Nghiên Cứu Phân Lập Và Tuyển Chọn Giống Vi Sinh Vật Nội Sinh Từ Vùng Sinh Thái Đất Ngập Mặn Phục Vụ Cho Sản Xuất Nông Nghiệp Và Bảo Vệ Môi Trường

Vi sinh vật nội sinh là vi sinh vật sống trong mô thực vật được tìm thấy ở vùng rễ, thân, lá, quả của thực vật, vì vậy vi sinh vật nội sinh được xem là một trong những đối tượng quan trọ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA MÔI TRƯỜNG

- -KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN

GIỐNG VI SINH VẬT NỘI SINH TỪ VÙNG SINH THÁI

ĐẤT NGẬP MẶN PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT

NÔNG NGHIỆP VÀ BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG

Người thực hiện : ĐỖ MINH THU

Giáo viên hướng dẫn : TS NGUYỄN THỊ MINH

Hà Nội - 2016

HỌC VIÊN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA MÔI TRƯỜNG

- -KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN

GIỐNG VI SINH VẬT NỘI SINH TỪ VÙNG SINH THÁI

ĐẤT NGẬP MẶN PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT

NÔNG NGHIỆP VÀ BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG

Người thực hiện : ĐỖ MINH THU

Chuyên ngành : KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG

Giáo viên hướng dẫn : TS NGUYỄN THỊ MINH

Địa điểm thực tập : HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Hà Nội - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan mọi kết quả trong bài viết này là hoàn toàn chân thực

và chưa từng được công bố trong một nghiên cứu nào trước đó

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

LỜI CÁM ƠN

Trong quá trình học tập tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, được sự giúp đỡ của các thầy cô, các đoàn thể, đặc biệt được bộ môn Vi sinh vật – Khoa Môi trường tạo điều kiện, đến nay, em đã hoàn thành khóa học và thực hiện xong khóa luận của mình Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô Nguyễn Thị Minh đã tận tình hướng dẫn em hoàn thành tốt nghiên cứu của mình Cảm ơn các thầy và các cô, các anh chị ở Phòng thí nghiệm Bộ môn vi sinh – Khoa môi trường và phòng thí nghiệm Jica – Khoa Quản lý đất đai đã tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành nghiên cứu này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè, thầy cô và gia đình đã giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường

Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực hiện

Đỗ Minh Thu

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

Em xin chân thành cảm ơn! i

Em xin chân thành cảm ơn! ii

Sinh viên thực hiện ii

Các chủng được đánh giá tính đối kháng theo từng cặp theo phương pháp đường vuông góc Cross-Streak Các chủng vi sinh vật được cấy thành cặp theo các đường giao nhau Nếu xuất hiện vòng đối kháng (các chủng mọc cách nhau) thì các chủng đó đối kháng nhau và không thể phối trộn chúng vào cùng chất mang 32

1.Agricultural Policies in Viet Nam 2015 80

http://www.oecd-ilibrary.org/agriculture-and-food/agricultural-policies-in-viet-nam-2015_9789264235151-en 80

thứ 6, 25/3/2016 80

thứ 6, 25/3/2016 85

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Sản lượng một số loại cây lương thực trên thế giới (triệu tấn) .3

Bảng 1.2 Sản lượng gạo năm 2014 của một số quốc gia (triệu tấn) 4

Bảng 1.3 Sản lượng một số loại cây trồng chủ yếu năm 2015 6

Bảng 2.1 Thành phần môi trường phân giải xenlulo và tinh bột 30

Bảng 2.2 Phương pháp xác định chất lượng dinh dưỡng vi sinh 33

Bảng 2.3 Các chỉ tiêu đánh giá đất trồng 33

Bảng 3.1 Diện tích các loại đất huyện Giao Thủy 36

Bảng 3.2 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu đất mặn Giao Thủy 38

Bảng 3.3 Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật nội sinh 40

Bảng 3.4 Đánh giá khả năng phân giải xenlulo, phân giải lân và tổng hợp IAA của các chủng vi sinh vật nội sinh 49

Bảng 3.5 Đánh giá khả năng chịu nhiệt của các chủng vi sinh vật 58

Bảng 3.6 Kết quả vòng phân giải tinh bột 62

Bảng 3.7 Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật nội sinh được tuyển chọn 69

Bảng 3.8 Chất lượng của chế phẩm dinh dưỡng vi sinh 70

Bảng 3.9 Một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây trồng sau thí nghiệm 71

Bảng 3.10 Chất lượng đất trước và sau thí nghiệm 71

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hoá các hợp chất lân hữu cơ thành muối của

H3PO4 24

Hình 3.1 Một số chủng vi sinh vật 47

nội sinh được phân lập 47

Hình 3.2 Chủng 3 LSH1 47

Hình 3.3 Một số chủng vi sinh vật nội sinh được giữ giống 47

3.3 Kết quả tuyển chọn chủng vi sinh vật nội sinh 48

Hình 3.4 Vòng phân giải xenlulo của một số chủng vi sinh vật nội sinh 53 Hình 3.5 Vòng phân giải lân của một số chủng vi sinh vật nội sinh 54

Hình 3.6 Vòng phân giải lân của chủng 8TDX 55

Hình 3.7 Một số chủng vi sinh vật nội sinh phân giải IAA cao làm đổi màu thuốc thử 56

Hình 3.8 Tính đối kháng của một số chủng vi sinh vật nội sinh 64

Hình 3.9 8 chủng giống vi sinh vật nội sinh được tuyển chọn 65

Hình 3.10 Hình thái khuẩn lạc 3 TDG1 66

Hình 3.11 Hình thái tế bào 3 TDG1 66

Hình 3.12 Hình thái khuẩn lạc TDG4 66

Hình 3.13 Hình thái tế bào TDG4 66

Hình 3.14 Hình thái khuẩn lạc 3 TDG5 66

Hình 3.15 Hình thái tế bào 3TDG5 66

Hình 3.16 Hình thái khuẩn lạc 3 LSH1 67

Hình 3.17 Hình thái tế bào 3 LSH1 67

Hình 3.18 Hình thái khuẩn lạc 6 LXL3 67

Hình 3.19 Hình thái tế bào 6 LXL3 67

Hình 3.20 Hình thái khuẩn lạc 6TSH3 67

Hình 3.21 Hình thái tế bào 6 TSH3 67

Hình 3.22 Hình thái khuẩn lạc 8 TDX 68

Hình 3.23 Hình thái tế bào 8 TDX 68

Hình 3.24 Hình thái khuẩn lạc Y ĐT3 68

Hình 3.25 Hình thái tế bào Y ĐT3 68

Hình 3.26 Cây trồng thí nghiệm sau 30 ngày 72

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

FAO : Tổ chức Nông Lương Thế giới

IAA : Indole-3-acetic acid

OECD : Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Hiện nay, sự phát triển nền nông nghiệp đang đi theo hướng thâm canh

và xen canh cao, cùng với đó là việc sử dụng ngày càng nhiều phân bón và thuốc bảo vệ thực vật hóa học Đó là một trong số những nguyên nhân làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, hệ vi sinh vật trong đất bị xáo trộn, tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng cao và nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến có thể phát sinh các loại dịch hại nghiêm trọng, khó dự báo trước (Cục Bảo vệ thực vật, 2014)

Việc sử dụng chế phẩm sinh học và phân hữu cơ vi sinh có tầm quan trọng đặc biệt đối với một nước nông nghiệp như Việt Nam, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp an toàn và bền vững Tuy nhiên, tình hình sản xuất phân vi sinh ở Việt Nam vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định Vì vậy, việc nghiên cứu để hoàn thiện và nâng cao chất lượng chế phẩm sinh học và phân vi sinh là hết sức cần thiết

Vi sinh vật nội sinh là vi sinh vật sống trong mô thực vật được tìm thấy

ở vùng rễ, thân, lá, quả của thực vật, vì vậy vi sinh vật nội sinh được xem là một trong những đối tượng quan trọng được phân lập và sàng lọc để làm giống cho sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ cho sản xuất nông nghiệp mà không ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe cộng đồng

Ở Việt Nam hiện nay còn thiếu những chủng vi sinh vật nội sinh phát huy tốt hiệu quả trên nhiều loại cây trồng ở các điều kiện sinh thái khác nhau Một số nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh trong các loài cây như phân lập

dòng Burkholderia tropica trên cây khóm, vi khuẩn Azospirillium lipoferum

và Klebsiella pneumonia từ cỏ chăn nuôi, Rhizobium hay nấm rễ Arbuscular Mycorrhizae từ rễ cây đậu đỗ và cây thảo quả Tuy nhiên, hầu hết các dòng vi

sinh vật nội sinh trên vẫn chưa được đánh giá đầy đủ và chưa được ứng dụng trong thực tiễn Mặt khác, các chế phẩm vi sinh đã và đang sử dụng ở Việt Nam thường chỉ có tác dụng đơn lẻ trong việc phòng trừ sâu bệnh, cải tạo đất hay xử lý phế thải,….và cũng không có tác dụng tổng hợp như các sản phẩm của nước ngoài.

