Nghiên cứu phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành sinh học phân tử, đã có nhiều phương pháp mới giúp cho việc chẩn đoán và phát hiện sớm một số loại UT nói chung và UTV n

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vú (UTV) là loại ung thư (UT) phổ biến ở phụ nữ nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển UTV chiếm gần 30% các loại UT ở phụ nữ, là ung thư có tỉ lệ tử vong cao thứ 2 trong số các loại ung thư [39] Theo hiệp hội ung thư Mỹ, năm 2008, trên toàn thế giới có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mới được chẩn đoán và 458.503

ca tử vong [40] Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc UTV ở Hà Nội là khoảng 30/ 100.000 dân và ở TP Hồ Chí Minh là khoảng 20/ 100.000 dân, đứng đầu trong các loại UT ở phụ nữ [17]

Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong tầm soát, phẫu thuật và các thuốc điều trị ngày càng có hiệu quả nhưng vẫn còn nhiều trường hợp bệnh nhân UTV nguyên phát ở giai đoạn sớm vẫn bị tái phát bệnh hoặc tử vong Các phương pháp cận lâm sàng được áp dụng trong chẩn đoán UT như các phương pháp chẩn đoán hình ảnh, các phương pháp sinh thiết và các phương pháp hóa sinh phát hiện các dấu ấn ung thư (tumor marker) Mỗi loại phương pháp chẩn đoán trên đều có những ưu điểm và hạn chế, do vậy thường phải kết hợp các phương pháp chẩn đoán khác nhau mới đem lại hiệu quả chẩn đoán chính xác và chẩn đoán sớm UTV Trong những năm gần đây, cùng với

sự phát triển mạnh mẽ của ngành sinh học phân tử, đã có nhiều phương pháp mới giúp cho việc chẩn đoán và phát hiện sớm một số loại UT nói chung và UTV nói riêng đã được ứng dụng Nguyên tắc chung của phương pháp này là

sử dụng kỹ thuật phân tích DNA xác định các gen gây UT Việc phát hiện các gen UT nếu được lấy từ các mô UT, hạch bạch huyết hoặc tủy xương chỉ có thể thực hiện khi sinh thiết hoặc sau phẫu thuật sẽ có nhược điểm là phát hiện muộn khi khối u đã lớn, gây đau đớn cho bệnh nhân, khó làm nhiều lần nên không thể được xem là phương pháp thường quy để chẩn đoán hoặc theo dõi

trong quá trình điều trị Do vậy, các nghiên cứu phát hiện các chỉ thị UT trong máu sẽ đưa ra một bước tiếp cận có sức thuyết phục nhằm phát hiện di căn tiềm ẩn từ giai đoạn sớm của bệnh nhân ung thư Các tế bào UT có nguồn gốc

từ các tế bào khối u nguyên phát hoặc các khối u đã di căn, sau đó thâm nhập

và di chuyển trong máu ngoại vi gọi là các tế bào khối u di chuyển (Circulating Tumor Cell - CTC) Các CTC là bằng chứng về sự di căn của các

tế bào UT trước khi có các biểu hiện lâm sàng [58] Hơn nữa, việc phát hiện các gen UT nếu được lấy từ mẫu máu ngoại vi sẽ có ưu điểm ít gây đau đớn cho bệnh nhân, có thể làm thường quy Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị khối u để xác định các tế bào khối u trong máu đóng vai trò quan trọng, có thể góp phần xác định sớm các trường hợp di căn, giúp cho việc chẩn đoán và điều trị có hiệu quả Một số gen chỉ thị khối u đã được phát hiện và nghiên cứu trong đó

có mRNA survivin Gen survivin mã hóa một protein ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) Gen này được biểu hiện mạnh trong các mô của bào thai đang phát triển và trong nhiều loại ung thư, trong đó có UTV, nhưng điều đặc biệt có ý nghĩa là gen survivin không biểu hiện ở các

mô bình thường [17] Do vậy, việc phát hiện gen survivin trong máu có thể được xem như là một công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán sớm và tiên lượng và theo dõi điều trị bệnh nhân UTV [23][31] [36] Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa

có nghiên cứu nào về vấn đề này trong UT nói chung và UTV nói riêng Chính vì vậy, để bước đầu góp phần nghiên cứu xây dựng các phương pháp mới xác định các tế bào UT trong máu chẩn đoán UTV ở phụ nữ, chúng tôi

tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu phát hiện gen survivin từ các tế bào ung

thư vú” với 2 mục tiêu:

1 Xây dựng quy trình phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú.

2 Nhận xét bước đầu giá trị của xét nghiệm phát hiện gen survivin trong chẩn đoán ung thư vú.

Chương 1TỔNG QUAN

1.1 Khái niệm bệnh và dịch tễ học UTV

1.1.1 Khái niệm bệnh

Ung thư là từ dùng để chỉ u bướu ác tính do sự phát triển và biệt hóa của các tế bào ở các mô của cơ thể trong tình trạng không kiểm soát được Ung thư vú là u ác tính phát sinh từ các tế bào biểu mô nguồn gốc từ mô vú, phần lớn từ các ống dẫn sữa hoặc các tiểu thuỳ UT có nguồn gốc từ ống sữa được gọi là ung thư biểu mô tuyến sữa và UT có nguồn gốc từ tiểu thuỳ được gọi là ung thư biểu mô tiểu thuỳ Có nhiều dạng UTV khác nhau với trạng thái khác nhau, sự ác tính khác nhau, bản chất di truyền khác nhau và tỷ lệ sống sót khác nhau phụ thuộc vào các yếu tố này

1.1.2 Dịch tễ học UTV

Tình hình ung thư vú trên thế giới

Ung thư vú không những là một bệnh ung thư hay gặp nhất ở phụ nữ

mà còn là nguyên nhân chính gây tử vong đối với phụ nữ tại nhiều nước Nguy cơ mắc bệnh UTV theo suốt cuộc đời người phụ nữ Tỷ lệ mắc thay đổi nhiều, từ 25-35/100.000 dân tại Anh, Đan Mạch, Hà Lan và Canada đến 1-5/100.000 dân tại Nhật Bản, Mexico, Venezuela [16] [18] [19]

Bệnh có tỷ lệ mắc cao nhất ở Mỹ và Bắc Âu, tỷ lệ mắc trung bình ở Nam Âu,Tây Âu và thấp nhất ở châu Á Người ta nhận thấy tỷ lệ mắc UTV tăng gấp 2 lần so với những năm 50 thế kỷ XX ở một số nước có nền công nghiệp phát triển mạnh trong các năm qua như Nhật Bản, Singapore, một số thành phố của Trung Quốc Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ mắc ở các vùng này phần nào được giải thích do sự thay đổi về lối sống, kinh tế phát triển,

ngày càng có nhiều phụ nữ làm việc trong lĩnh vực công nghiệp, tuổi thọ trung bình tăng, thay đổi về sinh sản, chế độ ăn Theo hiệp hội nghiên cứu ung thư thế giới, năm2008, trên toàn thế giới có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mới được chẩn đoán và 458.503 ca tử vong [40] Ở Anh năm

2005 có 212.930 trường hợp mắc bệnh mới trong đó 40.840 ca tử vong [34]

Ở Mỹ, năm 2010, hơn 207.000 phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mới được chẩn đoán và ước tính có tới 39.800 ca tử vong [39] Tỷ lệ UTV tăng theo tuổi, hiếm gặp ở lứa tuổi 30 (khoảng 0,8%), sau độ tuổi này, tỷ lệ mắc bệnh gia tăng một cách nhanh chóng (khoảng 6,5% ở tuổi 30-40) Theo thống kê của hiệp hội phòng chống UT Mỹ, tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi tăng từ 25/100.000 dân ở độ tuổi 30-34 lên đến 200/100.000 dân ở độ tuổi từ 45-49 [5] Tuy nhiên người ta nhận thấy rằng nguy cơ mắc bệnh này tăng chậm ở độ tuổi từ 45-50 Điều này gợi ý rằng UTV là loại UT có liên quan mật thiết với nội tiết

