Phát triển hệ thống tái sinh từ mô sẹo phục vụ chọn dòng chịu hạn ở cây đậu tương [Glycine max (L.) Merrill].

Một trong những công cụ quan trọng của tạo giống bằng công nghệ sinh học là kĩ thuật chọn dòng tế bào soma, với tần suất tạo biến di truyền ngẫu nhiên trong khoảng 10-5- 10-8, nuôi cấy m

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi khuẩn cố định đạm nên cây đậu tương thường được trồng luân canh với lúa và ngô để tăng vụ và cải tạo đất bạc màu Với những giá trị to lớn đó mà cây đậu tương được trồng phổ biến ở nhiều nơi từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới, từ

550 vĩ Bắc đến 550 vĩ Nam, từ vùng thấp hơn mực nước biển cho đến vùng cao trên 2000m so với mực nước biển với diện tích khoảng hơn 74,4 triệu ha [4], [9] Trong đó, chúng được trồng nhiều nhất ở Mỹ, Braxin, Argentina, Trung Quốc, Ấn Độ

Ở Việt Nam cây đậu tương được gieo trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nước Các giống đậu tương ở nước ta hiện nay rất phong phú gồm các giống đậu tương nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến và tập đoàn các giống đậu tương địa phương Các giống đậu tương địa phương đa dạng và phong phú cả về kiểu hình và kiểu gen, đây là nguồn nguyên liệu để chọn tạo giống đậu tương mới cho năng suất và chất lượng phù hợp với mục tiêu chọn giống [9]

Tạo giống đậu tương mới có năng suất cao, kháng bệnh, chống chịu với các điều kiện bất lợi do biến đổi khí hậu luôn được các nhà tạo giống quan tâm Bên cạch các phương pháp truyền thống, phương pháp tạo giống bằng công nghệ sinh học đã và đang là phương pháp mang lại hiệu quả cao trong công tác chọn giống cây đậu tương với các tính trạng mong muốn Ở Việt

Nam, tạo giống đậu tương bằng công nghệ sinh học mới đang bắt đầu được quan tâm nghiên cứu Một trong những công cụ quan trọng của tạo giống bằng công nghệ sinh học là kĩ thuật chọn dòng tế bào soma, với tần suất tạo biến di truyền ngẫu nhiên trong khoảng 10-5

- 10-8, nuôi cấy mô sẹo được xem như là nguồn vật liệu phong phú cho việc chọn dòng tế bào có tính chống chịu ở cây trồng (Lê Trần Bình và cs, 1997) [1]

Vì vậy, phát triển hệ thống tái sinh là một trong các khâu quan trọng trong việc ứng dụng công nghệ sinh học để cải tạo giống theo hướng tăng cường khả năng chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi của cây đậu tương Xuất phát từ lí do trên chúng tôi đã lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ

là: Phát triển hệ thống tái sinh từ mô sẹo phục vụ chọn dòng chịu hạn ở cây đậu tương [Glycine max (L.) Merrill]

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tạo dòng đậu tương từ mô sẹo chịu mất nước bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu điều kiện tối ưu khử trùng hạt sử dụng trong nuôi cấy in vitro

- Khảo sát môi trường tạo mô sẹo phôi hạt đậu tương

- Đánh giá khả năng chịu hạn của đậu tương bằng kỹ thuật thổi khô mô sẹo ở các ngưỡng thổi khô khác nhau: 3, 5, 7 (giờ)

- Khảo sát môi trường tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh

- Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá sự thay đổi hệ gen của các dòng đậu tương tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước

- Thiết lập sơ đồ hình cây và xác định khoảng cách di truyền giữa các dòng đậu tương nghiên cứu

- Tuyển chọn các dòng đậu tương ưu tú để tiếp tục theo dõi, đánh giá ở các thế hệ tiếp sau

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tương

Đậu tương có tên khoa học là (Glycine Max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidace) có bộ NST 2n = 40, có

nguồn gốc từ Trung Quốc là loại cây trồng hàng năm không thấy xuất hiện ở loài hoang dại Các giống đậu tương địa phương của nước ta hiện nay được

du nhập từ Trung Quốc đã từ lâu [4]

Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, khó có thế tìm thấy loại cây nào có tác dụng nhiều mặt và hiệu quả kinh tế cao như cây đậu tương Về thực phẩm hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao 40% - 50% protein, 18% - 25 % lipit và 20% gluxit [9] Protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong các loại protein của thực vật, có đầy đủ và cân đối các loại axit amin cần thiết Lipit của đậu tương chúa tỷ lệ lớn các axit béo chưa no, có hệ

số đồng hóa lớn (98%), chỉ số iot cao (120- 137) có tác dụng phòng chống bệnh biếu cổ cho người, đặc biệt đối với vùng trung du và miền núi Hạt đậu tương còn chứ nhiều khoáng và có khả năng cung cấp năng lượng khá lớn (4.710kcal), cho nên người ta đã chế biến hạt đậu tương thành hơn 600 sản phẩm khác nhau [9]