Đất mặn - Salic Fluvisols là đất chứa nhiều muối hòa tan (1 – 1,5% hoặc hơn) Nhóm đất mặn ở Việt Nam có diện tích xấp xỉ 1.180.200ha (Viện Nông hóa thổ nhưỡng, 2001), chiếm khoảng 3,57% diện tích tự nhiên của cả nước Nam Định là một trong những tỉnh chịu sự tác động mạnh mẽ của hiện tượng xâm nhiễm mặn do mực nước biển dâng cao, thu hẹp diện tích đất trồng cây lương thực, thực phẩm Diện tích đất mặn ở Nam Định là 15.615,89 ha, chiếm 12,03% diện tích các đơn vị đất và 9,54% diện tích tự nhiên của tỉnh

Đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố gây khó khăn cho sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loại cây trồng Tuy nhiên, vùng sinh thái đất mặn tại Nam Định lại có mức độ đa dạng về thành phần loài khá cao do các loại cây trồng và sinh vật ở đây đã hình thành được đặc tính thích nghi với môi trường mặn (Phạm Văn Phong, 2015)

Vì vậy, việc nghiên cứu vi sinh vật nội sinh ở vùng sinh thái đất mặn là cần thiết với mục tiêu phát hiện được những chủng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính sinh học cao phục vụ cho sản xuất nông nghiệp và bảo vệ môi trường

Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn được các chủng vi sinh vật nội sinh có nguồn gốc bản địa

từ đất mặn có tác dụng phân giải và chuyển hóa chất hữu cơ tạo dinh dưỡng

dễ tiêu, chống chịu cao với điều kiện bất lợi, hạn chế bệnh hại, tăng cường sinh trưởng phát triển của cây trồng,… phục vụ cho sản xuất nông nghiệp và bảo vệ môi trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hiện trạng phát triển nông nghiệp trên thế giới và Việt Nam

1.1.1 Hiện trạng phát triển nông nghiệp trên thế giới

Theo báo cáo “Triển vọng nông nghiệp 2013-2022” của Tổ chức Hợp tác

và Phát triển Kinh tế (OECD) và Tổ chức Nông Lương Thế giới (FAO), sản lượng nông sản trong 10 năm qua trên toàn thế giới tăng 2,1%/năm và được

dự báo tăng chậm ở mức 1,5%/năm nhưng vẫn cao hơn tỷ lệ tăng trưởng dân

số thế giới 0,5%/năm Một trong những yếu tố được dự báo khiến sản lượng tăng chậm so với thời gian trước là tình trạng đất canh tác ngày càng bị thu hẹp Mặc dù tại một số quốc gia có nền kinh tế mới nổi như Brazil và Nga, diện tích đất gieo trồng được tận dụng tối đa, nhưng đa số các nước khác đang phải đối mặt với tình trạng đất gieo trồng bị thu hẹp mà một phần là do việc

sử dụng đất cho các mục đích khác (OECD và FAO, 2013)

Trong 25 năm qua (1965-1990), diện tích đất canh tác của toàn thế giới tăng được có 9,4%, trong khi dân số lại tăng 68,5% trong cùng thời gian, làm cho bình quân diện tích đất canh tác trên đầu người giảm 35,1% hay 1,4%/năm (Nguyễn Văn Bộ, 2013)

Bảng 1.1 Sản lượng một số loại cây lương thực trên thế giới (triệu tấn)

Sản phẩm nông nghiệp có giá trị xuất khẩu lớn, khoảng 75 - 80 tỉ USD mỗi năm Lương thực được sản xuất ra rất an toàn, có chất lượng cao, phong phú

và giá cả phải chăng Nền nông nghiệp Hoa Kỳ cũng đạt được sự dồi dào và

đa dạng nhất trên thế giới Diện tích nước Mỹ là 9.161.923 km2, trong đó diện tích đất có thể canh tác được chiếm 18,1% Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp Mỹ tháng 02/2014, Mỹ có 2.109.363 nông trại, trung bình mỗi trại có diện tích 174 ha Năm 2012, tổng giá trị sản phẩm nông nghiệp đạt 394,6 tỷ

đô la Mỹ, tăng 33% so với năm 2007, trong đó giá trị các sản phẩm trồng trọt

là 219,6 tỷ đô la, giá trị sản phẩm chăn nuôi đạt 171,7 tỷ đô la Với diện tích đất canh tác rộng lớn nên việc áp dụng các phương tiện và kỹ thuật hiện đại trong sản xuất nông nghiệp đã khiến cho năng suất lao động tăng mạnh (Thu Trang, 2015)

Bảng 1.2 Sản lượng gạo năm 2014 của một số quốc gia (triệu tấn)

Nông nghiệp hữu cơ là hệ thống canh tác và chăn nuôi tự nhiên, không

sử dụng hóa chất làm phân bón và thuốc trừ sâu, giúp giảm thiểu ô nhiễm, bảo đảm sức khỏe cho người và vật nuôi Nông nghiệp hữu cơ được hình thành vào những thập kỷ 70 và ngày càng phát triển mạnh và được coi là một phương thức sản xuất phù hợp vì nó đảm bảo các yếu tố như tính bền vững, hài hòa các lợi ích về sức khỏe, môi trường và phát triển bền vững; sản xuất nông nghiệp hữu cơ còn được coi là một trong những biện pháp giảm thiểu

CO2, giảm thiểu tác động xấu đến biến đổi khí hậu Hiện nay trên thế giới đã

có 130 nước canh tác theo phương pháp nông nghiệp hữu cơ, chiếm một phần đất nông nghiệp với diện tích khoảng 35,6 triệu ha được quản lý theo hướng hữu cơ; ở Úc và các nước Châu âu khoảng 25,6 triệu ha; Châu Á diện tích sản xuất hữu cơ nhỏ nhưng tăng lên rất nhanh ở một số nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia, Ấn Độ, với diện tích canh tác nông nghiệp hữu

cơ khoảng 900.000ha (Hiệp Hội Nông nghiệp Hữu cơ, 2012)

1.1.2 Hiện trạng phát triển nông nghiệp Việt Nam

Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng của khoảng 130 triệu người vào năm 2035, Việt Nam phải cần tới 36 triệu tấn thóc và để đạt được sản lượng này cần phải duy trì tối thiểu 3 triệu ha đất chuyên trồng lúa hai vụ để có 6 triệu ha đất gieo trồng Tuy nhiên diện tích đất nông nghiệp trên đầu người tại Việt Nam ngày càng suy giảm, từ 0,13ha năm

1980 xuống còn khoảng 0,1 ha hiện nay, chỉ bằng 8,7% trung bình của thế giới

Đó là chưa kể những vùng sản xuất nông nghiệp tập trung như Đồng bằng sông Hồng thì chỉ còn gần 400 m2/người (Phạm Thị Thanh Hoa, 2012) Giá trị sản xuất nông, lâm nghiệp và thuỷ sản năm 2015 theo giá so sánh 2010 ước tính đạt 858,4 nghìn tỷ đồng, tăng 2,62% so với năm 2014, thấp hơn so với mức tăng các năm gần đây (năm 2014 tăng 4%, năm 2013 tăng 3,6%, năm 2012 tăng 3%) Trong lĩnh vực nông nghiệp, trồng trọt có mức tăng trưởng thấp nhất

so với cùng kỳ năm 2014 (+1,56%) Lĩnh vực trồng trọt đạt mức tăng trưởng thấp so với các năm gần đây chủ yếu do sản lượng một số cây trồng năm 2015

đạt mức tăng thấp, trong khi đó sản lượng một số cây công nghiệp hàng năm lại

giảm (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2015).

Bảng 1.3 Sản lượng một số loại cây trồng chủ yếu năm 2015

Đơn vị: 1000 tấn

Cây hàng năm chủ yếu

(Nguồn: Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2015)

Hơn nữa, Việt Nam còn gặp nhiều khó khăn khi còn phải nhập khẩu nhiều nguyên liệu, đặc biệt là phân bón để phục vụ sản xuất nông nghiệp Theo Niên giám thống kê Hải quan về hàng hóa năm 2014 lượng xuất khẩu phân bón các loại năm 2014 là 1,059 nghìn tấn tương đương 374 triệu USD.Trong khi đó, lượng nhập khẩu phân bón các loại là 3.796 nghìn tấn, tương đương 1.240 triệu USD (Tổng cục Hải quan, 2014)

Để đảm bảo an ninh lượng thực, các quốc gia đông dân, đất nông nghiệp hạn chế cả về số lượng và chất lượng như Việt Nam sẽ phải đi theo con đường thâm canh với việc tăng cường sử dụng giống mới năng suất cao, phân bón vô cơ và hoá chất bảo vệ thực vật Tuy nhiên việc lạm dụng phân bón và hóa chất bảo vệ thực vật đã và đang gây ra ô nhiễm môi trường và làm suy giảm chất lượng nông sản Nông nghiệp hữu cơ là một hệ thống sản xuất cho phép khai thác tối ưu các nguồn tài nguyên như đất, năng lượng, các

chất dinh dưỡng, các quá trình sinh học diễn ra trong tự nhiên với một phương pháp quản lý hợp lý nhất nhằm mục đích tạo ra sản phẩm đáp ứng yêu cầu về vệ sinh an toàn thực phẩm, đồng thời cũng đảm bảo cho hệ thống sản xuất bền vững về môi trường, xã hội và kinh tế Do vậy, phát triển nông nghiệp hữu cơ là một xu thế tất yếu nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm và giảm thiểu tác động tiêu cực đến sức khỏe cộng đồng cũng như môi trường sống (Nguyễn Văn Bộ, 2013)

