Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân keratin từ lông vũ gia cầm và thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện keratinase trong tế bào vi khuẩn E.Coli

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ MINH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ K

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ MINH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT

CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN KERATIN TỪ LÔNG VŨ GIA CẦM

VÀ THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN KERATINASE

TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2011

Trang 2

NGUYỄN THỊ MINH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT

CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN KERATIN TỪ LÔNG VŨ GIA CẦM

VÀ THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN KERATINASE

TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI

Chuyên ngành : Di truyền học

Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Huy Hoàng

Trang 3

Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh

Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân và sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Hoàng

– Phó trưởng Phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN Việt Nam, là người thầy_người anh đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, em đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ

bảo tận tình của các cán bộ Phòng Vi sinh vật đất, đặc biệt là Th.S Nguyễn

Quỳnh Mai, CN Nguyễn Thu Hiền đã giúp đỡ em trong quá trình tiến hành

thí nghiệm

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo tham gia giảng dạy tại Khoa Sinh-KTNN Đại Học Thái Nguyên- ĐH Sư Phạm Thái Nguyên- Khoa đào tạo sau đại học đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt 2 năm qua

Bên cạnh đó, em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới BGH cùng toàn thể cán bộ giáo viên trường THPT Điềm Thụy, Phòng ADT ứng dụng thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm CNG đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và Viện

Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ và những người thân trong gia đình lòng biết ơn sâu sắc, cảm ơn những người bạn đã chia sẻ khó khăn thử thách trong cuộc sống và công việc để em có được kết quả này

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 09 năm 2011

Nguyễn Thị Minh

Trang 4

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Keratin .3

1.2 Keratinase 6

1.3 Đa dạng vi sinh vật có khả năng sinh keratinase cao 8

1.4 Tình hình nghiên cứu 12

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 12

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

1.5 Sản xuất và ứng dụng quá trình thuỷ phân keratin trong lông vũ 14

1.5.1 Tăng hàm lượng chất dinh dưỡng trong thức ăn gia súc 17

1.5.2 Tạo phân bón 17

1.5.3 Tạo enzyme trong các ngành công nghiệp 18

1.5.4 Cải tạo đất 18

1.5.6 Tạo hợp chất màu 19

1.5.7 Ứng dụng trong công nghiệp dược và sản xuất thực phẩm chức năng 19

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Nguyên liệu 20

2.1.1 Nguyên liệu 20

2.1.2 Hoá chất 20

Trang 5

Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17ii

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 20

2.1.4.1 Môi trường Broth Peptone 20

2.1.4.2 Môi trường I 20

2.1.4.3 Môi trường II 21

2.1.4.4 Môi trường III 21

2.1.4.5 Môi trường để phân lập chủng Chryseobacterium .21

2.1.4.6 Môi trường nuôi lắc lông vũ 21

2.1.4.7 Môi trường MPA 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao 22

2.2.1.1 Lấy mẫu và đo pH đất 22

2.2.1.2 Phân lập chủng vi khuẩn Chryseobacterium 22

2.2.1.3 Phân lập chủng vi khuẩn Vibrio 23

2.2.1.4 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus 23

2.2.2 Xác định khả năng thuỷ phân lông vũ 23

2.2.2.1 Nuôi giống cấp 1 vào môi trường MPA 23

2.2.2.2 Xác định mật độ tế bào 25

2.2.3 Lựa chọn môi trường thích hợp cho các chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao 25

2.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn thủy phân lông vũ 26

2.2.5 Xác định đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn 26

2.2.6 Xác định gram âm và gram dương của vi khuẩn 26

2.2.6.1 Phương pháp Hucker cải tiến 26

2.2.6.2 Xác định bằng cách kiểm tra độ kết dính 27

2.2.7 Phương pháp phân loại vi khuẩn theo đặc tính sinh hoá 28

2.2.8 Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a 30

2.2.8.1 Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn 30

2.2.8.2 Nhân bản đoạn DNA bằng PCR 32

Trang 6

2.2.9 Phân tích hoạt tính keratinase ngoại bào 38

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Kết quả lấy mẫu ở các địa điểm 41