Tỷ lệ chết do UTV tăng lên theo tỷ lệ mắc [5] Tuy nhiên, ở một số nước phát triển mặc dù tỷ lệ mắc UTV gia tăng nhanh chóng nhưng tỷ lệ chết vẫn giữ được ở mức ổn định nhờ các tiến bộ trong sàng lọc phát hiện bệnh sớm và những thành tựu đạt được trong điều trị

Tình hình ung thư vú tại Việt Nam

Tại Việt Nam, theo ghi nhận tình hình UT ở Hà Nội, TP Hồ Chí Minh

và một số tỉnh trong nhiều năm, người ta ước tính tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi năm 2000 là 17,4/100.000 dân Khác với các nước phương tây, ở Việt Nam UTV bắt đầu tăng nhanh ở độ tuổi 35 và đạt tỷ lệ cao nhất ở độ tuổi trước và sau mãn kinh (45-54 tuổi) rồi sau đó có xu hướng giảm xuống rõ rệt

Tại Việt Nam giai đoạn 2001-2004, tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi ở

Hà Nội là 29,7/100.000 dân, tại TP Hồ Chí Minh và Cần Thơ là 19,4/100.000

dân, ở Hải phòng là 10,5/100.000 dân, ở Thái Nguyên là 11,6/100.000 dân, ở Huế

là 12,2/100.000 dân Đây là loại UT có tỷ lệ mắc đứng đầu ở phụ nữ Việt Nam

Tóm lại, UTV là bệnh phổ biến nhất trong tất cả các loại ung thư ở phụ

nữ trên thế giới cũng như ở Việt Nam

1.2 Tiến triển và các giai đoạn ung thư vú.

1.2.1 Tiến triển ung thư vú.

Biểu hiện lâm sàng của UTV có đặc trưng là kéo dài và rất khác nhau giữa các bệnh nhân Đa số các trường hợp UTV xâm lấn phát sinh từ tế bào biểu mô của thùy hoặc của ống dẫn của tuyến vú Các tế bào bị UT hóa nhân lên với tốc độ khoảng 60 ngày một chu kỳ Ước tính, từ khi tế bào chuyển biến ác tính đầu tiên đến khi phát hiện được khối u có kích thước 1cm thì phải mất khoảng thời gian vài năm Chỉ một số ít bệnh nhân (< 3%) ngay sau khi xuất hiện các triệu chứng đầu tiên, UTV tiến triển nhanh và tử vong trong vài tháng [3][4] UTV có khả năng chữa khỏi ở nhiều bệnh nhân nếu bệnh được chẩn đoán trong giai đoạn tiền lâm sàng (chưa có triệu chứng hay dấu hiệu lâm sàng)

Green Wood, Bloom và CS theo dõi những trường hợp UTV không điều trị, thấy thời gian sống thêm trung bình kể từ khi chẩn đoán là 31 tháng, tỷ lệ sống thêm 3 năm là 40% và 5 năm là 18 - 20%, có 4% sống thêm 10 năm [5]

Giai đoạn tại chỗ:

Khối u nguyên phát xuất phát từ đơn vị tiểu thùy - ống tuyến tận cùng, tức phần chế tiết của tuyến vú Sau đó phát triển lan sang mô lân cận, xô đẩy

tổ chức tuyến vú bình thường Xu hướng vượt khỏi mô tuyến vú xâm nhiễm

mô xung quanh đến các cấu trúc lân cận như da, làm co rút da, sần da cam, phù nề da, đỏ và loét da Khi chúng xâm nhiễm đến cân cơ ngực và thành ngực tạo thành một khối cứng

Giai đoạn lan tràn:

+ Theo đường bạch huyết: Nhờ mạng lưới mạch bạch huyết dày đặc,

UTV lan tới các chặng hạch trong đó hạch nách là vị trí hay gặp do đây là vị trí chính dẫn lưu dịch, bạch huyết của vú Tiếp theo là hạch thượng đòn, rồi đi vào hệ tuần hoàn tĩnh mạch cạnh sống, đám rối này được nối trực tiếp với vú qua mạch máu liên sườn

+ Theo đường máu: Các tế bào UTV có thể di căn đến khắp nơi trong

cơ thể, tuy nhiên UTV thường di căn tới xương, phổi, gan, não Khoảng 20 - 30% các bệnh nhân hạch bạch huyết âm tính nhưng vẫn có di căn xa chứng tỏ

di căn theo đường máu là chủ yếu ở các bệnh nhân này [50] Đôi khi sự lan tràn xảy ra thêm từ hệ tĩnh mạch ở vú, tiêu biểu từ hệ hạch bạch huyết của da dẫn đến lan rộng, xâm lấn thành ngực và sau đó đến màng phổi và phổi Các

tế bào UTV thường di căn rất sớm và tại thời điểm chẩn đoán được bệnh không thể phát hiện được các di căn này bằng các phương pháp chẩn đoán hiện có, do vậy việc nghiên cứu phát hiện các tế bào UTV thực sự là cần thiết

T: U nguyên phát

chỗ, bệnh Paget núm vú không có u

T1 U có đường kính lớn nhất ≤ 2cm

(thành ngực gồm xương sườn, cơ gian sườn, cơ răng cưa trước, không tính cơ ngực)

N: Hạch vùng

hoặc di căn hạch vú trong cùng bên nhưng không di căn hạch nách

hạch nách cùng bên, hoặc di căn hạch vú trong cùng bên kèm di căn hạch nách cùng bên, hoặc di căn hạch thượng đòn cùng bên có hoặc không kèm hạch nách hoặc hạch vú trong cùng bên

M: Di căn xa

nách (N2b) và kèm di căn hạch nách (N3b)

* Xếp giai đoạn lâm sàng

Bảng 1.1 Phân chia giai đoạn UTV

+ Lâm sàng: khối u và tính chất khối u

+ Chụp tuyến vú.

+ Mô bệnh học: chọc hút bằng kim nhỏ

Nếu một trong 3 yếu tố này còn nghi ngờ phải sinh thiết tức thì để chẩn đoán xác định Ngoài 3 phương pháp thông dụng trên còn một số phương pháp khác như: sinh thiết kim, sinh thiết mở, sinh thiết 48 giờ, chụp vú kỹ thuật số, siêu âm vú, chụp cộng hưởng từ hạt nhân được áp dụng cho từng trường hợp Hiện nay, do nhiều lý do mà chẩn đoán UTV bằng kỹ thuật sinh học phân tử chưa được ứng dụng rộng rãi, mặc dù kỹ thuật này thường cho kết quả chẩn đoán chính xác và độ tin cậy cao Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm nghiên cứu khả năng ứng dụng kỹ thuật sinh học phân

tử góp phần vào việc phát hiện, chẩn đoán UTV ở phụ nữ

1.3.2 Chẩn đoán phân biệt

- U xơ tuyến vú: thường gặp ở phụ nữ trẻ, u thường tròn nhẵn, ranh giới rõ ràng, di động Để chẩn đoán phân biệt phải chụp X-quang tuyến vú, làm xét nghiệm mô bệnh học

- Viêm xơ tuyến vú nang hóa: có thể gặp một nang đơn độc hoặc nhiều nang to nhỏ rải rác cả hai bên vú Kích thước có thể to từ vài mm đến 10cm, chẩn đoán phân biệt nhờ vào siêu âm

- Viêm giãn tuyến vú: chảy dịch đầu vú dai dẳng lúc đầu là dịch vàng trong, sau đó có thể bội nhiễm thành dịch vàng mủ hoặc chất bã có mùi hôi, một số khác chảy dịch máu

- Áp xe tuyến vú: có triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau

- Nang sữa: hình thành sau quá trình viêm tắc ống dẫn sữa, nang sữa có thể lỏng nhưng có thể đặc sền sệt

- U nhú nội ống: là những tổn thương trong lòng ống dẫn sữa thường gặp ở những ống dẫn sữa chính, tính chất u tròn, mềm có thể gây chảy dịch, máu qua núm vú.

