ta đang đứng trước nhiều thách thức như ô nhiễm môi trường, đất đai bạc màu, suy giảm đa dạng sinh học, ngộ độc thuốc bảo vệ thực vật ở người Xây dựng một nền nông nghiệp sạch, thân thiện với môi trường và sức khỏe con người là một đòi hỏi bức thiết

Theo Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (NN&PTNT) đánh giá: “Việc sản xuất nông nghiệp hữu cơ ở Việt Nam đã biết

từ lâu nhưng lại chỉ mới quan tâm thời gian ngắn gần đây khi việc mất an toàn

vệ sinh thực phẩm trong nông sản đến mức báo động Do đó, nâng cao chất lượng nông sản nhằm bảo đảm an toàn vệ sinh nông sản và thân thiện môi trường chính là mục tiêu hướng tới trong tương lai” Một số liệu nghiên cứu của bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn phối hợp Hội Nông dân Việt

Nam cho thấy, tỷ lệ nông dân Việt Nam có diện tích ứng dụng hữu cơ trong sản xuất năm 2015 vừa qua gần như đứng yên so với con số năm 2010 đạt 2% tổng diện tích đất nông nghiệp cả nước (Hải Thư, 2016).

1.2 Tác động của sản xuất nông nghiệp đến môi trường

1.2.1 Sử dụng phân bóntrong nông nghiệp

Việt Nam có khoảng 26 triệu ha đất nông nghiệp với nhu cầu sử dụng phân bón trung bình mỗi năm khoảng 10 triệu tấn, trong đó gần 20% phân đạm.Để nâng cao năng suất cây trồng, nông dân đã tăng lượng phân bón gấp 2-3 lần, thậm chí là 5-7 lần so với nhu cầu, dẫn đến dư thừa lượng nitrat trong rau củ quả Trong khi đó, kết quả điều tra của Tổ chức Lương thực và nông nghiệp Liên Hợp Quốc cho thấy, cây trồng chỉ sử dụng khoảng 40-50% số phân bón, còn lại bị rửa trôi hoặc tồn tại trên các bộ phận của cây (Phạm Hương, 2016)

Theo ước tính năm 2007 của bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn,

có khoảng 60- 65% lượng phân đạm không được cây trồng hấp thụ (tương ứng với 1,77 triệu tấn ure, 55-60% lượng lân tương đương với 2,07 triệu tấn supe photsphat và 55- 60%lượng kali tương đương với 344 nghìn tấn kali clorua được bón vào đất nhưng chưa được cây trồng sử dụng

Ngoài ra phân bón còn có những tác động nhất định tới môi trường:

- Ô nhiễm môi trường đất từ phân bón hóa học

Nitrat ( NO3-) là yếu tố cần thiết cho sinh trưởng và phát triển của nhiều loài cây trông, đồng thời cũng được xem là mối đe dọa cho sức khỏe con người và tính trong sạch của các nguồn nước tự nhiên Tính trung bình, khi bón phân đạm vào đất, thực vật hấp thụ khoảng 50 – 60%, số còn lại sẽ phân tán vào các nguồn khác (Phạm Hương, 2016)

Bảng 1.2 Liều lượng bón phân đạm và sự tích lũy NO 3

-trong nước ngầm, nước mặt

(Nguồn: Lê Văn Khoa, 2008)

Thực ra NO3- không độc, nhưng khi nó bị khử thành nitrit (NO2-) thì nó trở nên rất độc

- Phú dưỡng và sự suy giảm chất lượng các nguồn nước

Phú dưỡng là sự gia tăng hàm lượng nito và photpho trong nguồn nước nhập vào các thủy vực, gây sự tăng trưởng của các loai thực vật bậc thấp (rong, tảo…) Nó tạo ra những biến đổi lớn trong hệ sinh thái nước Do đó, chất lượng nước bị suy giảm và ô nhiễm (Vũ Năng Dũng, 2009)

1.2.2 Tác động của hóa chất bảo vệ thực vật đến môi trường

Hiện nay có hơn 1000 hợp nhất các chế tạo và sử dụng làm hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) Các loại thông thường nhất là: Thuốc trừ sâu (insecticides); thuốc trừ cỏ(herbicides) và thuốc diệt nấm(fungicides) (Vũ Năng Dũng, 2009)

Bảng 1.3 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật ở Việt Nam và ước

tính số lượng vỏ bao bì thải

Năm Khối lượng (tấn) Khối lượng vỏ, bao bì thải (tấn)

Bảng 1.4 Dư lượng HCBVTV trong một số loại rau

Loại rau Tổng số

mẫu

Tỷ lệ mẫuKhông có dư

lượng

Có dư lượng

Có dư lượng

>TCCP

200120032006

27926410236

41,254,149,036,1

54,541,738,255,6Rau muống 2000

200120032006

27926415336

67,062,554,263,9

29,431,437,333,3

20032006

13210236

29,628,455,5

51,541,130,6

Nguồn: Trung tâm kiểm dịch thực vật phía Bắc, 2007.

Việc sử dụng HCBVTV không chỉ có tác động đến cả hệ sinh thái – nơi con người sinh sống, mà còn dẫn đến ô nhiễm đất, nước Từ môi trường đất, nước, nông sản, HCBVTV sẽ xâm nhập vào cơ thể con người và tích tụ lâu dài, gây ra các bệnh ung thư, tổn thương về di truyền

1.3 Tổng quan về đất chua mặn (đất phèn)

Nhóm đất phèn, tên theo phân loại của FAO là Thionic Fluvisols là tên

gọi dùng để chỉ nhóm đất có chứa các vật liệu mà kết quả của các tiến trình sinh hoá xảy ra là axit sulfuric được tạo thành hoặc sẽ sinh ra với một số lượng có ảnh hưởng lâu dài đến những đặc tính chủ yếu của đất (Pons, 1973)

Đất phèn thường có màu đen hoặc nâu ở tầng đất, mặt.Đất thường bị glay mạnh ở tầng C, có mùi đặc trưng của lưu huỳnh và H2S

Theo ước tính hiện nay trên thế giới có khoảng 24 triệu ha đất phèn Loại đất này xuất hiện ở tất cả các lục địa, từ các vùng cực tới vùng nhiệt đới

và từ vùng ven biển đến các vùng nằm sâu trong lục địa Đất phèn chủ yếu xuất hiện ở các vùng ven biển nhiệt đới hay cận nhiệt đới, thuộc các nước Nhật Bản, Triều Tiên, Ấn Độ, Thái Lan, Brunei, Việt Nam và một số đảo của Indonesia,… nhìn chung hầu hết các nước Đông Nam Á có bờ biển đều có đất phèn