1.2 Tác động của sản xuất nông nghiệp đến môi trường

Tác động của sản xuất nông nghiệp đến môi trường tự nhiên

Theo Nguyễn Đình Mạnh (1996), khoảng 50-60% số lượng N bón vào đất dưới dạng vô cơ được cây sử dụng, một số không lớn chuyển thành dạng hữu cơ hoặc keo đất hấp thụ, một số bị rửa trôi tuỳ theo lượng mưa, cách tưới nước và lý tính đất Khoảng 30% lượng lân và kali bón vào đất được cây sử dụng do lân và kali sau khi hoà tan vào đất có khả năng chuyển từ dạng hoà tan trong nước sang dạng ít hoà tan hoặc khó hoà tan nên lượng lân và kali bị rửa trôi đi cũng không đáng kể, thường dưới 10%

Theo L.V.Mosolo (1987), tổng lượng N dự trữ trong lớp đất cày 25cm) giao động trong giới hạn rộng, trung bình dự trữ N bằng 0,1% khối lượng đất Quá trình Nitrat hoá là sự oxi hoá amoniac hình thành trong điều kiện yếm khí, lúc độ ẩm tối ưu là 60-70%, nhiệt độ từ 25-30oC, pH khoảng 6,2 - 9,2 thì nitrat hoá xảy ra mạnh nhất, khả năng nitrat hoá ở mức độ nào đó đặc trưng cho độ phì hữu hiệu của đất

(0-Phân vô cơ được sử dụng phổ biến trong thực tiễn sản, nhưng loại phân này tiềm ẩn nhiều nguy cơ rất lớn về làm gây ô nhiễm môi trường Phân bón

bị rửa trôi theo chiều dọc xuống tầng nước ngầm chủ yếu là phân đạm vì các loại phân lân và kali dễ dàng được giữ lại trong keo đất Ngoài phân đạm đi vào nguồn nước ngầm còn có các loại hóa chất cải tạo đất như vôi, thạch cao,

hợp chất lưu huỳnh, Nếu như phân đạm làm tăng nồng độ nitrat trong nước ngầm thì các loại hóa chất cải tạo đất làm tăng độ mặn, độ cứng nguồn nước Phân vô cơ có khả năng làm mặn hóa do tích lũy các muối như CaCO3, NaCl, … Cũng có thể làm chua hóa do bón quá nhiều phân chua sinh lý như KCl, NH4Cl, (NH2)2SO4, …Phân vô cơ sẽ gây hại đến hệ vi sinh vật trong đất

do làm thay đổi tính chất của đất như pH, độ thoáng khí, hàm lượng kim loại nặng trong đất Phân bón là một yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của một số vi sinh vật có khả năng cố định chất dinh dưỡng, ví dụ bón đạm nhiều cho đất có chưa vi khuẩn cố định N sẽ làm giảm khả năng này của chúng (Nông nghiệp – Nông thôn Việt Nam, 2011)

Phát thải Cacbon trong sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam đang tăng nhanh chóng Năm 2010, riêng trồng lúa đã chiếm 44% tổng lượng phát thải

CO2 quy đổi từ nông nghiệp Xét về tốc độ tăng trưởng, việc sử dụng phân bón trong các hoạt động nông nghiệp tác động tới phát thải khí CO2 đang tăng nhanh nhất (OECD, 2015)

Tác động của sản xuất nông nghiệp đến con người và sinh vật

Phạm Bích Ngân và Đinh Xuân Thắng (2012) cho rằng: “Tiếp xúc lâu dài với thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) có thể dẫn đến các rối loạn tim phổi, thần kinh và các triệu chứng về máu và các bệnh về da Người trực tiếp phun thuốc còn có thể bị nhiễm thuốc bảo vệ thực vật trong máu do thấm qua da, hít thở phải thuốc bảo vệ thực vật và gặp những vị trí tổn thương ở các cơ quan này Các chất Filitox, Azodrin, Cidi (thuộc nhóm Lân hữu cơ) và Xylene đều là những chất rất độc Trong đó Filitox và Azodrin độc nhóm độc I Các chất thuộc nhóm lân hữu cơ thường gây hại thần kinh, ức chế sự hoạt động của men dẫn truyền thần kinh Cholinesterase (ChE), làm giảm lượng men này trong máu và trong huyết tương) Trong trường hợp hít phải nồng độ cao người bị nhiễm sẽ bị ngộ độc cấp”

Nguyễn Văn Tuyến (2012) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng hóa chất bảo vệ thực vật Actardor 100WP tới vi sinh vật đất trồng chè Actardor 100WP là hóa chất bảo vệ thực vật hóa học với hoạt chất Imidacloprid (>96%) được thương mại hóa năm 1991 và được sử dụng rộng rãi cho mục đích bảo vệ thực vật Nghiên cứu chỉ ra rằng với liều lượng cao 100ml/360m2, thể hiện rõ ràng mức độ ảnh hưởng của hóa chất bảo vệ thực vật Actardor 100WP đối vi khuẩn Ở liều lượng cao hoạt chất Imidacloprid có thể gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn (vi khuẩn tổng số đều giảm so với mẫu đối chứng) Sau 60 ngày thí nghiệm, vi khuẩn tổng số vẫn giảm và chưa trở lại trạng thái cân bằng so với mẫu đối chứng (xuống còn 5,71x106 CFU/g đất)

1.3 Tổng quan về đất mặn

Tổng diện tích đất mặn ở trên thế giới là 351.560.160 ha Phân bố nhiều nhất Châu Á 195.006.300 ha (55,49%); Châu Mĩ 77.566.000 ha (22,06%); Châu Phi 53.492.000 ha (15,22%); Châu Đại Dương 17.597.000 ha (5%) và ít nhất là Châu Âu 7.838.000 ha (2,23%) (Szabolls, 1979)

Đất mặn được hình thành yếu là do các nguyên nhân sau:

- Do sử dụng nước ngầm có độ khoáng hóa cao để tưới

- Do thấm nước mặn

- Do xâm nhập của nước biển

- Do mực nước ngầm dâng cao

- Do chuyển động của muối

Nhóm đất mặn của Việt Nam được chia ra thành các loại sau:

- Đất mặn sú, vẹt, đước (Mangrove): Có khoảng 180 nghìn ha, tập trung

ở ven biển nhưng diện tích lớn nhất là ven biển Nam Bộ (Cà Mau, Bến Tre…) (Vũ Năng Dũng và cộng sự, 2009)

- Đất mặn nhiều: Có khoảng gần 300 nghìn ha, tập trung ven biển đồng bằng Bắc Bộ như Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình…và đồng bằng Nam Bộ (Tiền Giang, Trà Vinh, Bạc Liêu…) (Vũ Năng Dũng và cộng sự, 2009)

- Đất mặn trung bình và ít: Có diện tích khoảng 700 nghìn ha, tập trung chủ yếu ở ven biển, ở những nơi có đất mặn nhiều nhưng nằm sâu hơn vào phía đất liền Đặc điểm cơ bản của loại đất này là ít mặn hơn (Vũ Năng Dũng

sẽ chậm lớn, phát triển kém, cho năng suất thấp, nhiều khi bị chết Tác động của muối lên cây lúa trong quá trình hình thành có thể rất khác nhau: trao đổi nước bị phá vỡ, sự hấp thu các chất bị trở ngại, kém phát triển, quang hợp giảm, sự tổng hợp các chất hữu cơ bao gồm protit bị phá vỡ Cuối cùng thì năng suất và chất lượng của nó giảm Đất chứa 0,5% NaCl gây tích lũy các đạm vô cơ trong lá lúa làm thay đổi cả trao đổi gluxit Đất mặn có tác động đáng kể tới sự hấp thu các chất dinh dưỡng Trong mầm lúa, gieo trong môi trường giàu Na đã tìm thấy nhiều Na, Mg, K, Cl và ít N, P, Ca, S, Fe,

Mn Khi đất quá mặn lúa đẻ nhánh kém, và phát triển kém Mọi đất mặn đều ảnh hưởng làm giảm chiều cao cây, độ dài bông, tăng tỷ lệ lép và giảm khối lượng 1000 hạt (Trần Minh Châu, 2014)

1.4 Tổng quan về vi sinh vật nội sinh và chế phẩm sinh học

1.4.1 Tổng quan về vi sinh vật nội sinh

Khái niệm về vi sinh vật nội sinh có thể được hiểu là các vi khuẩn tập trung trong mô thực vật mà không gây bệnh hoặc những hậu quả tiêu cực khác đối với cây chủ (Schulz và Boyle, 2005)

