Luận văn Y tế: Liên quan giữa hình thái noãn với kết quả thụ tinh và hình thái phôi trong kỹ thuật ICSI

Bài luận văn thạc sỹ Y tế gồm 98 trang, bản đẹp, dễ dàng chỉnh sửa và tách trang làm tài liệu tham khảo. Mục lục đặt vấn đề 1 chương 1: tổng quan 3 1.1. Sự sỉnhnoãn 3 1.1.1. Các giai đoạn pháttriển của tế bảo dòng noãn 3 1.1.2. Các giai đoạn pháttriển của nang tnìng 5 1.1.3. Sự phóng noãn 6 1.2. Hình thái noãn trước ic siivf 7 1.2.1. Đánh giá tiưởng thành về nhân 7 1.2.2. Đánh giá các yếutố ngoải bão tưong noãn 7 1.2.3. Đánh giá các yếutố trong bão tưong noãn 9 1.3. Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bảo tưong noãn 11 1.3.1. Lịch sử pháttriển kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bảo tưong noãn 1 1 1.3.2. Quá trình thụ tinh diễn ra trong icsi 12 1.3.3. Đánh giá thụ tinh trong icsi 13 1.4. Sự phát triển của phôi ttton 14 1.4.1. Sự pháttriển của phôi tiền 1ảm tổ 14 1.4.2. Đánh giá hình thái phôi giai đoạn phân cắt 15 1.5. Liên quan giữa hình thái noãn với kết quả ttton 17 1.5.1. Liên quan hình thái mảng trong suốt với kết quả ttton 17 1.5.2. Liên quan hình thái khoãng quanh noãn với kết quả ttton 1 9 1.5.3. Liên quan hình thái hình thái thể cực thứ nhất với kết quả ttton 20 1.5.4. Liên quan hình thái bảo tương noãn với kết quả ttton: 21 chương 2: đối tượng và phương pháp nghiên cứu 23 2.1. Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.1. Tiêu chuẩn 1ụa chọn đối tượng 23 2.1.2. Tiêu chuẩn10ạỉt1ừ 23 2.1.3. Số1ượng đối tượng 23 2.2. Phương pháp nghiến cứu và thu thập số hệu 24 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu 24 2.22 phương pháp tiến hành và thu thập số hệu 24 2.2.3. Đánh giá thụ tỉnh và hình thái phôi 30 2.3. Các chỉ số nghiên cứu 30 2.3.1. Các chỉ số về đặc điểm mẫu nghiến cúu3o 2.3.2. Các chỉ số về kết quả thụ tinh và phân10ạỉ phôi 31 2.3.3. Các tiếu chuẩn đánh giá sử dụng trong nghiến cứu 31 2.4. Nhập và xử 1ý số hệu 35 2.4.1. Nhập số hệu 35 2.4.2. Xú: 1ý số hệu 35 2.4.3. Sai số trong nghiến cứu 35 2.5. Đạo đức nghiến cứu 36 chương 3: kết quả nghiên cứu 37 3.1. Đặc điểm đối tượng nghiến cứu 37 3.1.1. Kích thước trung bình noãn 37 3.1.2. Các đặc điểm hình thái noãn theo phân độ vsrm 38 3.1.3. Đặc điểm kết quả thụ tinh phôi 44 3.2. Liên quan giữa đặc điểm hình thái noãn và kết quả thụ tỉnh 47 3.2.1. Liên quan hình thái mảng trong suốt và kết quả thụ tính: 47 3.2.2. Liên quan hình thái khoãng quanh noãn và kết quả thụ tính: 48 3.2.3. Liên quan hình thái thế cục thứ nhất và kết quả thụ tỉnh: 49 3.2.4. Liên quan hình thái bão tuong, các báo quan và kết quả thụ tỉnh 50 3.3. Liên quan giữa đặc điểm hình thái noãn và hình thái phối 53 3.3.1. Liên quan hình thái mảng trong suốt và hình thái phối 53 3.3.2. Liên quan hình thái khoãng quanh noãn và hình thái phối 54 3.3.3. Liên quan hình thái thế cục thứ nhất và hình thái phôi 55 3.3.4. Liên quan hình thái bão tuong các báo quan và hình thái phối 55 chương 4: bàn luận 57 4.1. Bản iuận theo đặc điểm đối tượng nghiến cứu 57 4.1.1. Kích thước trung bình noãn 57 4.1.2. Phân bổ đặc điếm hình thái noãn 59 4.1.3. Đặc điếm kết quả thụ tinh tạc phôi 65 4.2. Bản iuận theo mỗi hến quan đặc điểm hình thái noãn với kết quả thụ tỉnh 67 4.2.1. Liên quan hình thái mảng trong suốt và kết quả thụ tỉnh 67 4.2.2. Liên quan hình thái khoãng quanh noãn và kết quả thụ tỉnh 68 4.2.3. Liên quan hình thái thế cục thứ nhất và kết quả thụ tính 69 4.2.4. Liên quan hình thái bão tuong, báo quan và kết quả thụ tỉnh 70 4.3. Bấn 1uận theo mỗi hến quan đặc điếm hình thái noãn với hình thái phôi 73 4.3.1. Liên quan hình thái mảng trong suốt với hình thái phối 73 4.3.2. Liên quan hình thái khoãng quanh noãn với hình thái phối 73 4.3.3. Liên quan hình thái thể cực thứ nhất với hình thái phôi 74 4.3.4. Liên quan hình thái bảo tương, các báo quan với hình thái phôi 75 kết luận 78 kiến nghị 80 tài liệu tham khảo phụ lục

FSH : Follicle Stimulating Hormon

Hormon kích nang trứng hCG : Human Chorionic Gonadotropin

ICSI : IntraCytoplasmic Sperm Injection

Tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn IVF : In-Vitro Fertiliztion

Thụ tinh trong ống nghiệm

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Sự sinh noãn 3

1.1.1 Các giai đoạn phát triển của tế bào dòng noãn 3

1.1.2 Các giai đoạn phát triển của nang trứng 5

1.1.3 Sự phóng noãn 6

1.2 Hình thái noãn trước ICSI/IVF 7

1.2.1 Đánh giá trưởng thành về nhân 7

1.2.2 Đánh giá các yếu tố ngoài bào tương noãn 7

1.2.3 Đánh giá các yếu tố trong bào tương noãn 9

1.3 Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn 11

1.3.1 Lịch sử phát triển kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn11

1.3.2 Quá trình thụ tinh diễn ra trong ICSI 12

1.3.3 Đánh giá thụ tinh trong ICSI 13

1.4 Sự phát triển của phôi TTTON 14

1.4.1 Sự phát triển của phôi tiền làm tổ 14

1.4.2 Đánh giá hình thái phôi giai đoạn phân cắt 15

1.5 Liên quan giữa hình thái noãn với kết quả TTTON 17

1.5.1 Liên quan hình thái màng trong suốt với kết quả TTTON 171.5.2 Liên quan hình thái khoảng quanh noãn với kết quả TTTON19

1.5.3 Liên quan hình thái hình thái thể cực thứ nhất với kết quả TTTON 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng 23

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 23

2.1.3 Số lượng đối tượng 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu và thu thập số liệu 24

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 24

2.2.2 Phương pháp tiến hành và thu thập số liệu 24

2.2.3 Đánh giá thụ tinh và hình thái phôi 30

2.3 Các chỉ số nghiên cứu 30

2.3.1 Các chỉ số về đặc điểm mẫu nghiên cứu 30

2.3.2 Các chỉ số về kết quả thụ tinh và phân loại phôi 31

2.3.3 Các tiêu chuẩn đánh giá sử dụng trong nghiên cứu 31

2.4 Nhập và xử lý số liệu 35

2.4.1 Nhập số liệu 35

2.4.2 Xử lý số liệu 35

2.4.3 Sai số trong nghiên cứu 35

2.5 Đạo đức nghiên cứu 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 37

3.1.1 Kích thước trung bình noãn 37

3.1.2 Các đặc điểm hình thái noãn theo phân độ VSRM 38

3.1.3 Đặc điểm kết quả thụ tinh - phôi 44

3.2 Liên quan giữa đặc điểm hình thái noãn và kết quả thụ tinh 473.2.1 Liên quan hình thái màng trong suốt và kết quả thụ tinh: 47

3.2.3 Liên quan hình thái thể cực thứ nhất và kết quả thụ tinh: 493.2.4 Liên quan hình thái bào tương, các bào quan và kết quả thụ tinh50

