HIV có hình cầu, kích thước 100120 nanometres, cấu trúc gồm : 2 sợi RNA có khoảng 9200 cặp base. Vi rút hoàn chỉnh có cấu trúc gồm 3 lớp: Bao ngoài: Màng lipid kép có các gai nhú ra bên ngoài là các phân tử Glycoprotein có trọng lượng 160 kilodalton ( Gp 160). Gồm hai thành phần: Glycoproteine màng ngoài trọng lượng phân tử 120 kilodalton (Gp 120). Phân tử Gp120 nhận biết thụ thể CD4 có trên tế bào lympho CD4 và một số tế bào khác, nhờ đó vi rút bám được vào tế bào đích. Xuyên qua màng lipid là các phân tử glycoprotein có trọng lượng 41 kilodalton (gp 41) tham gia vào giai đoạn hòa màng của vi rút và tế bào nhiễm. Các gp giúp cho virút bám và xâm nhập vào tế bào đích.
Trang 1I ĐẠI CƯƠNG VỀ HIV VÀ AIDS
1 LỊCH SỬ
Năm 1981, M Gottlieb (Los Angeles) đã mô tả bệnh phổi do Pneumocystis cariniitrên một người nam không có tiển sử bệnh lý đặc biệt và có sự giảm tế bào lymphoTCD4 Sau đó Trung tâm kiểm dịch Hoa Kỳ CDC Atlanta cũng đã nói đến bệnh nàytrong số những người đàn ông đồng tính luyến ái tại Mỹ, kèm theo những biểu hiệnnhiễm trùng cơ hội khác, sarcome Kaposi, và tình trạng giảm số lượng tế bào lympho
TCD4 Bệnh này được gọi tên là hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải, hay còn gọi là
AIDS
Năm 1983 một nhóm các nhà nghiên cứu của Pháp gồm: F.Barré- Sinoussi, J.C.Chermann, Luc Montanier đã phân lập được HIV -1từ hạch của một bệnh nhân bị hộichứng hạch to kéo dài
Năm 1984 các nhà nghiên cứu đã chứng minh được tế bào đích của HIV là tế bàolympho T CD4
Năm1985, những sinh phẩm phát hiện nhiễm HIV đầu tiên được sản xuất
Đến tháng 3/1986 : Nhóm nghiên cứu của Pasteur đã phân lập được HIV-2 ở haibệnh nhân Tây Phi
Cuối 1986 đã có những kết quả lâm sàng đầu tiên về điều trị bệnh nhân nhiễm HIVvới AZT
Năm 1990 những ghi nhận đã cho thấy số lượng tế bào lympho T CD4 như một chỉ sốquan trọng trong theo dõi, tiên lượng sự tiến triển bệnh
Năm 1995-1996 đã định lượng được lượng vi rút có trong huyết tương, đây là một chỉ
số có giá trị quan trọng trong tiên lượng tiến triển của bệnh và chỉ định điều trị
Cho đến nay đã có rất nhiều loại thuốc dùng điều trị nhằm giúp bệnh nhân kéo dàicuộc sống Sử dụng đa trị liệu là phương pháp tốt trong điều trị
Trang 22 PHÂN LOẠI
HIV được xếp vào phân nhóm vi rút chậm ( Lenti vi rút), thuộc họ Retrovirút
Họ Retro vi rút gồm những vi rút RNA, có đặc tính chung là có enzym sao chépngược (reverse transcriptase ) cho phép sao chép DNA từ RNA
Lenti vi rút gồm các virút gây các bệnh tiến triển chậm, trong đó HIV-1, HIV-2 gâybệnh cho người và một số vi rút khác gây bệnh trên súc vật: SIV (khỉ), VISNA (cừu), FIV(mèo), BIV (bò), EIAV (ngựa), CAEV(dê)
cả các nước trên thế giới HIV-2 được phát hiện năm 1986, tìm thấy ở một số nước Tâyphi Bệnh cảnh lâm sàng do hai loại này không thể phân biệt được, đường lây hoàn toàngiống nhau, chúng khác nhau ở một số điểm:
Về di truyền: bộ gien của HIV-1 và HIV-2 có cấu trúc di truyền khác nhau >50%,HIV-2 gần với SIV hơn Kháng nguyên 2 vi rút này cũng khác nhau Trọng lượng phân
tử của các thành phần cấu trúc cũng có khác biệt và thời gian không triệu chứng củaHIV-2 dài hơn HIV-1 Tỷ lệ nhiễm HIV-1 cao hơn HIV-2
Trang 3Trong HIV-1 người ta chia làm 3 nhóm lớn dựa trên cấu trúc của vòng V3, các nhóm có đặcđiểm di truyền khác nhau 20%, các thứ týp có đặc điểm di truyền khác nhau khoảng 5%:
- Nhóm M: có thứ týp (subtype) từ A →I
- Nhóm O: Chủ yếu gặp ở Gabon, Cameroun
- Nhóm N: Mới được biết đến ở Cameroun, gần với SIV của Chimpanze
3 TÍNH CHẤT CỦA HIV
3.1 CẤU TRÚC:
HIV có hình cầu, kích thước 100-120 nanometres, cấu trúc gồm : 2 sợi RNA có
khoảng 9200 cặp base Vi rút hoàn chỉnh có cấu trúc gồm 3 lớp:
Bao ngoài:
Màng lipid kép có các gai nhú ra bên ngoài là các phân tử Glycoprotein có trọng
lượng 160 kilodalton ( Gp 160) Gồm hai thành phần:
- Glycoproteine màng ngoài trọng lượng phân tử 120 kilodalton (Gp 120) Phân tử
Gp120 nhận biết thụ thể CD4 có trên tế bào lympho CD4 và một số tế bào khác,
nhờ đó vi rút bám được vào tế bào đích
- Xuyên qua màng lipid là các phân tử glycoprotein có trọng lượng 41 kilodalton
(gp 41) tham gia vào giai đoạn hòa màng của vi rút và tế bào nhiễm Các gp giúp
cho virút bám và xâm nhập vào tế bào đích
Vỏ trong (capside): Gồm 2 lớp protein
Sơ đồ cấu trúc HIV
Trang 4- Lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi phân tử protein có trọng lượng phân tử là 18kilodalton (p18).
- Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi phân tử protein có trọng lượng phân tử là 24kilodalton (p24)
Phần lõi: gồm
- Bộ gien gồm 2 chuỗi RNA giống hệt nhau, trên có gắn enzyme RT
- RT (reverse transcriptase): Còn gọi là men sao chép ngược, là enzyme RNAdạng hoạt động: p66/51 ở HIV-1 và p68 ở HIV-2, đảm nhiệm phiên mã bộ gien
- Ngoài ra có một số gien tổng hợp các protein chức năng điều hòa khác
3.2 PROTEIN CẤU TRÚC VÀ VAI TRÒ:
Sơ đồ gien của HIV-1
Trang 5Gồm ba nhóm gien chính, chung cho họ retro vi rút, mã hóa cho các protein:
- Gag (groupe antigen): Mã hóa cho các protein lõi (p24, p17).
