Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của một số chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces phân lập tại Thái Nguyên và định hướng ứng dụng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ---*--- ĐỖ THỊ TUYẾN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA MỘT

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-* -

ĐỖ THỊ TUYẾN

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ

CHỦNG XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES PHÂN

LẬP TẠI THÁI NGUYÊN VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, 2011

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-* -

ĐỖ THỊ TUYẾN

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG

XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES PHÂN LẬP TẠI

THÁI NGUYÊN VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Vi Thị Đoan Chính

Thái Nguyên, 2011

Trang 3

iii

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các kí hiệu, viết tắt vi

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình vẽ viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN 3

1.1.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 4

1.1.3 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 6

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN 7

1.2.1 Phương pháp phân loại truyền thống 7

1.2.2 Phương pháp phân loại dựa vào chỉ thị phân tử gene 16S rRNA 9

1.3 SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 12

1.3.1 Cơ chế sinh tổng hợp các chất kháng sinh 12

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 13

1.3.3 Tách chiết chất kháng sinh 15

1.4 XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 16

1.4.1 Vi nấm là nguyên nhân chủ yếu gây ra các bệnh hại cây trồng 16

1.4.2 Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật 17

1.5 XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG 19

Trang 4

iv

1.5.1 Tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme 19

1.5.2 Một số enzyme chủ yếu ứng dụng trong bảo vệ môi trường 20

Chương 2 :VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 23

2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ MÔI TRƯỜNG 23

2.2.1 Hóa chất 23

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 24

2.2.3 Môi trường nghiên cứu 24

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.3.1 Phương pháp phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 26

2.3.2 Phương pháp đếm số lượng tế bào 26

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 27

2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 28

2.3.5 Phương pháp xác định khả năng chịu nhiệt của enzyme 28

2.3.6 Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 28

2.3.7 Phương pháp xác định trình tự đoạn gene 16S rRNA 30

2.3.8 Nghiên cứu bước đầu quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh 33

2.3.9 Phương pháp tách chiết chất kháng sinh 33

2.3.10 Xác định ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của hạt 34

2.3.11 Phương pháp xử lý số liệu 34

Chương 3 :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 SỰ PHÂN BỐ VÀ TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN 35

3.1.1 Sự phân bố của xạ khuẩn trong đất 35

Trang 5

v

3.1.2 Tính đa dạng sinh học của xạ khuẩn 36

3 2 Hoạt tính kháng sinh và chọn lọc chủng xạ khuẩn có HTKS cao 37

3.2.1 Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập 37

3.2.2 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao 41

3.3 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI 2 CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 44

3.3.1 Đặc điểm hình thái 2 chủng xạ khuẩn HT 17.8 và HT19.1 44

3.3.2 Đặc điểm nuôi cấy 45

3.3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 46

3.3.4 Phân loại 2 chủng xạ khuẩn HT17.8 và HT19.1 51

3.4 NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP VÀ MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẤT KHÁNG SINH CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 59

3.4.1 Nghiên cứu sinh tổng hợp chất kháng sinh 59

3.4.2 Tách chiết và xác định một số tính chất của chất kháng sinh chủng HT17.8 62 3.5 TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH ENZYME 64

3.5.1 Hoạt tính enzyme của xạ khuẩn 64

3.5.2 Khả năng chịu nhiệt của enzyme 66

3.6 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CKS TRONG DỊCH NUÔI CẤY CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 TỚI KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HẠT 68

KẾT LUẬN 71

KIẾN NGHỊ 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

Trang 6

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh thực vật như đạo ôn, khô vằn, thối

cổ rễ, mốc sương… đã gây tổn thất nặng nề cho mùa màng, chúng chiếm tới 83% trong số các bệnh ở cây trồng [15] Theo thống kê của Tổ chức Nông Lương Liên hiệp Quốc (FAO), thiệt hại trong nông nghiệp do các bệnh vi nấm lên tới 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế giới [46].Trong khi đó, việc sử dụng thuốc hóa học trong bảo vệ thực vật từ lâu đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, làm mất cân bằng sinh thái và gây ô nhiễm môi trường Chính vì vậy, việc sử dụng các loại VSV đối kháng, các chất sinh học diệt khuẩn vào các vùng sinh thái khác nhau của cây trồng đã và đang là đích mà các nhà khoa học hướng đến, và xạ khuẩn sinh kháng sinh là đối tượng trung tâm trong cuộc tìm kiếm này [22]

Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ (Prokaryote) với số lượng loài lớn và phân bố ở nhiều vùng sinh thái khác nhau Chúng ngày càng được biết đến rộng rãi với nhiều ứng dụng thực tế thông qua việc tạo ra các sản phẩm trao đổi thứ cấp có giá trị sử dụng cao như CKS, chất chống ung thư, chất kích thích sinh trưởng và nhiều hợp chất y dược khác Thêm vào đó, XK còn khả năng sinh các enzyme ngoại bào nên được sử dụng rộng rãi làm các chế phẩm sinh học có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong công nghệ xử lý rác thải [9], [18]

Thái Nguyên là một tỉnh rất giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp nên có khu

hệ VSV khá phong phú, trong số đó có không ít loài XK sinh CKS Mặt khác, Thái Nguyên lại nằm trong vùng sinh khoáng, có nhiều loại hình khoáng sản phân bố tập trung Điển hình là khu vực núi Pháo thuộc xã Hà Thượng, huyện Đại Từ và khu vực thị trấn Trại Cau thuộc huyện Đồng Hỷ, là nơi đang diễn ra các hoạt động khai thác khoáng sản mạnh mẽ Các hoạt động khai thác khoáng sản đã có những tác động đáng kể đến môi trường đất, nước và qua đó, rất có thể sẽ ảnh hưởng đến hệ VSV Trên thực tế đã có những nghiên cứu về ảnh hưởng của hoạt động khai khoáng tới sự phát triển và đa dạng của các hệ động, thực vật nhưng lại chưa có

Trang 7

đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của một số chủng xạ khuẩn thuộc chi

Streptomyces phân lập tại Thái Nguyên và định hướng ứng dụng”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát sự phân bố, đặc điểm hình thái của XK trong các mẫu đất thu tại các địa điểm nghiên cứu

- Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các chủng XK phân lập được để từ đó có thể tuyển chọn ra một số chủng có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế, đặc biệt

là trong công tác bảo vệ thực vật và môi trường

3 Nội dung nghiên cứu

- Lấy mẫu, phân lập và thuần khiết XK từ các mẫu đất

- Kiểm tra HTKS của các chủng đã phân lập được với các VSV kiểm định để tuyển chọn ra các chủng có HTKS cao

- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý – sinh hóa và phân loại một số chủng XK có hoạt tính kháng nấm đã được tuyển chọn

- Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKS của các chủng XK lựa chọn

- Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào và nghiên cứu tuyển chọn ra một số chủng có hoạt tính enzyme cao, có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tiễn

Trang 8

3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN

1.1.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Theo hệ thống phân loại hiện nay, XK thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn G (+) và XK), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nhân sơ (Prokaryota)

Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ

Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và khoảng hơn 1.000 loài

Trong đó có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại

được xếp vào nhóm XK hiếm [58], [5]

Tên xạ khuẩn – Actinomycetes – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và

“mykes” (nấm) và ban đầu XK được coi là vi nấm vì chúng sinh trưởng giống với

nấm Tuy nhiên, đến nay, XK đã được chứng minh là thuộc nhóm vi khuẩn G(+), có

tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA [60]

Xạ khuẩn là một nhóm VSV rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất, nước, không khí, xác thực vật Nhưng chủ yếu XK phân bố nhiều ở trong đất Số lượng XK trong đất không chỉ phụ thuộc vào thành phần, tính chất của đất mà còn phụ thuộc vào độ ẩm, mức độ canh tác

và khả năng che phủ của thảm thực vật Xạ khuẩn phân bố nhiều hơn ở trong lớp đất đất tơi, xốp, có độ ẩm thích hợp, giàu chất hữu cơ và chất khoáng Số lượng

XK có thể đạt tới 9.800.000 – 80.000.000 CFU trong 1 gam đất [33]

Sự phân bố của XK trong đất còn phụ thuộc nhiều vào pH của đất Xạ khuẩn phân bố nhiều trong các loại đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu, có

pH khoảng 6,8 – 7,5 Trong các lớp đất kiềm hay axit ít gặp XK và càng hiếm gặp hơn trong các lớp đất có độ kiềm mạnh Nhìn chung, nhiệt độ ôn hòa 25 - 30ºC và

pH trung tính là điều kiện tối ưu cho XK phát triển Mặc dù vậy, nhiều loài XK đã

được phân lập ở các môi trường khắc nghiệt ví dụ như loài Arthrobacter ardleyensis