3.3 Liên quan giữa đặc điểm hình thái noãn và hình thái phôi 53

3.3.1 Liên quan hình thái màng trong suốt và hình thái phôi 533.3.2 Liên quan hình thái khoảng quanh noãn và hình thái phôi 543.3.3 Liên quan hình thái thể cực thứ nhất và hình thái phôi 553.3.4 Liên quan hình thái bào tương các bào quan và hình thái phôi55

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 57

4.1 Bàn luận theo đặc điểm đối tượng nghiên cứu 57

4.1.1 Kích thước trung bình noãn 57

4.1.2 Phân bố đặc điểm hình thái noãn 59

4.1.3 Đặc điểm kết quả thụ tinh- tạo phôi 65

4.2 Bàn luận theo mối liên quan đặc điểm hình thái noãn với kết quả thụ tinh 67

4.2.1 Liên quan hình thái màng trong suốt và kết quả thụ tinh 674.2.2 Liên quan hình thái khoảng quanh noãn và kết quả thụ tinh 684.2.3 Liên quan hình thái thể cực thứ nhất và kết quả thụ tinh 694.2.4 Liên quan hình thái bào tương, bào quan và kết quả thụ tinh70

4.3 Bàn luận theo mối liên quan đặc điểm hình thái noãn với hình thái phôi

73

4.3.1 Liên quan hình thái màng trong suốt với hình thái phôi 734.3.2 Liên quan hình thái khoảng quanh noãn với hình thái phôi 73

Bảng 1.1 Liên quan giữa hình thái màng trong suốt và kết quả TTTON

17Bảng 1.2 Liên quan giữa hình thái khoảng quanh noãn và kết quả

Bảng 1.3 Liên quan giữa hình thái thể cực thứ nhất và kết quả TTTON

20Bảng 1.4 Liên quan giữa hình thái bào tương noãn và kết quả TTTON

21Bảng 2.1 Các tiêu chuẩn đánh giá hình thái yếu tố ngoài bào tương noãn

32Bảng 2.2 Các tiêu chuẩn đánh giá hình thái yếu tố trong bào tương noãn

33Bảng 2.3 Các tiêu chuẩn đánh giá thụ tinh 34

Bảng 2.4 Các tiêu chuẩn đánh giá hình thái phôi ngày 2 34

Bảng 2.5 Tiêu chuẩn đánh giá tinh dịch đồ 35

Bảng 3.1 Các kích thước trung bình noãn 37

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái noãn theo phân độ VSRM 38

Bảng 3.3 Liên quan hình thái màng trong suốt và kết quả thụ tinh 47Bảng 3.4 Liên quan hình thái khoảng quanh noãn và kết quả thụ tinh

48Bảng 3.5 Yếu tố nguy cơ độ rộng khoảng quanh noãn đến thoái hóa sau

ICSI 49Bảng 3.6 Liên quan thể cực thứ nhất và kết quả thụ tinh 49

Bảng 3.9 Liên quan hình thái màng trong suốt và hình thái phôi 53Bảng 3.10 Liên quan hình thái khoảng quanh noãn và hình thái phôi 54Bảng 3.11 Liên quan hình thái thể cực thứ nhất và hình thái phôi 55Bảng 3.12 Liên hình thái bào tương và hình thái phôi 55

Bảng 3.13 Liên quan giữa các bào quan với hình thái phôi 56

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ thụ tinh và tạo phôi 44Biểu đồ 3.2 Kết quả thụ tinh 45Biểu đồ 3.3 Đặc điểm phân loại phôi 46

Hình 1.1 Sự hình thành và phát triển của noãn 4

Hình 1.2 Các giai đoạn phát triển của nang trứng 6

Hình 1.3 Phân loại noãn theo sự trưởng thành về nhân 7

Hình 1.4 Phân loại hình thái màng trong suốt 8

Hình 1.5 Phân loại hình thái khoảng quanh noãn 8

Hình 1.6 Phân loại hình thái thể cực thứ nhất 9

Hình 1.7 Phân loại độ mịn bào tương noãn 9

Hình 1.8 Phân loại hình thái thể vùi 10

Hình 1.9 Phân loại hình thái không bào 10

Hình 1.10 Phân loại hình thái lưới nội bào không hạt 11

Hình 1.11 Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn 11

Hình 1.12 Hình thái thụ tinh của hợp tử 13

Hình 1.13 Các giai đoạn phát triển của phôi 15

Hình 1.14 Độ đồng đều của phôi bào 16

Hình 1.15 Phân loại mảnh vỡ bào tương phôi 16

Hình 2.1 Hệ thống kính hiến vi đảo ngược có camera kết nối máy tính

26Hình 2.2 Thước đo chuẩn và hiệu chỉnh thước đo của camera ở vật kính

20X 27Hình 2.3 Đo độ dầy màng trong suốt 28

Hình 2.4 Đo kích thước khoảng quanh noãn 29

Hình 2.5 Đo thể cực thứ nhất, đường kính noãn 30

Hình 3.1 Phân loại hình thái màng trong suốt 39

Hình 3.4 Phân loại thái bào tương theo độ mịn 41

Hình 3.5 Phân loại hình thái thể vùi 42

Hình 3.6 Phân loại hình thái không bào 43

Hình 3.7 Phân loại hình thái lưới nội chất trơn 44

Hình 3.8 Hình thái thụ tinh 45

Hình 3.9 Hình thái phôi ngày 2 46

Hình 3.10 Hình thái độ đàn hồi màng bào tương51

ĐẶT VẤN ĐỀ

Noãn có vai trò quan trọng trong sự hình thành và phát triển của phôi

Sự hình thành và phát triển của noãn chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố vi môitrường do buồng trứng và nang trứng tiết ra [1],[2] Trong chu kỳ tự nhiên,phần lớn các nang trứng thoái triển, chỉ có một nang trứng được chọn lọc pháttriển vượt trội và gây phóng noãn hàng tháng Chính vì thế, việc sử dụng cácthuốc nội tiết để kích thích buồng trứng gây trưởng thành nhiều nang trứngthay vì bị thoái triển có thể ảnh hưởng tới chất lượng noãn [3]

Chất lượng noãn được đánh giá trên nhiều khía cạnh: hình thái, cấu trúc

di truyền, cấu trúc phân tử, sự chuyển hóa… Để đánh giá các khía cạnh ditruyền, phân tử, chuyển hóa đòi hỏi phải có phương tiện hỗ trợ phức tạp vàcan thiệp sâu vào noãn, nên mới chỉ được thực hiện trên mô hình động vật.Tại các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) việc đánh giá chấtlượng noãn chủ yếu dựa trên hình thái được quan sát trên kính hiển vi quanghọc, không can thiệp không ảnh hưởng tới noãn

Trong kỹ thuật IVF cổ điển, việc đánh giá hình thái noãn gặp nhiều khókhăn do có sự bao phủ của tế bào hạt quanh noãn Năm 1992, với sự ra đờicủa kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (Intra cytoplasmic sperminjection - ICSI), nhờ tách bỏ tế bào hạt mà nhiều yếu tố hình thái noãn đượcđánh giá chi tiết hơn: sự trưởng thành của nhân, bào quan, hình thái màngtrong suốt, thể cực thứ nhất, thoi vô sắc… Cùng trong năm này, lần đầu tiênVan Blerkom và Henry đề cập tới khái niệm “cytoplasmic dysmorphisms” -những mô tả bất thường về bào tương hoặc một số khiếm khuyết của hình tháinoãn Những bất thường xuất hiện sớm trong quá trình trưởng thành của noãn

có thể gây thất bại thụ tinh và liên quan đến dị bội thể, trong khi những bấtthường xuất hiện muộn hơn gây ảnh hưởng tới sự phát triển tiếp theo của phôicho dù thụ tinh diễn ra bình thường [4],[5],[6]

Các bất thường của noãn được phân loại thành nhóm bất thường trongbào tương noãn như: sự thay đổi mật độ hạt của bào tương, xuất hiện các dạngthể vùi, thoi vô sắc…; và các bất thường ngoài bào tương: hình thái thể cựcthứ nhất, màng trong suốt, khoảng quanh noãn [5] Hơn 50% số noãn thuđược sau chu kỳ kích thích buồng trứng có 1 hoặc nhiều hơn các đặc điểm bấtthường, tuy nhiên cơ chế gây ra những đặc điểm này vẫn chưa thực sự sáng tỏ[7] Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm tìm ra mối liên quan giữa đặcđiểm hình thái noãn với kết quả thụ tinh, hình thái phôi cũng như tiên lượngkhả năng có thai, nhưng kết quả hiện vẫn còn gây nhiều tranh cãi [8].