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, là cây cung cấp dầu quan trọng nhất trong các cây lấy dầu Hiện nay qua thống kê của FAO cho thấy từ năm 1980 trở lại đây sản lượng đậu tương thế giới đã tăng lên 2 lần chủ yếu nhờ vào tăng năng suất và diện tích Trong vòng 20 năm qua diện tích gieo trồng tăng nhanh, năng suất bình quân tăng khá cao 23 tạ/ha Các nước sản xuất đậu

tương đứng đầu thế giới: Mỹ, Brazin, Argentina và Trung Quốc chiếm khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu tương trên thế giới [9]

Ở Việt Nam, đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp, trong

đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng bằng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền Trung 1,6% [9] Cây đậu tương chiếm một vị trí rất quan trọng trong nền nông nghiệp nước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát triển

Tuy nhiên, việc sản xuất đậu tương ở trong nước vẫn chưa được đầu tư cao, năng suất còn thấp, do vậy nghiên cứu cải tiến các đặc điểm nông học của các giống địa phương và tạo giống mới có năng suất cao, thích nghi với điều kiện sinh thái ở những vùng khác nhau bằng phương pháp truyền thống kết hợp với hiện đại sẽ đáp ứng được yêu cầu của thực tiễn đặt ra và đó cũng

là chiến lược quan trọng về sự phát triển cây đậu đỗ ở nước ta

1.1.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái học của cây đậu tương

Cây đậu tương là cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân,

lá, hoa, quả và hạt Rễ đậu tương là rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên rễ có

nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định đạm

của không khí tạo thành đạm dễ tiêu [4] Các công trình nghiên cứu cho thấy những giống có khả năng cộng sinh và có đủ nốt sần thường làm cho hàm lượng protein cao, cho nên trồng cây đậu tương có tác dụng cải tạo đất Thân cây đậu tương là thân thảo, ít phân cành dạng bụi, lá đậu tương là lá kép với 3

lá chét, nhưng đôi khi cũng có 4-5 lá chét Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt hoặc trắng, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn, quả đậu tương thuộc loại quả ráp, thẳng hoặc hơi cong, có nhiều lông khi chín có màu vàng hoặc xám Hạt đậu tương không có nội nhũ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

5

mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn Hạt có hình tròn hoặc bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen đa số là hạt màu vàng Khối lượng hạt rất đa dạng dao động từ 20-400 mg/ hạt Màu sắc rốn hạt ở các giống là khác nhau, đây là một biểu hiện đặc trưng của giống Cây đậu tương có 2 loại hình sinh trưởng: sinh trưởng hữu hạn và sinh trưởng vô hạn, thời gian sinh trưởng thường chia ra nhóm chín sớm, trung bình và muộn

Theo thời gian sinh trưởng, các nhà chọn giống đậu tương cho rằng các giống chín rất sớm (75-90 ngày), các giống chín sớm (90-100 ngày), các giống chín trung bình (100-110 ngày), loại chín muộn trung bình (110-120 ngày), các giống chín muộn (130-140 ngày), các giống chín rất muộn (140-

150 ngày) thời gian sinh trưởng là một yếu tố rất quan trọng để lựa chọn cây trồng luân canh xen vụ Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh Trong tập đoàn giống đậu tương có những giống chỉ trồng vào vụ

hè, có những giống chỉ trồng vào vụ đông, có những giống trồng ở vụ xuân hè

và có những giống trồng thích hợp với vụ thu đông [9]

Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu

về nước cao hơn các loại cây khác và thuộc nhóm cây chịu hạn kém Đó là do trong hạt và cây đậu tương có hàm lượng protein và lipit rất cao, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500 – 530 kg nước, trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của cây đậu tương cũng khá cao 50%, trong khi đó ở ngô chỉ là 30%, lúa là 20% [9]

Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong tự nhiên dẫn đến tình trạng thiếu nước đặc biệt đối với thực vật Khái niệm về hạn được dùng để chỉ

sự thiếu nước do môi trường gây nên trong suốt quá trình hay trong từng giai đoạn làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối ổn định

trong điều kiện khô hạn được gọi là cây chịu hạn Khi nghiên cứu về đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương diện sinh lý và di truyền đã cho thấy rằng các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hóa keo của chất nguyên sinh, đặc điểm của quá trình trao đổi chất Tính chịu hạn của cây đậu tương là tính trạng đa gen Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau: như

sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tương đối, cũng như bản chất di truyền của từng giống có khả năng sử dụng nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Căn cứ vào đặc điểm này, đậu tương được chia thành hai nhóm:

- Nhóm chịu được mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây

- Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả các giai đoạn phát triển của cây

1.2 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG

1.2.1 Cơ sở khoa học của chọn dòng tế bào soma

Cơ sở khoa học đầu tiên của chọn dòng tế bào thực vật là tính toàn năng của tế bào thực vật Mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều là

khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Điều này đã được các nhà khoa học chứng minh qua nhiều thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn các tế bào không đồng nhất Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem như quần thể thực vật mà ở đó cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện thay đổi ở mức độ cơ thể Những biến đổi di truyền tự phát xảy ra trong quá trình nuôi cấy mô tế bào được Larkin và Scowcroft (1982) gọi là ―biến di sinh dưỡng‖ hay ―biến dị soma‖ Giải thích về sự xuất hiện biến dị soma trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

7

điều kiện in vitro có rất nhiều ý kiến khác nhau Theo Skirvin và CS (1994),

sự xuất hiện biến dị soma có thể là sự rối loạn trong phân bào nguyên nhiễm gây ra bởi các chất kích thích sinh trưởng hoặc sự có mặt của một số chất trong môi trường nuôi cấy Sự hình thành biến dị soma cũng có thể là do đột biến về số lượng hoặc cấu trúc nhiễm sắc thể, sự tái tổ hợp trong phân bào nguyên nhiễm[13], sự phát huy tác dụng của các yếu tố di truyền vận động, sự methyl hóa ADN…[1] Các loại mô đã phân hóa tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây, ngoài ra chúng có khả năng phát triển trực tiếp từ tế bào mô sẹo (callus)

Trong các phương thức nuôi cấy phổ biến hiện nay thì nuôi cấy mô sẹo được nghiên cứu trên nhiều đối tượng hơn cả Mô sẹo là loại tế bào chưa phân hóa, phân chia liên tục, có khả năng phân hóa thành phôi, chồi và cây

hoàn chỉnh Mô sẹo được hình thành qua nuôi cấy in vitro từ các cơ quan sinh

dưỡng của thực vật Trong môi trường chứa chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin, điều kiện nuôi cấy thích hợp mô sẹo có thể hình thành và duy trì thông qua cấy chuyển và tái sinh Các mô sẹo sau khi xử lý bởi điều kiện cực đoan thì khả năng sinh trưởng và tái sinh cây tăng lên rõ rệt [35] Nhiều nghiên cứu cho thấy, cây tái sinh từ mô sẹo có những biến đổi di truyền phong phú [16] Tuy nhiên, với mỗi loại cây nhất thiết phải nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy tối

ưu thích hợp cho việc đánh giá hoặc tái sinh cây Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới khả năng tái sinh của cây như nguồn gốc mô sẹo [23], mức bội thể của mô sẹo, thành phần và nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Theo Lê Trần Bình và CS (1995) dưới tách động của điều kiện cực đoan ở một mức độ và thời gian nhất định những mô hay tế bào thường chết, những tế bào có sức sống mới sống sót và cho hiệu quả tái sinh cao [3] Để đạt được hiệu quả trong chọn dòng bằng nuôi cấy mô sẹo người ta phải sử dụng các khối mô có kích thước nhỏ và đều nhau nhằm

hạn chế sự chọn lọc không triệt để do kích thước lớn và không đồng nhất của khối mô sẹo ban đầu

1.2.2 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

Hiện nay người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất kích thích sinh trưởng ở thực vật đó là: auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, absixic acid Những chất này được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo lẫn nhau Còn là một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất định Trong nuôi cấy mô người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều hòa sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin

Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh

lý học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất Auxin là những hoocmon thực vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan, kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng

tế bào Chính chức năng này đã được người ta sử dụng và đánh giá hoạt tính của nó, ví dụ bằng cách đo phần kéo dài lá mầm cây yến mạch trồng trong điều kiện tối sẽ biết được hoạt tính của auxin Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxyacetic acid (2,4-D), α - Naphtylacetic acid (α-NAA), Indolacetic acid (IAA), trong đó 2,4- D dễ gây độc nhưng có tác dụng kích thích quá trình phân chia tế bào nên thường được sử dụng nhiều nhất [16] α -NAA có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính của enzym và ảnh hưởng mạnh đến quá trình trao đổi nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng các chất trong môi trường, α-NAA có tác dụng tạo rễ cho cây non mạnh hơn các auxin khác [16]

Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua nghiên cứu bệnh lúa von,

nó tác động làm tế bào dãn và phân chia, làm cây lùn có thể cao được như

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

9

ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng Đại diện cho nhóm này là giberilic acid (GA3), chất này được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp

Nhóm cytokinin là nhóm chất kích thích sinh trưởng có tác dụng làm tăng phân chia tế bào Các cytokinin chính được dùng trong nuôi cấy mô là kinetin và 6- benzyl aminopurin (BAP) được phát hiện trong những nghiên cứu liên quan đến nuôi cấy mô

Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển nhưng gần đây chúng mới được coi là hoocmon thực vật Ethylen thường được sử dụng để làm quả chín đồng loạt ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, ảnh hưởng đến quá trình phân bào [16]

Abscisis acid (ABA) thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng, có tác dụng làm tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi [16], vì vậy ABA được đưa vào môi trường tái sinh cây và mang lại hiệu quả nhất định

1.2.3 Hệ thống nuôi cấy để chọn dòng tế bào có khả năng chống chịu

Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật chọn dòng tế bào thực vật là hiện tượng các tế bào thực vật khi được nuôi cấy ở tế bào mô sẹo trong điều kiện

in vitro chúng thường có những biến đổi di truyền tự phát, được gọi chúng là

biến dị của tế bào soma (biến dị soma) Xử lý mô sẹo bằng các tác nhân phi sinh học trong điều kiện phòng thí nghiệm cho phép chọn ra những dòng tế bào thích hợp theo định hướng chọn lọc Tuy vậy, đối với mỗi loài thực vật người ta phải nghiên cứu trạng thái nuôi cấy thích hợp cho việc chọn dòng Đến nay đối với chọn dòng tế bào chịu stress ở một số loài thực vật như lúa, lạc, đậu, ngô người ta đã sử dụng một số hệ thống nuôi cấy sau đây:

Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo là khối các tế bào mô mền có cấu trúc

thấp, chưa phân hóa, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di

truyền cao Mô sẹo thu được bằng nuôi cấy in vitro những cơ quan bộ phận

khác nhau của thực vật như thân, lá, rễ, hoa .trong môi trường chứa chất điều hòa sinh trưởng là nhóm auxin và điều kiện nuôi cấy thích hợp Mô sẹo có thể duy trì trong môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển có định

kỳ, tuy nhiên trong thực nghiệm thấy rằng: i) mô sẹo qua cấy chuyển nhiều lần có ảnh hưởng không tốt đến khả năng tái sinh cây; ii) tăng tính biến động di truyền của mô

Các tế bào di truyền có tính ổn định di truyền khá thấp Nhiều tác giả

đã công bố nhận được cây tái sinh từ mô sẹo thông qua nhiều lần cấy chuyển

có sự thay đổi nhiễm sắc thể (dị bội, đa bội) và những biến đổi di truyền khác

Vì vậy việc nhân nhanh và duy trì tính đồng nhất di truyền thông qua nuôi cấy

mô sẹo cần thận trọng đối với nhiều loại thực vật và nhất là chỉ sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh cây hoàn chỉnh thông qua con đường tạo phôi vô tính Mặt khác những cây tái sinh từ mô sẹo với những biến đổi di truyền phong phú lại có ý nghĩa trong việc chọn giống và như vậy vật liệu di truyền của cây trở lên phong phú hơn (Lê Trần Bình và CS) [1] [2] [3], (Bùi Bảo Hoàn) [6]

Nuôi cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù là nuôi cấy tế

bào đơn (single cell) hoặc cụm nhỏ tế bào (cell agregate) trong môi trường lỏng Các tế bào này cũng được tạo ra từ mô sẹo có nguồn gốc thân, lá, rễ, hoa, phôi…Muốn thu được những tế bào huyền phù nhỏ, cần sàng lọc liên tục qua các loại sàng có mắt lọc nhỏ (< 0,5 mm) Để đạt được nuôi cấy huyền phù tương đối đều nhau cần phải sàng lọc ít nhất hàng chục lần, như vậy thời gian cần thiết để thiết lập được môi trường nuôi cấy huyền phù ít nhất là 2-3 tháng Đây là điều trở ngại trong nghiên cứu với thực vật vì thời gian nuôi cấy dài các tế bào huyền phù sẽ mất khả năng tái sinh cây Lúc đó việc chọn dòng sẽ gặp khó khăn để ứng dụng cho thực tiễn tạo giống Vì vậy chỉ trong trường

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read

data error !!! can't not

read