Đặng Thị Mai Lan, Đặng Xuân Bình 2016, “Xác định tỷ lệ nhiễm và đặc tính sinh vật hóa học của một số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm trên thịt lợn tươi bán tại chợ trên địa bàn các tỉnh m
Trang 2ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y
Thái Nguyên, năm 2017
Trang 3Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Đặng Xuân Bình 2 PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh Phản biện 1:………
………
Phản biện 2:………
………
Phản biện 3
.
Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận cấp Đại học Thái Nguyên họp tại: ………
………
Vào hồi giờ ngày tháng năm
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia;
- Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên;
- Thư viện Trường Đại học Nông Lâm
Trang 4CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1 Đặng Thị Mai Lan, Đỗ Hồng Anh, Nguyễn Thị Huê, Trần
Phi Vương (2014), “Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus trong thịt lợn ở thành phố Thái Nguyên”, Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, Chuyên đề Nông lâm nghiệp trung
du, miền núi phía Bắc, tháng 6/2014, tr 104 - 110
2 Nguyễn Thị Hoài Thu, Phạm Thùy Linh, Bùi Văn Ngọc, Đặng Thị Mai Lan, Nghiêm Ngọc Minh (2015), “Biểu hiện và tinh sạch
vùng quyết định kháng nguyên Staphylococcus enterotoxin B (SEB)
được mã hóa bởi đoạn gen seb phân lập từ chủng tụ cầu vàng tại Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 13 (2), tr 295 - 301.
3 Đặng Xuân Bình, Đặng Thị Mai Lan, Nguyễn Thị Thu
Huyền (2015), “Indentification and Characterrization of
Staphylococcus aureus Bacteria In Fresh Pork At Public Markets In The North of Vietnam”, Research Journal of Animal and Veterinary Sciences, 8(2) Special 2015, pp 24 - 32.
4 Đặng Thị Mai Lan, Đặng Xuân Bình (2016), “Xác định
tỷ lệ nhiễm và đặc tính sinh vật hóa học của một số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm trên thịt lợn tươi bán tại chợ trên địa
bàn các tỉnh miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XXIII, số 6, tr 53 - 63.
5 Đặng Thị Mai Lan, Đặng Xuân Bình (2016), “ Xác định
khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp., Staphylococcus aureus phân lập được trên thịt lợn tươi bán tại chợ một số tỉnh miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XXIII, số 7, tr 46 - 53.
Trang 5MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm gần đây, ngộ độc thực phẩm (NĐTP) xảy rathường xuyên và với số lượng vụ NĐTP rất lớn làm ảnh hưởngkhông nhỏ đến sức khoẻ con người và kinh tế của người dân.Nguyên nhân là do thức ăn không đảm bảo vệ sinh, nhiều tạp chất,chất hoá học… đặc biệt do thức ăn nhiễm một số loại vi khuẩn như:
E coli, Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Staphylococcus aureus và Listeria monocytogenes…
Xuất phát từ thực tiễn chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu xác định tỷ lệ nhiễm và độc tố đường ruột (enterotoxin) của vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., Staphylococcus aureus ô nhiễm trong thịt lợn ở một số tỉnh phía Bắc”
* Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S aureus… nhiễm trên thịt lợn bán tại chợ ở các tỉnh khu vực phía Bắc.
- Nghiên cứu và xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột
của chủng vi khuẩn Salmonella spp và S aureus phân lập được.
* Ý nghĩa khoa học
- Cung cấp tư liệu khoa học về loài Salmonella spp và trình tự gene độc tố enterotoxin type B của S aureus phục vụ nghiên cứu tiếp
theo nhằm phòng, chống hiệu quả NĐTP
- Là cơ sở khoa học từ đó đề xuất biện pháp khống chế ô nhiễm
thịt lợn do Salmonella spp và S aureus gây ra.
* Ý nghĩa thực tiễn
- Bổ sung tư liệu về tình hình nhiễm khuẩn nói chung, ô nhiễm
Listeria, Salmonella spp và S aureus nói riêng trên thịt lợn.
Trang 6- Bổ sung tư liệu về độc lực và khả năng sản sinh độc tố
enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp., S aureus và giải trình tự
gene sản sinh độc tố của chúng
* Điểm mới của đề tài
- Xác định được khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi
khuẩn Salmonella spp., S aureus ô nhiễm trên thịt lợn.
- Đã nhân dòng và xác định trình tự của gene seb dạng tự nhiên
kích thước 534 bp và gene sản sinh độc tố enterotoxin của
Salmonella spp Đồng thời, đã nhân, biểu hiện và tinh sạch thành công protein tổ hợp seb 534 ở dạng tự nhiên.