Năm 1956, Long Tử Đồng, Hoàng Kế Mậu và nhiều tác giả nổi tiếng như Bers (1962), Dons, Bremen (1973), Rickard, Moormann, Fritlan đã đi sâu nghiên cứu đất phèn ở nhiều nước trên thế giới và đã có nhiều kết luận về nguồn gốc, quá trình hình thành và đặc tính của đất phèn ở những vùng nghiên cứu

Về tên gọi của đất phèn hay đất chua mặn, năm 1886, Van Bemmelen gọi là “Catclays” muốn chỉ đất chua có tầng sunphat sắt hay sunphat nhôm Năm 1956, Edelman và Van Staveren gọi là loại đất này là “Mudclays” với hàm ý chỉ tầng đất chứa nhiều sét bùn, chua, có chất nhờn Ngoài ra còn có các tên khác nhau như Jarosite muốn chỉ tầng đất chứa phèn màu vàng trấu hay vàng rơm của phức hợp KFe3(SO4)2(OH)6 và các tên Thiosol, Acid peat soil,…Đến nay các cuộc hội thảo Quốc tế lớn về đất phèn đã được tổ chức và đều lấy tên chung là “Acid sulphate soil”

Theo D Dent (1986) trong đất phèn ngập nước với sự tham gia của VSV kị khí sẽ diễn ra quá trình khử nitrate, oxit mangan, sắt (II) oxit và sulfat Trong đất phèn, nhộm và sắt sẽ tập trung rất nhiều ở pH nhỏ hơn 3,5

pH càng thấp lượng nhôm hòa tan càng nhiều

Năm 1996 các nhà khoa học đất thuộc hội Khoa Học Đất Việt Nam, đã xác định đất phèn có diện tích 1.863,128 ha, chiếm tỷ lệ 6,49% tổng diện tích

cả nước

Tại Việt Nam, diện tích đất phèn vào khoảng 1.863,128 ha, bao gồm đất phèn tiềm tàng là 652,244 ha và đất phèn hoạt động với 1.210,884 ha (Chiểu và ctv, 1996); trong đó vùng hạ lưu châu thổ sông Mekong chiếm đến khoảng 1,5 triệu ha (Sterk, 1992), phần lớn tập trung trong vùng Đồng Tháp Mười, Tứ giác Long Xuyên, Bán đảo Cà Mau và một phần của Tây Nam Sông Hậu.Phía Bắc đất phèn tập trung chủ yếu ở các tỉnh như Thái Bình, Hải Phòng, Quảng Ninh, Nam Hà, Ninh Bình với diện tích 79,209 ha Theo

Lê Văn Thượng (1975) đất chua mặn được hình thành trong quá trình bồi đắp phù sa một số vùng mặn đã bị ngăn cách với biển Trên những vùng này đã phát sinh ra những quá trình biến đổi khác nhau của đất, làm cho đất hóa chua.Đồng thời các xác thực vật chứa nhiều lưu huỳnh khi phân hủy đã giải phóng cho đất một khối lượng lưu huỳnh rất lớn góp phần tạo nên một loại đất mới có tên là “Đất chua mặn”

Lê Huy Bá (1981, 1982) đã cho rằng, đất phèn Nam Bộ cũng được hình thành từ tầng sú vẹt và nước biển Nếu bị ngập thường xuyên thì đất ở trạng thái khử, không có oxy, không có hệ VSV hảo khí và không có CaCO3 khi đó đất phèn tiềm tàng được hình thành Nếu đất bị oxi xâm nhập (do đào kênh, lên liếp, hạ mức thủy cấp, cạn nước…) thì quá trình oxy hóa sẽ diễn ra mạnh, pyrit sẽ bị oxi hóa để tạo thành axit sunfuric và Jarosite lúc này sẽ xuất hiện đất phèn hoạt động

Năm 1982, các nhà khoa học thuộc Viện Quy Hoạch và Thiết Kế Nông Nghiệp đã tiến hành nghiên cứu đất đai huyện Kiến Thụy Hải Phòng Trong tổng số 7.025,25 ha đất phèn của huyện, đất phèn mặn nhiều chiếm tỷ lệ 11,3%, phèn mặn trung bình chiếm 12,4% và phèn mặn ít chiếm 30,6% Nếu phân theo mức độ phèn thì phèn nhiều chiếm 31,6%, phèn trung bình chiếm 22,2%

Lê Văn Thượng (1975) cho rằng: đất chua mặn có thành phần cơ giới nặng, chứa nhiều ion Na+ nên tính trương co lớn Độ xốp thấp, đất có phản

ứng chua, pHKCl dưới 5.Hàm lượng nhôm và sắt cao Độ no bazơ thấp 45%), chất hữu cơ giàu, nghèo lân và canxi.

(20-Năm 1980 một số nhà khoa học đất thuộc Viện Quy Hoạch và Thiết Kế Nông Nghiệp đã cho rằng đất phèn thường chua, mặn, giàu mùn, mức độ phân giải chất hữu cơ yếu và đạm tổng số giàu Rất nghèo lân, đặc biệt là lân

dễ tiêu, kali trung bình, canxi, magie trao đổi trong đất nghèo đến rất nghèo.Đất thường có thành phần cơ giới từ thịt nặng đến sét, dẻo dính khi ướt, rất cứng khi khô

Trong quá trình sản xuất nông nghiệp nói chung, cây trồng nói riêng, đất phèn thường ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất trong đất, làm cho cây trồng hấp thụ dinh dưỡng kém, do vậy khi bón phân vào khu vực có đất phèn, lượng phân bón sẽ mất đi nhiều tác dụng quá trình ion hóa của Al3+ và Fe2+ tăng lên, độ pH sẽ hạ xuống thấp

Đất nhiễm phèn cũng nhận biết khá dễ thông qua lớp váng trên bề mặt đất, bao gồm màu vàng và màu đỏ gạch, đây là hiện tượng phân hóa có độc tố của Al3+ và Fe2+, là các chất độc ảnh hưởng đến các loài vi sinh vật trong đất

vì đây là các kim loại có mối quan hệ đến chức năng điều hòa áp suất của cơ thể sinh vật Sự có mặt của chúng sẽ làm ức chế sự hấp thu tích cực của ion natri (Na+) và clorua (Cl-) của các tế bào long hút… làm tăng quá trình mất thụ động các chất điện ly từ cơ thể cây trồng, do đó cây trồng không lấy được nước, dưỡng chất qua hệ rễ, các tế bào long hút bị hư hại, hệ rễ không phát triển mà thối dần, không thực hiện được quá trình trao đổi chất trong đất, bắt buộc chúng phải thực hiện quá trình trên theo thân và lá, nhưng chỉ duy trì được ở một thời gian nhất định trước khi chúng có thể chết hẳn nếu không có biện pháp tác động của con người nhằm cải tạo lại đất trồng tại khu vực đó