Sự xâm nhập của vi sinh vật nội sinh vào mô thực vật có thể diễn ra qua các con đường sau: Qua các lỗ tự nhiên như thủy khổng, khí khổng, bì khổng; qua vi lỗ hiện diện khi bắt đầu sự hình thành lông hút; qua vị trí hình thành

các rễ ngang (lateral root) hay qua các vết thương do tác động vật lý hoặc qua các vết bệnh Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi sinh vật nội sinh có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay di chuyển khắp nơi trong cây đến các tế bào bên

trong, vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al.,

2002) Mật độ của quần thể vi sinh vật nội sinh rất biến động, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường (Pillay và Nowak, 1997) Vi sinh vật nội sinh giúp tăng cường dinh dưỡng cho cây bằng nhiều cơ chế trực tiếp hay gián tiếp Nhiều vi sinh vật nội sinh có khả năng cố định đạm, có vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn nitrogen, bổ sung nguồn đạm cho đất và cây trồng, ổn định năng suất cây trồng và giúp phát triển sinh thái bền vững (Persello Cartieaux et al., 2003)

Vi khuẩn Azospirillum

Vi khuẩn Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động và có dạng hình que ngắn, kích thước biến động trong khoảng 0,8 - 1,7µm chiều rộng và 1,4 - 3,7µm chiều dài Các loài Azospirillum phân

bố rộng và gắn liền với sự đa dạng của cây trồng (Seshadri et al., 2000)

Trong những năm 1984 - 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của chi

Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) (Reinhold et al.,

1986), trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào nhu mô rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân ở dạng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri et al., 2000), sản xuất chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Vande et al., 1999) hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (Rangaraijan et al., 2003) Okon và Labandera-Gonzalez (1994) thử nghiệm ngoài đồng các cây trồng

được bổ sung với Azospirillum đã nhận thấy sản lượng cây trồng tăng 5 -

30%, cao hơn so với khi sử dụng phân hóa học

Vi khuẩn Azotobacter

Döbereiner (1974) phân lập được loài Azotobacter paspali từ các cây cỏ

đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà Sự khám phá ra vi khuẩn A

paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh Đây là loài

đặc hiệu cho cỏ Paspalum notatum và khoai lang

Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus

Vào năm 1988, Cavalcante và Döbereiner đã phân lập được G diazotrophicus từ rễ, thân và lá mía trồng ở Brazil, chúng hiện diện trong các

khoảng trống gian bào của tế bào nhu mô và được xem là vi sinh vật nội sinh bắt

buộc Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus thuộc họ Acetobacteraceae là

những vi khuẩn Gram âm, vi hiếu khí bắt buộc, tế bào hình que và không có nội bào tử (Muthukumarasamy et al., 2002) Vi khuẩn này có ở nhiều loại cây hòa thảo khác nhau như bắp, lúa hoang, cỏ voi, khóm, cà rốt, củ cải đường, cải bắp

và cây cà phê với các đặc tính ưu việt như có khả năng cố định đạm, tổng hợp cả IAA, gibberellin và hòa tan lân khó tan (Muthukumarasamy et al., 2002; Madhaiyan et al., 2004)

Vi khuẩn Herbaspirillum

Vi khuẩn Herbaspirillum thuộc nhóm β- Proteobacteria là vi khuẩn vi hiếu khí, vi khuẩn cố định đạm sống trong rễ của nhiều cây không phải là họ đậu, bao gồm các loại cây họ hòa bản có giá trị kinh tế Hai loài

Herbaspirillum seropedicae và Herbaspirillum rubrisubalbicans đã được tìm

thấy ở cây bắp, mía đường, lúa hoang và lúa trồng (Baldani et al., 1986) Vi khuẩn này cũng được tìm thấy ở cỏ chăn nuôi và các cây trồng nhiệt đới như khóm và chuối (Cruz et al., 2001) Trong vùng rễ, chúng có khả năng cố định đạm mạnh mẽ (Baldani et al., 1986), ngoài ra chúng còn di chuyển đến cả những vùng ở thân và lá (Barraquio et al., 1997)

trồng và sống nội sinh trong cây Có khoảng 30% các dòng của 2 loài này có thể cố định đạm trong các điều kiện kỵ khí Sau đó, các nhà nghiên cứu sử

dụng vi khuẩn K oxytoca dòng GR-3 bổ sung cho giống lúa Malviyadhan-36

thì nhận thấy vi khuẩn này giúp gia tăng toàn bộ chiều dài cây và tăng hàm lượng chlorophyll-a có hiệu quả, đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập

rễ bên và rễ bất định cho cây (Iniguez et al., 2004)

Vi khuẩn Enterobacter

Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm γ- Proteobacteria (vi khuẩn Gram âm), có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc Một số loài của vi khuẩn này sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng

cố định đạm, là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng thực vật Hwangbo et al

(2003) đã phân lập được loài Enterobacter intermedium từ vùng rễ của một số

cây cỏ ở Hàn Quốc, chúng có khả năng hòa tan các dạng lân khó tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2- ketogluconic acid

Vi khuẩn Azoarcus

Bilal et al., (1987) đã phân lập được một số loại vi khuẩn Azoarcus sống trong cỏ Kallar khi người ta phát hiện lúa mì sống trong vùng trước đây có cỏ thì có năng suất cao mà không cần bón nhiều phân hóa học Vi khuẩn này còn được phân lập từ rễ lúa, có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của lúa Ở những nơi trong vùng rễ có hàm lượng oxy thấp, vi khuẩn này có khả năng cố định đạm tốt (Malik et al., 1997)

Vi khuẩn Pseudomonas

Vi khuẩn Pseudomonas spp phân bố rộng rãi và có nhiều loài, là vi

khuẩn sống tự do, chúng được tìm thấy khắp nơi trong đất, nước, thực vật và động vật Vi khuẩn Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, hình que, có tiên mao

ở cực, không có khả năng tạo nội bào tử Chi Pseudomonas spp có nhiều loài

có khả năng cố định đạm như Pseudomonas diminuta, P fluorescens, P

paucimobilis, P pseudoflava, P putida, P stutzeri và P vesicularis (Chan et al., 1994) Một số dòng vi khuẩn Pseudomonas có khả năng hòa tan lân như

P fluorescens, P putida, P chlororaphis (Cattenlla et al., 1999) Một số loài thuộc chi Pseudomonas như: P putida, P fluorescens, P syringae có khả

năng tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật như IAA, cytokinin kích thích sự sinh trưởng của bộ rễ cây và làm tăng khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng trong đất (Glickmann et al., 1998), một số có khả năng kháng lại một

số vi sinh vật gây hại cây trồng Nhiều loài Pseudomonas được tìm thấy nội sinh trong nhiều loài thực vật như bông vải, đậu nành, cà phê, lúa hoang và lúa trồng (Koomnok et al., 2007) và khoai lang (Khan và Doty, 2009)

Vi khuẩn Burkholderia

Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn Gram âm, dạng que ngắn, chúng có thể di chuyển nhờ tiên mao ở đầu Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, trong môi trường ít khí oxy thì phát triển mạnh Vi khuẩn này có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần trong những cây họ đậu vùng nhiệt đới (Mounlin et al., 2001) Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định đạm, kích thích sự sinh trưởng của cây trồng, hiện diện vùng rễ và rễ của nhiều loài cây như bắp, mía và cà phê (Scarpella et al., 2003)

Trong số 40 loài thuộc chi Burkholderia, có nhiều loài có khả năng cố

định đạm như Burkholderia vietnamiensis, B brasilensis, B kururiensis, B tuberum, B phymatum, B unamae, B tropicalis và B terrae (Goris et al., 2004) Vi khuẩn B tropicalis được tìm thấy trong cây khóm (Trần Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp, 2012) Loài B vietnamiensis tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền Nam Việt Nam Thí nghiệm ở lúa cho thấy loài B vietnamiensis

sau 14 ngày bổ sung giúp tăng khả năng đâm chồi 33%, số lượng rễ tăng 57%, bề mặt lá tăng 30% và năng suất lúa tăng 13 - 22% (Van et al., 1994)

1.4.2 Tổng quan về chế phẩm sinh học

Chế phẩm sinh học là tập hợp các loài vi sinh vật gồm: Vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn Lactic, nấm men, xạ khuẩn, nấm mốc sống cộng sinh trong cùng môi trường Chế phẩm sinh học là những sản phẩm an toàn với môi trường, con người, vật nuôi, cây trồng và không gây hại và tác dụng phụ xấu khi sử dụng (Trần Thanh Loan, 2012)

Chế phẩm sinh học dùng trong nông nghiệp có những ưu điểm nổi trội so với các chế phẩm hóa chất Chế phẩm sinh học không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng như thuốc bảo vệ thực vật từ hóa chất Chế phẩm sinh học giúp cân bằng hệ sinh thái trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung Ví dụ như phân hữu cơ vừa tăng dinh dưỡng cho đất, vừa tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật đất hoạt động Sử dụng chế phẩm sinh học không những không làm thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất Chế phẩm sinh học giúp cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông phẩm Các loại chế phẩm sinh học còn có tác dụng tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làmảnh hưởng đến môi trường như các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa chất Tác dụng của chế phẩm sinh học đến từ từ chứ không nhanh như các loại hóa chất nhưng tác dụng dài lâu Một ưu điểm nữa của chế phẩm sinh học

là khả năng phân hủy, chuyển hóa các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp góp phần làm sạch môi trường (Minh Long, 2012)

