Nghiêng cứu chế tạo nano sắt từ oxit gắn kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt viêm gan b ứng dụng tìm kháng nguyên bề mặt viêm gan b trong huyết thanh bệnh nhân

HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG KHÁNG THỂ KHÁNG KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIÊM GAN B Anti-HBS – ỨNG DỤNG TÌM KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIÊM GAN B HBsAg TRONG HUYẾT THAN

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

KHÁNG THỂ KHÁNG KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIÊM GAN B (Anti-HBS) – ỨNG DỤNG TÌM KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIÊM GAN B (HBsAg) TRONG

HUYẾT THANH BỆNH NHÂN

Thực hiện: Bùi Trung Thành Tháng 3 / Năm 2017

1 Mở đầu

2 Thực nghiệm

3 Kết quả và bàn luận

4 Kết luận và hướng phát triển

J Gao, et al., Acc Chem Res 2009 42:1097 33R23R

1 Chế tạo hạt nano

2 Chức năng hóa.

3 Cố định phân tử

sinh học

4 Và, ứng dụng

Phân tử sinh học : nhiều cấu trúc, giá thành

Sự tương tác SA-biotin [www://streptavidin-biotin]

có bốn vị trí liên kết biotin

SA có giá thành thấp

+

Hạt nano gắn với kháng thể thông qua cầu nối SA-Biotin

Gắn kháng thể lên hạt nano

a) [http://blog.leinco.com/, Leinco Technologies 2010]

Xét nghiệm miễn dịch dùng hạt nano

Tổng hợp hạt nano Fe 3 O 4 – Anti-HBs

Chức năng hóa bề mặt

(Fe 3 O 4 /SiO 2 /NH 2 /CHO)

Gắn streptavidin

(Fe 3 O 4 /SiO 2 /NH 2 /CHO/SA)

Gắn kháng thể anti-HBs đã biotin

(Fe 3 O 4 /SiO 2 /NH 2 /CHO/SA/Anti-HBs)

Phương pháp solvothermal

Thực nghiệm tổng hợp hạt nano gắn kháng thể

- Cho vào tube Eppendorf 100 µL

Fe 3 O 4 /anti-HBs

- Mẫu huyết thanh

- 25 µL dung dịch anti-HBs/HRPO

- Trộn đều và ủ hỗn hợp dung dịch trong 30 phút ở 37 o C

- Rửa hỗn hợp dung dịch hai lần và tách bằng nam châm

- 100 µL dung dịch TMB

- Sau 3 phút thêm 100 µL dung dịch dừng phản ứng

- Dùng nam châm tách hạt nano

- Lấy dịch nổi và đo độ hấp thu (OD)

Xét nghiệm tìm HBsAg

Vật liệu - gắn streptavidin

-15000 -10000 -5000 0 5000 10000 15000

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

a)

b)

b ) Fe 3 O 4 /SiO 2

a ) Fe 3 O 4

H, Oe

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

a) Fe 3 O 4

b) Fe 3 O 4 /SiO 2

2875 2933

-1

3384

1627 1402 1095 956 801

572 471

c) Fe 3 O 4 /SiO 2 /NH 2

Sự phát huỳnh quang

XRD: Fe3O4

TEM: Fe3O4/SiO2 TEM: Fe3O4

VSM

FTIR

Gắn được streptavidin

Hạt nano tóm bắt anti-HBs

[C Louis, et al., Archives of Biochemistry

and Biophysics 1964 106:1 SA11]

Hạt nano đã tóm bắt anti-HBs

Xét nghiệm miễn dịch

Độ hấp thu của cùng lượng mẫu với nhiều

nồng độ HBsAg.

Lượng mẫu khác nhau nhưng cùng lượng HBsAg

độ hấp thu tăng 2 lần

- Đã làm giàu, tăng độ nhạy

Xét nghiệm miễn dịch

Giá trị cắt

[J.R Crowther, Humana Press 2009.E4B\]

Ngưỡng phát hiện mẫu dương và âm tính với HBsAg

[SAG1ULTRA.CE, DIA.PRO Diagnostic Bioprobes Srl (Italy) 2012.1HBsAg Elisa kit]