ưa lạnh được phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 0ºC [27] và

Trang 9

trong đất mà nhiều VSV khác không hấp thu được Các XK chi Streptomyces đặc

biệt nhiều trong đất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơ bằng các enzyme ngoại bào Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như axit humic trong đất [5] Nhiều chủng XK có khả năng hòa tan lignin bằng cách sinh các enzyme thủy phân cellulase, hemicellulase ngoại bào có ý nghĩa quan trọng đối với công nghiệp và bảo vệ môi trường Thực tế, mùi mốc đặc trưng của nhiều loại đất liên quan đến sự sản sinh hợp chất hữu cơ dễ bay hơi có tên là geosmin [57], [25], [44]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái

Đặc điểm nổi bật của XK là có hệ khuẩn ty (mycelium) phát triển, phân nhánh

và không có vách ngăn Đường kính của khuẩn ty thay đổi trong khoảng từ 0,2 µm – 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm Kích thước và khối lượng khuẩn ty thường không ổn định và phụ thuộc vào từng loại điều kiện nuôi cấy

Theo ISP, màu sắc KTKS của các chủng XK được chia thành 8 nhóm màu: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, và nhóm màu không xác định (X) [5], [40]

Khi nuôi cấy trong môi trường dịch thể, XK tạo thành dạng bông, khi già tạo thành kết tủa lắng xuống đáy, phần kết tủa này bao gồm các hạt liti, đó là sản phẩm phân hủy của màng nguyên sinh chất và vách tế bào [19]

Khi nuôi cấy trên môi trường đặc khuẩn ty của XK phát triển thành 2 loại Một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất - substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là

Trang 10

5

sinh sản [41] Nhiều loại XK, các KTKS phát triển theo hình phóng xạ, tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm Bản chất của hiện tượng này vẫn chưa được giải thích một cách thỏa đáng [19]

Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh của KTKS sẽ xuất hiện các cuống sinh bào tử – là cơ quan sinh sản đặc trưng của XK Trên mỗi CSBT mang từ 30 ÷ 100 bào tử, đôi khi có thể mang tới 200 bào tử, nhưng cũng có khi chỉ mang một bào tử hoặc hai bào tử CSBT là một trong những đặc điểm rất quan trọng để phân loại

XK Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, đặc điểm này không được ổn định mà vẫn

có thể thay đổi theo môi trường nuôi cấy

Bào tử XK có nhiều hình dạng khác nhau, thường có hình trụ, hình ovan, hình

cầu, hình que với kích thước trung bình khoảng 0,7 ÷ 0,9 × 0,7 ÷ 1,9 µm Bề mặt bào tử XK có thể nhẵn (Sm - Smooth), có gai (Sp - Spiny), khối u (Wa - Warty), nếp nhăn (Ru - Rugose) hay dạng tóc Ha - Hair like Nhìn chung, trong cùng một loài, hình dạng bào tử XK tương đối ổn định, vì vậy có thể xem đây là một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại XK [47]

Hình thái của khuẩn lạc XK rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng

có thể thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi Khuẩn lạc thường có đường kính 0,5 ÷ 2 mm, nhưng cũng có khuẩn lạc có đường kính đạt tới 1 cm hoặc lớn hơn nữa Khuẩn lạc XK thường rắn chắc, không trơn ướt hay trong suốt như của

vi khuẩn hay nấm men mà thường có dạng thô ráp, xù xì, có dạng vôi với nhiều màu sắc khác nhau và có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ

1.1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

XK thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, sử dụng muối nitrat, muối amôn, urê, pepton để làm nguồn nitơ Tuy nhiên khả năng hấp thụ các chất này không giống nhau ở các loài hay các chủng khác nhau

Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu khí, ưa ấm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 25 - 300C Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp

Trang 11

data error !!! can't not

read

Trang 12

read

Trang 13

read

Trang 14

read

Trang 15

read

Trang 17

read

Trang 18

read

Trang 19

read

Trang 20

read

Trang 21

read

Trang 22

read

Trang 23

read

Trang 24

read

Trang 26

read

Trang 27

read

Định dạng
Số trang	27
Dung lượng	480,66 KB