Các chế phẩm sinh học dùng trong nông nghiệp có thể được chia làm bốn nhóm như sau:

Nhóm chế phẩm sinh học ứng dụng cho việc phòng trừ dịch hại trên cây trồng

Thực chất đây là thuốc BVTV nguồn gốc sinh học có thể tiêu diệt hoặc phòng trừ dịch hại Dịch hại là các sinh vật, vi sinh vật, các loại sâu hại, các loài gậm nhấm, có khả năng gây hại cho cây trồng và lương thực

Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân bón vi sinh

Phân vi sinh là loại phân có chứa hàm lượng vi sinh vật có ích cao (≥1x108CFU/g), thường không có hàm lượng chất dinh dưỡng kèm theo Phân

vi sinh được sản xuất và bón vào đất nhằm tăng lượng vi sinh vật có ích cho cây trồng, đặc biệt đối với vi sinh vật cố định đạm

Phân hữu cơ sinh học là sản phẩm phân bón được tạo qua quá trình lên men vi sinh vật các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc khác nhau và chuyển hóa thành mùn Không có yêu cầu chủng vi sinh phải đạt là bao nhiêu

Phân hữu cơ vi sinh là loại phân bón được sản xuất từ nguyên liệu hữu

cơ, có chứa ít nhất một chủng vi sinh vật có ích phù hợp với hàm lượng cao (≥1x106CFU/g) (Bùi Thị Hiền, 2014)

Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho cải tạo đất và xử lý phế thải nông nghiệp

Là các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học được đưa vào đất để cải tạo

lý hóa tính của đất (kết cấu đất, độ ẩm, hữu cơ, khả năng giữ nước, pH…), hoặc giải phóng đất khỏi những yếu tố bất lợi khác (kim loại nặng, vi sinh vật, hóa chất độc hại …) làm cho đất trở nên tốt hơn để sử dụng làm đất trồng cây

Nhóm điều hòa sinh trưởng cây trồng (hooc mon tăng trưởng).

Ở Việt Nam, hooc mon tăng trưởng được xếp vào danh mục thuốc BVTV, chia thành hai nhóm nhỏ:

- Nhóm các chất kích thích sinh trưởng: các chất có tác dụng kích thích

sự sinh trưởng và phát triển của cây Hàm lượng các chất này được quy định chặt chẽ

- Nhóm các chất ức chế sinh trưởng: các chất có tác dụng kìm hãm, ức chế sinh trưởng và phát triển của cây như làm lùn, làm chín, làm rụng lá…(Minh Long, 2012)

1.5 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật nội sinh và chế phẩm sinh học trên thế giới và Việt Nam

1.5.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật nội sinh và chế phẩm sinh học trên thế giới.

Đã có rất nhiều nhà khoa học đi sâu nghiên cứu về vi khuẩn và đặc biệt

là vi khuẩn sống nội sinh trong mô của thực vật Phần lớn các loài vi sinh vật nội sinh có hoạt tính sinh học, tạo ra chất kháng sinh quan trọng để ngăn chặn

sự xâm nhập của sinh vật gây bệnh gây ra đối với cây chủ, trong đó có cây lâm nghiệp và nông nghiệp Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng các chủng vi sinh vật nội sinh để bảo vệ cây trồng là vấn đề rất quan trọng và đã được nhiều nước trên thế giới quan tâm

Chanway (1996) tiến hành phân lập và định danh các loài vi khuẩn sống

ở trong mô của thực vật của 2 loài thông: thông (Pinus radiata) và thông đỏ (Thuija plicata).

Theo kết quả thí nghiệm trên Mía của Boddey et al (1995) tại Brazil cho thấy vi sinh vật nội sinh có thể cung cấp 80 kgN/ha/năm Khi nghiên cứu ở 4 loài lúa trồng khác nhau ở Ấn Độ, người ta đã xác định được vi sinh vật nội

sinh Gluconacetobacter diazotrophicus có khả năng cố định đạm nhờ vào gen nif (Muthukumarasamy et al., 2005) Có 32 dòng thuộc các chi Pantoea, Pseudomonas, Burkholderia, Acinetobacter và Ralstonia đã được phân lập từ

hai loại cây trồng phổ biến ở Trung Quốc là Ngô và Cải Tất cả các dòng đều

có khả năng hòa tan tricalcium phosphate và làm giảm pH môi trường, đồng thời có hơn 60% tổng số dòng còn có khả năng sản sinh indoleacetic acid và siderophore (Huang et al., 2010)

Nhiều nghiên cứu cho thấy các vi sinh vật nội sinh như Enterobacter cloacae, Azospirillum brasilense, Azotobacter, v.v có khả năng tổng hợp

IAA từ tiền chất L-tryptophan (Koga et al., 1999; Ahmad et al., 2005; Somers

et al., 2005) Các khám phá mới về khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh

cho cây thông qua các tác nhân đối kháng sinh học hay khả năng tổng hợp các hợp chất giúp phân hủy thuốc bảo vệ thực vật hay các dung môi hữu cơ của các vi sinh vật nội sinh cũng đã được thông báo (Nelson, 2004; Berg et al., 2005; Siciliano et al., 2001; Germaine et al., 2006).

Một số loại chế phẩm sinh học từ vi sinh vật hữu ích đã được sản xuất và ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp trên thế giới

EM - vi sinh vật hữu hiệu do Giáo sư tiến sĩ Teruo Higa Trường đại học Ryukyus, Okinawoa, Nhật Bảnsáng tạo và áp dụng vào thực tiễn Chế phẩm

EM là một tập hợp gồm khoảng 80 - 120 loài vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí thuộc 10 chi khác nhau Bao gồm các vi khuẩn quang hợp tổng hợp, vi khuẩn

cố định Nitơ (sử dụng các hợp chất nitơ), vi khuẩn lactic (chuyển hoá thức

ăn khó tiêu thành thức ăn dễ tiêu), nấm men (sản sinh ra các vitamin và axít amin), xạ khuẩn (sản sinh ra các kháng sinh) Trong quá trình hoạt động, hệ

vi sinh vật có lợi sẽ đầy lùi được sự phát triển của hệ vi sinh vật có hại, do đó tạo nên môi trường sống thuận lợi cho cây trồng Xử lý chế phẩm EM tạo nên sự cộng hưởng, kích thích sự sinh trưởng phát triển, phòng chống được các bệnh do vi sinh vật có hại gây ra cho cây trồng (Teruo Higa, 2002)

Dịch phân bón dinh dưỡng Sumagrow của Mỹ với tập hợp nhiều loại vi sinh vật hữu ích ở mật độ cao không những có khả năng làm tăng năng suất cây trồng từ 20 – 200%, thay thế được từ 50 – 100% lượng phân bón sử dụng mà còn làm giảm tỉ lệ sâu bệnh, cung cấp dinh dưỡng và góp phần cải tạo đất (Sumagrow org.,2014)

1.5.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng vi sinh vật nội sinh và chế phẩm sinh học ở Việt Nam

Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững và ứng dụng Công nghệ sinh học vào nông nghiệp, trong những năm gần đây Việt Nam có khá nhiều nghiên cứu về các vi sinh vật nội sinh để sản xuất phân bón sinh học cho cây trồng

Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thị Mộng Huyền (2015) đã tiến hành phân lập và xác định đặc tính của 36 dòng vi sinh vật nội sinh trên rễ cây khoai

lang (Ipomoea batatas) trồng trên đất phèn ở huyện Hòn Đất, tỉnh Kiên

Giang Tất cả các dòng vi khuẩn này đều có dạng hình que và có khả năng chuyển động Trong đó, các dòng KL9, KL11, KL39a, KL39b là các vi sinh vật nội sinh có đủ 3 đặc tính tốt là cố định đạm, hòa tan lân khó tan, tổng hợp IAA

Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thành Dũng (2010) đã tiến hành phân lập được 101 dòng vi khuẩn trong cây khóm trồng ở huyện Vĩnh Thuận, tỉnh Kiên Giang trong đó có 85 dòng được xác định là vi sinh vật nội sinh bằng kỹ thuật PCR 16S-rDNA Sử dụng phép thử sinh hóa đã xác định được 38/85 dòng vi sinh vật nội sinh có đủ 3 đặc tính tốt (cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA)

Lăng Ngọc Dậu (2004) đã nghiên cứu khả năng tạo IAA của vi khuẩn

Azospirillum lipoferum, tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn này trên môi trường

Nfb có bổ sung Tryptophan và theo dõi tại những thời điểm khác nhau Kết quả cho thấy tại thời điểm 10 ngày sau khi cấy ủ, khả năng tao IAA cao nhất