* Bố cục của luận án
Luận án gồm154 trangđược chia thành các 3 chương, phần mởđầu: 3 trang, chương 1: Tổng quan tài liệu 49 trang; chương 2: Vậtliệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 19 trang; chương 3: Kếtquả nghiên cứu và thảo luận 57 trang; Kết luận và đề nghị 2 trang;Danh mục các công trình có liên quan đến luận án 01 trang; Tài liệutham khảo 16 trang; Hình ảnh của luận án 4 trang, Phụ lục 3 trang.Luận án có 29 bảng, 22 hình, 152 tài liệu tham khảo (65 tài liệu tiếngViệt, 79 tài liệu tiếng nước ngoài, 08 tài liệu Internet) và 12 ảnh màuđược cấu trúc từ ảnh điện di
Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Bộ Y tế (2008) đã tổng hợp số liệu thống kê của Cục an toàn Vệsinh thực phẩm trong vòng 8 năm (2000 - 2007) cho thấy: Nước ta,xảy ra 1.616 vụ NĐTP làm 41.898 người mắc, 436 người tử vong thì
có 178 vụ làm 4.036 người mắc và 7 tử vong người do sử dụng thức
ăn đường phố Trong các nguyên nhân gây NĐTP thì nguyên nhân
do vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao nhất (43,20 %)
Đặng Xuân Bình và Dương Thùy Dung (2010) cho biết: Trongtổng số 136 mẫu thịt lợn tươi được thu thập tại các chợ khu vực
Trang 7Trung tâm thành phố Thái Nguyên từ 5/2009 - 4/2010 có chỉ tiêu
tổng số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt chiếm 50 - 56 %; E coli chiếm 37,9 - 48,7 %; Salmonella spp chiếm 10 - 19,5 %; Bacillus cereus chiếm 27,5 - 31,7 %; S aureus chiếm 31,0 - 38,8 %; C perfringens
chiếm 10 - 14 %
Lê Huy Chính (2003) cho biết: vi khuẩn Listeria ít kháng thuốc kháng sinh, có thể điều trị bệnh do Listeria bằng penicillin hoặc
erythromycin cho kết quả tốt Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn đã
kháng lại tetracycline như: Listeria là 48,3 %; Salmonella spp là 63,6 %; Yersinia spp là 51,3 % (Jamali H và cs., 2014).
Trần Thị Xuân Mai và cs (2011) đã thực hiện kỹ thuật PCR đa
mồi để phát hiện Salmonella enteritica trong thực phẩm Kết quả nghiên cứu cho thấy cặp mồi invA đặc hiệu cho Salmonella spp và cặp mồi spvC đặc hiệu cho S enteritica (gồm S typhimurium và
S enteritidis) đã được phát triển thành công
Theo Walter Chaim và David A Eschenbach (2014) thì các yếu
tố độc lực của Listeria monocytogenes bao gồm: listeriolysin O
(LLO), protein ACTA, phospholipases, metalloprotease, protein P60,protease CLP và ATPases
Steven R G và cs (2005) đã thành công trong việc giải trình tự
bộ gene dài 2809422 bp của chủng Staphylococcus aureus COL Kết
quả giải trình tự đã được ghi nhận trên Genbank với mã số:CP000046.1 cho hệ gen nhân và CP000045 cho hệ gene plasmid Nghiêm Ngọc Minh và cs (2011) đã lựa chọn ngẫu nhiên dòng
khuẩn lạc số 1 để tiến hành biểu hiện protein tái tổ hợp seb ở nồng
độ IPTG 0,1 mM; nhiệt độ 30oC và thời gian cảm ứng là 5 giờ Kết
quả cho thấy protein seb đã được biểu hiện có khối lượng khoảng 28
kDa đúng theo lý thuyết tính toán
Trang 8Hao D và cs (2015) cũng đã phát hiện các gene mã hóa độc tố tụ
cầu vàng, trong đó gene chiếm ưu thế là sec (38,5 %); tiếp theo là seg (19,7 %); sej (16,2 %); see (12,8 %); sea (11,1 %) và seb (10,3 %)
Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
- Thịt lợn tươi sống bán tại chợ của Thái Nguyên, Hà Tây - HàNội, Bắc Giang, Vĩnh Phúc
- Vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S aureus
2.1.2 Địa điểm nghiên cứu
2.1.2.1 Địa điểm triển khai
- Chợ Trung tâm của tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây - HàNội, Vĩnh Phúc
2.1.2.2 Địa điểm xét nghiệm mẫu
- Bộ môn Vi sinh - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên
- Phòng Công nghệ sinh học môi trường và Phòng thí nghiệmtrọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học
2.1.3 Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2012 đến năm 2015
2.2 Vật liệu nghiên cứu
2.2.1 Động vật thí nghiệm
- Chuột bạch, có khối lượng 18 - 20g/con
- Thỏ, có khối lượng 2 - 2,5kg/con
2.2.2 Các loại môi trường sử dụng trong quá trình nghiên cứu
- Môi trường thông thường và đặc hiệu để nuôi cấy, phân lập và
giám định vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S aureus: Nutrient
Trang 9Broth, Selenite Broth, XLD, TSI, BHI, Chapman, Fraser, Palcam,…
và các loại đệm sử dụng trong nghiên cứu được chuẩn bị theoSambrook và Russell (2001) hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất
- Máy móc, trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất khác: do Bộ môn Visinh - Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên và Công nghệsinh học môi trường và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen
- Viện Công nghệ sinh học cung cấp
2.3 Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Xác định tỷ lệ nhiễm và đặc tính sinh học của vi khuẩn Listeria, Salmonella spp và S aureus trên thịt lợn tươi bán tại chợ Trung tâm của một số tỉnh phía Bắc
- Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S aureus trên
thịt lợn bán tại chợ Trung tâm của một số tỉnh phía Bắc
- Xác định các đặc tính sinh hóa, độc lực, tính mẫn cảm vớikháng sinh của các chủng vi khuẩn đã phân lập được
- Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn đã phân lập đượctrên chuột thí nghiệm
- Xác định tính mẫn cảm của các chủng vi khuẩn đã phân lậpđược đối với một số loại kháng sinh
2.3.2 Xác định serovar các chủng Salmonella spp phân lập được bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính
2.3.3 Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp và S aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ”.