- U mỡ hoặc hoại tử mỡ ở vú: hiếm gặp

- U phyloide lành tuyến vú

1.3.3 Chẩn đoán mô bệnh học

Carcinom chiểm khoảng 90% trong đó:

- Carcinom ống tuyến xâm nhập : 78%

- Sarcom, paget không xếp loại, nhưng bệnh paget có khối u được phân loại theo kích thước của u

1.4 Các yếu tố tiên lượng bệnh UTV

Các quyết định trong điều trị bổ trợ UTV được dựa vào các yếu tố tiên lượng Bên cạnh việc đánh giá các yếu tố tiên lượng kinh điển như kích thước

u, loại mô học, độ mô học, tình trạng hạch nách, các nhà nghiên cứu đang có

xu hướng đi sâu về bệnh học phân tử và gen để tìm ra bản chất phát triển của khối u nhằm đưa ra một phương thức điều trị tối ưu nhất cho bệnh nhân

1.4.1 Hạch vùng

Hạch nách: Tình trạng hạch nách được coi là yếu tố tiên lượng quan

trọng nhất liên quan đến tỷ lệ tái phát và sống thêm của bệnh nhân UTV Tỷ

lệ sống thêm, tái phát, thời gian tái phát, thất bại trong điều trị đều liên quan chặt chẽ với số lượng hạch di căn [13]

1.4.2 Khối u nguyên phát

Kích thước u nguyên phát: Kích thước u nguyên phát có mối liên quan với

thời gian sống thêm của bệnh nhân và tình trạng di căn hạch vùng Kích thước u tăng làm tăng hệ thống huyết quản và bạch mạch làm tăng nguy cơ di căn

1.4.5 Loại mô học

Hai thể mô học chính của UTBM tuyến vú là loại xâm lấn và loại không xâm lấn Trong hai loại này UTBM thể không xâm lấn có tiên lượng tốt hơn

Ung thư biểu mô tại chỗ bao gồm cả ung thư ống và tiểu thuỳ tại chỗ là loại có thể chữa khỏi hoàn toàn, và chỉ có 1% là di căn căn hạch nách Theo báo cáo của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, loại này chiếm khoảng 6,3% tổng số bệnh nhân UTV

Ung thư biểu mô thể ống xâm nhập chiếm tỷ lệ cao nhất là 67,9%, tỷ lệ sống thêm chung sau 5 năm ở nhóm này là 79% Ung thư biểu mô thể tiểu thuỳ xâm nhập chiếm khoảng 6,3%, tỷ lệ sống thêm chung sau 5 năm là 82% [12][13]

1.4.6 Độ mô học (ĐMH)

Độ mô học là một yếu tố tiên lượng quan trọng mặc dù nó không sử dụng để đánh giá giai đoạn bệnh Độ mô học dựa vào sự hình thành ống nhỏ,

sự đa hình thái của nhân và hoạt động nhân chia

1.4.7 Tỷ lệ sống theo giai đoạn

Bảng 1.2 Tỷ lệ sống thêm theo giai đoạn

Giai đoạn Tỷ lệ sống 5 năm (%) Tỷ lệ sống 10 năm (%)

1.5 Điều trị ung thư vú

Cho tới nay, việc nghiên cứu điều trị UTV vẫn đang được tiếp tục và ngày càng hoàn thiện Điều trị UTV là sự phối hợp điển hình giữa phương pháp điều trị tại chỗ (phẫu thuật, tia xạ) và điều trị toàn thân (hoá chất, nội tiết miễn dịch)

Trên thực tế lâm sàng, trước khi quyết định áp dụng phương pháp điều trị các thầy thuốc căn cứ vào nhiều yếu tố bao gồm giai đoạn bệnh, thể mô học, độ mô học, tuổi và một số yếu tố khác Giai đoạn bệnh là yếu tố chính quyết định việc lựa chọn phương pháp điều trị [17]

1.6 Các dấu ấn ung thư trong chẩn đoán và theo dõi điều trị UTV.

Dấu ấn ung thư là một nhóm các chất (enzyme, hormone, receptor, protein,…v.v) được các tế bào khối u trực tiếp sản xuất hoặc do các tế bào bình thường sản xuất do tác động kích ứng của các tế bào ung thư đi vào vòng tuần hoàn và có thể được sử dụng để chẩn đoán và theo dõi điều trị ung thư Các dấu ấn huyết thanh gồm CEA, CA15-3 và CK-BB Các mô có thể được phân tích đối với các receptor estrogen và progesterone, receptor của yếu tố

sinh trưởng biểu mô (Epidermal Growth Factor- EGF) Sự lựa chọn cách điều trị phụ thuộc vào các định lượng trên.

1.6.1 Dấu ấn có bản chất là protein.

Nhiều protein huyết thanh do tế bào UT sản xuất ra lưu thông trong máu đã được sử dụng như dấu ấn UT Dấu ấn là protein thường đặc hiệu hơn dấu ấn là enzyme, hormone và dễ phát hiện hơn so với các dấu ấn khác vì vậy được sử dụng khá phổ biến Tuy nhiên để chẩn đoán xác định cần phải phối hợp với lâm sàng và các xét nghiệm khác nữa

- CEA (Carcino Embryonic Antigen) được Gold và Freedman mô tả lần

đầu tiên vào năm 1965, là kháng nguyên ung thư bào thai có bản chất là glycoprotein CEA được sản xuất trong thời kỳ bào thai đặc biệt ở dạ dày, tụy

và gan Sau khi sinh chỉ tồn tại với hàm lượng rất trong huyết thanh của người bình thường và tăng cao trong một số loại ung thư CEA được coi là dấu ấn đặc hiệu cho ung thư đại tràng, tuy nhiên CEA còn thấy tăng trong ung thư

vú, đường tiêu hoá, phổi, buồng trứng, tụy và tuyến tiền liệt Hơn nữa, nó cũng tăng lên ở người nghiện rượu, viêm ruột, xơ hoá bàng quang (cystic fibrosis) và ở những người hút thuốc lá nặng Mặc dù CEA không đặc hiệu cho chẩn đoán, nhưng có giá trị tiên lượng và theo dõi điều trị Nồng độ CEA cao sau điều trị là cơ sở nghĩ đến sự tiến triển của khối u hay di căn

- CA15-3 (Carbohydrat Antigen) bản chất là một glycoprotein không

đặc hiệu nhưng nhạy cảm đối với UTV Bình thường có trong huyết thanh người với nồng độ < 25 U/ml, CA15-3 tăng kèm theo phosphatase kiềm dự báo khả năng tái phát của UTV Do vậy CA 15-3 thường được sử dụng để sàng lọc, theo dõi điều trị và phát hiện tái phát UTV sau giai đoạn điều trị

1.6.2 Dấu ấn có bản chất là enzym.

Các xét nghiệm về enzyme huyết thanh để chẩn đoán UT thường có độ đặc hiệu kém do vậy hiện nay rất ít được sử dụng trong chẩn đoán Enzym CK-BB là enzyme được sử dụng trong chẩn đoán UTV Tuy nhiên để chẩn đoán xác định cần phải phối hợp với lâm sàng và các xét nghiệm khác nữa

- Creatine kinase: Isoenzyme creatine kinase BB (CK1, CK-BB) có

trong huyết thanh nguồn gốc từ não và liên quan đến nhiều bệnh ung thư ác tính CK-BB tăng trong huyết thanh trong một số bệnh UT ác tính như: UTV,

UT buồng trứng, UT não, UT phổi, CK-BB trong huyết thanh bệnh nhân UTV di căn khoảng 13% Tuy nhiên CK-BB trong huyết thanh không đặc hiệu Isoenzym CK-BB được phát hiện và định lượng nhờ điện di

1.6.3 Dấu ấn có bản chất là receptor.

Các receptor của tế bào là các cấu trúc protein khu trú trên các màng ngoài của tế bào Chức năng của receptor là nhận biết và gắn đặc hiệu vào các chất gắn (ligand) như hormone Phức hợp ligand - receptor sau đó mở đầu cho một đáp ứng sinh học ở tế bào đích Có nhiều loại receptor khác nhau, mỗi loại receptor gắn với một chất gắn đặc hiệu khởi đầu cho một đáp ứng tế bào riêng biệt Các receptor có chức năng phù hợp đối với sự điều hòa hoạt động bình thường của tế bào Sự sản xuất các receptor được điều hòa một phần bởi nồng độ của ligand Có những thiếu hụt receptor do quá trình tổng hợp hoặc suy giảm chức năng của receptor do di truyền, hoặc do sự rối loạn tự miễn dịch (kháng thể trực tiếp chống lại receptor) Rất nhiều khối u ác tính gây những biến đổi về chức năng và số lượng receptor nên các receptor có thể được sử dụng như dấu ấn UT Các dấu ấn có bản chất là receptor thường được

sử dụng trong chẩn đoán và theo dõi điều trị đó các receptor estrogen và progesterone, receptor của yếu tố sinh trưởng biểu mô (Epidermal Growth Factor- EGF) Có hai phương pháp cơ bản để định lượng receptor của tế bào: Định lượng trên mẫu mô sinh thiết hoặc tổ chức u sau khi phẫu thuật cắt bỏ