- Pol (polymerase): Mã hóa cho các enzym sao chép ngược (transcriptase inverse),
protease và intergrase
- Env (enveloppe): Mã hóa cho các glycoproteine vỏ gp 41, gp120 có vai trò quan
trọng trong việc giúp vi rút bám và xâm nhập được vào tế bào đích
- Ngoài 3 nhóm gien chính, bộ gien của vi rút còn có các gien khác mã hóa chocác protein có chức năng điều hòa : Tat, Rev, Vif, Nef, Vpr, Vpu
Tính thay đổi về di truyền:
Glycoproteine gp120 có những vùng rất thay đổi đặc biệt là “vòng V3” (“boucle V3”)
là vùng mã hóa của epitope tạo kháng thể trung hòa Vi rút phân lập được trên cùng bệnhnhân là một tập hợp những vi rút khác nhau từ 3-5% về đặc điểm di truyền Sự khác nhaunày chủ yếu là do men sao chép ngược trong quá trình đọc mã, đã có những sai sót vớitần xuất 5/10 000 - 6.7/10 000 cặp base bị đột biến mỗi chu kỳ (khoảng 5-6 đột biếntrong một chu kỳ nhân lên) Các đột biến này giúp cho vi rút có khả năng thoát khỏi hệthống miễn dịch [22]
3.3 CHU KỲ TĂNG TRƯỞNG:
Vi rút gắn lên bế mặt tế bào:
HIV gắn vào bế mặt tế bào cảm thụ nhờ sự phù hợp giữa thụ thể của tế bào với gp 120của nó Đó là thụ thể CD4 của tế bào lympho T hỗ trợ và một số tế bào khác như bạchcầu đơn nhân, đại thực bào… Ngoài CD4 là thụ thể chính giúp cho gp 120 của vi rút bámvào tế bào, còn có sự hỗ trợ của các đồng thụ thể khác như CCR5, CXCR4… để vi rútvào được tế bào
Vi rút xâm nhập tế bào:
Sau khi bám vào thụ thể của tế bào ký chủ, phân tử gp 41 cắm vào màng tế bào tạo sựhòa nhập của vỏ vi rút với màng tế bào Do đó bộ gien và enzyme của HIV giải phóngvào trong tế bào
Trang 6Vi rút nhân lên trong tế bào:
Nhờ men sao chép ngược, DNA bổ xung của HIV được tạo thành từ khuôn mẫu RNAcủa nó Lúc đầu là sản phẩm lai RNA-DNA sau đó với tác dụng của men RNase sẽ táchsợi RNA khỏi DNA Sợi DNA mới được tổng hợp tạo thành phân tử DNA chuỗi kép
Tích hợp:
Sau khi được tổng hợp DNA kép chui vào nhân tế bào ký chủ, quá trình tích hợp vàoDNA tế bào nhờ men integrase Vì vậy, HIV đã tránh được sự bảo vệ của cơ thể, cũngnhư tác dụng của thuốc
Khi vi rút xâm nhập tế bào sẽ có hai khả năng có thể xảy ra:
Vi rút “ngủ” trong tế bào nhiễm Đây là giai đoạn tiềm ẩn không gây hủy hoại các tếbào lympho T CD4 Các tế bào CD4 bị nhiễm vi rút vẫn có thể lây cho người khác khi virút chuyển lại sang dạng hoạt động Vi rút gây nhiễm các hạch bạch huyết và các đại thựcbào
Hoặc tế bào lympho T CD4 hoạt hóa làm các vi rút nhân lên tạo ra những virion mớigây phá vỡ tế bào, đồng thời khi virion ra khỏi tế bào sẽ làm nhiễm các tế bào lành khác.Khi số lượng tế bào lympho T CD4 giảm đi, hệ thống miễn dịch suy yếu, các triệu chứngcủa AIDS xuất hiện
3.4 SỨC ĐỀ KHÁNG:
HIV đề kháng với nhiệt độ lạnh, tia gamma, tia cực tím Sống được 3 ngày trong máubệnh nhân nếu để ở ngoài trời
Dễ bị tiêu diệt bởi alcool 70O, javel Vi rút bị bất hoạt ở pH=1 hay pH=13 Đun nóng
56OC/30 phút hay trong môi trường ẩm ướt virút cũng dễ bị tiêu diệt
4 SINH BỆNH HỌC
Giai đoạn 1: xâm nhập vào cơ thể.
Trang 7Vi rút xâm nhập cơ thể qua các ngã: Sinh dục, máu, mẹ truyền sang con.
Giai đoạn 2: Tấn công tế bào đích.
Các tế bào đích là tế bào có thụ thể CD4: Gồm tế bào lympho T hỗ trợ đóng vai tròquan trọng trong đáp ứng miễn dịch, tế bào trình diện kháng nguyên, các đại thực bào,bạch cầu đơn nhân, tế bào răng cưa, tế bào langerhan, tế bào thần kinh đệm
Giai đoạn 3: Sinh sản trong tế bào và gây các hậu quả.
Khi đã xâm nhiễm vào tế bào, vi rút sử dụng nguồn năng lượng của tế bào gồm cácenzymes để tăng trưởng và nhân lên, hậu quả cuối cùng làm tế bào bị hủy hoại và chết.Các hiện tượng tạo nên sự phá hủy tế bào lympho T CD4 bao gồm:
- Hiện tượng hợp bào: khi lympho TCD4 nhiễm HIV, trên bề mặt có các gp120của virút Các gp120 này sẽ gắn với các phân tử CD4 của các tế bào khỏe mạnhbên cạnh tạo thành các hợp bào Hợp bào bị thay đổi tính chất và tính thấm, nókhông còn chức năng của một tế bào bình thường, sau đó sẽ bị vỡ
- Hiện tượng ADCC (Antibody dependent cellular cytotoxicity): Kháng nguyêncủa virút có trên bề mặt tế bào Lympho TCD4 bị nhiễm sẽ gắn với phần Fab củakháng thể đặc hiệu kháng gp120 Phần Fc của kháng thể này sẽ gắn lên thụ thểcủa có trên bề mặt tế bào diệt làm cho Lympho TCD4 có gp120 bị tiêu diệt
- Hiện tượng hoạt hóa bổ thể: Một số gp120 tự do trong máu do được phóng thích
từ những lympho bào T CD4 bị nhiễm vi rút sẽ gắn vào các lympho bào T CD4khác Kháng thể kháng gp120 sẽ đến gắn vào gp120 tạo thành phức hợp khángnguyên - kháng thể, khi đó hệ bổ thể được hoạt hóa và cuối cùng lympho T CD4
bị nhiễm này sẽ bị ly giải
- Hiện tượng siêu kháng nguyên (superantigen): HIV hoạt động như là một “siêukháng nguyên” Chính vì vậy nó sẽ hoạt hóa không chuyên biệt nhiều tế bàolympho T hỗ trợ và dẫn đến sự chết của chúng
- Tế bào chết phóng thích nhiều chất hòa tan có khả năng gây độc cho những tếbào khác
- Tế bào tủy xương là tiền thân của lympho TCD4 cũng bị nhiễm, hậu quả là sựsản sinh lympho TCD4 cũng bị giảm
Trang 85 MIỄN DỊCH HỌC
5.1 Miễn dịch dịch thể:
Người bị nhiễm vi rút, có kháng thể kháng lại vi rút, nhưng diễn tiến bệnh vẫn pháttriển, là do kháng thể kháng vi rút này trung hòa rất kém đây là hiện tượng đáp ứng miễndịch không đầy đủ
Bên cạnh đó, có sự hoạt động bất thường của dòng tế bào lympho B: sự hoạt hóa đadòng (polyclonal) của lympho B đưa đến sự tăng cao các globuline miễn dịch, làm xuấthiện các bệnh lý tự miễn như giảm tiểu cầu (thrombopenie) Ngoài ra còn xuất hiện sự rốiloạn tổng hợp Cytokines làm giảm IL-2, tăng Il-1, IL-6, TNF-α
5.2 Miễn dịch tế bào:
Bản chất các tế bào lympho có thụ thể CD4 là các tế bào T hỗ trợ (helper T cell, Th)
Th được coi là trung tâm điều hành hệ thống miễn dịch Nhiễm HIV làm cho Th bị tiêudiệt làm suy giảm miễn dịch qua trung gian tế bào, làm hư hỏng hệ thống miễn dịch vìvậy hậu quả là nhiễm trùng cơ hội và bệnh ung thư phát triển