2.3.4 Xác định gene sản sinh độc tố enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp và S aureus phân lập được
- Xác định gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi
khuẩn Salmonella spp và S aureus bằng phương pháp PCR
Trang 10- Đọc trình tự ADN trên máy đọc tự động và phân tích kết quảbằng phần mềm chuyên dụng
- Biểu hiện và tinh sạch gene seb của vi khuẩn S aureus phân lập
được
- Đề xuất biện pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm
2.4 Phương pháp nghiên cứu
Để thực hiện đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các phương phápnghiên cứu thường quy định trong phòng thí nghiệm được chuẩn hóatheo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn Quốc tế (ISO)
2.4.1 Phương pháp lấy mẫu
Mẫu thịt lợn tươi được lấy theo TCVN 4833 - 1 : 2002, TCVN
4833 - 2 : 2002, ISO 3100 - 1 : 1991
2.4.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn Listeria, Salmonella spp và S aureus nhiễm trên thịt lợn tươi
Xác định chỉ tiêu vi khuẩn hiếu khí nhiễm trên thịt lợn tươi theo
TCVN 7046 : 2002, vi khuẩn Salmonella spp theo TCVN 5153 :
1990, vi khuẩn Staphylococcus aureus theo TCVN 5156 : 1990; vi khuẩn Listeria theo TCVN 7700 - 1 : 2007.
2.4.3 Phương pháp nhuộm Gram xác định hình thái vi khuẩn
Nhuộm Gram nhằm xác định đặc điểm hình thái và khả năng bắtmàu của vi khuẩn, quan sát hình thái, và tính chất bắt màu của vikhuẩn dưới kính hiển vi với vật kính dầu (100)
2.4.4 Xác định các đặc tính sinh hóa của các chủng Listeria, Salmonella spp và S aureus đã phân lập được
Tiến hành giám định đặc tính vi sinh vật hóa học: kiểm tra hìnhthái, kích thước, tính chất bắt màu Gram, khả năng di động, phản ứng
Trang 11sinh Indole 45oC (+), H2S; urease, catalaza, coagulase, phản ứng lênmen đường…
2.4.5 Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Listeria, Salmonella spp và S aureus phân lập được trên chuột thí nghiệm
Tiến hành thử độc lực cho chuột thí nghiệm theo quy trình thườngquy sử dụng trong phòng thí nghiệm tại Bộ môn Vi sinh - Viện Khoahọc Sự sống - Đại học Thái Nguyên
2.4.6 Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của chủng vi khuẩn Listeria, Salmonella spp và S aureus phân lập được
Để đánh giá tính mẫn cảm với kháng sinh, sử dụng phương phápcủa Kirby- Bauer và đánh giá kết quả thử khả năng mẫn cảm của vikhuẩn với kháng sinh dựa vào bảng đánh giá của NCCLS - 2000 Mỹ
2.4.7 Phương pháp xác định serovar của vi khuẩn Salmonella spp phân lập được
Tiến hành định type theo bảng định type huyết thanh học của vi
khuẩn Salmonella spp theo sơ đồ của Kauffman - White (1972).