- Thụ thể estrogen và progesteron (ER và PR): ER và PR đã được

nghiên cứu rộng rãi khoảng 10 năm trở lại đây Các ER và PR được định lượng trong lâm sàng để xác định các bệnh nhân bị UTV có thể đáp ứng với phương pháp điều trị bằng hormon Có khoảng 50 - 85% các khối u nguyên phát và 45 - 55% các u di căn có ER dương tính Có nhiều nghiên cứu cho thấy giảm tỷ lệ tử vong và tái phát từ 20% - 30% ở những BN có ER (+) được điều trị nội tiết bổ trợ Khi cả ER và PR (+) khoảng 80% trường hợp u sẽ đáp ứng với phương pháp điều trị nội tiết Những u càng biệt hoá cao thì tỷ lệ dương tính với ER và PR cao Những ung thư biểu mô dương tính với ER và PR có tiên lượng tốt hơn so với những u âm tính với hai thụ thể này [3] [13] [25]

- Thụ thể yếu tố sinh trưởng biểu mô (Epidermal Growth Factor

receptor- EGFR): là thụ thể của các yếu tố sinh trưởng biểu mô (EFG) và yếu

tố biến đổi sinh trưởng tế bào α (Transforming Growth Factor α TGF-α) Họ thụ thể của các yếu tố sinh trưởng gồm các thụ thể: EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), HER3/c-neu (ErbB-3), HER4/c-neu (ErbB-4) Nồng độ cao của thụ thể có liên quan đến sự tái phát khối u và sự sống sót của bệnh nhân UTV

1.6.4 Gen đặc hiệu trong UTV

Các gen gây ung thư của tế bào (gen ung thư tế bào) là các gen bình thường có liên quan tới sự sinh trưởng, tăng sinh, biệt hóa và hoạt hóa phiên

mã Các gen gây UT của tế bào có thể biểu hiện một cách bất thường bởi sự đột biến gen hoặc do sự sắp xếp lại/sự chuyển vị, khuyếch đại biểu hiện gen hoặc thông qua việc mất các yếu tố điều hoà kiểm soát sự biểu hiện Với các khiếm khuyết đó thì chúng được gọi là gen gây UT Sự biểu hiện lầm lạc sẽ phát triển sự tăng sinh tế bào và gây ác tính Tới nay, rất nhiều gen gây UT đã được xác định có liên quan với nhiều loại ung thư, trong đó có UTV

Đầu thập kỷ 90, bắt đầu có các chương trình nghiên cứu về gen được tiến hành, trong đó có 3 gen được tập trung nghiên cứu và có khả năng liên quan nhiều đến UTV là BRCA1 (breast cancer 1), BRCA2 và p53 Gen BRCA1 nằm trên nhánh dài của NST 17 là gen ức chế tạo u, có chức năng ngăn ngừa sự phát triển và phân chia nhanh chóng hoặc không kiểm soát được của các tế bào Mặt khác gen BRCA1 còn sản sinh ra một loại protein tham gia trực tiếp vào việc sửa chữa trong quá trình tái bản DNA, một số nghiên cứu cho rằng có khoảng 80- 90% gặp đột biến gen này và gặp ở những gia đình có UTV và UT buồng trứng Gen BRCA2 nằm trên nhánh dài của NST

13, có vai trò giống gen BRCA1 có chức năng kìm hãm sự phát triển khối u, sửa chữa trong quá trình tái bản DNA Nhưng khác với gen BRCA1 là gen BRCA2 không có liên quan đến UT buồng trứng Gen BRCA2 chiếm khoảng 35-40% UTV mang tính di truyền và đã tìm thấy trong những gia đình bị UTV Gen p53 là gen ức chế khối u nằm trên nhánh ngắn NST 17 (17p13.1) tham gia vào quá trình điều hòa chu kỳ tế bào và ức chế sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) Đột biến gen p53 gây hậu quả ác tính ở rất nhiều

tế bào đích và các cơ quan Đột biến gen p53 được tìm thấy khoảng gần 30% trong UTV hay gặp ở người trẻ , độ mô học cao, thụ thể nội tiết âm tính, nhìn chung có tiên lượng xấu [5]

Hiện nay bằng kỹ thuật sinh học phân tử với độ nhạy cao, các nhà khoa học đã chứng minh được các tế bào ung thư có nguồn gốc từ các khối u, sau

đó xâm nhập và di chuyển trong máu ngoại vi từ giai đoạn rất sớm trước khi

có biểu hiện lâm sàng Các tế bào này gọi là các tế bào khối u di chuyển (Circulating Tumor Cell - CTC) mang gen đặc trưng khối u mà ở người bình thường không có Sự xuất hiện và di chuyển của các khối u vào máu ngoại vi bao gồm nhiều giai đoạn Ban đầu các tế bào ung thư với nhiều bất thường về

di truyền bắt đầu phát triển nhanh, cần nhiều oxy nên phát triển xâm lấn Các

tế bào này có mật độ thụ thể trên bề mặt thấp dẫn tới sự giảm liên kết với nhau và chống lại quá trình chết theo chương trình Kết quả là các tế bào này

có khả năng sống sót cao hơn và dễ dàng xâm nhập vào máu Các tế bào UT lưu hành trong cơ thể cho đến khi bám vào biểu mô mạch máu và cuối cùng rời khỏi vòng tuần hoàn để hình thành di căn Trên mô hình nghiên cứu ung thư ở động vật, hiện tượng di căn chỉ xảy ra khi phát hiện 1/10 000 CTC Theo những giả thuyết trước đây, sự di căn của các tế bào ung thư chỉ xảy ra

ở giai đoạn muộn, các tế bào ung thư vú có thể di căn tới hạch bạch huyết trước khi tới máu ngoại vi và tổ chức khác Nhưng ngày nay người ta đã chứng minh được rằng di căn xảy ra chỉ khoảng 50% bệnh nhân UTV tại chỗ, và thậm chí 20 - 30% bệnh nhân UTV với hạch bạch huyết âm tính sẽ vẫn có di căn xa trong vòng 5 năm [25] [26] [30] [38][46] Kết quả này mở ra triển vọng có thể phát hiện sớm khối u dựa vào việc phát hiện các CTC mang những gen chỉ thị đặc trưng cho khối u lưu hành trong máu Kỹ thuật PCR và hiện đại hơn là RT-PCR, Real-time PCR, các nhà khoa học đã tìm ra sự hiện diện của các tế bào UTV trong máu như cytokeratin 19 (CK19), cytokeratin

20 (CK 20), mammaglobin (hMAM), maspin, β-hCG, thụ thể yếu tố phát triển biểu mô( EGFR), Her-2/neu, MUC1 và CEA với độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau [26] Sự tiến bộ của xét nghiệm chẩn đoán để phát hiện các tế bào ung thư lưu hành trong máu đã được thực hiện trên rất nhiều nghiên cứu [41][42][43][44] Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng bộc lộ một vấn đề khó khăn đó

là một số gen gây UT cũng biểu hiện trong tế bào máu cũng như trong tế bào biểu mô bình thường Điều này dẫn đến kết quả dương tính giả, làm giảm đáng kể sự tương quan giữa sự biểu hiện của các gen UT và các yếu tố tiên lượng bệnh cảnh lâm sàng Do vậy, để tránh hiện tượng dương tính giả, cần phải lựa chọn cẩn thận được một gen chỉ biểu hiện ở bệnh UT mà không biểu hiện ở các tế bào bình thường Gen survivin mã hóa một protein ức chế quá

trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) Gen survivin được biểu hiện mạnh trong các mô của bào thai đang phát triển và trong nhiều loại ung thư, trong đó có UTV [56], nhưng điều đặc biệt có ý nghĩa là gen survivin không biểu hiện ở các mô bình thường [17] Do vậy, việc phát hiện gen survivin trong máu có thể được xem như là một công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán sớm, tiên lượng và theo dõi điều trị bệnh UTV [23][31] [36].