Giai đoạn sau tạo các tế bào khổng lồ đa nhân là kiểu hình SI (syncycium inducing)gồm tế bào lympho T CD4 nhưng không còn chức năng như một tế bào bình thường, nónhanh chóng bị vỡ Bệnh tiến triển xấu, nhanh có biểu hiện AIDS vì T CD4 bị giảmnhiều
Các tế bào nhiễm có thể bị diệt tế bào theo cơ chế:
Trang 9- Dấu hiệu thần kinh: Viêm não, màng não, viêm tủy
- Dấu hiệu ngoài da: Hội chứng tăng đơn nhân nhiễm khuẩn
- Dấu hiệu sinh học: lympho bào giảm nhẹ, tỷ lệ CD4/CD8 bị đảo ngược…
6.2 Giai đoạn ngủ yên (không triệu chứng)
Giai đoạn này bắt đầu từ 1 tuần - 3 tháng sau giai đoạn cấp và kéo dài trong nhiềunăm Trong thời gian này số lượng tế bào lympho T CD4 giảm dần và đa số bệnh nhânkhông biểu hiện bất kỳ triệu chứng bệnh nào
6.3 Giai đoạn suy giảm miễn dịch:
Bệnh tiến triển thành nhiều giai đoạn Bệnh nhân có thể phục hồi sau đó lại lâm vàotình trạng nặng dần
Giai đoạn có triệu chứng, TCD4 giảm <200/mm 3
Bệnh nhân xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng tiền AIDS: Hạch to toàn thân kéo dài,sang thương vùng miệng: đẹn, loạn sản dạng tóc, Zona, giảm tiểu cầu…
Biểu hiện lâm sàng của AIDS: là các biểu hiện nhiễm trùng cơ hội, ung thư, hay một
số biển hiện khác về thần kinh, sụt cân…
Theo dõi bệnh nhân HIV dương tính: Mỗi 3 đến 6 tháng:
Trang 10Bệnh nhân nhiễm HIV trong giai đoạn có triệu chứng cần được theo dõi dấu hiệu lâmsàng: nhiệt độ (sốt), cân nặng (giảm), viêm da, zona… và cần được làm các xét nghiệmsinh học như công thức máu, số lượng tế bào TCD4/TCD8, kháng nguyên p24, nồng độ
vi rút trong huyết tương (charge viral plasmatique)
Điều trị cần theo dõi các triệu chứng nhiễm trùng khác cho bệnh nhân, kiểm tra côngthức máu Theo dõi các tác dụng phụ của thuốc Khi điều trị thuốc đặc trị mà TCD4 vẫngiảm, nồng độ vi rút vẫn tăng, hay xuất hiện thêm các nhiễm trùng cơ hội khác, cần xemxét việc đổi phác đồ vì có thể đã xuất hiện chủng kháng thuốc
7 DỊCH TẾ HỌC
7.1 Đường lây:
- Qua đường máu do: Sử dụng chung bơm kim tiêm, truyền máu hay sản phẩmcủa máu bị nhiễm HIV
- Qua đường tình dục: Quan hệ tình dục không an toàn
- Lây từ mẹ sang con
7.2 Nguồn chứa vi rút:
Máu, tinh dịch, dịch âm đạo, dịch não tủy, sữa… Sự nhiễm trùng xảy ra do những tếbào nhiễm virút hay do các virút tự do Tuy có một lượng virút rất nhỏ được tìm thấytrong nước bọt, nước mắt, nhưng cho đến nay chưa có bằng chứng nào nói lên chúngđóng vai trò trong việc lây nhiễm
Ngoài ra, ở một số nhóm đối tượng có nguy cơ cao như: đồng tính luyến ái nam, tiêmchích xì ke, mại dâm, người bị bệnh ưa chảy máu thì nguy cơ lây nhiễm là tương đối cao
7.3 Tình hình thế giới:
Sự lan truyền của HIV theo hồi cứu đã bắt đầu vào cuối những năm 1970 hoặc đầunhững năm 1980, ở Châu Mỹ, Châu Úc, và Tây Au Lúc đầu nó xảy ra chủ yếu trênnhững người đàn ông đồng tính luyến ái hay có quan hệ tình dục với cả hai giới và ởnhững người sử dụng ma túy bằng đường tiêm chích (IDU ) tại một vài đô thị Tại một số
Trang 11miền thuộc vùng Caribe, Đông và Trung Phi, có sự lan truyền trong số đàn ông và đàn bà
có nhiều bạn tình Ngày nay vi rút này đã lan khắp mọi nơi trên thế giới và có khuynhhướng chuyển từ Châu Phi sang Châu A nơi mà tỷ lệ nhiễm mới ngày một gia tăng
Sự lan truyền HIV qua đường tình dục chiếm khoảng ba phần tư tổng số trường hợpnhiễm trên toàn thế giới Đa số do quan hệ tình dục khác giới giữa nam và nữ Tỷ lệnhiễm do quan hệ tình dục khác giới vẫn đang tiếp tục tăng lên Sự lây truyền do quan hệtình dục đồng giới ở nam xảy ra ở khắp mọi nơi trên thế giới và đặc biệt ở những nướcphát triển
Sự lây truyền HIV từ mẹ bị nhiễm sang cho con bao gồm sự lây trong thời kỳ mangthai, trong lúc sinh và cho con bú Khoảng 30% trẻ sinh ra từ mẹ bị nhiễm HIV sẽ bịnhiễm HIV
7.4 Tình hình Việt nam:
Trường hợp nhiễm HIV đầu tiên đươc phát hiện tại Thành phố Hồ Chí Minh vàotháng 12/1990 ở một phụ nữ trẻ bị lây nhiễm qua đường tình dục với một Việt kiều Năm 1992, Bộ Y Tế đã xây dựng hệ thống giám sát huyết thanh học nhiễm HIV.Năm 1993 số người nhiễm HIV được phát hiện lên đến 1148 trên cả nước, tập trungcao ở khu vực phía Nam, đặc biệt TP Hồ Chí Minh, Cần Thơ, An Giang 80% nhiễmHIV nằm trong nhóm tiêm chích ma túy, 10% trong nhóm lây qua đường tình dục
Tại Việt Nam có hai hình thái dịch lưu hành: trên nhóm tiêm chích ma túy và quađường tình dục Cho đến nay các trường hợp nhiễm phát hiện được trên tất cả các tỉnhthành cả nước Diễn biến của dịch ngày càng phức tạp, thay đổi theo sự phát triển kinh tế
xã hội, nhất là sự gia tăng các tệ nạn xã hội: ma túy, mại dâm, thất nghiệp, đời sống tìnhdục tự do… Dịch đã có dấu hiệu lan vào cộng đồng và lứa tuổi mắc có xu hướng trẻhơn Tại Tp Hồ Chí Minh tỷ lệ nhiễm HIV tăng cao trong nhóm thanh niên trẻ sử dụng
ma túy, tình dục đồng giới nam, đây là các nhóm vừa có nguy cơ lây nhiễm bằng đườngtiêm chích vừ có nguy cơ lây nhiễm bằng đường tình dục
Trang 128.2 Theo dõi – điều trị:
Điều trị:
Thuốc ức chế enzyme RT:
- Giống nucleoside (NRTIs): AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC, abacavir, adefovir
- Không phải nucleoside (NNRTIs): Nevirapine, Delavirdine, Efavirens
Thuốc ức chế men protease (PIs):
- Saquinavir, ritonavir, Indinavir, Amprenavir, ABT 378/ritonavir,…
Chiến lược điều trị:
Đa trị liệu, theo hướng dẫn của Bộ Y tế
- Điều trị dự phòng từ mẹ truyền sang con: dùng thuốc cho mẹ và cho bé trongnhững ngày đầu sau sinh cũng làm giảm một cách đáng kể tỷ lệ nhiễm HIV từ
mẹ sang con (theo phác đồ của Bộ Y tế)
- Điều trị dự phòng trong các tai nạn nghề nghiệp: nên dùng thuốc ngay (trongvòng 4 giờ tối đa là 48 giờ ), kéo dài 1 tháng
Theo dõi:
- Công thức bạch cầu, chỉ số TCD4/TCD8
- Tải lượng vi rút/huyết tương (viral load)
Trang 13- Các nhiễm trùng cơ hội khác.