3.2 Giá trị pH của các mẫu đất 41

3.3 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả thủy phân keratin 42

3.4 Lựa chọn môi trường thích hợp của các chủng được chọn lọc 44

3.5 Tối ưu nhiệt độ của các chủng vi khuẩn chọn lọc 47

3.6 Đặc điểm hình thái nhóm vi khuẩn thuỷ phân lông vũ 48

3.7 Kết quả xác định gram của các chủng vi khuẩn 49

3.8 Phân loại các chủng phân lập theo phương pháp sinh hoá 50

3.8.1 Phân loại theo kit API 50CHB của chủng vi khuẩn Đ.GT.2.2 50

3.8.2 Phân loại theo kit API 20NE của chủng vi khuẩn L.SC.1.2 51

3.9 Phân loại theo kiểu gene 52

3.9.1 Tách DNA tổng số 52

3.9.2 Nhân đoạn gene mã hóa 16S rARN bằng kỹ thuật PCR 53

3.10 Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a 55

3.10.1 Nhân đoạn gene keratinase bằng kỹ thuật PCR 55

3.10.2 Gắn sản phẩm PCR đã thôi gel tinh sạch vào vector tách dòng pET32a 56

3.10.3 Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến DH10B 58

3.10.4 Tách DNA plasmid tái tổ hợp 59

3.11 Đánh giá hoạt tính ezyme dịch thô của chủng chọn lọc 60

3.11.1 Định lượng Protein bằng phương pháp Bradford 60

3.11.2 Thử hoạt tính enzyme bằng azokeratin 62

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

4.1 Kết luận 64

4.2 Kiến nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

Trang 7

Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17iv

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) EtBr Dung dịch Ethidium Bromide

BSA Bovine serum albumin

DNA Deoxyribonucleic axid

rARN Ribosomal ribonucleic acid

LB Luria-Bertani

Ker Keratinase

bp Base pair(cặp ba zơ)

E.coli Escherichia coli

µl Microlit

EtOH Ethanol

Primer-F Mồi xuôi

Primer-R Mồi ngược

Trang 8

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Sự đa dạng của vi sinh vật có khả năng sinh

keratinase và các đặc tính hóa sinh của keratinase

9

1.2 Ứng dụng của enzyme 16 2.1 49 phép thử lên men API 50 CHB 28 2.2 50 phép thử sinh hóa API 20 CHB 31 3.1 Địa điểm lấy mẫu 41 3.2 Giá trị pH của các mẫu đất 41 3.3 Tỷ lệ thủy phân lông vũ của các chủng tuyển chọn 43 3.4 Mật độ tế bào và khả năng thủy phân 1 gam lông vũ

ở các nhiệt độ khác nhau(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)

Trang 9

Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

1.1 Một số hình dạng lông vũ 3 1.2 Cấu tạo phân tử keratin 5 1.3 Ảnh dưới kính hiển vi các sợi bên trong tế bào

3.2 Khả năng sinh trưởng và thủy phân lông vũ của

các chủng vi khuẩn trên các môi trường khác nhau (Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)

46

3.3 Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi

khuẩn trên các môi trường khác nhau (Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)

46

3.4 Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi

khuẩn các khung nhiệt độ khác nhau (Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)

và L.SC.1.2

55

3.9 Sản phẩm PCR bằng mồi ker F và ker R 56

Trang 10

3.11 Sản phẩm tinh sạch gene ker và vector

pET32asau khi xử lý bằng 2 enzyme cắt

57

3.13 Sản phẩm biến nạp của 2 chủng vi khuẩn vào tế

bào khả biến E.coli DH10B

58

3.14 Ảnh điện di sản phẩm tách DNA plasmid tái tổ

hợp của các chủng sau biến nạp

59

3.15 Sản phẩm phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp

bằng 2 enzyme cắt XhoI và BamHI

60

Trang 11

data error !!! can't not

read

Trang 12

read

Trang 13

read

Trang 14

read

Trang 15

read

Trang 17

read

Trang 18

read

Trang 19

read

Trang 20

read

Trang 21

read

Trang 22

read

Trang 23

read

Trang 24

read

Trang 26

read

Trang 27

read

Định dạng
Số trang	27
Dung lượng	307,91 KB