1.4 Tổng quan về VSV nội sinh và chế phẩm sinh học

1.4.1 Tổng quan về VSV nội sinh

Nội sinh (endophyte) theo tiếng Hy Lạp “endon” có nghĩa là bên trong

và “phyte” có nghĩa là thực vật và thuật ngữ này thường được áp dụng cho nấm bao gồm nấm cộng sinh (mycorrhizal fungi) (Clay K., 1988) Theo Wilson D., (1995), định nghĩa nội sinh cho đến nay được áp dụng cho cả nấm

và vi khuẩn có tất cả hay một phần của chu trình sống xâm nhập vào mô thực vật sống và không gây nhiễm cũng như gây triệu chứng bệnh rõ ràng cho mô thực vật

Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời sống bên trong cây trồng (Quispel, 1992) Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật.Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực vật và đất, nơi lắng đọng các chất hữu cơ và là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khác nhau cho các VSV đất Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thu các chất dinh dưỡng, độ ẩm, oxy từ vùng rễ và các chất do rễ tiết ra Đặc tính quan trọng của các dịch rễ là có tỉ lệ C/N cao nên có thể đẩy mạnh

sự phong phú của các vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ (Döbereiner, 1974) Ngược lại, VSV vùng rễ có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây

do sự tác động của chúng đến giá trị của các chất dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Harari et al., 1988)

Theo Zinniel et al., (2002), vi khuẩn nội sinh được tìm thấy trong rất nhiều loại cây trồng ở Hoa Kỳ, vi khuẩn nội sinh là các vi khuẩn từ vùng rễ xâm nhập vào rễ, thân và lá để sống bên trong các mô thực vật mà không gây hại hay cạnh tranh dinh dưỡng với cây chủ; trái lại chúng xúc tiến sự sinh trưởng của cây chủ Vi khuẩn nội sinh còn thúc đẩy các quá trình chuyển hóa trong cây, sự phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ (Harari et al., 1988) Vi khuẩn nội sinh giúp tăng cường sự sinh trưởng của cây bằng cách tổng hợp kích thích tố auxin (IAA) (Barbieri et al., 1986), tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng nhiều nguồn bệnh khác nhau của cây (Fashey et al., 1991; Bandara et al., 2006), giúp cố định đạm

sinh học, giảm tính mẫm cảm với mầm bệnh và sự thay đổi của thời tiết gây tổn hại cho cây, chúng có thể giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm (Rosenblueth

và Martínez-Romero, 2006), làm tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh của cây (Fahey et al., 1991), giúp cố định đạm sinh học, giảm tính mẫn cảm với mầm bệnh và sự thay đổi của thời tiết gây tổn hại cho cây (Xu et al., 1998)

1.4.2 Tổng quan về chế phẩm sinh học

Từ chế phẩm sinh học (Probiotics) có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp bao gồm hai từ pro có nghĩa là “Thân thiện” và biosis có nghĩa là “sự sống” Thay cho việc tiêu diệt các bào tử vi khuẩn, chế phẩm sinh học được sản xuất với mục đích kích thích sự gia tăng các loài vi khuẩn có lợi trong môi trường Chế phẩm sinh học lần đầu tiên được giáo sư Fuller R(1989) định nghĩa như sau:

“Một loại thức ăn có nguồn gốc từ những VSV sống và có ảnh hưởng có lợi lên vật chủ qua việc làm cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh trong đường ruột của vật chủ” (Công nghệ xanh, 2014)

Chế phẩm sinh học hiện nay được ứng dụng nhiều trong chăn nuôi, thủy sản, công nghiệp…, ứng dụng trong nông nghiệp rất được quan tâm ở Việt Nam CPSH dùng trong nông nghiệp có những ưu điểm nổi trội so với các chế phẩm hóa chất (Minh Long, 2012)

Các chế phẩm sinh học dùng trong nông nghiệp có thể được chia làm bốn nhóm như sau:

- Nhóm chế phẩm sinh học ứng dụng cho việc phòng trừ dịch hại trên

cây trồng

Thực chất đây là thuốc bảo vệ thực vật nguồn gốc sinh học có thể tiêu diệt hoặc phòng trừ dịch hại.Dịch hại là các sinh vật, VSV, các loại sâu hại, các loài gậm nhấm có khả năng gây hại cho cây trồng và lương thực

- Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học,

phân bón vi sinh

Phân vi sinh là loại phân có chứa hàm lượng VSV có ích cao (≥ 1x108CFU/g), thường không có hàm lượng chất dinh dưỡng kèm theo Phân

vi sinh được sản xuất và bón vào đất nhằm tăng lượng VSV có ích cho cây trồng, đặc biệt đối với VSV cố định đạm

Phân hữu cơ sinh học là sản phẩm phân bón được tạo qua quá trình lên men VSV các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc khác nhau và chuyển hóa thành mùn Không có yêu cầu chủng vi sinh phải đạt là bao nhiêu

Phân hữu cơ vi sinh là loại phân bón được sản xuất từ nguyên liệu hữu

cơ, có chứa ít nhất một chủng VSV có ích phù hợp với hàm lượng cao (≥ 1x106CFU/g)

- Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải nông

nghiệp

Là các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học được đưa vào đất để cải tạo lý hóa tính của đất (kết cấu đất, độ ẩm, hữu cơ, khả năng giữ nước, pH…), hoặc giải phóng đất khỏi những yếu tố bất lợi khác (kim loại nặng, VSV, hóa chất độc hại …) làm cho đất trở nên tốt hơn để sử dụng làm đất trồng cây

- Nhóm điều hòa sinh trưởng cây trồng (hooc mon tăng trưởng).

Ở Việt Nam, hooc mon tăng trưởng được xếp vào danh mục thuốc bảo

Các chất có tác dụng kìm hãm, ức chế sinh trưởng và phát triển của cây

như làm lùn, làm chín, làm rụng lá (Minh Long, 2012)

1.5 Tình hình nghiên cứu sử dụng VSV nội sinh và chế phẩm sinh học trên Thế giới và Việt Nam

1.5.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng VSV nội sinh và chế phẩm sinh học trên Thế giới

Có rất nhiều các công trình nghiên cứu sử dụng các tác nhân phòng trừ sinh học hệ rễ cho thấy rằng 5 trong số 6 vi khuẩn hệ rễ cảm ứng kháng hệ thống ở dưa chuột có khả năng tạo dòng rễ cả trong và ngoài Vi khuẩn nội sinh có hoạt tính đối kháng chống lại một số mầm bệnh thực vật như