- Trong trường hợp tai nạn nghề nghiệp cần được theo dõi: huyết thanh học HIVvào các ngày N0; N30; sau 3 tháng và sau 6 tháng
II. XÉT NGHIỆM HUYẾT THANH HỌC HIV
1 MỤC TIÊU CỦA XÉT NGHIỆM TÌM KHÁNG THỂ KHÁNG HIV
Gồm 4 mục tiêu chính
1.1 An toàn truyền máu:
Xét nghiệm theo quy định (sàng lọc) máu, các sản phẩm của máu và huyết thanh củanhững người cho tổ chức, cơ quan, tinh dịch hay trứng
1.2 Giám sát:
- Xác định tỷ lệ nhiễm HIV và phân bố nhiễm HIV trong các nhóm dân chúng
Trang 14- Theo dõi chiều hướng tỷ lệ nhiễm HIV theo thời gian, xác định nhóm có nguy
cơ cao nhiễm để đề ra các biện pháp can thiệp
- Xác định sự thay đổi các hình thái lây truyền HIV
- Dự báo tình hình nhiễm HIV để lập kế hoạch phòng chống hiệu quả
1.3 Chẩn đoán nhiễm HIV:
Xét nghiệm tình nguyện những người có yêu cầu, những người nhiễm HIV không cótriệu chứng, những người có dấu hiệu triệu chứng lâm sàng gợi ý nhiễm HIV/AIDS
1.4 Nghiên cứu khoa học:
Xét nghiệm tình nguyện nhằm mục đích nghiên cứu về dịch tễ học, lâm sàng, virúthọc và các nghiên cứu khác có liên quan tới nhiễm HIV
2. CÁC CHIẾN LƯỢC XÉT NGHIỆM
2.1 Chiến lược I: (áp dụng cho công tác an toàn truyền máu):
Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với phương cách I khi mẫu đó dương tínhvới một thử nghiệm có độ nhạy cao Trong truyền máu, mẫu máu được xét nghiệm vớichiến lược I nếu dương tính hay nghi ngờ đều phải loại bỏ
2.2 Chiến lược II: (áp dụng cho giám sát trọng điểm):
Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với chiến lược II khi mẫu đó dương tính cả 2lần xét nghiệm bằng 2 loại sinh phẩm với nguyên lý hoặc chuẩn bị kháng nguyên khácnhau
2.3 Chiến lược III: (áp dụng cho chẩn đoán các trường hợp nhiễm HIV):
Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với chiến lược III khi mẫu đó dương tính với
cả ba lần xét nghiệm bằng 3 loại sinh phẩm với nguyên lý hoặc chuẩn bị kháng nguyênkhác nhau
3. PHÂN NHÓM PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM
Trang 153.1 Phương pháp trực tiếp: Tìm trực tiếp tác nhân gây bệnh :
- Phân lập virút bằng nuôi cấy tế bào nhiễm
- Tìm chất liệu di truyền (ARN hoặc ADN provirut) bằng kỹ thuật PCR (kỹthuật khuếch đại chuỗi gen)
- Phát hiện kháng nguyên virút trong máu: kháng nguyên p24 của HIV
3.2 Phương pháp gián tiếp:
Tìm sự hiện diện kháng thể kháng HIV trong máu cho biết bệnh nhân đã nhiễm HIV
Sơ đồ biến động huyết thanh học trong nhiễm HIV
4 PHƯƠNG PHÁP TRỰC TIẾP
Đối với trẻ dưới 18 tháng tuổi sinh ra từ mẹ nhiễm virut HIV, kháng thể của mẹtruyền sang cho con va có thể tồn lưu trong máu trẻ cho đến 18 tháng tuổi Do đó nếu tadựa vào kết quả của việc tìm kháng thể trong huyết thanh của trẻ dưới 18 tháng thì chưa
Trang 16thể kết luận chính xác kháng thể phát hiện được là của mẹ truyền sang hay do bé bị nhiễmHIV tạo ra
Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện trực tiếp virút có thể được thực hiện trong cáctrường hợp khó, suy giảm miễn dịch bẩm sinh hoặc trầm trọng
4.1 Phân lập virút bằng phương pháp nuôi cấy tế bào
Phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút rất đặc hiệu nhưng giá thành cao và chỉ đượcthực hiện tại các phòng xét nghiệm có đủ trang bị kỹ thuật cần thiết
4.2 Phát hiện RNA hoặc DNA provirut bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được áp dụng rộng rãi trong công tác xétnghiệm, nghiên cứu đặc tính sinh học và di truyền của virut
PCR (Polymerase chain reaction: phản ứng khuếch đại chuỗi gen) là một kỹ thuật chophép khuếch đại rất nhiều lần một đoạn của phân tử DNA hoặc RNA, cho nên cho phépphát hiện một lượng genom virut rất thấp trong mẫu bệnh phẩm Kỹ thuật PCR được thựchiện tại các phòng thí nghiệm có trang bị đặc biệt
4.3 Phát hiện kháng nguyên p24:
Kháng nguyên p24 là protein cấu thành quan trọng của lõi virut, bao bọc các chất liệu
di truyền p24 là một chỉ số trực tiếp phản ánh sự nhân lên của vi rút Kháng nguyên p24tồn tại dưới dạng tự do hoặc trong phức hợp kháng nguyên -kháng thể ở giai đoạn đầu vàgiai đoạn cuối của nhiễm HIV
Phát hiện kháng nguyên p24 thông thường được sử dụng trong:
- Chẩn đoán nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh: đây là một kỹ thuật kém nhạy nhưng rấtđặc hiệu
- Trong giai đoạn đầu mới nhiễm HIV: Kháng nguyên p24 có thể được phát hiệntrước khi có sự biến đổi huyết thanh, ở giai đoạn cửa sổ khi chưa có kháng thể
Trang 175 PHƯƠNG PHÁP GIÁN TIẾP
Tìm kháng thể kháng HIV là phương pháp thông thường được sử dụng trong sàng lọcmáu, giám sát dịch tễ và chẩn đoán nhiễm virut HIV ở người lớn
Có rất nhiều kỹ thuật phát hiện kháng thể hiện đang được sử dụng như kỹ thuật miễndịch men (ELISA), kỹ thuật ngưng kết hạt (SFD), các kỹ thuật xét nghiệm nhanh, kỹthuật western-blot…
Kháng thể kháng HIV sẽ xuất hiện trong máu người bị nhiễm khoảng 1 -3 tháng saukhi virút xâm nhập vào cơ thể
Tùy thuộc vào các nhóm quần thể, mục đích xét nghiệm và điều kiện kinh tế của từngquốc gia hay địa phương, các xét nghiệm nhiễm HIV được tiến hành theo những phươngcách khác nhau
6 ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA MỘT THỬ NGHIỆM
- Độ nhạy là khả năng một thử nghiệm cho kết quả dương tính đối với một mẫu thực sự
Trang 18c d c+d
- Âm tính giả là khả năng một thử nghiệm cho kết quả âm tính đối một mẫu thực sự là
dương tính
Âm tính giả= c/(a+c)
- Dương tính giả là khả năng một thử nghiệm cho kết quả dương tính với một mẫu thực
sự là âm tính
Dương tính giả = b/(b+d)
- Giá trị dự đoán dương là tỉ lệ người có xét nghiệm dương tính thực sự mắc bệnh.
