Xác định trình tự gen E6 và L1 của HPV và gen EBNA-1 của EBV để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC --- HOÀNG VĂN MẠNH XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN E6 VÀ L1 CỦA HPV VÀ

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-

HOÀNG VĂN MẠNH

XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN E6 VÀ L1 CỦA HPV VÀ GEN EBNA-1 CỦA EBV ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHUẨN ĐOÁN UNG

THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ VÒM MŨI HỌNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Lê Thanh Hoà

Thái Nguyên - 2011

Trang 2

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Trang 3

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang 4

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Bản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi của người có khả năng nhiễm ung thư cổ tử cung của các châu lục 4 Hình 1.2 Cơ chế nhiễm HPV (Human papilloma virus) trong ung thư cổ tử cung 9 Hình 1.3 Mối quan hệ phả hệ và nguồn gốc của 101 Papillomavirus

dựa trên so sánh chuỗi nucleotid của gene capsid L1 11 Hình 1.4 Human Papillomavirus chụp dưới kính hiển vi điện tử 12

Hình 1.7 Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của EBV trong cơ thể bị

Hình 1.8 Cấu trúc hệ gene EBV dạng khép lại thành mạch vòng (a)

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu phân tích gene EBNA-1 của

Hình 3.3 Kiểm tra sản phẩm tách dòng đoạn gen E6 của mẫu PK12

Hình 3.4 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen

Hình 3.5 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen

Hình 3.8 Kết quả bước đầu phát hiện HPV16/HPV18 bằng phương

Trang 5

Hình 3.10 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di gen EBNA-1 61 Hình 3.11 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen

Trang 6

MỤC LỤC Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) 4

1.1.1 Dịch tễ học ung thư cổ tử cung 4

1.1.1.1 Trên thế giới 4

1.1.1.2 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam 6

1.1.1.3 Các yếu tố có nguy cơ đối với ung thư CTC 6

1.1.1.4 Human papilloma virus và bệnh ung thư cổ tử cung 6

1.1.2 Phân loại và đặc tính sinh học của Papilloma virus 9

1.1.2.1 Phân loại Papilloma virus 9

1.1.2.2 Đặc tính sinh học của Human Papillomavirus 12

1.1.2.3 Quá trình nhân lên của HPV 14

1.1.2.4 Cơ chế gây ung thư cổ tử cung của HPV 16

1.1.3 Chẩn đoán ung thư CTC 17

1.1.3.1 Chẩn đoán tế bào học 17

1.1.3.2 Chẩn đoán dựa trên phân tích mRNA 19

1.1.3.3 Định týp HPV bằng sinh học phân tử 19

Trang 7

1.1.4 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng

phương pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung ở Việt Nam 21

1.2 UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV) 22

1.2.1 Dịch tễ học ung thư vòm mũi họng 22

1.2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 22

1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 23

1.2.2 Đặc tính sinh học của Epstein-Bar virus (EBV) 24

1.2.2.1 Phát hiện virus Epstein - Barr và ung thư VMH 24

1.2.2.2 Đặc điểm phân loại và cấu trúc EBV 25

1.2.2.3 Sự nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thư của EBV… 26

1.2.2.4 Sinh học phân tử và sắp xếp hệ gene của EBV 28

1.2.2.5 Gene và sản phẩm của gene EBNA-1 29

1.2.3 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thư vòm mũi họng ở Việt Nam 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Đối tượng nghiên cứu 33

2.2 Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu và hoá chất nghiên cứu 33

2.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị 33

2.2.2 Hoá chất 33

2.3 Phương pháp nghiên cứu 34

2.4 Quy trình nghiên cứu 35

2.4.1 Lấy mẫu và bảo quản 35

2.4.2 Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số 35

2.4.3 Quy trình phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm PCR 37

Trang 8

2.4.3.1 Thiết kế mồi……… 37

2.4.3.2 Quy trình phản ứng PCR 38

2.4.3.3 Kỹ thuật phát hiện sản phẩm PCR 40

2.4.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR 41

2.4.4 Phương pháp tạo dòng sản phẩm PCR 42

2.4.4.1 Tạo vectơ tái tổ hợp 42

2.4.4.2 Chuyển nạp……… ……… 43

2.4.4.3 Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp 44

2.4.4.4 Tách DNA plasmid tái tổ hợp 45

2.4.4.5 Kiểm tra DNA tái tổ hợp 47

2.4.5 Giải trình trình tự và xử lý số liệu 48

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen E6 của HPV-16 và L1 của HPV-18 51

