Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc

1 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ------ HỨA THỊ SƠN Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi kh

1

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- -

HỨA THỊ SƠN

Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối

kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum

gây bệnh héo xanh cây lạc

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2010

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- -

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum

gây bệnh héo xanh cây lạc

Hướng dẫn khoa học: TS Lê Như Kiểu

Hà Nội – 2010

Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Lê Như Kiểu, Phó viện trưởng Viện Thổ nhưỡng Nông hóa–Viện Khoa học Nông nghiệp Việt nam, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và định hướng cho tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn thạc sĩ này

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể bộ môn Vi sinh vật-Viện Thổ nhưỡng Nông hóa và tập thể bộ môn Sinh học Môi trường Nông nghiệp-Viện Môi trường Nông nghiệp đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm trong công việc để tôi có thể hoàn thành luận văn đúng thời gian qui định

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn

Tôi chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó./

Hà nội, ngày 2 tháng 12 năm 2010

Học viên

Hứa Thị Sơn

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

A, T, G, C Adenine, Thyamine, Guanine, Cytosine

ADN Acid deoxyribonucleic

ALIV African lampeye iridovirus

BIV bream iridovirus

bp base pair

DGIV Dwarf gourami iridovirus

EBI European Bioinformatics Institute

EDTA Ethylenediamin Disodium Tetra Acetate

EHNV Epizootic haematopoietic necrosis virus

GIV Grouper iridovirus

GSDIV Grouper sleepy disease iridovirus

ISKNV Infectious spleen and kidney necrosis virus

kb kilo base

LCDV Lymphocystis disease virus

MCP Major capsid protein

NCBI National Center for Biotechnology Information OIE World Organisation for Animal Health

OSGIV orange spotted grouper iridovirus

PCR Polymerase Chain Reaction

RBIV Rock bream iridovirus

RSIVD red sea bream iridoviral disease

SBIV Red sea bream iridovirus

SN-PCR Semi-nested - Polymerase chain reaction

TAE Tris - Acetic – EDTA

TE Tris - EDTA 10 mM

TGIV Taiwan Grouper Iridovirus

1.1 Tình hình trồng trọt trên thế giới và Việt Nam 2

1.2 Tình hình bệnh hại lạc trên thế giới và Việt Nam 7

2.2.1 Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng 33 2.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng bằng phương pháp đục lỗ thạch 34 2.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng bằng phương pháp cấy chấm điểm 35 2.2.4 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng 36 2.2.5 Phân loại vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen

2.2.5.1 Phương pháp PCR thông thường (đơn) 39

2.2.5.2 Phương pháp kiểm tra độ sạch và xác định nồng độ 40

2.2.5.4 Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen 43

2.2.5.5 Phương pháp tin sinh học (sử dụng phần mềm NCBI, EBI, Expasy…) 46

3.1 Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng 47

3.2 Đánh giá hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn 50

3.3 Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng 52

3.4 Một số đặc điểm cơ bản của các chủng vi khuẩn đối kháng 54

3.4.1.Một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đối kháng 54

3.4.2 Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng đến quá trình nảy

3.4.3 Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do R solanacearum của các

3.4.4 Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng lên quá trình sinh

3.5 Xác định vi trí phân loại các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phương pháp

giải trình tự đoạn gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom 63

Bảng 3.2 Hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn với đại diện các chủng vi khuẩn 50

gây bệnh héo xanh R Solanacearum

Bảng 3.3 Một số đặc điểm sinh học của 8 chủng vi khuẩn đối kháng 52

Bảng 3.4 Một số đặc điểm sinh học cơ của các chủng vi khuẩn đối kháng 55

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của 8 chủng vi khuẩn đối kháng lên khả năng nảy mầm 57

MỤC LỤC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Hoạt tính đối kháng của một số chủng vi khuẩn đối kháng với 51

R solanacearum BHT gây bệnh héo xanh lạc

vi khuẩn đối kháng đại diện

Hình 3.3 Hình thái tế bào chủng vi khuẩn TH24 chụp dưới kính hiển vi 54 điện tử với độ phóng đại 20.000 lần