Tại Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của hìnhthái noãn đến kết quả TTTON; việc lựa chọn phôi chuyển chủ yếu vẫn dựatrên các đặc điểm hình thái của phôi, mà chưa quan tâm nhiều đến nguồn gốc

của noãn Chính vì thế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với đề tài: “Liên quan giữa hình thái noãn với kết quả thụ tinh và hình thái phôi trong kỹ thuật ICSI” Đề tài có các mục tiêu:

1 Mô tả hình thái noãn trưởng thành trước ICSI.

2 Đánh giá mối liên quan giữa hình thái noãn trưởng thành với kết quả thụ tinh và hình thái phôi ngày 2.

Chương 1TỔNG QUAN

1.1 Sự sinh noãn

1.1.1 Các giai đoạn phát triển của tế bào dòng noãn

Noãn nguyên bào:

Vào cuối tuần thứ 3 của phôi, các tế bào sinh dục nguyên thủy đượchình thành trên thành túi noãn hoàng, sau đó di cư theo mạc treo ruột lưngđến mầm tuyến sinh dục, trên đường đi nó nguyên phân liên tục tăng nhanh

về số lượng Tới tuần thứ 6, tế bào sinh dục nguyên thủy trở thành noãnnguyên bào, tiếp tục nguyên phân tích cực, một số noãn nguyên bào bắt đầubiệt hóa thành noãn bào 1

Noãn bào 1:

Từ tháng thứ 3 - 5 của thai kỳ, noãn nguyên bào bắt đầu quá trình giảmphân, nhưng dừng lại ở cuổi kỳ đầu của lần phân chia thứ nhất, tạo thành noãnbào 1, còn gọi là noãn sơ cấp giai đoạn GV (Germinal Vesicle) chứa bộ NST2n, màng nhân vẫn còn Từ khi sinh ra tới trước khi dậy thì, buồng trứng bégái chỉ chứa toàn noãn bào 1

Noãn bào 2:

Sau khi có đỉnh LH vào mỗi chu kỳ kinh, noãn bào 1 chứa trong nang

trứng chín (nang de Graff) mới bắt đầu quá trình trưởng thành, bao gồm sự

trưởng thành về nhân và bào quan noãn

Sự trưởng thành về nhân đánh dấu bằng việc noãn bào 1 hoàn thành lầnphân chia thứ nhất của quá trình giảm phân, bộ NST được chia đôi, kết quảsinh ra 2 tế bào chứa bộ NST đơn bội: 1 lớn chứa phần lớn bào tương và toàn

bộ bào quan có chức năng sinh dục, 1 nhỏ gọi là thể cực thứ nhất; noãn nàyđược là noãn bào 2 hay noãn MII [9]

Sự trưởng thành của các bào quan thể hiện trong việc thay đổi và sắpxếp lại của một số bào quan trong bào tương noãn như: bộ khung tế bào, lớphạt vỏ, lưới nội bào; tổng hợp và điều chỉnh protein và ARN thông tin, táihoạt hóa các phản ứng hóa sinh và phản ứng phân tử nhằm cung cấp chất liệucần thiết cho thụ tinh, sự phát triển và làm tổ của phôi [2]

Sự trưởng thành về nhân và bào quan phải diễn ra đồng bộ mới đảmbảo khả năng thụ tinh của noãn, cũng như phát triển của phôi sau này

Noãn bào 2 tiếp tục quá trình phân bào giảm nhiễm nhưng dừng lại ởbiến kỳ 2 cho đến khi được thụ tinh, quá trình giảm phân mới hoàn thành, giảiphóng ra thể cực thứ 2 [9]

Hình 1.1 Sự hình thành và phát triển của noãn [9]

1.1.2 Các giai đoạn phát triển của nang trứng

Nang trứng là túi chứa noãn tập trung ở vùng vỏ, giữa tổ chức liên kếtdưới màng trắng Trong buồng trứng có thể thấy nang trứng ở tất cả các giaiđoạn phát triển

 Nang trứng chưa phát triển:

Là các nang trứng nguyên thủy có kích thước 40 µm chiếm 90 - 95%tổng số nang của buồng trứng, được tạo thành tại vỏ buồng trứng khi thaiđược 6 - 9 tháng Số lượng nang trứng nguyên thủy giảm nhanh từ sau khisinh (khoảng 2 triệu nang) đến lúc dậy thì (còn khoảng 300 nghìn nang), đếnkhi mãn kinh khó tìm thấy nang trứng nguyên thủy trong buồng trứng

 Nang trứng phát triển:

Chỉ từ khi dậy thì đến khi mãn kinh, trong buồng trứng mới thấy nhữngnang trứng đang phát triển bao gồm: các nang trứng nguyên phát, nang trứngđặc, nang trứng có hốc, nang trứng có hốc điển hình, nang trứng chín

Sự phát triển của nang trứng bao gồm những sự kiện chính: (1) sự tăngsinh và biến đổi về hình thái, chức năng của tế bào hạt bao quanh nang trứng;(2) sự hình thành màng trong suốt do chế tiết của tế bào hạt và noãn bào 1; (3)

sự hình thành và tăng nhanh kích thước dịch hốc nang, từ đó nang trứng tăngnhanh kích thước từ 40 µm đến 20 mm [9]

Nang trứng có vai trò rất quang trọng trong sự phát triển của noãn.Nang trứng cung cấp các yếu tố vi môi trường, các tín hiệu phân tử hóa họckích thích sự tăng trưởng của noãn bào 1, đồng thời điều khiển sự trưởngthành của noãn: (1) duy trì tình trạng ngừng phân bào của noãn trong suốt thời

kỳ phát triển của nang trứng, (2) tái khởi động quá trình phân bào giảm nhiễmcủa noãn ở nang trứng chín, (3) hỗ trợ cho sự trưởng thành của các bào quantrong noãn [10],[11]

Hình 1.2 Các giai đoạn phát triển của nang trứng [2]

1.1.3 Sự phóng noãn

Một chu kỳ phát triển của nang trứng bao gồm chuỗi các sự kiện diễn

ra một cách có trật tự: sự chiêu mộ các nang trứng, sự chọn lọc các nangtrứng, sự vượt trội của một nang trứng, trưởng thành và phóng noãn

Sự chiêu mộ sơ cấp diễn ra liên tục từ thai nhi đến hết đời sống sinh sảncủa người phụ nữ, cơ chế hiện chưa được biết rõ Sau đó, vào đầu mỗi chu kỳkinh, trong số các nang đã được chiêu mộ sơ cấp sẽ có một vài nang tiếp tụcđược chiêu mộ thứ cấp, được chọn lọc phát triển tiếp Sự phát triển này phụthuộc vào hormone FSH và LH

Khoảng giữa chu kỳ kinh, thường chỉ có một nang duy nhất phát triểnvượt trội và phóng noãn, những nang còn lại thoái triển Sự phóng noãn diễn

ra do tác dụng của đỉnh LH [12]

1.2 Hình thái noãn trước ICSI/IVF

Một số trung tâm trên thế giới cũng xây dựng hệ thống thang điểmriêng để đánh giá noãn/ phôi Nhằm mục đích thống nhất về thuật ngữ và đưa

ra một đồng thuận chung cho đánh giá hình thái noãn/ phôi, hội nghị quốc tế

do tổ chức Alpha và hiệp hội các nhà phôi học ESHRE diễn ra vào ngày 26

-27 tháng 2 năm 2010 tại Istabul, Thổ Nhĩ Kỳ Dựa trên đồng thuận Alpha vàESHRE, tháng 12/2012 chi hội Y học sinh sản Việt Nam (VSRM) đã banhành "Đồng thuận đánh giá và phân loại noãn, phôi trong hỗ trợ sinh sản"[13],[14]

1.2.1 Đánh giá trưởng thành về nhân

Thông thường, noãn trưởng thành về nhân - noãn MII khi có xuất hiệnthể cực thứ nhất ở khoảng quanh noãn và không còn nhân Noãn chưa trưởngthành ở giai đoạn GV khi thấy túi nhân vẫn còn và có một hạt nhân, hoặcnoãn MI khi không có túi nhân và cũng không có thể cực thứ nhất (chi tiếtxem trang 25)

A: noãn MII với thể cực ở vị trí 12 giờ B: Noãn GV với túi nhân C: Noãn MI

Hình 1.3 Phân loại noãn theo sự trưởng thành về nhân [5]

1.2.2 Đánh giá các yếu tố ngoài bào tương noãn

Màng trong suốt: là cấu trúc đặc biệt bao quanh ngoài noãn, hình thành

do sự chế tiết của cả noãn bào và tế bào hạt Màng trong suốt có thể dao động

từ 10 µm đến 30 µm, trung bình 13 - 15µm Tính chất màng trong suốt rất đadạng về hình dạng, màu sắc, độ dày, được chia thành 4 thang điểm từ 1 đến 4theo VSRM (chi tiết xem trang 25)

ZP1: màu sắc, kích thước bình thường ZP2: Màng mỏng ZP3: màng dày ZP4: màng trong suốt sẫm màu

Hình 1.4 Phân loại hình thái màng trong suốt [5].