Nguyễn Anh Dũng và cộng sự (2012) đã phân và xác định mức độ cố

định đạm sinh học của Azospirillum trên cây ngô trong bầu đất tại Đăk Nông

Kết quả chủng này có thể thay thế 25– 50% N, cho năng xuất cao hơn đối chứng khi bón 100%N mà không nhiễm vi khuẩn

Phạm Bích Hiên và cộng sự (2003) đã nghiên cứu 10 chủng Azotobacter

của Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố định N chúng còn có khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA Nhiệt độ thích hợp của các chủng này là 25-300C, pH thích nghi rộng từ 5,5- 8,0

Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Mít (2007) cũng nghiên cứu hiệu quả

phân vi khuẩn Gluconacetorbacter diazotrophycus và vi khuẩn Pseudomonas

stusderi trên năng suất và trữ lượng đường trên cây mía (Saccharum officinarumL.) trồng trên đất phù sa tỉnh Hậu Giang

Trần Thanh Phong (2012) đã nghiên cứu đánh giá khả năng cố định đạm của vi sinh vật nội sinh đến năng suất và chất lượng của trái khóm trồng tại Huyện Tân Phước, Tỉnh Tiền Giang

Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu bón thử nghiệm chủng cố định

N tự do Azotobacter và chủng phân giải phosphate Archomobacter và Pseudomonas aeruginosa Kết quả cho thấy chế phẩm sinh học làm tăng sinh

trưởng chiều cao mạ 7,47 - 16,93% và năng suất lúa tăng từ 13,39 – 55,85%.Lâm Minh Tú và Trần Văn Tuân (2003) nghiên cứu sản xuất một số loại phân bón đơn chủng và đa chủng cho cây trồng Các chủng sử dụng trong

nghiên cứu là Azotobacter bejerinski, Azotobacter vinelandii, Bacillus subtilis

và Bacillus polymyxa Thử nghiệm trên khoai tây làm tăng năng suất từ 100 -

300% so với đối chứng

Hồ Thị Kim Anh (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng cố định N trong rễ lúa đến sinh trưởng của mầm lúa CR 203 Nhóm tác giả đã phân lập được 78 chủng cộng sinh với rễ lúa Các chủng này có đặc điểm của chi

Azospirillum Các chủng này kích thích sự nảy mầm và rễ của lúa CR 203.

Nguyễn Thị Ngọc Sương và cộng sự (2016) đã nghiên cứu và sản xuất

được chế phẩm hòa tan lân từ vi khuẩn Bacillus B68 và vi khuẩn Pseudomonas T15 có khả năng hòa tan lân khó tan khá cao và không gây độc

Chế phẩm sinh học nấm đối kháng Trichoderma ngoài tác dụng sản xuất phân bón hũu cơ sinh học hay sử dụng như một loại thuốc BVTV thì còn có tác dụng để xử lý ủ phân chuồng, phân gia súc, vỏ cà phê, chất thải hũu cơ như rơm rạ và rác thải hữu cơ rất hiệu quả Chế phẩm sinh học BIMA (có

chứa Trichoderma sp.) của Trung Tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí

Minh, chế phẩm Vi-ĐK của Công ty thuốc sát trùng Việt Nam đang được nông dân TP Hồ Chí Minh và khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long, Đông Nam Bộ sử dụng rộng rãi trong việc ủ phân chuồng bón cho cây trồng Việc

sử dụng chế phẩm sinh học này đã đẩy nhanh tốc độ ủ hoai phân chuồng từ 2 – 3 lần sovới phương pháp thông thường, giảm thiểu ô nhiễm môi trường do mùi hôi thối của phân chuồng (Trần Minh Hiền và cộng sự, 2013)

Chế phẩm sinh học cải tạo đất

Viện Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm sinh học giữ ẩm cho đất có tên

là Lipomycin -M Thành phần chính là của Lipomycin-M là chủng nấm men Lipomyces PT7.1 có khả năng tạo màng nhầy trong điều kiện đất khô hạn,

giúp giảm thoát nước, duy trì độ ẩm cho đất trong điều kiện địa hình không có nước tưới thời gian dài, góp phần nâng cao tỷ lệ sống của cây trồng và hỗ trợ tốt cho việc phủ xanh đất trống đồi trọc Chế phẩm sinh học này được xem là một giải pháp cải tạo đất bền vững cho môi trường sinh thái (Trần Minh Hiền

và cộng sự, 2013)

Chế phẩm sinh học ứng dụng phòng trừ sâu bệnh

Bằng kỹ thuật công nghệ sinh học, các nhà khoa học Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu và sản xuất ra 7 loại chế phẩm thuộc nhóm

thuốc trừ sâu sinh học như chế phẩm vi sinh BT (Baccilus Thuringiensis var.)

có nguồn gốc vi khuẩn, phổ diệt sâurộng và hữu hiệu đối với các loại sâu như sâu cuốn lá, sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang và sâu ăn tạp

Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng trường Đại học Cần Thơ cũng

đã nghiên cứu và đưa ra 02 chế phẩm sinh học Biobac và Biosar có khả năng phòng trừ 02 bệnh thường gặp trên lúa là đốm vằn và cháy lá (Trần Minh Hiền và cộng sự, 2013)

1.6 Cơ sở khoa học của việc sử dụng vi sinh vật đối với sản xuất chế phẩm sinh học.

1.6.1 Khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ của vi sinh vật

- Xenlulo (glucan) là hợp chất cao phân tử được trùng hợp (polyme hóa)

từ các gốc β - D - glucozơ bằng liên kết β - 1,4 - glucozơ nhờ khả năng tự dưỡng dưới ánh sáng mặt trời của giới thực vật

Hệ vi sinh vật phân hủy tàn dư thực vật chủ yếu là xenlulozơ khá phong phú gồm có vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc Chúng có khả năng tiết vào môi trường enzym thủy phân xenlulo là enzym xenlulaza Hệ enzym này gồm 3 enzym là endoglucanaza, exoglucanza và β - glucozidaza Quá trình thủy phân xenlluloza theo trình tự như sau:

- Hemixenlulo (xylan) là một phức hệ gồm Endo - 1,4 - β - D - mannaza

và 1,4 - β - D - xylozidaza Enzym mannaza thủy phân xylan thành các oligosaccarit hòa tan trong nước và enzym xylozidaza sẽ tiếp tục thủy phân Sản phẩm cuối cùng là xylozo và mannozo (Lương Đức Phẩm, 2011)

- Tinh bột là chất dinh dưỡng chính dự trữ ở thực vật, có nhiều ở trong các loại hạt ngũ cốc và củ (khoai lang, khoai tây, sắn ) Tinh bột dưới tác dụng của enzym amylaza do vi sinh vật tiết ra sẽ bị thủy phân thành dextrin, đường maltozo và glucozo (Lương Đức Phẩm, 2011)

- Pectin là hợp chất polymer dạng keo, thuộc loại polysaccarit dị hình được cấu tạo từ các gốc axit galacturonic với nhau bằng liên kết α - 1,4 - glucozit và một số gốc khác Trong thành phần có axit pectinic, axit pectic và

protopectin Pectin có mặt trong tất cả các mô thực vật bậc cao (khoảng 5%)

là thành phần cơ bản của thực vật Cùng với lignin và xenlulozơ, pectin tham gia hình thành bộ khung của thực vật, điều chỉnh độ ẩm và trạng thái của tế bào thực vật Pectin bị phân giải bởi enzym pecticnaza Enzym này được sản sinh nhờ một số loài vi khuẩn và nhiều loài nấm mốc (Lương Đức Phẩm, 2011)

- Protein là hợp chất được cấu tạo từ các axit amin với mối liên kết peptit Quá trình phân hủy các chất protein dưới tác dụng của vi sinh vật còn gọi là quá trình thối rữa hoặc quá trình amôn hóa Quá trình phân hủy các chất protein xảy ra như sau: Protein  Polypeptit  Oligopeptit Axit amin NH3 (Lương Đức Phẩm, 2011)

1.6.2 Khả năng phân giải và chuyển hóa lân của vi sinh vật

Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ

Sự chuyển hoá các hợp chất lân hữu cơ thành muối của H3PO4

(Stoklaza–1991, Menkina – 1952) theo sơ đồ hình 1.1

Sơ đồ của quá trình phân giải nucleoprotein:

Nucleoprotein Nucleinaxit nucleicNucleotic H3PO4

Lơxitin  Glixerphosphat  H3PO4

Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ chủ yếu gồm các chủng Bacillus và Pseudomonas

- Bacillus mycoides: Vi khuẩn hình que, dài khoảng 1,6 – 3,6µ, rộng khoảng

0,5 - 1µ, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là vi khuẩn yếm khí, có tiêm mao ở đầu và quanh cơ thể Trên môi trường thạch, khuẩn lạc gần giống khuẩn lạc của nấm Nó có thể phân giải lân hữu cơ và amôn hoá protit nhưng không sinh H2S

Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hoá các hợp chất lân hữu cơ thành muối của