1.7 Gen survivin trong ung thư vú

1.7.1 Khái quát về sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis)

Sự chết tế bào bao gồm chết bệnh và chết tự nhiên Trường hợp bệnh

lý, những tế bào không được cung cấp máu có thể bị trương lên, màng tế bào

bị nứt, rách và dẫn đến tế bào vỡ tung ra Sự chết tế bào như vậy cuối cùng cũng sẽ đưa đến chết mô, đó là sự chết hoại Tuy nhiên trong một số trường hợp khác, những tế bào không bị trương lên mà teo lại Màng tế bào vẫn còn nhưng sần sùi và nhân thường kết đặc lại, tế bào ở dạng này gọi là apoptosis Apoptosis xẩy ra một cách bình thường như là một phần trong chương trình hoạt động sống của tế bào Trong cơ thể bình thường, hai quá trình trái ngược nhau, đó là sự phân chia tế bào và sự chết tế bào nhằm điều chỉnh tế bào của

cơ thể Phân chia tế bào làm tăng số lượng tế bào Apoptosis làm giảm số lượng tế bào, đảm bảo duy trì hình thái bình thường của cơ thể, của cơ quan Apoptosis là một quá trình sinh lý đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển hài hòa trong thời gian phát triển phôi và bảo vệ cơ thể, thay thế mô ở những cơ thể trưởng thành

Hình 1.1 Apoptosis

Khi quá trình apoptosis không xảy ra hoặc bị ức chế, tế bào sẽ không bị phá hủy bởi sự chết theo chương trình và tế bào sẽ phân chia, tạo thành các tế bào con với DNA bị tổn thương Điều này có thể là một cơ chế dẫn đến sự phát sinh ung thư

1.7.2 Survivin

1.7.2.1 Cấu trúc survivin

Hình 1.2 Survivin

Survivin là thành viên thuộc nhóm các protein ức chế sự chết theo chương trình của tế bào (IAP) và điều hòa phân chia tế bào Survivin được phát hiện vào năm 1997 từ thư viện bộ gen của người [17] Gen survivin có chiều dài 15 kb, nằm ở vị trí NST 17q25 Sợi mã hóa của survivin có cấu trúc

mở gồm 426 nucleotid mã hóa cho protein gồm 142 aa với TLPT vào khoảng 16,3 kDa

Hình 1.3 Sơ đồ NST 17 và vị trí của gen survivin

Ngoài ra gen survivin còn có thêm 4 loại biến thể ghép nối [53]:

Bảng 1.4 Cấu trúc cDNA của các loại biến thể ghép nối của survivin

STT Các dạng biến thể ghép nối Các exon

Hình 1.4 mRNA survivin tiền thân tạo thành mRNA trưởng thành với 5

biến thể ghép nối.

1.7.2.2 Vai trò của survivin

*.Vai trò ức chế sự chết theo chương trình tế bào của survivin

Survivin đóng vai trò quan trọng ngăn chặn tế bào chết theo chương trình bằng cách trực tiếp hay gián tiếp ức chế hoạt hoá caspase 3 và 7 Caspases (viết tắt của cysteine-aspartic protease) là enzyme protease dạng cysteine-aspartic là một trong những yếu tố chính tham gia vào quá trình apoptosis Caspases có vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis bằng cách phá hủy những enzym nhân đôi và enzym sửa chữa DNA, hoạt hóa những enzym để cắt DNA thành những mảnh nhỏ giống nhau, phá vỡ cấu trúc protein trong nhân

* Vai trò của survivin trong phân chia tế bào

chu kỳ tế bào, survivin được phát hiện ở phần tâm ở kỳ đầu/ kỳ giữa và có ở vùng giữa sợi thoi vô sắc ở kỳ sau/ kỳ cuối, nhưng không phát hiện được vào

thời điểm kết thúc kỳ cuối [45] Trong một nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng survivin tồn tại ở tâm động cho đến kỳ giữa, sau đó đến phần giữa của thoi vô sắc vào kỳ sau và tách về phía hai cực ở kỳ cuối nguyên phân và phân bào giảm nhiễm [46] Survivin được cho là nằm trong nhóm protein vận chuyển nhiễm sắc thể (NST), có nhiệm vụ vận chuyển NST đến trung tâm của tế bào

ở kỳ giữa và có vai trò quan trọng trong quá trình phân bào giảm nhiễm và sự chuyển động của NST trong phân bào nguyên phân [47]

* Vai trò của survivin trong tăng sinh mạch

Cơ chế tăng sinh mạch của survivin đóng góp vào việc bảo tồn tính toàn vẹn của vi cấu trúc hình ống và ức chế apoptosis ở tế bào nội mạc, làm cho tế bào này có khả năng tồn tại và chức năng bảo vệ tế bào ung thư [59]

1.7.3 Survivin trong ung thư vú

Ung thư vú xảy ra khi các tế bào mất khả năng kiểm soát sự cân bằng của quá trình tăng trưởng và chết tế bào Bình thường, sự tăng trưởng mạnh của tế bào này sẽ bị ức chế do số lượng tế bào chết tăng lên gọi là quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) Tại trường đại học St Vincent, người ta đã nghiên cứu các protein liên quan đến sự tăng trưởng và chết của

tế bào, đặc biệt có một loại protein tên là survivin Protein này biểu hiện mạnh trong các mô của bào thai đang phát triển vì giúp đảm bảo sự sống còn của bào thai chỉ cho đến khi sinh Survivin được tìm thấy trong nhiều loại ung thư bao gồm cả ung thư vú Điều đặc biệt có ý nghĩa là các protein này không biểu hiện ở các mô vú bình thường nhưng lại có nồng độ rất cao trong các khối u vú ác tính [17] [32] Kiểu biểu hiện của protein này và chức năng ức chế quá trình apoptosis cho thấy vai trò quan trọng của survivin đối với việc duy trì sự sống của tế bào ung thư và ức chế quá trình apoptosis [21] Survivin biểu hiện cao trong các dòng tế bào UTV, UTP và thấp hơn nhiều trong các

UT khác [35] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng survivin có thể là một marker

nồng độ cao hơn đáng kể trong các hạch bạch huyết ở bệnh nhân UTV khi so sánh với mô vú và cao hơn hẳn ở bệnh nhân UTV di căn Đó có thể là do survivin tham gia vào sự phát triển của các khối u và sự di căn của tế bào ung thư Các nhà khoa học đã thực hiện rất nhiều nghiên cứu đã nhận ra rằng survivin có thể tham gia vào quá trình tăng trưởng của các tế bào ung thư và phát triển với tốc độ rất nhanh dẫn đến việc dùng các thuốc hoá học trị liệu để diệt tế bào ung thư là rất khó khăn [20] Trong một nghiên cứu với trên 500 bệnh nhân UTV cho thấy nồng độ survivin càng cao thì tiên lượng sống của bệnh nhân càng giảm và có nhiều khả năng bệnh tái phát Vì vậy survivin có thể là một yếu tố dự báo tiên lượng bệnh nhân UTV [21] Hơn nữa, mRNA survivin đã được phát hiện tới 69,2% -93,8% trên mô bệnh nhân UTV nguyên phát, mức biểu hiện của survivin có liên quan với kết quả lâm sàng

minh gen survivin là một dấu ấn tiên lượng nguy cơ tái phát của bệnh nhân UTV sau phẫu thuật Sau khi nghiên cứu trên 275 mô vú của bệnh nhân UTV đã được phẫu thuật, định lượng mRNA survivin bằng kỹ thuật TaqMan RT-PCR, kết quả cho thấy rằng nồng độ mRNA survivin