2.4.8 Phương pháp xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp.
và S aureus bằng “Phản ứng khuyếch tán trong
da thỏ”
Tiêm độc tố vào dưới da thỏ thí nghiệm, khoảng 2h sau tiêmdung dịch Evan Blue vào tĩnh mạch tai, liều 40 mg/kg thể trọng.Nuôi tiếp 2 giờ rồi giết thỏ, lột da và đọc kết quả phản ứng trên da
2.4.9 Xác định gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp và S aureus bằng phương pháp PCR
Trang 12Để thu nhận ADN tinh sạch, dùng nhiệt độ cao (95oC) để biến
tính chuỗi ADN sợi kép, kết hợp với enzym Taq ADN polymerase
chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp cho từng giai đoạnphản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động.Phân tử ADN quan tâm sẽ được giữ lại trên cột tinh sạch có bản chất
là các hạt sepharose, sau đó sử dụng đệm để thu lại các phân tử ADNnày để tiến hành xác định trình tự trên máy tự động
2.4.10 Phương pháp đọc trình tự ADN trên máy đọc tự động và phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụng đối với vi khuẩn S aureus
Trình tự nucleotide của gene được xác định bằng phương phápxác định trình tự gene tự động trên máy ABI PRISMR 3100 AvantGenetic Analyzer theo phương pháp của Sanger và được xử lý bằngphần mềm ABI PRISM 3.100 Avant Data Collection v 1.0, sau đóđược so sánh với trình tự của các vi khuẩn đã được công bố trongngân hàng gene thế giới
2.4.11 Phương pháp biểu hiện và tinh sạch gene seb 534 của vi khuẩn S aureus
Đoạn gene wtSEB được khuếch đại từ khuôn là ADN tổng số
của S aureus bằng phương pháp PCR Sau khi kiểm tra bằng cắt với
enzyme hạn chế và PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu,những dòng chứa plasmid pET21a(+) mang đúng gene wtSEB sẽđược sử dụng cho biểu hiện gene và khảo sát một số yếu tố ảnhhưởng như: nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng, thời gian cảmứng để tìm ra các điều kiện tối ưu nhất cho việc sinh tổng hợpprotein ngoại lai wtSEB Protein tái tổ hợp wtSEB được tinh sạchbằng cột sắc ký ái lực Ni2+ của Invitrogen
Trang 132.5 Phương pháp xử lý số liệu
Đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu thường quy trongphòng thí nghiệm, phương pháp thống kê sinh học Minitab, SAS3.1, Nguyễn Văn Thiện (2002) và trên phần mềm Microsoft officeexcel 2007
Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tình hình tiêu thụ và tỷ lệ nhiễm khuẩn trên thịt lợn ở một số tỉnh phía Bắc
3.1.1 Khảo sát tình hình giết mổ lợn trên địa bàn một số tỉnh phía Bắc
Bảng 3.1 Tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn bán tại chợ Trung tâm ở Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây và
Vĩnh Phúc
Địa điểm
(chợ)
Thời gian hoạt
động (giờ)
Số lượng quầy bán thịt
Tỷ lệ quầy được kiểm tra vệ sinh thú y (%)
Số lượng lợn giết thịt trung bình (con/ngày)
Khối lượng thịt tiêu thụ trung bình (tấn/ngày)
X ± m X X ± m X
Thái Nguyên 4 - 20 29 100 54,56 ± 2,12 2,39 ± 0,58Bắc Giang 4 - 20 27 100 55,05 ± 1,86 2,81 ± 0,19
Hà Tây 5 - 19 14 100 17,36 ± 1,25 0,75 ± 0,11Vĩnh Phúc 5 - 19 18 100 22,42 ± 1,51 0,96 ± 0,16
Kết quả từ bảng 3.1, cho thấy: Các chợ bán thịt bắt đầu hoạtđộng trong khoảng thời gian từ 4 hoặc 5 giờ đến 19 hoặc 20 giờ Đây
là thời điểm thuận lợi để người tiêu dùng đến chợ trao đổi/mua bánthực phẩm nói chung và thịt lợn nói riêng Số lượng các quầy hàng
Trang 14bán thịt lợn tươi cũng có sự thay đổi do quy mô và vị trí địa lý - tựnhiên xã hội của từng chợ Mặt khác có sự tương quan giữa số lượngcon lợn được giết thịt mỗi ngày với khối lượng thịt tiêu thụ do mật
độ dân cư ở mỗi địa điểm lấy mẫu có sự khác nhau
3.1.2 Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp và S aureus trên thịt lợn bán tại chợ Trung tâm của tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây và Vĩnh Phúc
Bảng 3.2 Kết quả tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp.
và S aureus trên thịt lợn bán tại chợ Trung tâm của tỉnh Thái
Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây và Vĩnh Phúc
Địa điểm
Số mẫu xét nghiệ m
Listeria Salmonella
spp S aureus
Số mẫu dươn
g tính
Tỷ lệ (%)
Số mẫu dươn
g tính
Tỷ lệ (%)
Số mẫu dươn
g tính
Tỷ lệ (%)