Giá trị dự đoán dương = a/(a+b)
- Giá trị dự đoán âm là tỉ lệ người có xét nghiệm âm tính thực sự không mắc bệnh.
Giá trị dự đoán âm = d/(c+d)
Độ nhạy và độ đặc hiệu là hai yếu tố quan trọng xác định độ chính xác của mộtsinh phẩm Sinh phẩm có độ nhạy cao cho kết quả âm tính giả thấp Sinh phẩm có độnhạy cao thường dùng trong xét nghiệm sàng lọc, đặc biệt trong sàng lọc an toàn truyềnmáu hoặc cấy ghép mô, phủ tạng, hoặc được sử dụng trong xét nghiệm sàng lọc ban đầutrong chẩn đoán người nhiễm HIV
Một sinh phẩm có độ đặc hiệu cao cho kết quả dương tính giả thấp Sinh phẩm có
độ đặc hiệu cao thường dùng trong các xét nghiệm bổ sung thứ 2 và thứ 3 trong chuẩnđoán nhiễm HIV
Trang 197 Ý NGHĨA XÉT NGHIỆM HIV
VỚI NGƯỜI > 18 THÁNG TUỔI
KẾT QUẢ ÂM TÍNH:
- Chưa phát hiện có kháng thể kháng HIV
Có thể do:
- Chưa bị nhiễm HIV, giai đoạn cửa sổ, giai đoạn cuối của bệnh
KẾT QUẢ DƯƠNG TÍNH:
- Có kháng thể kháng HIV
Có nghĩa:
- Đã bị nhiễm HIV, có thể lây cho người khác
Tuy nhiên:
- Không cho phép xác định thời gian nhiễm
- Không có nghĩa đã bị AIDS
- Lưu ý ở trẻ dưới 18 tháng tuổi
XÉT NGHIỆM HIV Ở TRẺ EM dưới 18 tháng tuổi
* Trẻ em sinh ra từ mẹ nhiễm HIV :
Kháng thể mẹ tồn lưu trong máu của bé nên kết quả xét nghiệm HIV bằng các kỹthuật phát hiện kháng thể sẽ dương tính Vì vậy cần theo dõi sự biến động kháng thể đến
18 tháng hoặc có thể xét nghiệm trực tiếp tìm:
Kháng nguyên p24 của HIV
Trang 20 Nuôi cấy phân lập virus HIV
Kỹ thuật PCR phát hiện chất liệu di truyền của virút trong tế bàobạch cầu đơn nhân ở máu ngoại vi
Kỹ thuật RT-PCR phát hiện sự hiện diện của virút trong huyết tương
III. QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM
1 CÁC KHÁI NIỆM
1.1 Chất lượng (Quality): là phép đo tính ưu việt của một sản phẩm hoặc một
dịch vụ nhằm đảm bảo sản phẩm hoặc dịch vụ đó thỏa mãn yêu cầu của kháchhàng
1.2 Quản lý chất lượng (Quality Management System – QMS): là một loạt các
hoạt động phối hợp để chỉ dẫn và điều khiển một phòng xét nghiệm nhằm liêntục cải tiến và nâng cao hiệu quả các hoạt động
1.3 Đảm bảo chất lượng (Quality Assurance-QA): là các hoạt động được lập kế
hoạch và mang tính hệ thống, qui trình được thực hiện để đảm bảo việc tiếnhành thu thập mẫu, thực hiện xét nghiệm, ghi chép và báo cáo kết quả là đạttiêu chuẩn chất lượng đề ra
1.4 Kiểm soát chất lượng (Quality Control): là những phép đo bắt buộc trong quá
trình xét nghiệm nhằm kiểm định xem các phép đo có đúng hay không
1.5 Cải thiện chất lượng (Quality Improvement-QI): là một quy trình để phân
tích xác định các nguyên nhân cốt lõi của các vấn đề mà Đảm bảo chất lượng
và Kiểm soát chất lượng phát hiện ra, sau đó đưa ra các biện pháp khắc phục
và xây dựng kế hoạch để cải thiện hệ thống chất lượng
2 YÊU CẦU VỀ QUẢN LÝ: bao gồm các yếu tố thiết yếu sau:
- Hệ thống tổ chức và quản lý
- Các tiêu chuẩn chất lượng
- Ghi chép và lưu trữ hồ sơ
Trang 21- Phòng xét nghiệm cần xây dựng sổ tay chất lượng trong đó nêu rõ chính sách chấtlượng, cam kết của phòng xét nghiệm nhằm đạt được mục tiêu chất lượng đó Trưởngphòng xét nghiệm sẽ giao trách nhiệm và quyền hành cho cán bộ thích hợp chịu tráchnhiệm trực tiếp về việc thực hiện chính sách và hệ thống chất lượng
- Để tạo thuận lợi cho việc xây dựng và triển khai hệ thống chất lượng, giám đốc cầnphải cam kết thực hiện đảm bảo chất lượng cũng như phân bổ đầy đủ các nguồn lực
2.2 Các tiêu chuẩn chất lượng
- Là một phần bắt buộc của hệ thống chất lượng nhằm đảm bảo tính an toàn và
sự đồng nhất của hệ thống chất lượng, đồng thời cần phải thực hiện theo các tiêu
chuẩn này để đáp ứng các yêu cầu hiện hành của cơ quan quản lý để giám sát chức
năng của phòng xét nghiệm
- Tiêu chuẩn quản lý và tiêu chuẩn kỹ thuật cần phải được theo sát nhằm đảm
bảo chất lượng nhưng cũng cần phải phù hợp với luật pháp sở tại
2.3 Tài liệu
- Tài liệu là các hướng dẫn bao gồm chính sách, sổ tay chất lượng, quy trình, tiêu
chuẩn kỹ thuật, bản báo cáo, bản mô tả công việc của phòng xét nghiệm; và cũng baogồm các tài liệu gốc bên ngoài (ví dụ: các quy định, các tiêu chuẩn của cơ quan quản lý).Các tài liệu này có thể được lưu trữ dưới các hình thức khác nhau bằng văn bản giấy hoặcvăn bản điện tử
- Hệ thống chất lượng của các phòng xét nghiệm cần xác định và xây dựng các
quy trình để kiểm soát tất cả các tài liệu và thông tin (trong nội bộ và bên ngoài) Các vănbản mới có liên quan cần phải có sẵn ở tất cả các bộ phận triển khai những hoạt động cầnthiết cho việc vận hành hiệu quả hệ thống chất lượng
2.4 Giám sát và đánh giá
- Trưởng phòng xét nghiệm phải xây dựng và triển khai các chỉ số về chất lượng đểđánh giá và giám sát một cách hệ thống việc thực hiện xét nghiệm Việc giám sát và đánhgiá giúp phát hiện được các sai sót và xác định được các cơ hội cải thiện chất lượng trong
Trang 22phòng xét nghiệm, trưởng phòng xét nghiệm sẽ thực hiện các hành động thích hợp đểkhắc phục các sai sót Công tác quản lý các sai sót cũng cần được thực hiện một cách chặtchẽ và sát sao.