tỷ lệ với mức độ nặng nhẹ của bệnh nhân Như vậy, nhóm bệnh nhân có

nguy cơ thấp có thể tránh những điều trị không cần thiết và nhóm bệnh nhân

có nguy cơ cao sẽ phải điều trị tích cực hơn Những kết quả này cũng cho thấy gen survivin được coi như là một mục tiêu đầy hứa hẹn trong điều trị cho bệnh nhân ung thư vú [31] Một nghiên cứu khác của Shin-Ichi Yamashita và cộng sự tại bệnh viện Kumamoto, Nhật Bản trên 76 mẫu mô của bệnh nhân UTV giai đoạn nguyên phát Những bệnh nhân này tại thời điểm phẫu thuật được chẩn đoán là UTV chưa có di căn và được theo dõi điều trong 5 năm

mRNA survivin được đánh giá bằng kỹ thuật TaqMan RT-PCR Khi so sánh

sự biểu hiện của survivin trên 76 bệnh nhân UTV với các yếu tố bệnh học lâm sàng không tìm thấy sự liên quan giữa tỷ lệ survivin và các yếu tố như tuổi, tình trạng mãn kinh, tình trạng ER và PgR và loại phẫu thuật.Kết quả cho thấy khối u giai đoạn từ T1-T4 liên quan với nồng độ của mRNA của survivin tăng dần lên (p=0.0104) Nồng độ mRNA survivin ở bệnh nhân UTV giai đoạn III cao hơn so với giai đoạn I hoặc II; bệnh nhân có di căn hạch cao hơn so với bệnh nhân không có hạch (p = 0,0001) Những bệnh nhân có biểu hiện survivin thấp có khả năng sống sót tốt hơn đáng kể so với những bệnh nhân

có biểu hiện survivin cao trong UTV giai đoạn I và II (p <0,0001) Như vậy, survivin có thể được sử dụng như một chỉ thị mới để tiên lượng và theo dõi

UTV [33] Survivin không những được nghiên cứu trên mô mà còn được nghiên cứu nhiều trên máu ngoại vi Một công trình nghiên cứu của Yie SM,

Luo B và cộng sự tại trung tâm nghiên cứu UT Chengdu, Trung Quốc về sự biểu hiện của gen survivin từ các tế bào UTV lưu hành trong máu ngoại vi dựa trên kỹ thuật RT-PCR ELISA.Trong số 67 bệnh nhân UTV ở giai đoạn khác nhau, người ta đã phát hiện được mRNA survivin trong các mẫu máu ngoại vi ở 34 bệnh nhân chiếm 50,7% nhưng không phát hiện được gen này ở nhóm chứng gồm 135 phụ nữ bình thường khỏe mạnh Sự biểu hiện của gen survivin từ các tế bào UTV lưu hành trong máu ngoại vi có liên quan đáng kể với các thông số bệnh học lâm sàng như thâm nhiễm mạch, loại mô học, kích

Các bệnh nhân trên được theo dõi tiếp trong 36 tháng, kết quả cho thấy 9 trong số 11 bệnh nhân UTV (chiếm 81,8%) có biểu hiện survivin (+) tại thời điểm kiểm tra xét nghiệm ban đầu bị tái phát bệnh, trong khi tỉ lệ tái phát chỉ tìm thấy trên 2 trong số 6 bệnh nhân UTV (chiếm 33,3%) mà biểu hiện

survivin (-) Vì vậy, việc phát hiện các tế bào ung thư lưu hành có biểu hiện mRNA survivin có thể cung cấp thông tin có giá trị cho các dự báo di căn và khả năng tái phát của UTV [37] Như vậy, có thể thấy gen survivin có giá trị rất lớn trong chẩn đoán sớm, tiên lượng và theo dõi điều trị bệnh nhân UTV Chính vì lý do này mà nghiên cứu đánh giá sự biểu hiện mRNA survivin trong máu nhằm mục đích tìm ra tế bào ung thư vú lưu hành có thể là một mục tiêu lý tưởng trong chẩn đoán, tiên lượng và theo dõi điều trị UTV

Ở Việt Nam có rất nhiều nghiên cứu về UTV, tập trung chủ yếu vào lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh, giải phẫu bệnh Các nghiên cứu về gen ung thư trong chẩn đoán và điều trị UTV chưa nhiều Nhờ những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học phân tử trong những năm gần đây đã làm thay đổi nhiều quan

Tôn Hoàng và PGS Tạ Thành Văn là nhóm nghiên cứu đầu tiên sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử đánh giá mức độ sao chép của gen HIP (heparansulsulfate interacting protein) ở mô UTV Các tác giả đã đưa ra những bằng chứng về sự khác biệt đáng kể mức độ sao chép mRNA của HIP

ở mô UTV so với mô u xơ vú đơn thuần Đặc biệt mức độ sao chép này lại phụ thuộc vào giai đoạn tiến triển của khối u Trong khi đó, biểu hiện mức độ thấp ở 1 trong số 5 mẫu u xơ (chiếm tỷ lệ 20%) Vì vậy nghiên cứu các loại dấu ấn ung thư có bản chất là gen có thể mở ra ứng dụng phát hiện sớm, tiên

thấy có nghiên cứu về phát hiện gen survivin trên mô cũng như trong máu bệnh nhân UTV Chính vì vậy, để bước đầu góp phần nghiên cứu xây dựng các phương pháp mới xác định các tế bào UT góp phần chẩn đoán UTV ở

phụ nữ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu phát hiện gen survivin

từ các tế bào ung thư vú ”

1.8 Các kỹ thuật di truyền phân tử sử dụng để phát hiện sự biểu hiện của tế bào ung thư.

Phát hiện các CTC trong máu hoặc tủy xương đòi hỏi kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để có thể phát hiện được 1 tế bào ung thư trong số

dịch tế bào như PCR, RT-PCR được sử dụng rất nhiều Mỗi phương pháp đều

sử dụng đặc điểm khác nhau của các CTC để phát hiện ra các CTC

Phát hiện các CTC bằng phương pháp hóa miễn dịch dựa vào khả năng phân biệt giữa các tế bào của các tổ chức mô khác nhau của kháng thể, ví dụ như các tế bào biểu mô từ các tế bào tạo máu có nhân Kháng nguyên được sử dụng nhiều nhất trên tế bào biểu mô là cytokeratin được biểu hiện giống nhau

ở các tế bào biểu mô Các kháng thể có đánh dấu qui định cho cytokeratin, được phân tích bởi sử dụng kính hiển vi huỳnh quang (fluorescence microscopy - FM), kỹ thuật dòng chảy (flow cytometry - FC) và thường xuyên hơn bởi kỹ thuật hóa tế bào miễn dịch (immunocytochemistry – ICC) với kỹ thuật nhuộm peroxidase hoặc alkaline phosphatase

1.8.1 Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry – IHC)

Nguyên lý

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC) là phương pháp áp dụng các nguyên

lý và kỹ thuật miễn dịch để nghiên cứu tế bào và mô Dựa trên sự biểu lộ mang tính đặc hiệu kháng nguyên trên bề mặt tế bào, các kháng thể đặc hiệu

sẽ giúp cho việc nhận ra và phân loại các tế bào, mô IHC được sử dụng rộng rãi trong sử dụng rộng rãi để phát hiện các tế bào bất thường trong bệnh ung thư Trong trường hợp phổ biến nhất, một kháng thể liên hợp với một loại enzyme, ví dụ như peroxidase, có thể xúc tác cho phản ứng màu Ngoài ra, kháng thể cũng có thể được gắn huỳnh quang như fluorescein hoặc Rhodamine

1.8.2 Kỹ thuật hóa tế bào miễn dịch (Immunocytochemistry- ICC)

Nguyên lý

ICC là kỹ thuật được sử dụng để đánh giá sự có mặt của một loại protein hoặc kháng nguyên đặc hiệu trong tế bào bằng cách sử dụng của một kháng thể đặc hiệu liên kết với kháng nguyên, do đó cho phép hiển thị và kiểm tra dưới kính hiển vi

Phát hiện các CTC trong tủy xương dựa vào kỹ thuật hóa tế bào miễn dịch (ICC) được sử dụng rất nhiều trên thế giới Ưu điểm của phương pháp này là ICC có thể kết hợp với FISH cho phép phân loại các tế bào ở mức độ phân tử và phân tích hình thái tế bào Tuy nhiên, để xác định các tế bào có chứa cytokeratin đòi hỏi kháng thể đánh dấu cần thấm qua màng tế bào Điều này sẽ gây ra chết tế bào và do đó không thể phân biệt giữa các tế bào sống và

tế bào chết Thực tế là chỉ có những tế bào sống được mới có thể phát triển thành ung thư di căn