3.1.1 Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 51

3.1.2 Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex-PCR phát hiện HPV-16 và HPV-18 52

3.1.3 Kết quả tách dòng và giải trình tự các sản phẩm HPV-16 và HPV-18 từ các mẫu kiểm tra 53

3.1.4 Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen E6 của HPV-16 và

chuỗi gen L1 của HPV-18 54

3.1.5 Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen E6 của HPV16 và L1 của HPV18 56

3.1.6 Kết quả bước đầu phát hiện HPV-16 và HPV-18 bằng phương pháp đa mồi multiplex-PCR 59

Trang 9

3.2 Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen EBNA – 1 của

EBV 60

3.2.1 Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 60

3.2.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR 61

3.2.3 Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen EBNA-1 của EBV 62

3.2.4 Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen EBNA-1 của EBV 63

3.2.5 Kết quả xác định phân týp EBV qua phân tích vị trí acid amin số 487 của EBNA-1 thu nhận với chuỗi gen tương ứng của các chủng Việt Nam và thế giới 64

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

4.1 KẾT LUẬN 69

4.2 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 10

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, ung thư (cancer) là một trong những nguyên nhân gây tỷ lệ tử vong cao nhất ở người, chiếm khoảng 12% trong tổng số trường hợp tử vong hàng năm trên thế giới, đứng thứ 2 sau tỷ

lệ tử vong của các bệnh lí về tim - mạch và ngày càng có xu hướng gia tăng

Bệnh ung thư nếu không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ dẫn đến nguyên nhân gây tử vong, do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu Bệnh

có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi, ở cả hai giới (nam và nữ) và ở tất cả các mô, các cơ quan trong cơ thể Đặc biệt, ung thư cổ tử cung (CTC) và ung thư vòm mũi họng (VMH) là hai trong số 5 loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao nhất ở Việt Nam

và các quốc gia đang phát triển trong khu vực Trong đó, ung thư CTC đứng thứ

2 trong số các ung thư và là nguyên nhân gây tử vong cao nhất cho phụ nữ ở Việt Nam [1], [9] Bên cạnh đó, ung thư VMH cũng là một trong 5 loại ung thư phổ biến nhất ở người và là loại hay gặp nhất trong ung thư vùng tai mũi họng ở các nước vùng Đông nam Á và phía nam Trung Quốc [23], [56]

Nguyên nhân gây ra ung thư rất phức tạp, liên quan đến thể địa, tập quán, thói quen và môi trường sống Trong đó, một số yếu tố đã được coi là liên quan chặt chẽ với việc gây ra ung thư như: yếu tố vật lí (phóng xạ), hóa chất độc, các gốc tự do và đặc biệt ngày nay đã phát hiện ra vai trò của các virus trong tiến triển ung thư Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh virus là nguyên nhân gây ra hai loại ung thư này ở người Nhiều nghiên cứu đã phát hiện sự hiện

diện của HPV (Human papilloma virus) trong hơn 95% các trường hợp ung thư

cổ tử cung [62], do đó HPV được coi là nguyên nhân gây bệnh ung thư CTC [9]

Các nghiên cứu về mối liên quan giữa Epstein-Barr Virus (EBV) và ung thư

VMH cũng đã cho thấy sự biểu hiện của kháng nguyên virus trong các giai đoạn của bệnh, vai trò quan trọng của EBV trong bệnh học cũng như trong quá trình sàng lọc chẩn đoán điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh [24]

Trang 11

data error !!! can't not

read

Trang 12

read

Trang 13

read

Trang 14

read

Trang 15

read

Trang 17

read

Trang 18

read

Trang 19

read

Trang 20

read

Trang 21

read

Trang 22

read

Trang 23

read

Trang 24

read

Trang 26

read

Trang 27

read

Định dạng
Số trang	27
Dung lượng	765,83 KB