Clavibacter michiganensis subsp sepedonicum, tác nhân gây bệnh thối vòng

trên khoai tây (Van Buren AM et al., 1993) và P fluorescens 89B-27 và

Serratia marcescens 90-166 cảm ứng kháng với P syringae pv lachrymans, Fusarium oxyporum f.sp cucumerium và Colletrotrichum orbiculare (Liu L

et al., 1995) Ứng dụng vi khuẩn nội sinh vào cây bông bằng tiêm cành làm

giảm thối rễ gây ra bởi Rhizoctonia solani và héo mạch gây ra bởi F

oxysporum f.sp vasinfectum (Chen C et al., 1994) Xử lý hạt cà chua với

chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus pumilus SE4 cản trở đường vào của nấm bệnh gây héo mạch F oxysporum f.sp radicislycospersici và sự sinh trưởng của khuẩn ty chỉ hạn chế ở biểu bì và bao rễ ngoài Ứng dụng chủng P

fluorescens 63-28 hạn chế sự sinh trưởng của Pythium ultimum ở đậu và F oxysporum f.sp.radici-lycopersici ở cà chua Chủng Pseudomonas fluorescent

(CCA90) có thể tạo dòng cả bên trong và bên ngoài mô rễ và cành Và các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây sồi có hoạt tính sinh học chống lại

mầm bệnh gây héo sồi Ceratocystis fagacearum (Brooks DS et al., 1994).

Hiện nay, các nước trên thế giới đang quan tâm đến việc sử dụng phân hữu cơ như phân chuồng, phân ủ, phân xanh

Ấn Độ hàng năm sản xuất 286 triệu tấn phân ủ compost từ chất thải nông thôn và thành phố, ước tính thu được 3,5- 4,0 triệu tấn NPK (Lê Văn Tri, 2001) Sử dụng phân VSV cho lúa, cao lương, bông làm tăng năng suất trung bình 11,4; 18,2 và 6,8triệu tấn/ha mang lại lợi nhuận khoảng 1,105; 1,149; 3,43 rupi/ha (Lê Văn Tri, 2004)

Hiện nay, Trung Quốc, Ấn Độ là hai quốc gia đang đẩy mạnh chương trình phát triển ứng dụng công nghệ sản xuất lân vi sinh ở quy mô lớn với diện tích sử dụng hàng chục ha Trung Quốc sử dụng phân hữu cơ vi sinh từ nguồn rơm rạ, phân xanh, khô dầu ước tính tương đương 65 kg (N + P2O5 + K2O) (Lê Văn Tri, 2001).

Các kết quả nghiên cứu từ Canada, Ấn độ, Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản cho thấy sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh có thể cung cấp cho cây trồng 30-60 kg/ha/năm hoặc thay quặng phốt phát ngoài ra thông qua các hoạt động sống của VSV cây trồng được nâng cao khả năng trao đổi chất khả năng chống chịu bệnh và qua đó góp phần nâng cao chất lượng nông sản (Nguyễn Thị Lẫm, 1999) Chế phẩm VSV có thể sử dụng như phân bón hoặc phối trộn với phân hữu cơ tạo thành phân bón hữu cơ VSV

Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu và sản xuất ra chế phẩm sinh học, hữu cơ chức năng được đẩy mạnh để dần thay thế phân bón hóa học

và thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc hóa học đã được hầu hết các nước quan tâm và khuyến khích vì nó có nhiều ưu điểm vượt trội nhưng không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người và cây trồng, không gây ô nhiễm môi trường, giúp cân bằng hệ sinh thái (VSV, dinh dưỡng…) Sản phẩm của nông nghiệp hữu cơ thường có giá trị thương mại cao, thậm chí cao gấp hàng chục lần so với các sản phẩm canh tác thông thường Nhiều nước đã nghiên cứu thành công các chế phẩm sinh học và phân bón hữu cơ vi sinh đa chức năng

từ VSV nội sinh và được lưu hành trên thị trường Ví dụ như dịch phân bón dinh dưỡng Sumagrow của Mỹ với tập hợp nhiều loại VSV hữu ích ở mật độ cao không những có khả năng làm tăng năng suất cây trồng từ 20-200%, thay thế được từ 50-100% lượng phân bón sử dụng mà còn làm giảm tỷ lệ sâu bệnh, cung cấp dinh dưỡng và góp phần cải tạo đất (Sumagrow org., 2014) Chế phẩm dinh dưỡng Kurojiru của Nhật Bản có chứa các VSV có lợi giúp cải tạo đất, tăng độ phì cho đất, làm rễ cây phát triển tốt, hạn chế tối đa dịch

bệnh và việc sử dụng phân bón hóa học và thuốc trừ sâu: tạo các sản phẩm hữu cơ, đặc biệt có thể giúp tăng năng suất cây trồng lên gấp 2 lần và an toàn tuyệt đối cho người sử dụng…(Giải pháp hiệu quả cho nhà nông, 2014).

1.5.2.Tình hình nghiên cứu sử dụng VSV nội sinh và chế phẩm sinh học Việt Nam

Gần đây, VSV nội sinh và vai trò của chúng đã bắt đầu được các nhà khoa học trong nước quan tâm nghiên cứu Nguyễn Thị Thu Hà và cộng sự (2009) đã phân lập được 7 dòng vi khuẩn nội sinh trong một số loại cỏ chăn nuôi có đặc tính cố định đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA cao Vi khuẩn nội sinh trong nhóm cây khóm trên đất phèn và cây Xuyến chi đã được phân lập và nhận diện (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi, 2009, Cao Ngọc Điệp

và Nguyễn Thành Dũng 2010; Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2011) Khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sinh tổng hợp IAA của vị

khuẩn vi khuẩn Azospirillium lipoferum cũng được đánh giá bởi Lăng Ngọc

Dậu và cộng sự (2007) Tuy nhiên, các nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở mức phân lập, nhận diện và đánh giá sơ bộ vai trò của một số loại VSV nội sinh trên cây trồng

Nguyễn Thị Minh và cộng sự (2005, 2014) đã phân lập được một số

loài nấm rễ nội cộng sinh Arbuscular Mycorrhizac dùng để xử lý cho cây

trồng hay sản xuất vật liệu sinh học nhằm tái tạo thảm thực vật phủ xanh Đặc tính đa mang của vi khuẩn nốt sần Rhizobia trên cây họ đậu và khả năng hiệp đồng của chúng giúp kích thích sinh trưởng của cây đã được chứng minh bởi Nguyễn Thị Minh và cộng sự (2009, 2010) Mặc dù một số loại VSV nội sinh trên một số thực vật đã được phân lập nhưng chưa được đưa vào ứng dụng trong thực tiễn sản xuất và chưa đáp ứng đủ nhu cầu phục vụ cho phát triển nông nghiệp hữu cơ bền vững về bảo vệ mội trường

Phạm Quang Thu, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Xuân Hưng, Nguyễn Văn Nam (Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) phân lập và đánh giá hiệu

lực ức chế nấm gây bệnh của các chủng VSV nội sinh từ các dòng Keo tai tượng Phân lập được 8 chủng vi khuẩn nội sinh và 13 chủng vi nấm nội sinh

từ 35 dòng Keo tai tượng khảo nghiệm tại Thừa Thiên Huế, trong đó có 15 chủng gồm vi khuẩn và nấm nội sinh trên tổng số 21 chủng có hoạt tính ức

chế nấm Ceratocystis sp Ở mức độ mạnh và rất mạnh và chỉ có 8 trên tổng số

21 chủng ức chế nấm Corticium salmonicolor ở mức độ mạnh và rất mạnh.