Khoảng quanh noãn: Là khoảng không bao quanh noãn được giới hạn

bởi màng trong suốt và màng bào tương noãn Độ rộng của khoảng quanh noãn

có liên quan tới độ trưởng thành của noãn Ở noãn bào 1, khoảng quanh noãnrất hẹp và bắt đầu tăng kích thước khi noãn tái khởi động quá trình giảm phân.Khoảng quanh noãn có độ rộng hẹp khác nhau, có thể xuất hiện hạt trongkhoảng quanh noãn, nguồn gốc của hạt chưa rõ ràng Theo độ rộng và sự xuấthiện hạt, hình thái khoảng quanh noãn chia thành 4 độ (chi tiết trang 25)

PVS 1: độ rộng bình thường PVS 2: rộng 1 phần chu vi noãn PVS 3: rộng toàn bộ PVS 4: có hạt

Hình 1.5 Phân loại hình thái khoảng quanh noãn [5]

Thể cực thứ nhất: Sự xuất hiện của thể cực thứ nhất ở khoảng quanh

noãn là dấu hiệu cho thấy noãn trưởng thành về nhân Vào năm 1995,Eichenlaub và cộng sự đã đưa ra giả thuyết hình thái thể cực thứ nhất có thểphản ánh thời gian tồn tại của noãn sau khi phóng noãn, thể cực thứ nhất phânmảnh có thể do noãn quá trưởng thành [15] Hình thái thể cực thứ nhất đượcđánh giá dựa trên các tiêu chí: hình dạng (tròn, bầu dục), kích thước (to, nhỏ),

bề mặt (trơn, nhám) và sự nguyên vẹn, chia thành 4 thang điểm từ 1 đến 4theo phân độ của VSRM (chi tiết trang 25)

Độ đàn hồi màng bào tương: độ đàn hồi của màng bào tương noãn có thể

được xác định khi đâm kim ICSI vào bào tương noãn Có 3 cách vỡ của màngbào tương noãn thường gặp: (1) ngay khi tiêm màng bào tương không hìnhthành dạng nón mà vỡ đột ngột, không thể phục hồi; (2) màng bào tương vỡ bìnhthường, quá trình xâm nhập của kim ICSI bình thường có hình thành dạng nón,màng bào tương vỡ tại trung tâm của noãn; (3) và màng bào tương dai, khó đâmkim vào, khi rút kim bào tương noãn kéo theo kim, biến dạng hình nón [14]

PB 1: nguyên vẹn, bề mặt trơn PB 2: nguyên vẹn, bề mặt nhám PB 3: Phân mảnh PB4 : thể cực to

Hình 1.6 Phân loại hình thái thể cực thứ nhất [5]

1.2.3 Đánh giá các yếu tố trong bào tương noãn

Độ mịn của bào tương: bào tương noãn có hạt thô là đặc điểm thường

gặp trong TTTON Thông thường các hạt phân bố đồng đều trong khắp bàotương noãn có thể sáng màu hoặc sẫm màu Trong một số trường hợp biểuhiện rõ hơn thì các hạt thô tập trung thành từng đám ở vùng trung tâm(Centrally Located Granular- CLG) Nguyên nhân về sự xuất hiện quầng hạtthô trung tâm hiện chưa được biết rõ, có giả thuyết cho rằng CLG có liênquan đến sự chưa trưởng thành của tế bào chất noãn [16] Theo phân độ củaVSRM, độ mịn của bào tương được chia thành 4 độ (chi tiết trang 25)

Gran 1: Bào tương mịn sáng Gran 2: Nhiều hạt thô sáng màu.

Gran 3: Quầng hạt thô trung tâm Gran 4 : Quầng hạt thô trung tâm chiếm trên ¾ chu vi noãn.

Hình 1.7 Phân loại độ mịn bào tương noãn [5].

Các bào quan trong bào tương noãn: Một số bào quan được ghi nhận

thường xuất hiện trong noãn TTTON: thể vùi, không bào, lưới nội bào khônghạt Tất cả các bào quan đều được đánh giá hình thái theo phân độ VSRM vàchia thành 4 độ (chi tiết trang 25)

- Thể vùi là các túi nhỏ dạng lipofuscin, được cho là phức hợp giữa thànhphần lipid và vật liệu cô đặc, đậm màu từ bào tương Thành phần và nguyênnhân xuất hiện thể vùi hiện chưa rõ ràng [17] Hình thái thể vùi được đánh giátheo số lượng và kích thước và chia thành 4 độ (chi tiết xem trang 25)

Hình 1.8 Phân loại hình thái thể vùi [5],[13]

- Không bào là một dạng bào quan có màng bao quanh dạng túi hìnhcầu chứa đầy dịch (chất cặn bã trong tế bào), có bản chất giống chất dịchtrong khoang quanh noãn Chúng có thể xuất hiện một cách tự phát hoặc bằngcách dung hợp các túi từ lưới nội bào hoặc hệ thống Golgi trước khi xuất bào[18] Dựa vào số lượng và kích thước, không bào được chia thành 4 độ (chitiết xem trang 25)

Hình 1.9 Phân loại hình thái không bào [5],[13].

Inc 1: không có thể vùi Inc 2: 1 thể vùi nhỏ (≤3µm) Inc 3: 1 thể vùi lớn Inc 4: 2 thể vùi lớn (>5µm)

Vac 1: không có không bào Vac 2: 1 không bào nhỏ (< 10µm)

Vac 3: 1 không bào trung bình Vac 4: nhiều không bào

- Lưới nội bào không hạt là một thành phần bào quan không thể thiếutrong tế bào, liên quan đến bộ Golgi và hoạt động ty thể, cũng như đóng vaitrò làm khu vực trung chuyển các sản phẩm của lưới nội bào đến những nơikhác trong bào tương Lưới nội bào không hạt có thể phân biệt với không bào

vì chúng không tách biệt với bào tương bởi màng [18]

Hình 1.10 Phân loại hình thái lưới nội bào không hạt [5],[13]

1.3 Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

1.3.1 Lịch sử phát triển kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

Kỹ thuật TTTON cổ điển có lịch sử lâu dài, ban đầu được chỉ định chocác trường hợp vô sinh nữ, sau được chỉ định cho các trường hợp thiểu năng tinhtrùng nhưng cho kết quả không khả quan Cùng với sự phát triển của hệ vi thaotác, các kỹ thuật SUZI (Subzonal Insermination)- tiêm tinh trùng vào khoảngquanh noãn, và kỹ thuật PZD (Partial Zona Dissection)- đục thủng màng trongsuốt để hỗ trợ thụ tinh cho các trường hợp tinh trùng thiểu năng ra đời Tuynhiên kết quả không thực sự như mong đợi, tỉ lệ thụ tinh không tăng đáng kể [3]

Hình 1.11 Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

Ser 1: không có lưới nội bào không hạt Ser 2: 1 lưới nội bào không hạt nhỏ (< 10µm) Ser 3: 1 lưới nội bào không hạt trung bình Ser 4: 1 lưới nội bào không hạt lớn

Năm 1992, lần đầu tiên Palermo và cộng sự báo cáo thành công về kỹthuật tiêm 1 tinh trùng vào bào tương noãn- ICSI (Intracytoplasmic Injection).Đây là kỹ thuật được thực hiện thông qua hệ thống kính hiển vi đảo ngược có gắn

bộ vi thao tác Một tinh trùng sẽ được bắt giữ bởi một vi tiêm và tiêm thẳng vàobào tương noãn Kỹ thuật ICSI đã thực sự mở ra một cánh cửa mới cho điều trị

vô sinh nam Với kỹ thuật ICSI, người chồng vẫn có thể có con của chính mình

dù bị bất thường tinh trùng nặng, kể cả các trường hợp không có tinh trùng [6]

