Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu hiện kháng nguyên Her2

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN PH

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN PHƯƠNG HOA

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIỄN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2010

Trang 2

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Nguyễn phương Hoa

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIÊN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2

Ngành: Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Quang Huấn

Hà Nội - 2010

Trang 3

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU………1

Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……… 3

1 Khái niêm, phân loại và ứng dụng của immunotoxin……….3

1.2 Tình hình ung thư vú (UTV) trên thế giới và ở Việt Nam 4

1.2.1.Trên thế giới 4

1.2.2.Ở Việt Nam 4

1.3 Giới thiệu ung thư vú………5

1.3.1 Khái niệm chung về bệnh UTV 5

1.3.2 Nguyên nhân phát sinh ung thư vú 6

1.3.3 Các phương pháp chẩn đoán 7

1.3.4 Các phương pháp điều trị 9

1.4 Kháng nguyên Her2 đặc hiệu tế nào ung thư vú 10

1.4.1 Khái quát về kháng nguyên HER2 10

1.4.2 Cấu trúc HER2 11

1.4.2.1 Cấu trúc gen HER2 11

1.4.2.2 Cấu trúc protein HER2 11

1.4.2.3 Sự khuếch đại HER2 và cơ chế gây ung thư của HER2….13 1.5 Khái quát chung về kháng thể - Kháng thể đơn dòng 16

1.5.1 Cấu tạo chung của kháng thể 16

1.5.2 Kháng thể đơn dòng 17

1.5.3 Kháng thể đơn chuỗi - Mảnh kháng thể……… 17

1.5.4 Một số kháng thể đơn dòng sử dụng trong điều trị ung thư vú …19

1.5.5 Kháng thể kháng HER2 gắn Melitin………22

Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 Vật liệu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Sinh phẩm 23

2.1.2 Hoá chất Error! Bookmark not defined 2.1.3 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.2 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2.1 Phương pháp PCR……….24

2.2.2 Cắt bằng enzym giới hạn 26

2.2.3 Phương pháp thiết kế vector biểu hiện 26

2.2.4 Phương pháp biến nạp 29

2.2.5 Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp 30

2.2.6 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 31

2.2.7 Phương pháp tính sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+ 32

2.2.8 Phương pháp phân tích khối phổ 33

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Thiết kế vector biểu hiện pET-21A(+)mang gen mã hoá độc tố miễn dịch

hermel 36

Trang 4

3.1.1 Cắt gen Hermel 36

3.1.2.Cắt vector pET-21A(+) 36

3.1.3 Gắn gen hermel vào vector pET-21A(+) và chọn dòng plasmid tái tổ hợp……… 38

3.1.4 Xác định trình tự gen hermel ………Error! Bookmark not defined 3.2 Biểu hiện và tối ưu hoá biểu hiện gen hermel ……….Error! Bookmark not defined 3.2.1 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-21A(+) vào tế bào E.coli BL21(DE3) Er ror! Bookmark not defined 3.2.2 Biểu hiện gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2 trong tế bào E coli BL 21(DE3)……… 45

3.3 Ngiên cứu điều kiện biểu hiện gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2 trong E coli 46

3.3.1.Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh tổng hợp độc tố miễn dịch herme 47

3.3.2 Ảnh hưởng của oxi lên khả năng biểu hiện của gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2………48

3.3.3 Khảo sát nồng độ kháng sinh………50

3.3.4 khảo sát nhiệt độ nuôi cấy ……… Error! Bookmark not defined 3.3.5 Ảnh hưởng của IPTG……….52

3.3.6 Khảo sát thời gian thu mẫu………54

3.3.7 Biểu hiện protein tái tổ hợp hermel ở các điều kiện thích hợp đã lựa chọn……….55

3.4 Tinh sach protein tái tổ hợp hermel, khẳng định bằng khối phổ và xác đinh hoạt tính……… 56

3.4.1 Tinh sạch protein tái tổ hợp HER2……… 56

3.4.2 Phân tích khối phổ protein tái tổ hợp……….57

3.4.3 Xác đinh hoạt tính của protein hermel……… 59 Kết luận và kiến nghị

……… Error! Bookmark not defined

Tài liệu tham khảo

………Error! Bookmark not defined

Trang 5

Trang 6

THUậT NGữ VIếT TắT

1 ADN Axit Deoxyribonucleic

10 IPTG Isopropyl- -D-Thiogalactopyranoside

11 IR Inter-repeat region (miền lặp nội mạch bảo tồn)

14 LB Môi tr-ờng Lauria Betani

16 LRR Leucine-rich repeat (đoạn lặp giàu leucine)

17 LTA Axit lipoteichoic

18 NASBA Nucleic acid sequence-based amplification (khuếch đại dựa trên

trình tự axit nucleic)

19 OD Optical Density (Mật độ quang học)

20 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

21 SDS Sodium Dodecyl Sulphate

22 TAE Tris - Acetate - EDTA

Trang 7

Trang 8

- 1 -

MỞ ĐẦU

Cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunotoxin - ITs) được xác định là những chất gây độc cho tế bào, được tạo ra để giết một cách chọn lọc quần thể tế bào mà ở đó có biểu hiện những kháng nguyên hoặc thụ thể bề mặt đặc hiệu

Phân tử độc tố miễn dịch ITs có tác dụng nhận biết và làm tan tế bào ung thư vú biểu hiện quá mức HER2 một yếu tố phát triển biểu mô biểu hiện mạnh ở 25-30% bệnh nhân ung thư vú