Phạm Quang Thu (2002) sử dụng VSV nội sinh thực vật có khả năng

ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh cây rừng đã được nghiên cứu ử Việt Nam từ năm 2002, tác giả đã đi sâu vào nghiên cứu khả năng tương tác của các VSV có khả năng ức chế sinh vật gây bệnh với các loài sinh vật đặc thù khác nhau như VSV phân giải lân, VSV kích thích sinh trưởng, VSV cố định đạm hội sinh và cộng sinh, VSV đối kháng với nấm gây bệnh để tạo ra chế phẩm hỗn hợp được gọi là “phân vi sinh đa chức năng” Phân vi sinh đa chức năng này đã được nghiên cứu và sản xuất thử cho từng đối tượng cây trồng như: cây Bông, cây Đậu, cây Cà chua, cây Điều và một số cây khác như cây keo, cây Thông nhựa, Thông mã vĩ

Nguyễn Thị Thu Hà và cộng sự (2008) đã phân lập được 71 dòng vi khuẩn khác nhau trong một số loại cỏ chăn nuôi Cao Ngọc Điệp và Nguyễn

Ái Chi (2009), Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thành Dũng (2010) phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây khóm trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long

An và huyện Vĩnh Thuận, tỉnh Kiên Giang Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp đã phân lập và nhận diện vi khuẩn nội sinh trong cây cúc xuyến

chi (Twedelia Trilobata (L.) Hitche.), có 27/37 dòng được xác định là vi

khuẩn nội sinh (6 dòng phân lập trên môi trường Nfb, 10 dòng phân lập trên môi trường RMR, 11 dòng phân lập trên môi trường LGI) bằng kỹ thuật PCR 16s-rDNA

Nguyễn Thị Huỳnh Như và cộng sự (Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ) đã phân lập 43 dòng vi khuẩn

trên hai loại môi trường NFb và Baz có khả năng tổng hợp IAA và cố định đạm trên cây chuối

Bên cạnh đó, nhiều đề tài nghiên cứu xử lý phế thải chăn nuôi và sản xuất phân hữu cơ và hữu cơ vi sinh bằng chế phẩm sinh học và VSV nội sinh

Chính vì vậy, các loại phân hữu cơ vi sinh và chế phẩm vi sinh hiện đang lưu hành trên thị trường chưa thực sự phát huy được hiệu quả và chưa đưa vào ứng dụng đại trà trong sản xuất nông nghiệp

- Chế phẩm Xử lý phụ phế phẩm nông nghiệp

Chế phẩm sinh học nấm đối kháng Trichoderma ngoài tác dụng sản

xuất phân bón hũu cơ sinh học, hay sử dụng như một loại thuốc BVTV thì còn có tác dụng để xử lý ủ phân chuồng, phân gia súc, vỏ cà phê, chất thải hũu cơ như rơm, rạ, rác thải hữu cơ rất hiệu quả Chế phẩm sinh học BIMA

(có chứa Trichoderma sp.) của Trung Tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí

Minh, chế phẩm Vi-ĐK của Công ty thuốc sát trùng Việt Nam đang được nông dân TP (Trần Minh Hiền và cộng sự, 2013)

Các chế phẩm sinh học của Viện Sinh học nhiêt đới như BIO-F, chế phẩm sinh học chứa các VSV do nhóm phân lập và tuyển chọn: xạ khuẩn

Streptomyces sp., nấm mốc Trichoderma sp và vi khuẩn Bacillus sp…Những

VSV trên trong chế phẩm sinh học có tác dụng phân huỷ nhanh các hợp chất hữu cơ trong phân lợn, gà và bò(protein và cellulose), gây mất mùi hôi Trước

đó, chế phẩm sinh học BIO-F đã được sử dụng để sản xuất thành công phân bón hữu cơ vi sinh từ bùn đáy ao, vỏ cà phê và xử lý rác thải sinh hoạt (Trần Minh Hiền và cộng sự, 2013)

- Chế phẩm sinh học cải tạo đất

Viện Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm sinh học giữ ẩm cho đất có tên

là Lipomycin-M Thành phần chính là của Lipomycin-M là chủng nấm men

Lipomyces PT7.1 có khả năng tạo màng nhầy trong điều kiện đất khô hạn,

giúp giảm thoát nước, duy trì độ ẩm cho đất trong điều kiện địa hình không có nước tưới thời gian dài, góp phần nâng cao tỷ lệ sống của cây trồng, hỗ trợ tốt cho việc phủ xanh đất trống đồi trọc (Trần Minh Hiền và cộng sự, 2013).

- Chế phẩm sinh học ứng dụng phòng trừ sâu bệnh

VINEEM 1500 EC là sản phẩm của Công ty thuốc sát trùng Miền Nam, được chiết xuất từ nhân hạt Neem (Azadirachta indica A Juss) có chứa hoạt chất Azadirachtin, có hiệu lực phòng trừ nhiều lọai sâu hại trên cây trồng như lúa, rau màu, cây công nghiệp, cây ăn trái, hoa kiểng Bằng kỹ thuật công nghệ sinh học, các nhà khoa học Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu và sản xuất ra 7 loại chế phẩm thuộc nhóm thuốc trừ sâu sinh học

như chế phẩm vi sinh BT (Bacciluss Thuringiensis var.) có nguồn gốc vi

khuẩn, phổ diệt sâu rộng và hữu hiệu

Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng (Đại học Cần Thơ) cũng đã nghiên cứu và đưa ra 02 chế phẩm sinh học Biobac và Biosar có khả năng phòng trừ 02 bệnh thường gặp trên lúa là đốm vằn và cháy lá (Trần Minh Hiền và cộng sự, 2013)

Chính phủ Việt Nam đã sớm nhận thấy được vai trò quan trọng này, vì vậy từ năm 1994, Thủ tướng Chính phủ đã ra Chỉ thị số: 644/TTg ngày 5 tháng 11 năm 1994 chỉ đạo việc quản lý: sản xuất, kinh doanh và chất lượng phân bón vi sinh(Trần Minh Hiền và cộng sự, 2013)

