Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB3 điều khiển tính chống chịu của cây đậu tương [Glycine Max (L.) Merrill]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BÀNH THỊ MAI ANH TÁCH DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

BÀNH THỊ MAI ANH

TÁCH DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ

HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG

CHỊU CỦA ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill]

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2011

1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

TÁCH DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ

HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHỊU

CỦA ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill]

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62.42.70

Học viên: Bành Thị Mai Anh Người hướng dẫn: PGS.TS Chu Hoàng Hà

THÁI NGUYÊN - 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa có ai công bố trong một công trình nào khác Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Hà đã tận tình hướng dẫn, chỉ

bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Sơn , TS Phạm Bích Ngọc, Ths Lê Thu Ngọc cùng toàn thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thực vật , Viện Công nghệ Sinh học

đã tận tình giúp đỡ cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Sinh-KTNN và khoa Sau đại học, trường Đại học

Sư phạm – Đại học Thái Nguyên Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận văn này

Thái Nguyên, ngày 29 tháng 9 năm 2011

Học viên

BÀNH THỊ MAI ANH

i

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục i

Danh mục chữ viết tắt iv

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

MỞ ĐẦU……… 1

I Đặt vấn đề 1

II Mục tiêu nghiên cứu……… 2

III Nội dung nghiên cứu……… 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐẬU TƯƠNG……… 3

1.1.1 Nguồn gốc phân loại cây đậu tương……… 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây đậu tương……… 3

1.1.3 Giá trị kinh tế của cây đậu tương 5

1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam 6

1.2 HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG……… 7

1.3 CÁC NHÓM GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN……… 11

1.3.1 Các nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn……… 11

1.3.2 Các nhân tố phiên mã điều khiển các gen liên quan đến tính chịu hạn……… 12

ii

1.3.3 Promoter rd29A……… 15

1.4 NHÂN TỐ ĐIỀU KHIỂN PHIÊN MÃ DREB……… 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử 25

2.2.1.1 Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA……… 25

2.2.1.2 Phương pháp tổng hợp cDNA……… 26

2.2.1.3 Phản ứng PCR ……… 27

2.2.1.4 Phương pháp tách dòng gen……… 27

2.2.1.5 Thiết kế cấu trúc pBI101:: rd29A :: DREB3……… 29

2.2.2 Phương pháp tái sinh và chuyển gen thông qua Agrobacterium 30

2.2.2.1 Phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương thông qua Agrobacterium 30

2.2.2.2 Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium 32

2.2.3 Phương pháp phân tích cây chuyển gen 33

2.2.3.1 Phương pháp PCR 33

2.2.3.2 Phương pháp gây hạn nhân tạo 33

2.2.4 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 33

2.2.5 Phương pháp xử lý trình tự gen và amino acid 33

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 34

3.1 KẾT QUẢ TÁCH DÕNG GEN DREB3……… 34

iii

3.1.1 Kết quả nhân gen DREB3 từ RNA tổng số giống đậu tương Nâu Cao Bằng 34

3.1.2 Kết quả ghép nối đoạn gen DREB3 vào vector tách dòng ……… 35

3.1.3 Phân tích và xếp nhóm protein DREB3 dựa vào vùng bảo thủ AP2………… 39

3.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN DREB3 ……… 42

3.2.1 Thiết kế vector ……… 42

3.2.2.Biến nạp cấu trúc vector pBI 101::rd29A::DREB3 vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens……… 47

3.3 KẾT QUẢ CHUYỂN GEN DREB3 VÀO CÂY THUỐC LÁ THÔNG QUA AGROBACTERIUM……… 48

3.3.1 Kết quả chuyển cấu trúc vector pBI ::rd29A::DREB3 vào giống thuốc lá K326……… 48

3.3.2 Kết quả phân tích và đánh giá các dòng thuốc lá thu được……… 50

3.4 KẾT QUẢ CHUYỂN PROMOTER RD29A TRONG CÂY ĐẬU TƯƠNG……… 52

3.4.1 Kết quả chuyển cấu trúc promoter rd29A vào đậu tương……… 52

3.4.2 Kết quả phân tích cây đậu tương chuyển gen bằng kỹ thuật PCR…… 55

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……… 56

DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN……… 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 58

PHỤ LỤC………

iv

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

v

vi

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ năm 2003 đến 2010… 6

Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm tách chiết……… 25

Bảng 2.2 Thành phần của phản ứng PCR……… 27

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng……… 27

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng colony – PCR……… 28

Bảng 2.5 Thành phần hoá chất tách plasmid……… 29

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme BamHI, SacI 29

Bảng 2.7 Môi trường nuôi cấy đậu tương……… 31

Bảng 2.8 Môi trường nuôi cấy thuốc lá……… 32

Bảng 3.1 Sự sai khác về trình tự nucleotide và amino acid của 3 trình tự gen DREB3 thu được với gen GmDREB3 mã số DQ055133……… 38

Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót của của các mảnh thuốc lá biến nạp qua các giai đoạn chọn lọc 48

Bảng 3.3 Tỷ lệ sống sót của các mô đậu tương qua các giai đoạn chọn lọc 53

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read