- Ngoài ra, còn có một số công cụ đánh giá chất lượng khác đó là thông qua việc đánhgiá nội bộ và bên ngoài và tham gia vào chương trình đánh giá chất lượng từbên ngoài vàkết quả đánh giá này sẽ đưa ra định hướng giúp nhóm cán bộ quản lý cải thiện thêm vềchất lượng
- Phòng xét nghiệm phải xây dựng chương trình tập huấn phù hợp cho tất cả các
nhân viên để đảm bảo thực hiện tốt các công việc được giao Chương trình đào tạo cầnlàm cho học viên hiểu được tại sao chất lượng lại quan trọng và chương trình đào tạo cần
đi đôi với thực hành tại phòng xét nghiệm.Tập huấn cho nhân viên cần phải dựa trênnăng lực và phải triển khai các hoạt động hỗ trợ sau tập huấn
3 YÊU CẦU VỀ KỸ THUẬT: bao gồm các thành tố sau
- Nhân sự
- Cơ sở hạ tầng và điều kiện môi trường
- Thiết bị phòng xét nghiệm
- Các giai đoạn trước, trong và sau xét nghiệm
- Báo cáo kết quả
- Kiểm soát chất lượng
III.1 Nhân sự:
- Nhân sự là nguồn lực quan trọng nhất của phòng xét nghiệm Nhân viên phòng xét
nghiệm cần có vốn kiến thức phù hợp và có đủ kinh nghiệm để thực hiện các nhiệm vụđược giao Phòng xét nghiệm cần có đủ nhân viên để đáp ứng công việc được giao cũngnhư thực hiện các chức năng khác của hệ thống quản lý chất lượng
- Trưởng phòng xét nghiệm phải xây dựng kế hoạch tổ chức bao gồm chính sácc về
nhân sự, sơ đồ báo cáo, bản mô tả công việc trong đó có quy định rõ về trình độ và nhiệm
vụ của tất cả các nhân viên Phòng xét nghiệm cần lưu giữ hồ sơ của tất cả nhân viên baogồm bản mô tả công việc, bằng cấp, sơ yếu lý lịch và trình độ đào tạo
III.2 Cơ sở hạ tầng và điều kiện môi trường
- Phòng xét nghiệm phải có đủ diện tích cho khối lượng công việc và được thiết kế phù
hợp để đảm bảo an toàn và sự thoải mái cho nhân viên
III.3 Trang thiết bị
Trang 23- Phòng xét nghiệm phải được trang bị đầy đủ các thiết bị cần thiết cho việc cung cấp
các dịch vụ (từ lấy mẫu, xử lý mẫu, xét nghiệm mẫu và lưu trữ) Tất cả các thiết bị cầnđảm bảo hoạt động tốt kèm theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sổ tay vận hành
- Phòng xét nghiệm có kế hoạch thẩm định, hiệu chuẩn và bảo dưỡng định kỳ các trang
thiết bị Các trang thiết bị cần được quản lý chặt chẽ, ghi tên nhãn mác, hướng dẫn sửdụng và kèm hồ sơ, bảo dưỡng đầy đủ và thống nhất với hướng dẫn chất lượng quy định
- Cán bộ sử dụng cần phải được tập huấn về sử dụng thiết bị, nếu thiết bị cần được sửa
chữa thi sau khi nhận lại thì phải kiểm tra, hiệu chuẩn lại trước khi sử dụng
III.4 Các giai đoạn trước, trong và sau xét nghiệm
- Giai đoạn trước xét nghiệm: mẫu máu cần phải được lấy, dán nhãn, bảo quản, đóng
gói và vận chuyển đúng cách Các tiêu chí chấp nhận và loại bỏ mẫu phải được xây dựng
và tuân thủ một cách nghiêm ngặt nhằm bảo đảm tính nguyên vẹn của mẫu máu (thamkhảo bài Mẫu bệnh phẩm)
- Giai đoạn trong xét nghiệm: Phòng xét nghiệm tuân thủ đúng hướng dẫn của nhà sản
xuất và các hướng dẫn quốc gia trong khi tiến hành xét nghiệm Ngoài ra, phòng xétnghiệm cũng nên xây dựng các quy trình chuẩn (SOP) riêng dựa vào hướng dẫn của nhàsản xuất hoặc hướng dẫn quốc gia Các quy trình chuẩn cần được lưu trữ ở vị trí giúpnhân viên có thể dễ dàng tiếp cận và phải tuân thủ chặt chẽ các quy trình này
- Giai đoạn sau xét nghiệm: Trưởng phòng xét nghiệm phải kiểm tra các kết quả xét
nghiệm trước khi trả kết quả Mẫu bệnh phẩm phải được lưu giữ theo chính sách/quyđịnh của phòng xét nghiệm và sau đó được thải bỏ theo đúng quy định về an toàn sinhhọc
III.5 Báo cáo kết quả
- Trưởng phòng xét nghiệm phải rà soát và kiểm tra các kết quả xét nghiệm một cách hệthống và trước khi trả kết quả cho bệnh nhân
- Báo cáo cần phải rõ ràng, không mơ hồ và ghi rõ ngày tháng, thời gian, quy trình được
sử dụng, danh tính và địa chỉ của bệnh nhân cũng như họ tên của cán bộ cho phép công
bố báo cáo có kèm chữ ký
Trang 24- Phòng xét nghiệm cũng nên giữ lại tất cả hồ sơ, bảng biểu và mẫu báo cáo trong hai
năm hoặc theo các chính sách đã được thông qua
3.6. Kiểm soát chất lượng: là những phép đo bắt buộc trong quá trình xét nghiệm
nhằm kiểm định xem các phép đo có đúng hay không Kiểm soát chất lượng bao gồm nội
kiểm tra và ngoại kiểm tra
3.6.1 Kiểm soát chất lượng nội bộ hay nội kiểm tra (Internal Quality
Control-IQC): là quy trình theo dõi độ tập trung và độ chính xác của kết quả chạy IQC trước mỗi
đợt làm xét nghiệm cho bệnh nhân để phát hiện ra các sai sót chính trong quá trình thực
hiện Mẫu nội kiểm tra bao gồm mẫu chuẩn máy và mẫu chứng
Mẫu chuẩn máy (calibrators): là chất có thành phần không giống mẫu bệnh nhân,
có độ tinh khiết cao và giá trị đã được biết trước Mẫu chuẩn được sử dụng để hiệu chuẩn
máy tại giá trị máy được cài đặt và đánh giá độ chính xác
Mẫu kiểm chứng (controls): là chất có thành phần tương tự như mẫu bệnh nhân
với giá trị được biết trước Mẫu chứng được sử dụng để đảm bảo quy trình xét nghiệm
đang thực hiện đúng và đánh giá độ tập trung
3.6.2 Đánh giá chất lượng bên ngoài hay ngoại kiểm tra (External Quality
Assessment-EQA) là một hệ thống để đánh giá khách quan về năng lực của phòng xét
nghiệm thông qua một đơn vị hay tổ chức bên ngoài
IV CÁC QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHI TIẾT
1 QUI TRÌNH CHUNG KHI TIẾN HÀNH KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM
1 Lập sơ đồ đặt mẫu, ly tâm mẫu thử
2 Chuẩn bị thuốc thử: Thuốc thử và mẫu phải để ổn định về nhiệt độ phòng 15OC -30OC trướckhi tiến hành xét nghiệm
Trang 25Chuẩn bị các giếng thử nghiệm theo số lượng thích hợp Pha thuốc thử trước khi thử nghiệm.Ghi rõ ngày tháng sau khi mở hộp hoặc pha chế.