1.6 Cơ sở khoa học của việc sử dụng VSV đối với sản xuất chế phẩm sinh học

1.6.1 Khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ của VSV

- Xenlulozo (glucan) là hợp chất cao phân tử được trùng hợp (polyme hóa) từ các gốc β - D - glucozơ bằng liên kết β - 1,4 - glucozơ nhờ khả năng

tự dưỡng dưới ánh sáng mặt trời của giới thực vật

Hệ VSV phân hủy tàn dư thực vật chủ yếu là xenlulozơ khá phong phú gồm có vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc Quá trình thủy phân xenlluloza theo

trình tự như sau:

- Hemixenlulozo (xylan) là một phức hệ gồm Endo - 1,4 - β - D - mannaza và 1,4 - β - D - xylozidaza Enzym mannaza thủy phân xylan thành các oligosaccarit hòa tan trong nước và enzym xylozidaza sẽ tiếp tục thủy phân Sản phẩm cuối cùng là xylozo và mannozo (Lương Đức Phẩm, 2011)

- Tinh bột là chất dinh dưỡng chính dự trữ ở thực vật, có nhiều ở trong các loại hạt ngũ cốc và củ (khoai lang, khoai tây, sắn ) Tinh bột gồm 2 glucan: amylozo (15-17%) - mạch dài, không phân nhánh và amylopectin phân nhánh Chúng được trùng hợp từ các monomer là D - glucozo với các mối liên kết α - 1,4 và α - 1,6 -glucozit Tinh bột dưới tác dụng của enzym amylaza sẽ bị thủy phân thành dextrin, đường maltozo và glucozo (Lương Đức Phẩm, 2011)

- Pectin là hợp chất polymer dạng keo, thuộc loại polysaccarit dị hình được cấu tạo từ các gốc axit galacturonic với nhau bằng liên kết α - 1,4 - glucozit và một số gốc khác Trong thành phần có axit pectinic, axit pectic và protopectin.Pectin có mặt trong tất cả các mô thực vật bậc cao (khoảng 5%)

là thành phần cơ bản của thực vật.Cùng với lignin và xenlulozơ, pectin tham gia hình thành bộ khung của thực vật, điều chỉnh độ ẩm và trạng thái của tế bào thực vật.Pectin bị phân giải bởi enzym pecticnaza Enzym này được sản sinh nhờ một số loài vi khuẩn và nhiều loài nấm mốc (Lương Đức Phẩm, 2011)

- Protein là hợp chất được cấu tạo từ các axit amin với mối liên kết peptit Quá trình phân hủy các chất protein dưới tác dụng của VSV còn gọi là quá trình thối rữa hoặc quá trình amôn hóa Các VSV gây thối rữa bao gồm vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn đều có khả năng tiết ra môi trường enzym proteaza ngoại bào Quá trình phân hủy các chất protein xảy ra như sau:

Protein  Polypeptit  Oligopeptit Axit amin NH3.

Quá trình này được tiến hành nhờ enzym phân cắt đại phân tử protein được gọi là proteaza hay proteinaza Các nhóm VSV có khả năng tiết enzym proteaza gồm có vi khuẩn hiếu khí Bacillus, Pseudomonas, Proteus, nhóm nấm mốc Aspergillus, Penicillium, Tricoderma (Lương Đức Phẩm, 2011)

1.6.2 Khả năng phân giải và chuyển hóa lân của VSV

Photpho là nguyên tố quan trọng thứ 2 trong 3 nguyên tố dinh dưỡng

đa lượng chính của cây trồng (N, P,K), là thành phần của axit nucleic, phytin, photpholipit Photpho cáo tác động trực tiếp đến quá trình tích lũy đường, protein, lipid, vitamin… của cây trồng Thiếu photpho, sự hình thành tế bào mới bị chậm lại, cây còi cọc ít phân cành, đẻ nhánh, lá có màu xanh lục bẩn, không sáng Thiếu photpho, năng suất cây trồng bị giảm sút nghiêm trọng, ngay cả khi được cung cấp đủ nitơ (Havlin et al, 1999)

Sự xuất hiện, tồn tại và chuyển hóa của photpho trong tự nhiên diễn ra theo một quy trình khép kín gọi là vòng tuần hoàn của photpho thông qua 4 quá trình (khoáng hóa, cố định sinh học, cố định hóa học và phân giải) Theo Murphy và cộng sự (2013), cây trồng chỉ có thể hấp thu 5 - 25% lượng lân được bón, số còn lại bị đất giữ lại dưới dạng hấp phụ hoặc cố định, trong đó hấp phụ thông qua trao đổi ion sẽ trở thành dạng tan, còn cố định thì không thể chuyển đổi thông qua ion trao đổi

VSV phân giải lân, VSV chuyển hóa lân (Phosphate Solubilizing

Microorganisms – PSM) là các VSV có khả năng chuyển hóa hợp chất

photpho khó tan tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng Các VSV phân

giải hợp chất photpho khó tan được biết đến nay là các loài: Pseudomonas,

Micrococus, Bacillus, Flavobacterium, Penicillium, Sclerotium, Aspergillus

(Gaur, A C., 1992; Richardson, 2001)

1.6.3 Khả năng cố định Nito của vi sinh vật

Sự cố định đạm sinh học đóng góp 180.106 tấn N/năm trên toàn cầu, trong đó có các hiệp hội cộng sinh giữa vi sinh vật và thực vật chịu trách nhiệm sản xuất khoảng 80% và phần còn lại đến từ các hệ thống vi sinh vật sống tự do hoặc kết hợp (Graham, 1988 trích dẫn của Saharan and Nehra, 2011) Có thể chia vi khuẩn cố định đạm thành 2 nhóm chính: các vi khuẩn

cộng sinh bắt buộc ở cây họ Đậu (như các Rhizobium) và cây không thuộc họ Đậu (như Frankia); các vi khuẩn không cộng sinh (sống tự do, liên hiệp với cây hoặc nội sinh), gồm có Vi khuẩn lam, Azospirillum, Azotobacter,

Acetobacter diazotrophicus, Azoarcus, v.v… Cố định đạm được tăng cường

thông qua gia tăng cả về số lượng và trọng lượng khô của nốt rễ, tăng hoạt động của nitrogenase đối với các quan hệ cộng sinh ở cây họ Đậu hoặc thông qua sự tăng hàm lượng các chất dinh dưỡng khác trong đất hoặc sự mở rộng

hệ thống rễ khi chủng phối hợp các diaztrophe với các vi khuẩn có khả năng hòa tan các khoáng dinh dưỡng hay các vi khuẩn tổng hợp được các chất điều

hòa sinh trưởng thực vật (Saharan and Nehra, 2011) Việc chủng Rhizobium

sp giúp gia tăng đáng kể số lượng nốt rễ cũng như năng suất so với đối chứng

trong điều kiện ngoài đồng Thử nghiệm được tiến hành ở Ấn Độ cho thấy tùy thuộc vào cây họ Đậu, điều kiện đất đai và khí hậu, thông qua việc chủng các