Những kỹ thuật phát hiện dựa vào kháng thể thường cho kết quả không đặc hiệu vì cytokeratin cũng biểu hiện trong cả tế bào tạo máu ICC cho phép

đủ độ đặc hiệu để phát hiện tổ chức nơi các tế bào ung thư thật sự có mặt

Kỹ thuật ICC là 1 kỹ thuật đòi hỏi có sự tham gia của nhiều người và tốn thời gian Hơn nữa, đây là kỹ thuật thao tác bằng tay rất tốn tiền nên không thể sử dụng là phương pháp thường quy để chẩn đoán ung thư [61]

1.8.3 PCR

Kỹ thuật phát hiện phân tử dựa trên acid nucleic như PCR, RT-PCR được sử dụng phân tích acid nucleic để nhận biết giữa tế bào tạo máu và tế bào ung thư biểu mô Hiện nay, đây là những kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhằm phát hiện các CTC trong tủy xương và trong máu

PCR được phát minh bởi Kary Mullis năm 1983, và giúp ông đoạt giải Nobel hóa học năm 1993

Nguyên lý

PCR được sử dụng để khuếch đại một chuỗi DNA (DNA đích) Chuỗi này có thể là gen, một phần của gen, hay chuỗi không mã hóa PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase Khi DNA polymerase tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn cần có mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn có thể bắt cặp chuyên biệt với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase nối dài mồi tạo một mạch DNA mới [2]

Quy trình

Các phản ứng PCR được thực hiện với nhiều bước thay đổi nhiệt độ và lặp lại nhiều chu kỳ (thường là 20-35 chu kỳ) Nhiệt độ và thời gian mỗi chu kỳ

phụ thuộc vào nhiều thông số: enzyme, nồng độ cation và dNTPs, nhiệt độ chảy của mồi

phá vỡ nối hydrogen của chuỗi đôi DNA tạo thành các chuỗi đơn

xung vào hai đầu của đoạn DNA đích

- Kéo dài chuỗi: nhiệt độ phụ thuộc vào DNA polymerase sử dụng,

dNTPs lại đầu 3’của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để tổng hợp mạch bổ xung mới

phút sau chu kỳ PCR cuối cùng để đảm bảo tất cả các chuỗi đơn DNA được kéo dài đủ

giữ phản ứng trong thời gian ngắn

Qua mỗi chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân thành hai bản sao, và nếu chu kỳ được lặp lại liên tục 25-35 lần thì từ 1 DNA đích sẽ được khuếch đại lên 225 đến 235 bản sao, tức là hàng tỷ bản sao [2] [14] [26] Thông thường tổng số chu kỳ dưới 30, nếu càng kéo dài thì khả năng xảy ra đột biến càng cao và tạo sản phẩm PCR ngoài mong muốn

Hình 1.6 Các bước cơ bản của phản ứng PCR

(Nguồn: Vierstraete,1999) 1.8.4 RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)

RT-PCR (hay còn gọi là phiên mã ngược PCR) là một kỹ thuật sử dụng RNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên chuỗi DNA bổ sung (cDNA), gồm có 2 giai đoạn: 1) Giai đoạn thứ nhất tổng hợp cDNA (complementary DNA) từ RNA dưới tác dụng của enzyme phiên mã ngược

và các mồi oligo-(T) hoặc các mồi ngẫu nhiên; 2) giai đoạn nhân bản gen quan tâm từ cDNA bằng PCR với các mồi đặc hiệu

RNA được cấu tạo nhờ bốn loại nucleotide (adenine, guanine, cytosine

và uracil) liên kết với nhau tạo thành một chuỗi đơn Khi chuỗi nucleotide này được biến đổi thành DNA thì uracil (U) được thay thế bằng thymine (T)

Phản ứng biến đổi RNA hệ gen thành sợi DNA thứ nhất phải nhờ đến một enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) do vậy giai đoạn này được gọi là phiên mã ngược (RT), sau đó quá trình tổng hợp sợi DNA thứ hai lại nhờ một enzyme khác là DNA polymerase I (thường dùng đoạn Klenow).

Khi đã có DNA sợi đôi từ khuôn mẫu RNA thì phản ứng tiếp theo sẽ là khuếch đại gen nhờ kỹ thuật PCR được thực hiện với ba mức nhiệt độ phù hợp ở mỗi chu kỳ Toàn bộ phản ứng khuếch đại một đoạn DNA từ khuôn mẫu RNA trải qua hai giai đoạn nói trên được gọi là RT-PCR

Kỹ thuật RT- PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lượng rất thấp, không thể phát hiện bằng các phương pháp cổ điển khác như Northern blot RT- PCR thường được sử dụng để phát hiện các tế bào ung thư thông qua biểu hiện của các bản phiên mã mRNA

Hình 1.7 RT-PCR

Do PCR cho kết quả khuếch đại gấp triệu lần, mọi thay đổi các yếu tố trong quá trình khuếch đại sẽ ảnh hưởng đáng kể đầu ra cuối cùng Do vậy RT-PCR thường quy không được sử dụng cho mục đích phân tích định lượng

1.8.5 Real-time PCR

Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sự phân tích đầu cuối (end-point) bằng cách chạy điện di DNA trên agarose gel sau khi phản ứng kết thúc Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang

Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặc primer đặc hiệu chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR) Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ

Real-time PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép chúng ta định lượng số copy khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao trên một phạm vi động học lớn Các kết quả của real-time PCR có thể là chất lượng (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng (số bản copy của DNA) Số liệu của real-time PCR có thể đánh giá mà không cần điện di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưa vào quá trình được tăng lên Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và số liệu được đánh giá trong một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễm bẩn được giảm thiểu và sự cần thiết của các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ

Ứng dụng chính của real-time PCR trong nghiên cứu biểu hiện gen Xác định sự hoạt động của gen và định lượng mức độ biểu hiện của nó thông qua RNA bằng kỹ thuật RT-PCR

1.8.6 Kỹ thuật Microarray (Microscopy arrays)

Microarray là một kỹ thuật mới, hiện đại cho phép cùng một lúc xác định được sự có mặt và biểu hiện của các gen ở những mô, tế bào đặc trưng.

Nguyên lý: Gen được gắn vào lam kính hiển vi (đĩa microarray) cho

biến tính để được DNA ở dạng mạch đơn Mỗi đĩa microarray được gắn hàng ngàn đến hàng chục ngàn gen Tách các mRNA ở các mô, tế bào đặc thù và được đánh dấu bằng các chất có khả năng phát huỳnh quang Sau phản ứng lai, tiến hành rửa các mRNA không lai, quan sát vị trí lai nhờ phát hiện sự phát quang dưới kính hiển vi huỳnh quang

Dựa vào kết quả lai sẽ phát hiện được mRNA của gen đang hoạt động

và những gen ở trạng thái không hoạt động Sử dụng các chương trình phần mềm chuyên dụng để xác định sự biểu hiện của gen ở các mẫu phân tích

Hình 1.8 Kỹ thuật Microarray

Kỹ thuật microarray được ứng dụng để theo dõi mức độ biểu hiện của hàng ngàn gen cùng một lúc và cung cấp thông tin liên quan đến hoạt động tế bào Vì vậy, microarray đã được ứng dụng trong nghiên cứu chẩn đoán bệnh ung thư và nhiều bệnh khác , tuy nhiên hiện tại giá thành còn rất cao

1.8.7 Northern blot

Kỹ thuật này đã được phát hiện vào năm 1977 bởi James Alwine, David Kemp, và George Stark tại Đại học Stanford.