H 3 PO 4

- Bacillus megaterium var phosphaticum: Vi khuẩn hình que, có nha

bào, yếm khí tuỳ tiện, có khả năng phân giải lân hữu cơ rất mạnh

Bacillus là trực khuẩn gram dương, sinh bào tử, chiều ngang của bào tử

không vượt quá chiều ngang của tế bào vi khuẩn, do đó khi có bào tử vi khuẩn không thay đổi hình dạng, bào tử của vi khuẩn này có sức sống rất lâu

Ngoài ra, còn có các vi khuẩn như: Bacillus cereus, Bacillus asterosporus,Pseudomonas sp cũng có khả năng phân giải lân hữu cơ Ngày

nay, ngoài vi khuẩn, người ta còn thấy xạ khuẩn, nấm cũng có khả năng phân giải lân hữu cơ (Dương Hồng Dật, 1979)

Vi sinh vật phân giải lân vô cơ

Quá trình có thể phân giải lân vô cơ theo phương trình sau:

Ca3(PO4)2 + 2 H2CO3 + H2O  Ca(H2PO4)2 H2O + 2 Ca(HCO3)2

Trong đất, vi khuẩn nitrat hoá và vi khuẩn chuyển hoá lưu huỳnh cũng

có tác dụng quan trọng trong việc phân giải Ca3(PO4)2 Vì trong quá trình sống, các vi khuẩn này tích luỹ trong đất HNO3 và H2SO4 Quá trình hoà tan

có thể biểu thị theo các phương trình sau:

Ca3(PO4)2 + 4 HNO3 Ca(H2PO4)2 + 2 Ca(NO3)2

Ca3(PO4)2 + 2 H2SO4 Ca(H2PO4)2 + 2 CaSO4

Các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng phân giải lân của vi sinh vật gồm có:

- Độ pH: nhìn chung pH, ít ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân Tuy nhiên pH trong khoảng 7,8 – 7,9 ảnh hưởng tốt tới sự phát triển của hệ vi sinh vật phân giải lân

- Nhiệt độ: các chủng vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp cho quá trình phân giải lân là khác nhau Nhìn chung, khoảng nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 20 – 40oC

- Hợp chất hữu cơ: chất hữu cơ làm tăng quá trình sinh trưởng của vi sinh vật Do đó khả năng phân giải lân của chúng sẽ tăng lên

- Độ ẩm: ở những nơi có độ ẩm cao, do hoạt động của vi sinh vật mạnh nên tạo ra nhiều axit hữu cơ làm tăng phân giải lân

- Hệ rễ: hệ rễ cây trồng khích thích sự sinh trưởng của vi sinh vật Do đó phân giải lân cũng được tăng cường (Dương Hồng Dật, 1979)

1.6.3 Khả năng cố định Nito của vi sinh vật

Trong suốt quá trình cố định đạm sinh học N2 giảm trong hệ thống vận chuyển điện tử kết quả tạo NH3 và phóng thích H2 NH3 sau đó được sử dụng

để tổng hợp các chất khác Quá trình chuyển N2 thành NH3 được xúc tác bởi phức hệ enzyme nitrogenase với sự tham gia của năng lượng ATP Enzyme

dinitrogenase reductase và dinitrogenase có các tiểu đơn vị nif (γ2 homodimeric azoferredoxin) và NifD/K (α2β2 heterotetrameric

molybdoferredoxin) Điện tử chuyển từ ferredoxin (hoặc flavodoxin) đến dinitrogenase reductase và chuyển đến dinitrogenase, cung cấp điện tử dưới dạng H2 đến các N2 tạo thành NH3 Mỗi mol N2 được cố định cần có 16 ATP

và có sự tham gia của protein nifH (Kneip et al., 2007).

Phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase tổng hợp N2

thành NH3 theo sơ đồ sau:

Ammonia được tạo ra trong chu trình tiếp tục kết hợp với chuỗi carbon

để đồng hóa thành những acid amin đầu tiên cung cấp trực tiếp cho cây trồng Nitrogenase là một phức hệ enzyme, enzyme này được điều khiển bởi hệ thống gen nif có trong bộ genome của tế bào vi khuẩn Enzyme nitrogenase không chỉ xúc tác cho quá trình tổng hợp N2 thành NH3, mà còn có thể xúc tác khử các chất CH3CN, HCN, NH3, N2O, C2H2, thành các sản phẩm tương ứng như C3H6, CH4, H2, N2, C2H4 (Kneip et al., 2007)

1.6.4 Khả năng tổng hợp IAA của vi sinh vật

Indole-3-acetic acid (IAA) là dạng auxin, là chất điều hòa sinh trưởng của thực vật IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa sinh mô, phát triển trái và hạt và chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng (Theologies và Ray, 1982) Theo Sergeeva et al., (2002), các nhóm vi khuẩn khác nhau kể cả vi khuẩn đất, vi khuẩn biểu sinh, vi sinh vật nội sinh

và một số vi khuẩn lam (Cyanobacteria) đã được phát hiện là có khả năng sinh tổng hợp indole-3-acid acetic từ tiền chất L-tryptophan (Trp) Một số loài của các chi Azospirillum, Gluconacetobacter và Pseudomonas là những

vi khuẩn cố định đạm nhưng nhờ vào khả năng tổng hợp IAA của chúng nên cũng được xem là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật, góp phần làm tăng sản lượng cây trồng (Kloepper et al., 1989)

Có 3 lộ trình tiêu biểu nhất cho sự biến đổi của L-tryptophan thành IAA

đã được Koga et al., (1991) mô tả chi tiết như sau:

Lộ trình indole-3-pyruvic acid:

Tryptophan  indole-3-pyruvic acid  indole-3-acetaldehyde IAA

Lộ trình tryptamine:

Tryptophan  tryptamine  indole-3-acetaldehyde  IAA

Lộ trình indole-3-acetamide: Tryptophan  indole-3-acetamide  IAACarređo-López et al., (2000) cũng nhận thấy trong các lộ trình tổng hợp

IAA ở loài Azospirillum brasilense thì lộ trình indole-3-pyruvic acid vẫn là

con đường chủ yếu để tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan và được xúc tác chủ yếu bởi enzyme indole pyruvic decarboxylase (Costacurta et al., 1994)

1.6.5 Khả năng kháng bệnh hại cây trồng

Nhiều loạivi sinh vật có khả năng kháng bệnh hại cây trồng bởi một số

cơ chế sau:

Cơ chế do kháng sinh

Kháng sinh là một chất quan trọng sinh ra trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật để tiêu diệt những mầm bệnh có trong đất, giúp cây trồng phát triển Nó có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn một cách đặc hiệu (Lê Thị Thanh Thủy, 2014)

Cơ chế do siderophore

Vi sinh vật đối kháng có khả năng cạnh tranh trực tiếp với nguồn bệnh về dinh dưỡng, oxy, không gian sống, sinh kháng sinh, tạo siderophore v v để sinh trưởng Trong đó, siderophore là một loại protein sinh ra trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, nó có khả năng hấp thụ các ion Fe+3 trong môi trường với ái lực cao nhằm phục vụ trực tiếp cho sự sinh trưởng và hô hấp của

vi sinh vật, làm cho môi trường xung quanh nghèo sắt, dẫn đến các loại vi sinh vật khác không có đủ ion Fe+3 cho quá trình sinh trưởng của mình, do đó chúng

sẽ không sinh trưởng được (Lê Thị Thanh Thủy, 2014)

Cơ chế tăng cường sức đề kháng của cây

Tác dụng của vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật: Vi khuẩn kích

thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth-Promoting Bacteria – PGPB) là vi

khuẩn vùng rễ khi tương tác với rễ cây có thể tạo ra tính kháng của cây chống lại vi khuẩn, nấm và virut gây bệnh Hiện tượng này được gọi là tính kích kháng hệ thống - ISR (Induced Systemic Resistance), cũng giống như tính kích kháng hệ thống có điều kiện - SAR (Systemic Acquired Resistance) (Ryu, C M và cs., 2004)

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vi sinh vật nội sinh

- Địa điểm nghiên cứu: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Thí nghiệm chậu vại: cây rau mồng tơi (Basella alba L)

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1 đến tháng 5 năm 2016

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Đặc điểm phân bố và tính chất của đất mặn tại Nam Định

- Phân lập các chủng vi sinh vật nội sinh

- Đánh giá đặc tính sinh học và tuyển chọn chủng vi sinh vật nội sinh

- Phân loại các chủng vi sinh vật nội sinh được tuyển chọn

- Hiệu quả của chế phẩm dinh dưỡng vi sinh từ vi sinh vật nội sinh trên cây trồng

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu thập số liệu thứ cấp

Số liệu thứ cấp được thu thập là các tài liệu về điều kiện tự nhiên, đặc điểm và tính chất của vùng sinh thái đất mặn tại Nam Định

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu đất được lấy tại khu vực xã Giao Thiện, huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định để xác định độ mặn của đất Kỹ thuật lấy mẫu đất theo TCVN 7538-2:2005.