Rhizobium, có thể bổ sung khoảng 50% nhu cầu về đạm, dẫn đến sự gia tăng

năng suất đáng kể (Saharan and Nehra, 2011) Ngoài hoạt động cố định N2,

các Rhizobium có thể cải thiện tình trạng dinh dưỡng lân của cây trồng bằng

cách huy động lân vô cơ và hữu cơ.Alikhani và ctv (2006) đã phân lập được

từ đất trồng ở Iran các chủng Rhizobium có khả năng hòa tan Ca3(PO4)2 và inositol hexaphosphate

Vi khuẩn Burkholderia được Yabuuchi et al tìm ra vào năm 1992 Đến năm 2009, Spilker et al đã phân loại được hơn 40 loài Burkholderia, chúng

có mặt khắp nơi trong tự nhiên, trong đó có Burkholderia cepacia complex

(Bcc) với 17 loài phụ Trong số hơn 40 loài Burkholderia, có nhiều loài được

xác nhận có khả năng cố định đạm gồm: Burkholderia vietnamiensis,

Burkholderia brasilensis (dòng 130), Burkholderia kururiensis, Burkholderia tuberum, Burkholderia phymatum, Burkholderia unamae, Burkholderia tropica/tropicalis, Burkholderia xenovorans, Burkholderia phytofirmans, và Burkholderia terrae (Goris et al, 2004; CaballeroMellado et al., 2004; Reis et

al., 2004; Sessitsch et al., 2005)

1.6.4 Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng cây trồng

Các chất kích thích sinh trưởng của thực vật là những chất ở nồng độ sinh lý có tác dụng kích thích các quá trình sinh trưởng của cây Các chất kích thích sinh trưởng thực vật gồm có các nhóm chất: Auxin, Gibreelin, Cytokinine

Indole-3-acetic acid (IAA, 3-IAA) là phổ biến nhất trong tự nhiên, hoóc môn thực vật của lớp auxin, là chất điều hòa sinh trưởng của thực vật.IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa sinh mô, phát triển trái và hạt và chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng Tác động của IAA phụ thuộc vào dạng tế bào, ở các nồng độ khác nhau tùy thuộc vào loại phân sinh mô, IAA kích thích đồng thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi đầu của rễ bên và sự thành lập lông rễ (Theologies và Ray, 1982) Theo Sergeeva et al., (2002), các nhóm vi khuẩn khác nhau kể cả vi khuẩn đất, vi khuẩn biểu sinh, vi khuẩn

nội sinh và một số vi khuẩn lam (Cyanobacteria) đã được phát hiện là có khả

năng sinh tổng hợp indole-3-acid acetic từ tiền chất L-tryptophan (Trp) Một

số loài của các chi Azospirillum, Gluconacetobacter và Pseudomonas là

những vi khuẩn cố định đạm nhưng nhờ vào khả năng tổng hợp IAA của chúng nên cũng được xem là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật, góp phần làm tăng sản lượng cây trồng (Kloepper et al., 1989)

1.6.5 Khả năng kháng bệnh hại cây trồng

VSV đối kháng có khả năng cạnh tranh trực tiếp với nguồn bệnh về dinh dưỡng, oxy, không gian sống, sinh kháng sinh, tạo siderophore để sinh trưởng (Lê Thị Thanh Thủy, 2014).

Tác dụng của VSV kích thích sinh trưởng thực vật: Vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth-Promoting Bacteria – PGPB) là vi khuẩn vùng rễ khi tương tác với rễ cây có thể tạo ra tính kháng của cây chống lại vi khuẩn, nấm và virut gây bệnh Hiện tượng này được gọi là tính kích kháng hệ thống - ISR (Induced Systemic Resistance), cũng giống như tính kích kháng

hệ thống có điều kiện - SAR (Systemic Acquired Resistance) (Ryu, C M và cs., 2004)

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- VSV nội sinh

- Đất chua mặn (đất phèn)

- Dịch dinh dưỡng sau xử lý phế thải chăn nuôi

2.2 Phạm vi nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Học viện Nông Nghiệp Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2016 đến tháng 5/2016

- Địa điểm lấy mẫu: Đất phèn lấy tại huyện Kiến Thụy, thành phố Hải Phòng

Cây lấy mẫu: Rau cải(Brassicaceae), cỏ ba lá(Trifolium), rau lang

(Ipomoea batatas), đậu que (Vigna), khoai tây (Solanum tuberosum), chuối

lùn(Musa), xuyến chi (Bidens pilosa), đậu tương (Glycine max), lạc (Arachis

hypogaea).

- Thí nghiệm chậu vại: Rau mồng tơi (Basella alba).

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Đặc điểm phân bố và tính chất của đất phèn tại Hải Phòng

- Phân lập các chủng giống VSV nội sinh từ đất phèn

- Đánh giá đặc tính sinh học và tuyển chọn giống VSV nội sinh

- Phân loại các giống VSV nội sinh tuyển chọn

- Hiệu quả của chế phẩm dinh dưỡng vi sinh từ VSV nội sinh trên cây trồng

2.4 Phương pháp nghiêncứu

2.4.1 Phương pháp khử trùng mẫu

Mẫu cây được rửa sạch đất bám ở rễ, thân và lá; sau đó cắt rời rễ và thân cây ra Để loại trừ các VSV có khả năng còn bám ở bề mặt, mẫu sau khi thu thập được tiến hành xử lý như sau: rửa sạch phần thân, rễ dưới vòi nước

mạnh; tiếp tục rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi cắt rễ và thân thành những đoạn nhỏ 1-2 cm, làm khô mẫu bằng giấy hút ẩm; sau đó lần lượt khử trùng mẫu (rễ, thân) bằng cồn 96% trong 3 phút, hypochloride 1% trong 3 phút, hydrogen peroxide 3% trong 3 phút và rửa lại với nước cất vô trùng 4 lần để tẩy rửa các loại hóa chất còn thừa

Để kiểm tra khả năng các VSV còn sót lại trên bề mặt mẫu sau khi khử trùng, lấy 200μl nước cất vô trùng đã rửa mẫu ở lần thứ 4 (lần cuối) chủng lên các đĩa môi trường Tryptone glucose yeast agar(phụ lục 1)và ủ ở 300C, nếu sau 24 giờ ủ các đĩa môi trường này không có sự xuất hiện các khuẩn lạc thì các mẫu đã khử trùng đạt yêu cầu (Cao Ngọc Điệp, 2010)

2.4.2 Phân lập chủng giống VSV nội sinh

Các mẫu khử trùng đạt yêu cầu được cho vào các ống nghiệm chứa 10

ml nước cất vô trùng và nghiền mịn mẫu bằng đũa thủy tinh đã khử trùng trên đèn cồn Lấy 200µl dịch mẫu nghiền cho vào các ống nghiệm chứa 3ml môi trường LGI (Lavacante, Dobereiner, 1988), Nfb (Krieg, Dobereiner, 1984) và