3 Ghi chú qui trình làm
4 Chú ý: các vật liệu của bộ thuốc thử đều phải coi như có khả năng gây bệnh Vì vậy phảimang găng khi cầm mẫu bệnh phẩm, dung dịch rửa, pipette,
5 Không sử dụng test kit đã hết hạn sử dụng
6 Toàn bộ hồ sơ phải được lưu giữ theo qui định của Bộ Y tế
2 KỸ THUẬT NGƯNG KẾT HẠT
(SERODIA HAY SFD)
A NGUYÊN TẮC :
Bộ sinh phẩm ngưng kết hạt dựa trên nguyên tắc phản ứng ngưng kết thụ động:
những hạt gelatin được gắn với các thành phần kháng nguyên HIV1/2 sẽ ngưng kết
Trang 26khi có sự hiện diện của kháng thể tương ứng trong huyết thanh (hoặc huyết tương) bệnh nhân.
B THUẬN LỢI: Đặc biệt thuận lợi trong điều tra dịch tễ vì :
Dễ làm, thực hiện nhanh
Không cần máy móc, dụng cụ đắt tiền
Có thể làm hàng loạt và đọc kết quả bằng mắt thường
Độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tỷ lệ dương tính giả thấp
C TRÌNH BÀY BỘ THUỐC THỬ:
Lọ có chữ A : dùng để pha dung dịch thử cho lọ có chữ C và D
Lọ có chữ B : dùng để pha loãng mẫu
Thuốc thử, dụng cụ và mẫu thử phải ở nhiệt độ phòng (22O-26OC) trong 3 giờ hay ở
37OC trong 15 phút trước khi thử nghiệm
2/ Tiến hành:
Dùng ống nhỏ giọt nhỏ dung dịch pha loãng huyết thanh vào :
Giếng 1 : 3 giọt ( mỗi giọt = 25µl )
Trang 27Giếng 2 & 3 : 1 giọt (đối với mẫu chứng dương thì thm 2 giếng 4 & 5)Dùng pipette vi lượng nhỏ 25µl huyết thanh vào giếng 1, trộn đều với dung dịch phaloãng rồi chuyển 25µl sang giếng 2, trộn đều chuyển 25µl sang giếng 3 sau đó bỏ đi 25µlcủa giếng 3 (đối với mẫu chứng dương thì làm tiếp đến giếng thứ 5 mớo bỏ đi 25µl)
Dùng ống nhỏ giọt nhỏ 1 giọt (25µl) dung dịch treo có hạt không gắn kháng nguyênvào giếng 2 (giếng làm chứng âm) Nhỏ 1 giọt (25µl) dung dịch treo có hạt gắn khángnguyên vào giếng 3
Tiến hành tương tự cho mẫu chứng dương đến giếng thứ 5
Lắc đều, đậy plaque, đặt vào một chỗ phẳng, để ở nhiệt độ phòng trong 2h
25µl
25µl+
25µl
25µl+
Trang 28Tất cả các giếng thứ 2 có hạt gélatin không gắn kháng nguyên phải âm tính (gomthành nút)
- Phản ứng âm tính: không có hiện tượng ngưng kết ở cả hai giếng (hạt gélatin
gom thành nút)
- Phản ứng nghi ngờ: vòng ngưng kết nhỏ, phẳng.
- Phản ứng dương tính: không có hiện tượng ngưng kết với hạt không gắn
kháng nguyên, ngưng kết hoàn toàn với hạt gắn kháng nguyên
Mẫu thử dương tính:
+ Ngưng kết hoàn toàn ở giếng 3
+ Giếng 2 (chứng âm): chứa hạt không gắn kháng nguyên nên lắng thành nút.
Mẫu thử âm tính: hoàn toàn không ngưng kết ở cả hai giếng 2 và 3
Chứng dương : phải dương tính đến giếng thứ 5
Mẫu nghi ngờ: hiện tượng ngưng kết không rõ ràng Cần thực hiện lại bằng sinh phẩm
ny một lần nữa hoặc kiểm tra bằng phương pháp khác
Âm tính :
Các hạt gom thành nút ở đáy giếng
Có mặt trăng tròn nhỏ phía ngòai
Nghi ngờ :
Các hạt không gom thành nút, có viền mặt trăng bên ngoài
Dương tính :
Các hạt tạo mạng rộng lớn Dương tính mạnh, do thừa kháng thể nên có hiện tương
vùng có thể pha loãng huyết thanh để kết quả rõ hơn
Trang 29Biện luận kết quả phản ứng ngưng kết
Chú ý:
Sinh phẩm chỉ được dùng nhằm mục đích chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
Khi sử dụng chứng dương hãy xem như là chất chứng có khả năng lây nhiễm dùchúng đã bị bất hoạt
Vì không có 1 phương pháp được biết nào bảo đảm rằng tác nhân này đã bị tiêudiệt hoàn toàn, nên cẩn thận và xem thuốc thử và mẫu thử như là có khả năng lâynhiễm
Mang găng tay và áo choàng, theo sát qui trình chuẩn thức của phòng thí nghiệmkhi làm việc với huyết tương và huyết thanh người
Không được hút bằng miệng
Loại bỏ các mẫu thử, vật dụng đã sử dụng như là chất thải sinh học có khả nănglây nhiễm
Không nên trộn hoá chất của lô này và lô khác
Không được sờ tay vào đầu tip (côn)
Không được dùng sinh phẩm quá hạn
Bảo quản sinh phẩm vừa mới pha:
Hạt không gắn KN HIV ½ (lọ có chữ D) và hạt gắn KN HIV ½ ( lọ có chữ C): sau
khi pha chỉ bảo quản được tối đa 14 ngày ở nhiệt độ từ 2oC – 8oC
Bảo quản sinh phẩm chưa sử dụng
Cho tất cả các dung dịch thuốc thử còn lại vào hộp nguyên thuỷ Bảo quản ở 2o-8 o C.Không được đông lạnh sinh phẩm
Giới hạn
Thử nghiệm ngưng kết hạt là thử nghiệm sàng lọc Sự sản xuất kháng thể kháng HIV
có thể chậm sau khi bị nhiễm, thử nghiệm sàng lọc tìm kháng thể kháng HIV có thể
Trang 30không phát hiện những giai đoạn nhiễm HIV rất sớm Vì thế trong trường hợp nghi ngờ,khi tiến hành thử nghiệm không có phản ứng với kỹ thuật này thì không nên xem nhưbằng chứng kết luận rằng bệnh nhân không tiếp xúc hay không nhiễm HIV
G XỬ LÝ HUYẾT THANH
(Cho kỹ thuật ngưng kết hạt)
Nếu mẫu thử ngưng kết ở cả hai giếng số 2 (chứng âm) và 3, cần loại trừ hiện tượng tựngưng kết bằng tiến trình sau:
1/ Lấy 350 µl dung dịch không gắn kháng nguyên ( lọ có chữ D) vào một ốngnghiệm
Thêm 50 µl huyết thanh vào ống nghiệm Ủ, lắc nhẹ một hai lần ở nhiệt độ phòng/ 20 phút
2/ Ly tâm 2000 vòng / phút trong 5 phút.