Xét nghiệm miễn dịch

Kết quả xét nghiệm HBsAg bằng phương pháp dùng hạt nano

Độ nhạy: 199/203 = 98 %

Độ đặc hiệu: 188/194 = 97 %

Độ phù hợp: (199 + 188)/(203 + 194) = 97.5 %

Xây dựng được một nền tảng kỹ thuật mới:

- Có thể làm giàu kháng nguyên đặc hiệu

- Hạt nano gắn kháng thể dễ bảo quản hơn giếng ELISA

Tài liệu tham khảo

1.Bozza C., Cinausero M., Iacono D., and Puglisi F (2016) Hepatitis B and cancer: A practical guide for the oncologist Critical reviews in oncology/hematology, 98: 137-146

2.Brechot C., Kremsdorf D., Soussan P., Pineau P., et al (2010) Hepatitis B virus (HBV)-related hepatocellular carcinoma (HCC): molecular mechanisms and novel paradigms Pathologie-biologie, 58: 278-287

3.Chaleawlert-umpon S and Pimpha N (2012) Preparation of magnetic polymer microspheres with reactive epoxide functional groups for direct immobilization of antibody Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 414: 66-74

4.Crowther J.R (2009) The ELISA Guidebook Humana Press

5.Deng H., Li X., Peng Q., Wang X., et al (2005) Monodisperse Magnetic Single-Crystal Ferrite Microspheres Angewandte Chemie, 117: 2842-2845

6.Girginova P.I., Daniel-da-Silva A.L., Lopes C.B., Figueira P., et al (2010) Silica coated magnetite particles for magnetic removal of Hg2+ from water Journal of colloid and interface science, 345: 234-240

7.Häfeli U., Schütt W., Teller J., and Zborowski M (1997) Scientific and clinical applications of magnetic carriers Plenum Press, New York 8.Hou Y., Han X., Chen J., Li Z., et al (2013) Isolation of PCR-ready genomic DNA from aspergillus niger cells with Fe3O4/SiO2microspheres Separation and Purification Technology, 116: 101-106

9.Hu B., Pan J., Yu H.-L., Liu J.-W., et al (2009) Immobilization of Serratia marcescens lipase onto amino-functionalized magnetic

nanoparticles for repeated use in enzymatic synthesis of Diltiazem intermediate Process Biochemistry, 44: 1019-1024

10.Jamin N., Dumas P., Moncuit J., Fridman W.-H., et al (1998) Highly resolved chemical imaging of living cells by using synchrotron infrared microspectrometry Proc Natl Acad Sci., 95: 4837–4840

11.Khatiri R., Reyhani A., Mortazavi S.Z., and Hossainalipour M (2013) Immobilization of serum albumin on the synthesized three layers core–shell structures of super-paramagnetic iron oxide nanoparticles Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 19: 1642-1647

12.Liu X., Ma Z., Xing J., and Liu H (2004) Preparation and characterization of amino–silane modified superparamagnetic silica nanospheres Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 270: 1-6

13.Louis C and Prank J.W (1964) The Properties of Streptavidin, a Biotin-Binding Protein Produced by Streptomycefes Archives of

Biochemistry and Biophysics, 106: 1-5

14.Lubbe A.S., Alexiou C., and Bergemann C (2001) Clinical applications of magnetic drug targeting The Journal of surgical research, 95: 200-206

15.SAG1ULTRA.CE (2012) HBsAgone Version ULTRA DIA.PRO Diagnostic Bioprobes Srl (Italy): 1-9

16.Stober W and Fink A (1968) Controlled Growth of Monodisperse Silica Spheres in the Micron Size Range Journal of colloid and interface science, 26: 62-69

17.Wang B., Wei Q., and Qu S (2013) Synthesis and Characterization of Uniform and Crystalline Magnetite Nanoparticles via Oxidation-precipitation and Modified co-Oxidation-precipitation Methods Int J Electrochem Sci., 8: 3786 - 3793

18.Wu F.Y., Liao Y.W., Wu J.F., Chen H.L., et al (2016) A Simple and Rapid Test-card Method to Detect Hepatitis B Surface Antigen and Antibody: Potential Application in Young Children and Infants Pediatrics and neonatology, 57: 219-224

19.Yuen M.-F., Kato T., Mizokami M., Chan A.O.-O., et al (2003) Clinical outcome and virologic profiles of severe hepatitis B exacerbation due to YMDD mutations Journal of Hepatology, 39: 850-855