RMR bán đặc (Elbeltagy et al, 2001) rồi đem ủ ở 30oC trong 2-3 ngày, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

Sau 2-3 ngày nuôi, quan sát thấy các ống nghiệm chứa các môi trường bán đặc đã nhiều dịch triết của mẫu xuất hiện một lớp màng mỏng cách mặt môi trường khoảng 0,5 cm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh Lấy một ít vi khuẩn từ các màng mỏng của các môi trường bán đặc lần lượt cấy chuyển sang các đĩa môi trường đặc để tách dòng các khuẩn lạc Sau vài lần cấy chuyển trên các môi trường đặc, chọn các khuẩn lạc rơi và đều nằm trên đường cấy quan sát dưới kính hiển vi Khi thấy vi khuẩn đã thuần thì cấy chuyển sang ống nghiệm chứa môi trường đặc tương ứng để giữ giống ở

4oC.Các môi trường sử dụng để phân lập VSV nội sinh bao gồm: LB, MPA, Gause 1, NA, Hansen, LGI, Sabouraud, YMA, MRS (phụ lục 2)

2.4.3 Xác định khả năng phân giải xenlulozo và tinh bộttheo phương pháp khuếch tán phóng xạ trên đĩathạch

Nuôi dịch chiết: Nuôi cấy VSVtrên 9ml dung dịch môi trường chuyên tính với 1 vòng que cấy chứa VSV, đưa lên máy lắc ở 150 vòng/phút Sau 72 giờ dịch nuôi cấy được đánh giá khả năng phân giải enzym

Chuẩn bị môi trường:

Nhỏ dịch: Hút 0,2ml dịch thể nhỏ vào các lỗ thạch đã đục Đặt đĩa petri trong tủ lạnh 6 giờ để enzym khuếch tán trên đĩa thạch, sau đó đặt vào

tủ nuôi ở 28oC trong 48 giờ rồi đem nhuộm màu bằng dung dịch lugol, sau khi xuất hiện vòng phân giải đem đo đường kính và khả năng phân gải được tính bằng hiệu giữa đường kính vòng phân giải và đường kính lỗ thạch

2.4.4 Xác định khả năng phân giải lân

Nuôi dịch chiết: Nuôi cấy VSVtrên 9ml dung dịch môi trường chuyên tính với 1 vòng que cấy chứa VSV, đưa lên máy lắc ở 150 vòng/phút Sau 48 giờ dịch nuôi cấy được đánh giá khả năng phân giải.Môi trường đem hấp ở 1210C, áp suất

1 atm trong vòng 20 phút, đổ ra đĩa petri với lượng môi dày 2mm và để nguội Cấy chấm điểm dịch nuôi VSVtrên môi trường Pikovaskya (phụ lục 3)

Theo dõi khả năng hình thành phòng phân giải của các chủng

VSVtrong thời gian 72h.VSV có hoạt tính phân giải lân sẽ có vòng sáng halo tạo thành xung quanh khuẩn lạc, còn vùng chưa phân giải có màu đục hơn

Khả năng phân giải lân được tính bằng hiệu giữa đường kính vòng sáng halo và đường kính khuẩn lạc VSV.

2.4.5 Định lượng IAA bằng phương pháp Salkowski

Vi khuẩn được nuôi trong môi trường NA bổ sung 0.1% tryptophan lắc với tốc độ 200 vòng/ phút ở nhiệt độ 300C trong 48h Sau đó thu dịch nuôi cấy đem ly tâm với tốc độ 5500 vòng/ phút trong 5 phút

Hút 1 ml dịch trong thu được sau ly tâm cho vào ống nghiệm chứa sẵn 2

ml thuốc thử Salkowski, đối chứng là 1 ml môi trường dịch thể đã ly tâm không nuôi VSV thêm vào 2 ml thuốc thử Lắc đều, để trong tối 20 phút So màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng 530nm Chỉ số OD được đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lượng IAA trong dịch nuôi cấy Hàm lượng IAA tính theo đơn vị µg IAA/ml

Thuốc thử Salkowski (phụ lục 4) sau khi pha xong cần bảo quan trong bình tối

Phương pháp xây dựng đồ thị đường chuẩn

Xây dựng đường chuẩn IAA: gồm 10 bình định mức được đánh số theo thứ tự từ 0 đến 10 với ống 0 là bình đối chứng âm, hàm lượng IAA các bình theo thứ tự tăng dần là 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60,70, 80, 90 µg/ml IAA.Lắc đều các bình sau đó hút từ mỗi bình 1ml dung dịch thêm vào 2 ml thuốc thử Salkowski lần lượt vào các ống nghiệm đánh số từ 0 đến 10.Lắc đều, để trong tối 20 phút So màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng 530nm Chỉ số OD được dùng để xây dựng đường chuẩn

Phương trình đường chuẩn có dạng: Y = a * X + b, trong đó X là nồng độ của mẫu (µg/ml), Y là độ hấp thụ quang(OD 530nm) Hàm lượng IAA có trong mẫu theo công thức: X = (Y-b)/a

2.4.6 Đánh giá khả năng thích ứng pH và nhiệt độ

- Đánh giá khả năng thích ứng pH khác nhau: Bổ sung 10% dung dịch đệm pH (pha bằng Na2HPO4 và KH2PO4, đo và chỉnh pH của dung dịch bằng

giấy quỳ) vào môi trường chuyên tính, đem hấp khử trùng và đổ vào đĩa petri, cấy VSV tương ứng và đem nuôi ở 28oC, sau đó đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành.

- Đánh giá khả năng chịu nhiệt của các chủng VSV: Cấy VSV trên từng môi trường chuyên tính tương ứng sau đó đem nuôi ở các mức nhiệt độ khác nhau 20oC – 30oC – 35oC – 40oC, đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành

2.4.7 Xác định tính đối kháng của chủng giống VSVtheo phương pháp cấy vạch

Các chủng giống được đánh giá tính đối kháng theo từng cặp theo phương pháp đường vuông góc Cross-Streak Các chủng VSV được cấy thành cặp theo các đường giao nhau Nếu xuất hiện vòng đối kháng (các chủng mọc cách nhau) thì các chủng đó đối kháng nhau và không thể phối trộn chúng vào cùng chất mang

2.4.8 Phân tích chất lượng dinh dưỡng của chế phẩm dinh dưỡng vi sinh

Chỉ tiêu Tiêu chuẩn Việt Nam Phương pháp

-Độ ẩm TCVN 8728 : 2012 Phương pháp sấy khô

OM% TCVN 9294:2012 Phương pháp Walkley-Black