Lựa chọn các loại cây trồng, cây dại phổ biến tại vùng sinh thái đất mặn, sinh trưởng và phát triển tốt, không bị dịch bệnh, sâu hại để phục vụ cho nghiên cứu

2.4.3 Phương pháp khử trùng mẫu

Mẫu cây được rửa sạch đất bám ở rễ, thân và lá; sau đó cắt rời rễ và thân cây ra Để loại trừ các vi sinh vật có khả năng còn bám ở bề mặt, mẫu sau khi thu thập được tiến hành xử lý như sau: rửa sạch phần thân, rễ dưới vòi nước mạnh; tiếp tục rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi cắt rễ và thân thành những đoạn nhỏ 1-2 cm, làm khô mẫu bằng giấy hút ẩm; sau đó lần lượt khử trùng mẫu (rễ, thân) bằng cồn 96% trong 3 phút , hypochloride 1% trong 3 phút, hydrogen peroxide 3% trong 3 phút và rửa lại với nước cất vô trùng 4 lần để tẩy rửa các loại hóa chất còn thừa

Để kiểm tra khả năng các vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt mẫu sau khi khử trùng, lấy 200μl nước cất vô trùng đã rửa mẫu ở lần thứ 4 (lần cuối) chủng lên các đĩa môi trường Tryptone glucose yeast agar (phụ lục 1) và ủ ở

300C, nếu sau 24 giờ ủ các đĩa môi trường này không có sự xuất hiện các khuẩn lạc thì các mẫu đã khử trùng đạt yêu cầu (Cao Ngọc Điệp, 2010)

2.4.4 Phân lập vi sinh vật nội sinh

Chọn các mẫu rễ, thân đã khử trùng đạt yêu cầu cho vào các ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng, dùng đủa thủy tinh đã khử trùng trên đèn cồn nghiền mịn mẫu Lấy 200μl dịch nghiền của rễ, thân, lá lần lượt cho vào các ống nghiệm chứa 3ml môi trường rồi đem ủ ở 300C trong 48h, mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần Sau 48h, quan sát ống nghiệm chứa môi trường bán đặc, nếu thấy có một lớp màng mỏng gần bề mặt môi trường thì chứng tỏ có sự hiện diện của vi sinh vật nội sinh trong dịch chiết xuất mẫu

Lấy một ít vi khuẩn từ các màng mỏng của các môi trường bác đặc để tách dòng các khuẩn lạc Sau vài lần cấy truyền trên các môi trường đặc chọn các khuẩn lạc rời và đều nằm trên đường cấy Khi thấy vi khuẩn đã đồng nhất thì cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường đặc trưng.

Các môi trường phân lập vi sinh vật nội sinh bao gồm: YMA, CA, LB, MPA, Gause 1, NA, Hansen, LGI (phụ lục 2)

Vi sinh vật hiếu khí được cấy chuyền và giữ trong ống thạch nghiêng

Ở nhiệt độ phòng, phương pháp này chỉ giúp giữ giống ngắn hạn, cần phải cấy chuyền lại sau vài tuần Để kéo dài thời gian bảo quản từ 3 – 5 tháng, ống giống trong tủ lạnh được bảo quản trong tủ lạnh (ở nhiệt độ khoảng 5oC)

2.4.5 Xác định khả năng phân giải xenlulo và tinh bột theo phương pháp khuếch tán phóng xạ trên đĩa thạch (William, 1983)

Nuôi dịch chiết: Nuôi cấy vi sinh vật trên 9ml dung dịch môi trường chuyên tính với 1 vòng que cấy chứa vi sinh vật, đưa lên máy lắc ở 150 vòng/phút Sau 72 giờ dịch nuôi cấy được đánh giá khả năng phân giải enzym

Bảng 2.1 Thành phần môi trường phân giải xenlulo và tinh bột

Đơn vị: g/l nước cấtPhân giải xenlulo Phân giải tinh bột

Môi trường đem hấp ở 1210C, áp suất 1 atm trong vòng 20 phút, đổ ra đĩa petri với lượng môi trường dày 2mm và để nguội Dùng miệng ống nghiệm đã khử trùng đục 3 lỗ trên 1 đĩa thạch với đường kính 12mm

Nhỏ dịch: Hút 0,2ml dịch thể nhỏ vào các lỗ thạch đã đục Đặt đĩa petritrong tủ lạnh 6 giờ để enzym khuếch tán trên đĩa thạch, sau đó đặt vào tủ nuôi ở 28oC trong 48 giờ rồi đem nhuộm màu bằng dung dịch lugol, sau khi xuất hiện vòng phân giải đem đo đường kính và khả năng phân giải được tính bằng hiệu giữa đường kính vòng phân giải và đường kính lỗ thạch

2.4.6 Xác định khả năng phân giải lân

Nuôi dịch chiết: Nuôi cấy vi sinh vật trên 9ml dung dịch môi trường chuyên tính với 1 vòng que cấy chứa vi sinh vật, đưa lên máy lắc ở 150 vòng/phút Sau 48 giờ dịch nuôi cấy được đánh giá khả năng phân giải Môi trường đem hấp ở 1210C, áp suất 1 atm trong vòng 20 phút, đổ ra đĩa petri với lượng môi dày 2mm và để nguội Cấy chấm điểm dịch nuôi vi sinh vật trên môi trường Pikovaskya (phụ lục 3)

Theo dõi khả năng hình thành phòng phân giải của các chủng vi sinh vật trong thời gian 72h Vi sinh vật có hoạt tính phân giải lân sẽ có vòng sáng tạo thành xung quanh khuẩn lạc, còn vùng chưa phân giải có màu đục hơn

Khả năng phân giải lân được tính bằng hiệu giữa đường kính vòng sáng

và đường kính khuẩn lạc vi sinh vật

2.4.7 Định lượng IAA bằng phương pháp Salkowski.

Vi khuẩn được nuôi trong môi trường NA bổ sung 0.1% tryptophan lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 300C trong 48h Sau đó thu dịch nuôi cấy đem ly tâm với tốc độ 5500 vòng/ phút trong 5 phút

Hút 1 ml dịch trong thu được sau ly tâm cho vào ống nghiệm chứa sẵn

2 ml thuốc thử Salkowski (phụ lục 4), đối chứng là 1 ml môi trường dịch thể

đã ly tâm không nuôi vi sinh vật thêm vào 2 ml thuốc thử Lắc đều, để trong tối 20 phút So màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng 530nm Chỉ số OD được đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lượng IAA trong dịch nuôi cấy Hàm lượng IAA tính theo đơn vị µg IAA/ml

Phương pháp xây dựng đồ thị đường chuẩn

Xây dựng đường chuẩn IAA: gồm 10 bình định mức được đánh số theo thứ tự từ 0 đến 10 với ống 0 là bình đối chứng âm, hàm lượng IAA các bình theo thứ tự tăng dần là 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60,70, 80, 90 µg/ml IAA

Lắc đều các bình sau đó hút từ mỗi bình 1ml dung dịch thêm vào 2 ml thuốc thử Salkowski lần lượt vào các ống nghiệm đánh số từ 0 đến 10 Lắc đều, để trong tối 20 phút So màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng

530nm Chỉ số OD đo được dùng để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiến hành

đo giá trị OD của các mẫu thí nghiệm

Phương trình đường chuẩn có dạng: Y = a * X + b, trong đó X là nồng độ của mẫu (µg/ml), Y là độ hấp phụ quang (OD 530nm) Hàm lượng IAA tương đương IAA có trong mẫu theo công thức: X = (Y-b)/a

2.4.8 Đánh giá khả năng thích ứng pH và nhiệt độ

- Đánh giá khả năng thích ứng pH khác nhau: Bổ sung 10% dung dịch đệm pH (pha bằng Na2HPO4 và KH2PO4, đo và chỉnh pH của dung dịch bằng giấy quỳ) vào môi trường chuyên tính, đem hấp khử trùng và đổ vào đĩa petri, cấy vi sinh vật tương ứng và đem nuôi ở 28oC sau đó đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành

- Đánh giá khả năng chịu nhiệt của các chủng vi sinh vật: Cấy vi sinh vật trên từng môi trường chuyên tính tương ứng sau đó đem nuôi ở các mức nhiệt

độ khác nhau 20oC – 30oC – 35oC – 40oC, đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành

2.4.9 Xác định tính đối kháng của chủng vi sinh vật theo phương pháp cấy vạch.

Các chủng được đánh giá tính đối kháng theo từng cặp theo phương pháp đường vuông góc Cross-Streak Các chủng vi sinh vật được cấy thành cặp theo các đường giao nhau Nếu xuất hiện vòng đối kháng (các chủng mọc cách nhau) thì các chủng đó đối kháng nhau và không thể phối trộn chúng vào cùng chất mang

2.4.10 Phân loại sơ bộ các chủng vi sinh vật

Phân loại các chủng vi sinh vật bằng phương pháp so sánh đặc điểm hình thái và các phản ứng sinh hóa đặc trưng theo khóa phân loại Cambell (1971), Peter (1991) và Bergey (2009)

2.4.11 Xác định chất lượng của chế phẩm dinh dưỡng vi sinh

Giống vi sinh vật nội sinh từ ống giống được cấy chuyển và nhân giống riêng rẽ trên môi trường chuyển thể chuyên tính trên máy lắc với tốc