ITs được tạo ra bằng việc kết hợp giữa 2 yếu tố : (1) chất gây độc (toxins) có bản chất là protein và (2) tác nhân hướng đích theo các phương pháp hoá học (7) hoặc bằng công nghệ ADN tái tổ hợp

HER2 là một loại thụ thể thuộc họ các yếu tố phát triển biểu mô

(Human Epidermal growth Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase,

đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá tế bào Cho đến nay vẫn chưa tìm thấy ligand đặc hiệu của HER2; tuy nhiên nó có thể tạo dimer với bản thân nó hoặc với các thụ thể khác trong họ để hình thành đồng thụ thể (coreceptor) thúc đẩy các con đường truyền tín hiệu Sự khuếch đại gen HER2 trên nhiễm sắc thể 17 dẫn đến sự tăng biểu hiện thụ thể HER2 trên

bề mặt tế bào ung thư vú Biểu hiện quá mức HER2 có thể biến đổi tế bào thành dạng ác tính và làm tăng quá trình hình thành khối u Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có sự khuếch đại gen HER2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong các tế bào ung thư Tính chất này làm cho HER2 trở thành một đích hữu hiệu để chẩn đoán sớm cũng như đích tấn công của liệu pháp điều trị miễn dịch

Trang 9

- 2 -

Ung thư vú hiện nay đang là một trong hai loại ung thư chiếm tỷ lệ cao nhất trong các bệnh ung thư ở nữ giới Điều trị ung thư vú cũng như nhiều loại ung thư khác theo các liệu pháp truyền thống như hoá trị liệu và xạ trị liệu mặc dù hiệu quả tiêu diệt khối u cao nhưng lại có một nhược điểm rất lớn, đó là tác dụng lên cả các cơ quan bình thường xung quanh (non-targeted effect) Mặt khác, các phương pháp này đa phần chỉ áp dụng đối với trường hợp các khối u đã phát triển và ở giai đoạn muộn nên có hiệu quả điều trị thấp Những nghiên cứu gần đây về các marker sinh học trong ung thư vú đã

mở ra một hướng điều trị mới, thông minh và đầy triển vọng, liệu pháp điều trị tấn công đích (targeted therapy), có thể loại bỏ gần như hoàn toàn nhược điểm của các liệu pháp truyền thống Một trong số thuốc có bản chất kháng thể đặc hiệu HER2 đã được FDA chấp thuận để điều trị cho các bệnh nhân ung thư vú dương tính với HER2 ở giai đoạn cuối là HERCEPTIN

Để góp phần nghiên cứu nhằm tạo các bộ kít chẩn đoán và các loại thuốc có hiệu quả điều trị cao đối với dạng ung thư vú dương tính với HER2

chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu hiện kháng nguyên Her2’’

Trang 10

- 3 -

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Khái niệm, phân loại và ứng dụng Immunotoxin

Như đã nói ở trên, cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunôtxin-IT) được xác định là những chất gây độc cho tế bào, được tạo ra để giết một cách chọn lọc quần thể tế bào mà ở đó biểu hiện những kháng nguyên hoặc receptor bề mặt đặc hiệu Những độc tố dạng này đang được nghiên cứu và chế tạo không chỉ trong trị liệu ung thư (5), mà còn được thử nghiệm trên các bệnh khác như GvHD (6), các bệnh tự miễn dịch và AIDS (7) Immunotoxin được tạo ra bằng việc kết hợp giữa hai yếu tố : chất gây độc (toxins) có bản chất là protein và (2) tác nhân hướng dích theo các phương pháp hoá học (9) hoặc công nghệ ADN tái tổ hợp (11) Cho tới nay các toxin thường hay được dùng nhất để chế tạo ITs là các protein từ vi khuẩn [pseudomonas exotoxin (PE) hay diptheria toxin (DT)] , hoặc từ thực vật [nhóm các protein bất hoạt riboxom (RIPs) như : Ricin, pokweet anti- viral protein (PAP) Saporin (SAP) ] Cả hai loại toxin này tác động lên tế bào theo cơ chế làm bất hoạt EP-2 (PE, DT) hay tác động lên điểm gắn của EP-2 (RIPs) trên tiểu phần riboxom 28S, làm ức chế quá trình sinh tổng hợp protein (17) Mặc dù các toxin kể trên có hoạt tính cao và chỉ bằng không đến 10 phân tử có thể giết chết một tế bào đích, việc kết hợp giữa chúng để tạo ra ITs còn mang lại giá trị sử dụng cao hơn nhiều.Các kết quả nghiên cứu cũng đã cho thấy ITs tạo ra bởi các toxin kể trên có khả năng ức chế tế bào ung thư mạnh và hiệu quả hơn

từ hàng trăm tới hàng nghìn lần do có tính hướng đích và tính chọn lọc

Độc tố Melitin là gì ?

Melitin là một loại protein hay chuỗi axit amin, thu hút rất mạnh đối với màng tế bào nên ngay khi tiếp xúc với bề mặt tế bào mục tiêu, nó nhanh

Trang 11

data error !!! can't not

read

Trang 12

read

Trang 13

read

Trang 14

read

Trang 15

read

Trang 17

read

Trang 18

read

Trang 19

read

Trang 20

read

Trang 21

read

Trang 22

read

Trang 23

read

Trang 24

read

Trang 26

read

Trang 27

read

Định dạng
Số trang	27
Dung lượng	607,96 KB