Ngày nay, ICSI đã trờ thành một kỹ thuật phổ biến, và tại nhiều nơi trênthế giới, người ta sử dụng kỹ thuật này như 1 kỹ thuật thường quy Theo báocáo của Anderson và cộng sự năm 2009, số chu kỳ thực hiện ICSI chiếm trên60% tổng số chu kỳ hỗ trợ sinh sản, và có khoảng 1- 4% số trẻ sinh ra ở Châu

Âu là từ các chu kỳ ICSI [19] Ở Việt Nam, kỹ thuật ICSI bắt đầu được triểnkhai từ năm 1999 ở bệnh viện Từ Dũ cho tới nay tất cả các trung tâm thụ tinhtrong ống nghiệm đều đã triển khai thành công kỹ thuật này

1.3.2 Quá trình thụ tinh diễn ra trong ICSI

Quá trình thụ tinh trong tự nhiên và IVF cổ điển trải qua các giai đoạn:(1) tinh trùng gắn màng trong suốt, (2) phản ứng cực đầu, (3) xâm nhập vàomàng trong suốt, (4) hòa màng bào tương noãn và tinh trùng, (5) hoạt hóanoãn và (6) sự hình thành và hòa nhập của 2 tiền nhân

Trong kỹ thuật ICSI, một tinh trùng sẽ được bất động, thu giữ bằng một

vi kim, và được tiêm thẳng vào bào tương của noãn Sự thụ tinh trong ICSIdiễn ra khác với bình thường do không có các rào cản sinh học bên ngoài như:lớp tế bào hạt quanh noãn, màng trong suốt, màng bào tương không còn tácdụng chọn lọc tinh trùng Do đó quá trình thụ tinh trong ICSI chỉ bắt đầu bằnghiện tượng hoạt hóa noãn và hình thành tiền nhân [12],[20]

 Hoạt hóa noãn:

Việc bất động tinh trùng trong kỹ thuật ICSI sẽ gây ra những tổnthương màng bào tương tinh trùng Nhờ đó nhân tinh trùng tiếp xúc với các

nhân tố giải cô đặc nhân tinh trùng (glutathione) trong bào tương noãn Đồngthời, tinh trùng cũng giải phóng vào bào tương noãn một số nhân tố, mộttrong số đó đặc biệt là PLCzeta (phospholipase C), nhân tố này không hoạtđộng được khi tế bào chết PLCzeta từ tinh trùng làm sản sinh IP3 (inisitoltrisphosphate) kích thích giải phóng ion Ca2+ nội bào từ các bào quan bêntrong noãn (mạng lưới nội chất) giúp cho noãn có thể tiếp tục phát triển, quátrình thụ tinh sau ICSI được diễn ra [21],[22].

 Sự hợp nhất tinh trùng với noãn hình thành tiền nhân sau ICSI:

Sự hợp nhất của tinh trùng với noãn kèm theo giải nén chất nhiễm sắcxảy ra trong tế bào chất của noãn trưởng thành Các tiền nhân bắt đầu đượchình thành 5- 6 giờ sau ICSI Hai tiền nhân được hình thành không đồng bộ,tiền nhân đực được hình thành trước tiền nhân cái Tiền nhân đực có thể nhậnbiết được nhờ các phần còn sót lại của tinh trùng bám vào Nguyên nhân của

sự không đồng bộ này vẫn chưa rõ ràng [20]

1.3.3 Đánh giá thụ tinh trong ICSI

Thụ tinh trong ICSI thường được đánh giá vào thời điểm 16- 20 giờ saukhi ICSI với sự xuất hiện của tiền nhân và thể cực thứ 2

Hợp tử được đánh giá bình thường có 2 tiền nhân và 2 thể cực Những đặcđiểm của 2 tiền nhân vào ngày kiểm tra thụ tinh như: kích thước và vị trí 2 tiềnnhân trong bào tương noãn, số lượng và sự phân bố của hạch nhân, hình thái bàotương noãn được xem là có giá trị tiên lượng kết quả thụ tinh tốt hay xấu

A: Thụ tinh bình thường 2 tiền nhân B: thụ tinh bất thường 3 tiền nhân

Hình 1.12 Hình thái thụ tinh của hợp tử [5]

Một trong những bất thường thụ tinh quan sát thấy là sự xuất hiện củanhiều hơn 2 tiền nhân (PN- pronucleic) Có nhiều nguyên nhân dẫn đến hiệntượng này như: không phóng thích thể cực thứ hai, hoặc đa thụ tinh (tiêmnhiều tinh trùng vào cùng một noãn) Sự xuất hiện của 1 PN vào thời điểm thụtinh cũng là một trường hợp bất thường thụ tinh Phân tích di truyền ở hợp tử

1 PN cho thấy khoảng 50% các trường hợp mang bộ nhiễm sắc thể đơn bội.Đây là kết quả của hiện tượng trinh sản, tức là noãn tự hoạt hóa mà không cầntinh trùng Những trường hợp còn lại là do sự phát triển không đồng bộ củatiền nhân (tiền nhân thứ hai, thường là tiền nhân đực, sẽ xuất hiện một vài giờsau đó) hoặc do sự hòa màng sớm của hai tiền nhân (trường hợp này hợp tửmang bộ NST lưỡng bội) [12]

1.4 Sự phát triển của phôi TTTON

1.4.1 Sự phát triển của phôi tiền làm tổ

Sự phát triển của phôi tiền làm tổ trong cơ thể (invivo) hầu như chỉđược nghiên cứu trên động vật, chủ yếu là chuột nhắt Nghiên cứu trên người

bị hạn chế do các vấn đề về đạo đức xã hội Mọi hình thái và sự phát triển củaphôi đến giai đoạn phôi nang của người đều thu được từ nghiên cứu trong ốngnghiệm (invitro) Mặc dù mọi sự kiện diễn ra in vitro đều tương tự in vivo,nhưng thời gian và tốc độ phân cắt có phần chậm hơn [3]

20- 22 giờ sau thụ tinh, hai tiền nhân sẽ sát nhập hòa màng, hợp tử bắtđầu lần nguyên phân đầu tiên tạo thành 2 phôi bào có kích thước bằng nhauchứa một nửa bào tương của tế bào mẹ, trung bình mỗi phôi bào sẽ phân cắt18-20 giờ một lần

Ngày 2: phôi có từ 4 đến 6 tế bào Những lần phân bào đầu diễn ra dưới

sự chỉ huy của bộ gien mẹ

Ngày 3: Phôi có 6 đến 8 tế bào (khoảng 3 ngày sau thụ tinh) bộ gien củaphôi mới bắt đầu hoạt hóa và chỉ huy quá trình phát triển tiếp theo của phôi

Ngày thứ 4 sau thụ tinh: phôi có 8- 16 tế bào Lúc này các phôi bào gắn

chặt với nhau thành một khối đặc gọi là phôi dâu (morula) Cuối giai đoạn

này, các phôi bào phân hóa rõ thành 2 nhóm tế bào: nhóm tế bào ở ngoài lớn,nhóm tế bào phía trong nhỏ hơn

Vào ngày thứ 5 (khoảng 100 giờ) sau thụ tinh: hai dòng tế bào đượcbiệt hóa rõ: lớp tế bào phía ngoài mỏng dẹt là nguồn gốc của lá nuôi phôi, lớp

tế bào phía trong tạo thành một khối đẩy về một cực của phôi tạo thành tế bàogốc Giữa các lớp tế bào này hình thành một khoang chứa dịch tăng nhanhkích thước làm lớp màng trong suốt mỏng dần và bị vỡ, phôi nang thoát mànglàm tổ trong buồng tử cung vào ngày 6, 7 sau thụ tinh [23]

A: hợp tử B: lần phân cắt đầu tiên C: phôi ngày 2

D: phôi ngày 3 E: phôi ngày 4 F: phôi ngày 5- phôi nang

Hình 1.13 Các giai đoạn phát triển của phôi [5]

1.4.2 Đánh giá hình thái phôi giai đoạn phân cắt

Chất lượng phôi hiện nay được đánh giá chủ yếu dựa trên yếu tố hìnhthái quan sát trên kính hiển vi quang học, bao gồm các yếu tố: tốc độ pháttriển của phôi, độ đồng đều của các phôi bào, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương Theođồng thuận của VSRM, hình thái phôi được chia thành 3 độ từ 1 đến 3

Tốc độ phát triển của phôi:

Theo đồng thuận, phôi được coi là phát triển đúng tốc độ khi có 4 tếbào vào ngày 2 và 8 tế bào vào ngày 3 phụ thuộc vào thời điểm thụ tinh Theo

C

một số nghiên cứu, phôi có tốc độ phân chia chậm hơn tốc độ mong đợithường có khả năng làm tổ thấp, những phôi có tốc độ phân chia nhanh hơnmong đợi thường có bất thường và cũng có khả năng làm tổ thấp.