3/ Nhỏ 25 µl dung dịch pha loãng vào giếng 2,3,4… giếng 12
4/ Lấy 50 µl nước nổi cho vào giếng 1
5/ Trộn đều phần nước nổi này, lấy 25 µl tiếp tục pha sang giếng 2, giếng 3, tiếptục đến giếng 12 (làm tương tự khi muốn thực hiện phản ứng bán định lượng), sau
đó nhỏ dung dịch không gắn kháng nguyên ( lọ có chữ D) vào giếng thứ 2, dungdịch gắn kháng nguyên ( lọ có chữ C) vào giếng thứ 3 đến giếng 12
6/ Ủ 2 giờ ở nhiệt độ phòng Đọc và biện luận kết quả như trên
3 DETERMINE HIV 1/2
A Mục đích thử nghiệm: Là thử nghiệm miễn dịch định tính invitro, đọc bằng mắt
thường để phát hiện kháng thể kháng HIV1 và HIV2
B Nguyên lý: là thử nghiệm sắc ký miễn dịch định tính kháng thể kháng HIV-1 và
HIV-2
Trang 31Mẫu thử được cho vào nơi nhỏ mẫu sẽ di chuyển qua vùng cộng hợp, được cố định lại vàtrộn lẫn với chất dạng keo Selenium-cộng hợp kháng nguyên Phức hợp này tiếp tục dichuyển qua pha rắn tới những kháng nguyên tái tổ hợp đã bất động và peptide tổng hợptại vùng đọc kết quả.
Nếu có kháng thể kháng HIV-1 hay HIV-2 trong mẫu, kháng thể sẽ gắn với khángnguyên - chất dạng keo Selenium và kháng nguyên tại vùng đọc kết quả bệnh nhân, tạothành vạch màu đỏ tại đây
Nếu không có kháng thể trong mẫu thử, kháng thể-chất dạng keo sẽ đi qua vùng đọc kếtquả bệnh nhân và không có vạch màu đỏ
Để đảm bảo giá trị kết quả, trên thanh kiểm nghiệm luôn có sữ xuất hiện của vạch kiểmchứng
Bảo quản: 2-30OC cho đến khi hết thời hạn sử dụng
Có thể dùng huyết thanh, huyết tương hoặc máu toàn phần Đối với huyết tương và máutoàn phần phải dùng ống lấy máu có EDTA
Mẫu huyết thanh hay huyết tương nên được bảo quản ở 2-8OC nếu tiến hành xét nghiệmtrong 7 ngày kể từ khi lấy mẫu Nếu lâu hơn nên bảo quản -20OC
Mẫu máu toàn phần lấy từ đầu ngón tay nên dùng ống mao quản EDTA (số 7D22-21)làm đầy máu giữa 2 vạch đánh dấu
Mẫu máu toàn phần không nên làm lạnh
E Phương pháp tiến hành: Xé test nên tiến hành từ bên phải vì số lô sẽ còn lại bên
trái tấm thử nghiệm
Trang 32- Bóc vỏ bọc bảo vệ bên ngoài
- Đối với mẫu là huyết thanh hay huyết tương:
Nhỏ 50 µl mẫu vào nơi nhỏ mẫu (được đánh dấu bằng mũi tên)
Chờ tối thiểu 15 phút (cho đến 60 phút) và đọc kết quả
- Đối với mẫu là máu toàn phần lấy từ tĩnh mạch
Nhỏ 50 µl mẫu (pipette chính xác) vào nơi nhỏ mẫu (được đánh dấu bằng mũi tên)Chờ 1 phút rồi nhỏ 1 giọt dung dịch đệm vào nơi nhỏ mẫu
Chờ tối thiểu 15 phút (cho đến 60 phút) và đọc kết quả
- Đối với mẫu là máu toàn phần lấy từ đầu ngón tay
Nhỏ 50 µl mẫu (bằng ống mao dẫn EDTA) vào nơi nhỏ mẫu (được đánh dấu bằngmũi tên)
Chờ cho đến khi máu được hấp thụ hoàn toàn tại nơi nhỏ mẫu, rồi nhỏ 1 giọt dungdịch đệm vào nơi nhỏ mẫu
Chờ tối thiểu 15 phút (cho đến 60 phút) và đọc kết quả
F Kiểm tra chất lượng: Để đảm bảo thử nghiệm có giá trị, tại vị trí kiểm chứng
(ghi chữ control) phải có vạch màu đỏ Nếu vạch màu đỏ không xuất hiện sau khithử nghiệm thì kết quả này không có gía trị và mẫu thử nên được làm lại
Trang 33Cho mẫu Kết quả
G Đọc kết quả:
- Dương tính: (hai vạch) Vạch đỏ xuất hiện cả hai vị trí ở vạch kiểm chứng (ghi chữ
control) và vùng đọc kết quả bệnh nhân (ghi chữ patient) trên thanh thử nghiệm Bất
kỳ màu đỏ nào có thể thấy được tại nơi đọc kết quả bệnh nhân thì nên đọc kết quả làdương tính
- Âm tính: (một vạch) Một vạch đỏ xuất hiện ở vạch kiểm chứng (ghi chữ control) trên
thanh thử nghiệm và không có vạch đỏ xuất hiện tại vùng đọc kết quả bệnh nhân (ghichữ patient)
- Không có giá trị: (không có vạch nào) Nếu không có vạch đỏ nào tại vùng kiểm
chứng trên thanh thử nghiệm, kết quả không có giá trị và nên tiến hành thử nghiệm lại(ngay cả khi vạch đỏ xuất hiện trên vùng đọc kết quả bệnh nhân trên thanh thửnghiệm)
H Hạn chế của phương pháp:
- Determine HIV1/2 nhằm phát hiện kháng thể kháng HIV1 và HIV2 trong huyết thanh,huyết tương, máu toàn phần Dùng những mẫu hoặc dịch cơ thể khác có thể cho kếtquả không chính xác