Hình 3.4 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn của các chủng 60

vi khuẩn đối kháng trên Lạc

Hình 3.5 Điện di đồ ADN tổng số của hai chủng vi khuẩn nghiên cứu 64

Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 65

Hình 3.7 Tuyển chọn các khuẩn lạc mang gen mã hóa đoạn 16S ARN riboxom 66

của các chủng vi khuẩn NA10 và TH24 bằng phương pháp colony PCR

Hình 3.8 Tách và kiểm tra plasmid mang đoạn gen mã hóa phần tử 16S 67 riboxom của các chủng vi khuẩn đối kháng

Hình 3.10 Trình tự nucleotit gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom của 70 chủng TH24

Hình 3.11 Trình tự nucleotit gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom của 70 chủng vi khuẩn NA10

9

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU

Bệnh héo xanh cây trồng do khuẩn Ralstonia solanacearum là một bệnh

phổ biến và nghiêm trọng ở nhiều loại cây trồng như cà chua, khoai tây, lạc, ớt, gừng (1, 2, 54,58,57) Đây là bệnh chủ yếu làm giảm năng suất và mất mùa lạc

ở nhiều nước như Trung Quốc, Thái Lan, Việt nam, Indonesia Hàng năm dịch bệnh có thể gây thiệt hại từ 50-80% năng suất cây trồng Tình hình gây hại là như vậy nhưng cho tới nay những nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn ở lạc

và vừng chủ yếu chỉ giới hạn trong phạm vi xác định mức độ thiệt hại, sự phân

bố của bệnh và bước đầu xác định nguồn gen kháng trong tập đoàn các giống hiện có

Kiểm soát dịch bệnh bằng phương pháp sinh học (kiểm soát sinh học) đang dần trở thành xu hướng phổ biến và được áp dụng rộng rãi trong nông nghiệp ở nhiều nước trên thế giới Bằng việc áp dụng các biện pháp sinh học người ta có thể thay thế các loại thuốc trừ sâu hóa học có hại đến sức khỏe con người và môi trường sinh thái Trong đó biện pháp sử dụng vi sinh vật như một tác nhân kiểm soát và phòng ngừa bệnh hại đang dần trở lên phổ biến (5, 7) vì hiệu quả rõ rệt mà nó mang lại, các chủng vi sinh vật lựa chọn phải có hoạt tính đối kháng cao, ổn định trong thời gian dài và không gây hại cho động, thực vật

Với mục đích này tôi được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài “Tuyển chọn

và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc”

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình trồng lạc trên thế giới và Việt nam

1.1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới

Trong các loại cây trồng làm thực phẩm cho con người, lạc có vị trí quan

trọng Mặc dù có nguồn gốc từ lâu đời nhưng tầm quan trọng kinh tế của cây lạc

36 được xác định cách đây khoảng trên 100 năm Khi những xưởng ép dầu ở Macxây (Pháp) bắt đầu nhập cảng lạc từ Tây Phi, mở đầu cho thời kỳ dùng lạc

ép dầu trên qui mô lớn Công nghiệp ép dầu đã hình thành và phát triển nhanh chóng ở các nước Châu Âu và lan ra trên toàn thế giới Phần lớn diện tích trồng lạc trên thế giới còn sản xuất theo lối cổ truyền, kỹ thuật canh tác lạc hậu Những năm gần đây nhờ ứng dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật mới vào sản xuất năng suất lạc đã được nâng lên Tuy nhiên các tiến bộ kỹ thuật ở các nước không đồng đều, ở các nước phát triển năng suất lạc tăng nhanh còn ở các nước chậm phát triển thì hàng năm năng suất lạc tăng không đáng kể Các nước có năng suất lạc tăng nhanh đó là: Mỹ trong vòng từ năm 1961 đến 1975 năng suất bình quân đã tăng từ 1.564kg/ha lên 2.875kg/ha Ở Trung Quốc chương trình nghiên cứu nâng cao năng suất lạc được tiến hành từ 1979 và đã đạt được kết quả khả quan Các thành tựu về chọn giống lạc trong những năm 80 đã được ứng dụng vào sản xuất tạo nên các điển hình năng suất cao như giống Nonghua 22 đạt năng suất trung bình 4.219kg/ha ở miền trung và miền nam Trung Quốc Ngoài ra nhiều giống lạc mới có năng suất cao đã và đang được đưa ra sản xuất và mở rộng (5, 14)

Cây lạc được trồng ở tất cả các châu lục với trên 100 nước trên thế giới, diện tích trồng lạc khoảng 20-21 triệu ha, năng suất biến động từ 11-12tạ/ha và

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

read

data error !!! can't not

read