 Độ đồng đều của phôi bào:

Phôi ở giai đoạn 2, 4 và 8 tế bào nên chứa những phôi bào có kích thướcbằng nhau Kích thước phôi bào chỉ khác nhau khi phôi chưa hoàn tất phân chia.Cách đánh giá kích thước phôi bào cũng sử dụng hệ nhị phân để ghi nhận tất cảphôi bào có kích thước hợp lý với giai đoạn phát triển hay không

A: Phôi 4 tế bào kích thước đồng đều B: phôi 4 tế bào kích thước không đồng đều

Hình 1.14 Độ đồng đều của phôi bào [5]

Mảnh vỡ bào tương:

Là một khối bào tương có màng bao, không có nhân nằm bên ngoài tếbào Các mức độ mảnh vỡ bào tương bao gồm: nhẹ (< 10%), vừa (15- 20%),nặng (≥25%) Giá trị tỷ lệ mảng vỡ được tính dựa trên thể tích của phôi bào, ví

dụ ở phôi 4 tế bào, 25% mảnh vỡ bào tương sẽ tương đương với 1 phôi bào

A: tỷ lệ mảnh vỡ 0% B: tỷ lệ mảnh vỡ 10% C: tỷ lệ mảnh vỡ 15% D: Tỷ lệ mảnh vỡ 20%

Hình 1.15 Phân loại mảnh vỡ bào tương phôi [5]

1.5 Liên quan giữa hình thái noãn với kết quả TTTON

B

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu để tìm ra mối liên quan giữa cácyếu tố hình thái noãn với kết quả TTTON Tháng 12 năm 2009, Rienzi vàđồng sự đã thực hiện một tổng quan hệ thống các nghiên cứu về hình tháinoãn viết bằng tiếng Anh thực hiện từ năm 1996 và đã được công bố chínhthức Kết quả có 50 nghiên cứu phù hợp các từ khóa tìm kiếm, có nhiềunghiên cứu kết quả chưa thống nhất [8].

1.5.1 Liên quan hình thái màng trong suốt với kết quả TTTON

Bảng 1.1 Liên quan giữa hình thái màng trong suốt và kết quả TTTON

Nhóm tác giả Yếu tố đánh giá Kết quả Ghi chú

De Sutter và cs

(1996) Thụ tinh, hình thái phôi

Không Độ dày và màu sắcEsfandiari và cs

(2006) Thụ tinh, phát triển phôi,thai lâm sàng Không Độ dày màng

Loutradis và cs

(1999)

Thụ tinh, phát triển phôi, hình thái phôi, thai lâm sàng

Không Có*

*Đo độ lưỡng chiết quang màng (cao tốt hơn)

Không Có* *Đo độ dày lớp trong màngtrong suốt (dày tốt hơn)Ten và cs, (2007) Thụ tinh, hình thái phôi Không Độ dày màu sắc

Các nghiên cứu chủ yếu đánh giá trên độ dày màng trong suốt, màusắc màng, dao động độ dày của màng; nghiên cứu riêng lẻ từng đặc điểm hoặc

phối hợp Phần lớn các nghiên cứu đều không tìm thấy mối liên quan giữa độdày và màu sắc màng trong suốt với tỷ lệ thụ tinh, hình thái phôi, tỷ lệ làm tổhay thai lâm sàng Chỉ có nghiên cứu của Bertrand thực hiện năm 1995 chothấy màng trong suốt dày làm giảm tỷ lệ thụ tinh trong IVF cổ điển, điều nàyđược lý giải màng trong suốt dày có thể cản trở sự xâm nhập của tinh trùngvới noãn Còn trong kỹ thuật ICSI, 1 tinh trùng được tiêm thẳng vào bàotương noãn mà không phải qua lớp rào cản là màng trong suốt, nên có thểmàng trong suốt không còn vai trò chọn lọc tinh trùng [8].

Một số nghiên cứu được thực hiện trên kính hiển vi phân cực nhằm đo

độ lưỡng chiết quang của màng và độ dày lớp trong của màng trong suốt(Madaschi, Montag, Rama Raju, Shen) Quan sát trên kính hiển vi phân cựcmàng trong suốt phân biệt thành 3 lớp rõ rệt, và lớp trong cùng có độ lưỡngchiết quang cao nhất Kết quả của các tác giả này gần tương đương nhau Độlưỡng chiết quang của màng trong suốt không ảnh hưởng tới tỷ lệ thụ tinhnhưng có liên quan đến khả năng phát triển của phôi, tỷ lệ làm tổ và tỷ lệ thailâm sàng, độ dày của lớp trong màng trong suốt có ảnh hưởng tới sự phát triểncủa phôi và thai lâm sàng Theo các tác giả trên, lớp trong cùng của màngtrong suốt phản ánh lịch sử của quá trình phát triển và trưởng thành của noãnbào Những noãn có lớp trong màng trong suốt dày và lưỡng chiết quang caothường là noãn trưởng thành cả nhân và tế bào chất, phôi từ những noãn này

có tiềm năng phát triển tốt hơn những noãn còn lại [8]

1.5.2 Liên quan hình thái khoảng quanh noãn với kết quả TTTON

Bảng 1.2 Liên quan giữa hình thái khoảng quanh noãn và kết quả TTTON

Nhóm tác giả Yếu tố đánh giá Kết

Không Có*

*Hạt trong khoảng quanh noãn (có hạt kém hơn) Hassan Ali và

Không Có* *Độ rộng (rộng kém hơn)Ten và cs,

(2007)

Thụ tinh, Hình thái phôi

Không Có* *Độ rộng (rộng tốt hơn)

Đa số các nghiên cứu không tìm thấy mối liên quan giữa độ rộngkhoảng quanh noãn và thụ tinh cũng như hình thái phôi Tuy nhiên, nghiêncứu của Rienzi lại có kết quả ngược lại: khoảng quanh noãn rộng sẽ làm giảm

tỷ lệ thụ tinh cũng như hợp tử tốt, còn nghiên cứu của Ten thì cho rằng phôi

có nguồn gốc từ noãn có khoảng quanh noãn rộng có hình thái tốt hơn nhómcòn lại [8]

Việc xuất hiện hạt trong khoảng quanh noãn ảnh hưởng tới khả nănglàm tổ của phôi cũng như tỷ lệ thai lâm sàng theo nghiên cứu của Farhi Theonghiên cứu của Hassan việc xuất hiện hạt trong khoảng quanh noãn có liênquan đến việc quá liều hMG khi kích thích nang trứng, đây có thể là biểu hiệncủa noãn quá trưởng thành Ở noãn quá trưởng thành tiềm năng phát triển tiếpthường thấp [8]

1.5.3 Liên quan hình thái hình thái thể cực thứ nhất với kết quả TTTON

Bảng 1.3 Liên quan giữa hình thái thể cực thứ nhất và kết quả TTTON

Chamayou và cs

(2006)

Hình thái phôi Thai lâm sàng, làm tổ

Có*

Không

*Tính toàn vẹn của thể cực (không phân mảnh tốt hơn) Ciotti và cs (2004) Thụ tinh, phát triển phôi,

thai lâm sàng, làm tổ Không Hình thái thể cựcEbner và cs (2000) Thụ tinh, hình thái phôi Có Hình thái thể cực (thể cực

độ 1 tốt nhất) Fancsovits và cs

(2006) Thụ tinh, hình thái phôi Có

Hình thái thể cực (thể cực phân mảnh tốt hơn) Navarro và cs

(2009)

Thụ tinh, hình thái phôi, phát triển phôi Có

Kích thước thể cực (lớn kém hơn)

Rienzi và cs

(2008)