Northern blot là một kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử để nghiên cứu biểu hiện gen bằng cách phát hiện RNA Phát hiện RNA bằng cách lai với cDNA đã đánh dấu Mặc dù kỹ thuật này vẫn được sử dụng để đánh giá biểu hiện gen, tuy nhiên để thực hiện kỹ thuật Northern blot cần một lượng tương đối lớn RNA và kỹ thuật này chỉ có thể định tính hoặc bán định lượng mức độ mRNA

Hình 1.9 Kỹ thuật Northern blot 1.8.8 Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH: fluorescence in situ hybridization)

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ là một kỹ thuật di truyền tế bào phát triển bởi các nhà nghiên cứu y sinh trong đầu những năm 1980

Nguyên lý: Sử dụng một trình tự ngắn của chuỗi DNA sợi đơn, gọi là

mẫu DNA dò (probe DNA) để phát hiện một trình tự đích Các mẫu DNA dò được đánh dấu huỳnh quang và sẽ lai với DNA đích trên tiêu bản NST ở kỳ giữa hoặc gian kỳ Qua sự lai của DNA dò với trình tự bổ sung, ta có thể phát

hiện và định vị được trình tự ấy qua phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang FISH cũng có thể được sử dụng để phát hiện mRNA đặc hiệu trong các tế bào

và mô, giúp cho việc phát hiện sự biểu hiện gen trong các tế bào và mô d ựa vào việc sử dụng của một gen để cung cấp các tín hiệu huỳnh quang

Hình 1.10 Kỹ thuật FISH

Hạn chế của kỹ thuật FISH: Kết quả phụ thuộc vào chất lượng cũng như số lượng DNA mẫu, phụ thuộc vào rất nhiều kinh nghiệm của người phân tích kết quả do vậy khả năng âm tính giả cao

Tóm lại, hiện nay có rất nhiều kỹ thuật để phát hiện sự biểu hiện gen gây bệnh UTV Việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào đặc điểm của từng gen Hiện tại đã có rất nhiều nghiên cứu về gen survivin ở bệnh nhân ung thư trên thế giới Nói chung các nghiên cứu đều dựa trên kỹ thuật RT-PCR [43][44], real-time RT-PCR [34][54] hoặc các biến thể của nó như RT-PCR ElISA[38]

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

+ Mẫu bệnh

- Mẫu máu và mẫu mô của 13 bệnh nhân UTV tuổi từ 31 – 71, giai đoạn

II, III, IV đã được chẩn đoán lâm sàng và mô bệnh học

Giai đoạn I: 01 bệnh nhân

Giai đoạn II: 07 bệnh nhân

Giai đoạn III: 05 bệnh nhân

Các bệnh nhân được làm các xét nghiệm hoá sinh, huyết học, X- quang, tại Bệnh viện K trung ương

♠ Tiêu chuẩn loại trừ: Có bất kỳ một khối u hay ung thư một cơ quan nào khác ngoài ung thư vú

+ Mẫu chứng

- Mẫu mô: 05 mẫu mô của bệnh nhân u vú lành tính Các bệnh nhân này cũng được chẩn đoán lâm sàng và mô bệnh học tại Bệnh viện K trung ương Bệnh nhân không mắc bất kỳ một loại hình bệnh tật hay ung thư nào khác

Lấy mẫu

Sau khi có kết quả chẩn đoán của lâm sàng và cận lâm sàng, những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn của nghiên cứu sẽ được lựa chọn Bệnh nhân được hẹn ngày lấy máu và phẫu thuật cắt bỏ khối u UTV

- Mẫu máu: Bệnh nhân được lấy 5ml máu tĩnh mạch chống đông bằng

RNA tổng số Quy trình đảm bảo tuyệt đối vô trùng

- Mẫu mô: Được lấy trên cùng bệnh nhân lấy máu, ngay sau khi bệnh nhân được phẫu thuật cắt bỏ khối u Mẫu được lấy vào lọ vô trùng, mẫu mô được lấy vào mô ung thư nhằm đảm bảo độ chính xác cho kết quả nghiên cứu

Quy trình lấy mẫu sẽ được tối ưu hóa nhằm đảm bảo chất lượng và nhất quán trong toàn bộ quá trình thực hiện đề tài

2.2.Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Thời gian nghiên cứu bắt đầu từ 3/2011- 11/2011

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Phòng công nghệ tế bào động vật - Viện Công nghệ sinh học

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang Kết quả thu được được xử lý trên

hệ thống máy tính bằng các thuật toán y sinh học

2.4 Phương tiện nghiên cứu

2.4.1.Dụng cụ

- Máy PCR: Effpendorf (Đức)

- Tủ lạnh sâu: -300 C; - 800C (Sanyo), tủ ấm

- Máy điện di ngang Mupid ( Nhật Bản),

- Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và máy ly tâm để bàn Effpendorf (Đức)

- Máy soi gel

- Máy đo Nanodrop- 1000 Spectrophotometer

- Pipet định mức, đầu côn các loại, ống PCR, ống effpendorf 2ml, ống Falcon, găng tay, giấy thấm đã được vô trùng tuyệt đối

- Lò vi sóng, tủ sấy, tủ đá, nồi hấp thanh trùng và các thiết bị khác thuộc Phòng nghiên cứu tế bào động vật (Viện Công nghệ sinh học)

2.4.2 Hóa chất

- Hóa chất dùng để tách chiết RNA tổng số: Theo kit của Qiagen

- Hóa chất dùng để tạo cDNA: Theo kit của Invitrogen

- Hóa chất dùng cho PCR: Dung dịch đệm, dNTPs, taq polymerase, mồi, nước cất

- Hóa chất dùng cho real-time PCR : Kit real-time PCR sử dụng SYBR Green của Roche

+ Mồi GAPDH (kiểm tra chất lượng cDNA)

Mồi xuôi : 5’- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC- 3’

Mồi ngược: 5’- GAAGATGGTGATGGGATTC- 3’

+ Mồi survivin: thiết kế và đặt Macrogen sản xuất

2.5 Xây dựng quy trình nghiên cứu

2.5.1 Thiết kế mồi

Hình 2.1 Ba loại mRNA survivin: survivin, survivin 2B, survivin ∆Ex3

Người ta đã phát hiện mRNA của survivin có nhiều biến thể ghép nối Hình 2.1 minh họa mRNA của 3 loại survivin: survivin, survivin 2B và survivin ∆Ex3 Mục đích nghiên cứu là khuếch đại gen survivin vì đây là dạng hay gặp nhất nên chúng tôi thiết kế cặp mồi dựa vào trình tự gen survivin (hình 2.2) Gen survivin gồm có 4 exon: exon 1 từ vị trí Nu 1 – 232, exon 2 từ vị trí Nu 233 – 342, exon 3 từ vị trí Nu 343 – 460, exon 4 từ vị trí

Nu 461 – 2631 Intron nẵm xen giữa exon 1 và exon 2 dài 252 bp Do vậy, thiết kế mồi khuếch đại gen survivin có kích thước phải nhỏ hơn 252 bp để có thể đảm bảo chính xác là khuếch đại đúng mRNA Dựa vào phần mềm Primer

3 chúng tôi đã thiết kế cặp mồi có trình tự dựa vào exon 1, exon 2 và một phần exon 3 Vị trí của mồi F từ Nu 189-209 và mồi R là 335-358 Như vậy là mồi F nằm ở exon 1, mồi R vừa nằm trên exon 2 và đầu exon 3

181tacattcaag aactggccct tcttggaggg ctgcgcctgc accccggagc ggatggccga

241 ggctggcttc atccactgcc ccactgagaa cgagccagac ttggcccagt gtttcttctg

301 cttcaaggag ctggaaggct gggagccaga tgacgacccc atagaggaac ataaaaagca

Hình 2.2 Trình tự một đoạn gen surviving

Đoạn trình tự đánh dấu màu vàng là mồi F; Đoạn trình tự đánh dấu màu đỏ là mồi R

Mồi gen survivin có trình tự như sau:

Cặp mồi này có mồi F dài 21bp và mồi R dài 24bp, khuếch đại một đoạn DNA dài 170bp, trong đó có chứa exon 1, exon 2 và một phần exon 3 Khi sử dụng phần mềm protocol-online.org để kiểm tra lại cho thấy đáp ứng đủ tiêu chuẩn cho một cặp mồi PCR: Tm tương đương nhau, ít cấu trúc kẹp tóc, không bắt cặp bổ xung giữa mồi xuôi và ngược

2.5.2 Kỹ thuật nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu được sử dụng trong thời gian khoảng 1 tháng sau khi thu thập