Hình thái hợp tử, thụ tinh, hình thái phôi Có

Hình thái thể cực (Thể cực bất thường kém hơn) Ten và cs (2007) Thụ tinh, hình thái phôi Không Hình thái thể cực

Một số nghiên cứu tìm thấy mối liên quan giữa hình thái thể cực với tỷ

lệ thụ tinh cũng như hình thái phôi Thể cực toàn vẹn và kích thước bìnhthường sẽ cho tỷ lệ thụ tinh và phôi độ 1 cao hơn nhóm còn lại Thể cực to bấtthường, thoái hóa hoặc nhiều thể cực làm giảm khả năng thụ tinh (Navarro,Rienzi) Phần lớn các nghiên cứu đều khẳng định để cực phân mảnh không ảnhhưởng tới kết quả thụ tinh trong ống nghiệm trừ nghiên cứu của Fancsovit [8]

1.5.4 Liên quan hình thái bào tương noãn với kết quả TTTON:

Bảng 1.4 Liên quan giữa hình thái bào tương noãn và kết quả TTTON

Không Màu sắc bào tương, xuất

hiện bào quan Balaban và cs

(2008)

Sống sau rã đông Phôi nang

(1996) Thụ tinh, hình thái phôi

Không Màu sắc bào tương, xuất

hiện bào quan Ebner và cs

(2008a) Thụ tinh, phôi nang

Không Có*

* Kích thước lưới nội bào không hạt (lớn kém hơn) Otsuki và cs

Có Màu sắc bào tương, độ mịn

bào tương, bào quan (sẫm màu, có quầng hạt thô, không bào lớn kém hơn) Ten và cs

(2007)

Hình thái phôi Thụ tinh

Có Màu sắc bào tương (sẫm

màu kém hơn)

Wilding và cs

(2007)

Thụ tinh phát triển phôi, thai lâm sàng

Có * Không

* Tính chất màng bào tương (bở kém hơn), màu sắc bào tương (sẫm màu kém hơn), không bào (lớn kém hơn)

 Độ đàn hồi màng bào tương:

Màng bào tương kém đàn hồi làm giảm tỷ lệ thụ tinh nhưng không ảnhhưởng đến hình thái phôi (Wilding) [8].

 Màu sắc bào tương:

Phần lớn các nghiên cứu đều tìm thấy mối liên quan giữa màu sắc bàotương noãn với kết quả TTTON Những noãn có bào tương sẫm màu giảm tỷ

lệ thụ tinh, giảm chất lượng hợp tử cũng như hình thái phôi (Balaban,Loutradis, Rienzi, Wilding) Một số nghiên cứu tìm thấy ảnh hưởng của màusắc bào tương với khả năng sống sau rã đông của phôi [8]

Độ mịn của bào tương:

Sự xuất hiện của quầng hạt thô trung tâm có thể ảnh hưởng tới chấtlượng hợp tử và hình thái phôi Tỷ lệ tạo thành phôi nang ở nhóm noãn cóquầng hạt thô trung tâm lớn cũng giảm (Ebner) [8]

Các bào quan:

Các dạng bào quan thường xuất hiện trong noãn có thể nhận thấy đó là:thể vùi, không bào, lưới nội bào không hạt Do chỉ có thể đánh giá các cấutrúc xuất hiện trong noãn thông qua quan sát, nên bản chất nguồn gốc của cácdạng bào quan trên vẫn chưa rõ ràng

Nghiên cứu về ảnh hưởng của các bào quan tới kết quả TTTON hiệnchưa thống nhất Không bào có kích thước lớn có thể làm giảm tỷ lệ thụ tinh(Rienzi, Wilding); giảm chất lượng hợp tử và hình thái phôi (Loutradis,Rienzi), đồng thời tỷ lệ lệch bội ở nhóm noãn có không bào lớn cũng tăng(Wilding) Thể vùi lớn ảnh hưởng tới tỷ lệ thụ tinh và tạo thành phôi nang(Otsuki) Lưới nội bào không hạt không ảnh hưởng tới tỷ lệ thụ tinh, hình tháiphôi nhưng có ảnh hưởng tới tỷ lệ thai lâm sàng (Otsuki) [8]

Chương 2ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các noãn MII được thụ tinh với tinh trùngbằng phương pháp ICSI, và nuôi cấy thành phôi của các bệnh nhân làm thụtinh trong ống nghiệm tại bệnh viện phụ sản Hà Nội, trong thời gian từ tháng

12 năm 2015 đến tháng 7 năm 2016

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng

Toàn bộ noãn MII được thụ tinh với tinh trùng bằng phương pháp ICSI của các cặp vợ chồng thỏa mãn điều kiện sau:

 Vợ kích thích buồng trứng bằng phác đồ Antagonis

 Chồng có tinh dịch đồ bình thường theo tiêu chuẩn của WHO 2010

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

Noãn không đủ tiêu chuẩn để ICSI

2.1.3 Số lượng đối tượng

Nghiên cứu theo phương pháp mô tả tiến cứu nên cỡ mẫu được tínhtheo công thức sau:

2 1-α/2 × p × q(p ×)²Trong đó:

N = cỡ mẫu tối thiểu

Z2

1-α/2: biểu thị độ tin cậy; độ tin cậy của nghiên cứu là 95%, tương ứngvới α= 5% thì Z² 1-α/2 = 1,96

 = 0,09 là độ sai lệch của nghiên cứu so với thực tế

p = 0,37 (tỷ lệ noãn có hình thái bình thường trên tất cả các yếu tố theonghiên cứu của Basak Balaban và cộng sự năm 1998 )

q = 1- p biểu thị tỷ lệ noãn có hình thái bất thường

Thay vào N= 413

2.2 Phương pháp nghiên cứu và thu thập số liệu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu theo phương pháp mô tả tiến cứu

2.2.2 Phương pháp tiến hành và thu thập số liệu

 Địa điểm nghiên cứu:

Nghiên cứu được tiến hành tại khoa Hỗ trợ sinh sản Bệnh viện phụ sản

Hà Nội từ tháng 12/ 2015 đến tháng 7/2016

 Quy trình tiến hành và thu thập số liệu:

Tất cả các noãn được thu nhận theo quy trình sau:

Chọc hút noãn

36 giờ sau tiêm

hcG

Kích thích buồng trứng

Thu nhận tinh trùng

Tách noãn sau 2,5- 3 giờ

Lọc rửa tinh trùng Chụp ảnh khi

ICSI

Đánh giá sơ bộ noãn

Nuôi cấy giọt đơn

Đánh giá thụ tinh

(18 giờ sau ICSI)

Đánh giá hình thái phôi (45 giờ sau ICSI)

Đo các kích thước trên ảnh

Sơ đồ 2.1: Quy trình nghiên cứu

 Kích thích buồng trứng:

Bệnh nhân được kích thích buồng trứng từ ngày 2 của chu kỳ kinh theophác đồ Antagonis Theo dõi sự phát triển của nang noãn trên siêu âm và xétnghiệm FSH, LH, E2, P4 Tiến hành chọc hút noãn sau khi tiêm hcG 36 giờ

 Chọc hút noãn:

Noãn được lấy ra theo đường âm đạo dưới sự chỉ dẫn của siêu âm.Noãn được hút vào bơm tiêm 10mL (Terumo- Đức) và bơm trực tiếp ra đĩaFalcon BD BD Ø 60 để tìm khối phức hợp noãn- tế bào hạt dưới kính hiển visoi nổi độ phóng đại 10X Sau khi thu nhận, noãn được nuôi trong đĩa Nunc 4giếng chứa môi trường G-IVF (Vitrolife- Thụy Điển) trong tủ cấy CO2 6,0% ởnhiệt độ 37oC

 Lọc rửa tinh trùng:

Tinh trùng được lấy bằng phương pháp thủ dâm, vào lọ vô trùng

Tinh trùng sau khi thu nhận được lọc rửa bằng phương pháp thang nồng

độ, sử dụng môi trường SpermGrad (Vitrolife- Thụy Điển) để lọc và môitrường SpermRinse (Vitrolife- Thụy Điển) để rửa

 Tách noãn:

Sau khi chọc hút noãn 2,5- 3 giờ tiến hành tách noãn Đĩa tách noãn làđĩa Falcon BD Ø 60 có chứa giọt môi trường Hyase (Vitrolife- Thụy Điển)pha với G-Gamete (Vitrolife- Thụy Điển) theo tỷ lệ 1:9 để loại bỏ tế bào hạtquanh noãn, và giọt môi trường G-Gamete để rửa noãn, mỗi giọt môi trường

có thể tích 100 µL Sử dụng kim thương mại có đường kính 120 để tách noãn

Noãn sau khi tách được nuôi tiếp trong đĩa Falcon BD Ø 35 chứa giọtmôi trường G-IVF (Vitrolife- Thụy Điển) trong tủ cấy CO2 6.0% ở nhiệt độ

37oC Mọi đĩa môi trường đều được phủ dầu Ovoil (Vitrolife- Thụy Điển)

 Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI)- chụp ảnh noãn:

Tất cả các noãn trưởng thành đều được thụ tinh bằng tiêm tinh trùngvào bào tương noãn với tinh trùng di động của chồng hoặc người hiến tặngsau khi tách noãn 1 giờ

Đưa noãn vào đĩa ICSI là đĩa Falcon BD Ø 35 chứa môi trường Gamette (Vitrolife- Thụy Điển), mỗi giọt thể tích 5µL có phủ dầu Ovoil(Vitrolife- Thụy Điển), mỗi giọt môi trường chứa một noãn Xoay noãn saocho thể cực thứ nhất ở vị trí 6 giờ hoặc 12 giờ Tiến hành chụp ảnh từng noãnMII trước khi ICSI bằng camera của kính hiển vi đảo ngược ở vật kính 20X.Đánh giá sơ bộ một số đặc điểm hình thái noãn: màu sắc màng trong suốt, độmịn bào tương, độ đàn hồi màng bào tương

G-Tinh trùng được đưa vào giọt môi trường PVP trên đĩa ICSI, lựa chọntinh trùng di động có hình thái bình thường, dùng kim ICSI chà lên đuôi tinhtrùng để bất động Hút tinh trùng vào kim ICSI, chuyển sang giọt môi trườngchứa noãn Noãn được giữ bằng kim holding vị trí 9 giờ, cực cầu ở vị trí 12giờ hoặc 6 giờ Đâm kim ICSI vào vị trí 3 giờ và tiêm tinh trùng vào bàotương noãn Lần lượt ICSI theo đúng thứ tự giọt môi trường ghi trên đĩa

Hình 2.1 Hệ thống kính hiến vi đảo ngược có camera kết nối máy tính

Sau khi ICSI, noãn được chuyển ngay vào đĩa cấy phôi Đĩa cấy phôi làđĩa Falcon BD Ø 60 chứa giọt môi trường G1(Vitrolife- Thụy Điển) có phủdầu Ovoil, mỗi giọt môi trường có thể tích 10 µL, đánh số thứ tự Noãn saukhi ICSI sẽ được nuôi cấy đơn giọt theo đúng thứ tự vừa mới ICSI trong tủcấy CO2 6,0%, nhiệt độ 370C

 Đo các thông số và đánh giá hình thái noãn trên ảnh:

Hiệu chỉnh thước đo của camera:

Thước đo chuẩn được khắc trên một lam kính, 1 đoạn thẳng có độ dài

2000 µm chia thành 200 vạch, khoảng cách giữa 2 vạch liền kề là 10µm Đặtthước đo chuẩn trên bệ kính hiển vi đảo ngược, vật kính 20X Camera kết nốivới vật kính được hiển thị trên máy tính bằng phần mềm RI Viewer Mở chế

độ hiệu chỉnh kích thước của phần mềm RI viewer, đặt độ phóng đại 20X Dichuyển vạch chia trên màn hình trùng khớp với vạch chia trên thước đochuẩn Lưu lại thay đổi

Hình 2.2 Thước đo chuẩn và hiệu chỉnh thước đo của camera ở vật kính 20X

Tạo đường kích thước tỷ lệ: Tạo đường kích thước tỷ lệ bằng cách vẽ

và đo đoạn thẳng nối 2 điểm bất kỳ trên màn hình hiển thị của camera kínhhiển vi đảo ngược ở vật kính 20X Chụp lại hình ảnh đoạn thẳng cùng kíchthước vừa đo được Mọi thông số máy ảnh, ánh sáng và độ phóng đại của

A: vị trí 3 giờ trên thành ngoài màng trong suốt

d1: đường thẳng tiếp tuyến với màng trong suốt tại A

d2: đường vuông góc với d1 tại A

B: d2 cắt thành trong màng trong suốt.

AB: độ dày màng trong suốt

kính phải đồng bộ với thông số khi chụp ảnh noãn Dùng phần mềm autocad

mở ảnh có chứa đường kích thước tỷ lệ và đặt tỷ lệ theo ảnh đó (đơn vị µm)

Đo các kích thước noãn: Sau khi đã đặt tỷ lệ xích theo đường kích

thước tỷ lệ mới tiến hành đo các kích thước cần thiết của noãn trên ảnh bằngphần mềm Autocad:

- Độ dày màng trong suốt:

+ Nếu độ dày đồng đồng đều đo 1 vị trí: ở vị trí 3 giờ thành ngoài màngtrong suốt vẽ 1 đường tiếp tuyến với thành ngoài màng trong suốt Kẻ 1đường thẳng vuông góc với đường tiếp tuyến vừa tạo cắt thành trong màngtrong suốt tại 1 điểm, đo khoảng cách giữa điểm vừa tạo được và điểm 3 giờthành ngoài màng trong suốt

+ Nếu độ dày không đồng đều, đo đoạn màng trong suốt dày nhất vàđoạn màng mỏng nhất, lấy giá trị trung bình cũng bằng cách vẽ tiếp tuyến vớimàng tại vị trí cần đo và kẻ đường vuông góc như trên

Hình 2.3 Đo độ dầy màng trong suốt

- Khoảng quanh noãn: Đo ở vị trí khoảng quanh noãn rộng nhất Vẽđường kính qua vị trí 3- 9 giờ và vị trí 6- 12 giờ của noãn, giao điểm 2 đường

d1

d1

d2

d2

kính là tâm noãn Nhận định vị trí khoảng quanh noãn rộng nhất Kẻ 1 đườngthẳng từ tâm noãn đế thành trong màng trong suốt ở vị trí khoảng quanh noãnrộng nhất Đo độ dài đoạn thẳng nằm ở khoảng quanh noãn

O: tâm noãn

OA: đường kính đi tới thành trong màng trong suốt ở vị trí khoảng quanh noãn rộng nhất B: OA cắt màng bào tương noãn tại B

AB: kích thước khoảng quanh noãn

Hình 2.4 Đo kích thước khoảng quanh noãn

- Thể cực thứ nhất: Đo đường kính ngang thể cực thứ nhất Các trườnghợp thể cực thứ nhất phân mảnh hoặc nhiều hơn 1 thể cực chỉ ghi nhận, không

đo kích thước

A

OB

- Đường kính noãn: Noãn hình tròn đo đường kính của noãn từ vị trí 3giờ đến vị trí 9 giờ so với thể cực thứ nhất, noãn hình trứng đo đường kínhngang và đường kính dọc.

- Các bào quan: đo đường kính các bào quan xuất hiện trong bào tương noãn

Hình 2.5 Đo thể cực thứ nhất, đường kính noãn

2.2.3 Đánh giá thụ tinh và hình thái phôi

Thụ tinh được đánh giá 16 - 18 giờ sau khi ICSI Noãn được đánh giá làthụ tinh khi xuất hiện hai tiền nhân và 2 thể cực Trường hợp noãn có ba tiềnnhân và noãn thoái hóa thì loại bỏ Chuyển noãn sang đĩa nuôi mới, là đĩa Falcon

BD Ø 60 chứa giọt môi trường G1 (Vitrolife- Thụy Điển) có phủ dầu Ovoil, mỗigiọt môi trường có thể tích 10 µL, đánh số thứ tự, hợp tử vẫn được giữ nguyênthứ tự như ở đĩa sau ICSI, nuôi tiếp tục trong tủ cấy CO2 6% và nhiệt độ 37oC

Hình thái phôi ngày 2 được đánh giá 44- 46 giờ sau khi ICSI: số lượngphôi bào, độ đồng đều của phôi bào, tỷ lệ mảnh vỡ Tiêu chuẩn phân loại phôitheo tiêu chuẩn đang sử dụng tại bệnh viện phụ sản Hà Nội

2.3 Các chỉ số nghiên cứu

2.3.1 Các chỉ số về đặc điểm mẫu nghiên cứu

 Tổng số noãn MII đã được ICSI

 Độ dày màng trong suốt