Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bởi một số chủng vi khuẩn lactobacillus (tt)

Vì vậy, lên men sản xuất axit lactic từ đường xylose, cellobiose là một hướng nghiên cứu có tính khả thi bởi lẽ nó không những làm giảm giá thành sản phẩm, góp phần giải quyết ô nhiễm mô

MỞ ĐẦU

Axit lactic là một trong số những chất hóa học rất quan trọng, được

sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mĩ phẩm và công nghiệp hóa học Trong đó, hơn 70% axit lactic sản xuất ra được ứng dụng vào trong thực phẩm và các ngành có liên quan đến thực phẩm

Hiện nay, 90% lượng axit lactic được sản xuất bằng quá trình lên men bởi vi khuẩn Nguyên liệu truyền thống để sản xuất axit lactic thường

là sản phẩm từ cây lương thực như tinh bột khoai tây, tinh bột bắp, tinh bột mì, Tuy nhiên nguồn nguyên liệu này có giá thành cao và cạnh tranh với nguồn nguyên liệu của thực phẩm Do đó, lên men sản xuất axit lactic từ nguồn nguyên liệu không có nguồn gốc thực phẩm như biomass đã được tập trung nghiên cứu Ngoài ra, axit lactic được xác nhận là một trong số

30 chất hóa học có khả năng được sản xuất từ biomass Trong số các nguồn sinh khối biomass, sinh khối lignocellulose có sẵn với số lượng lớn, phân bố rộng rãi và giá thành khá thấp Tuy nhiên, cellulose và hemicellulose trong lignocellulose không thể trực tiếp được sử dụng bởi vi khuẩn lactic (LAB) để sản xuất axit lactic vì cấu trúc phức tạp của lignocellulose và thiếu các enzyme cellulolytic trong LAB Dịch thủy phân của lignocellulose sau khi tiền xử lý và thủy phân chủ yếu bao gồm hỗn hợp đường glucose, cellobiose, xylose và arabinose Như vậy, dẫn xuất đường thu được từ quá trình thủy phân lignocellulose ngoài đường glucose còn có đường xylose và cellobiose

Vì vậy, lên men sản xuất axit lactic từ đường xylose, cellobiose là một hướng nghiên cứu có tính khả thi bởi lẽ nó không những làm giảm giá thành sản phẩm, góp phần giải quyết ô nhiễm môi trường mà còn tăng hiệu quả của quá trình sản xuất axit lactic từ vật liệu lignocellulose

Việt Nam là nước nông nghiệp, phế phụ phẩm nông nghiệp thải ra hàng năm rất lớn Trong số các loại phế phụ phẩm nông nghiệp, rơm rạ là loại nguyên liệu có sản lượng lớn và dễ thu gom Ước tính, mỗi năm có khoảng 61 triệu tấn rơm rạ Tuy nhiên, phần lớn rơm rạ được thải bỏ khi còn tươi hoặc phương thức phổ biến nhất hiện nay là đốt bỏ trên đồng ruộng điều này gây lãng phí nguồn nguyên liệu và ô nhiễm môi trường

nghiêm trọng Nghiên cứu sản xuất axit lactic từ rơm rạ cũng đã có những bước tiếp cận, tuy nhiên mới chỉ dừng lại ở nguồn đường glucose thủy phân từ cellulose mà chưa tận dụng hết được các nguồn đường khác như cellobiose (thủy phân cellulose), xylose (thủy phân hemicellulose) Do đó,

đề tài “Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy

phân rơm rạ bởi một số chủng vi khuẩn Lactobacillus” đã được tiến

hành nhằm khai thác những thế mạnh của nguồn nguyên liệu lignocellulose trong đó tập trung vào nguyên liệu rơm rạ- nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose và xylose

- Nghiên cứu lên men axit lactic từ đường xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bởi các chủng vi khuẩn đã chọn ở trên

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose và xylose

- Khảo sát và tối ưu các điều kiện thích hợp lên men axit lactic từ xylose và cellobiose bởi các chủng được chọn

- Khảo sát các điều kiện thích hợp lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng vi khuẩn, xác định dạng D, L axit lactic tạo thành

Những đóng góp mới của đề tài

- Luận án phân lập được 2 chủng vi khuẩn từ các sản phẩm lên men

truyền thống ở Việt Nam: L fermentum Y6 có khả năng lên men axit lactic

từ xylose và chủng L plantarum HC2 có khả năng lên men axit lactic từ

đường cellobiose

- Luận án nghiên cứu một cách có hệ thống về quá trình lên men sinh axit lactic từ xylose và cellobiose (phân lập, tuyển chọn, định tên chủng vi khuẩn, tối ưu hóa các điều kiện lên men axit lactic) và lên men axit lactic

từ dịch thủy phân rơm rạ bởi 2 chủng đã được lựa chọn

Bố cục của luận án

Luận án được trình bày trong 131 trang: Mở đầu (2 trang), tổng quan

tài liệu (33 trang), vật liệu và phương pháp nghiên cứu (14 trang), kết quả

và thảo luận (51 trang với 21 bảng, 68 hình và sơ đồ), kết luận và kiến nghị (2 trang), danh mục các công trình đã công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (14 trang với 4 tài liệu tiếng Việt và 142 tài liệu tiếng Anh) và phụ lục (9 trang)

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

Tổng quan các vấn đề nghiên cứu của luận án được trình bày chi tiết

về các phần:

1.1 Axit lactic

1.1.1 Đặc tính hóa học của axit lactic

1.1.2 Ứng dụng của axit lactic

1.1.3 Các phương pháp sản xuất axit lactic

1.3.2 Quá trình thủy phân

1.3.3 Quá trình lên men sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bằng vi khuẩn lactic

1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ trên thế giới và ở Việt Nam

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

- Mẫu phân lập: Các mẫu từ nguồn thực phẩm lên men truyền thống

từ các địa bàn khác nhau như: Cà muối chua, dưa muối chua , dưa bắp cải muối, sung muối, măng chua, hành muối, bã dong giềng, dạ dày bò Các mẫu được thu thập từ các địa bàn Hà Nội, Sơn Tây

- Rơm rạ: Rơm rạ Khang Dân vụ đông, hè thu gom vào các vụ năm

2014, 2015 tại Hoài Đức, Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh và sinh học phân tử

2.2.1.1 Phân lập và tuyển chọn chủng sinh axit lactic từ đường xylose và cellobiose (Bergey D.H và cộng sự (1994), Le.T.B và cộng sự (1999), Vamanu E và cộng sự (2005), Bevilacqua A.E và cộng sự (1989))

2.2.1.2 Quan sát đặc điểm hình thái, sinh lí và sinh hóa của chủng vi khuẩn được chọn(Bergey D.H và cộng sự (1994))

2.2.1.3 Định danh vi khuẩn theo phương pháp sinh học phân tử

2.2.1.4 Kiểm tra khả năng đối kháng của 2 chủng vi khuẩn Y6 và HC2

2.2.2 Phương pháp lên men

Lên men axit lactic từ đường xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ được tiến hành như sau:

- Lên men axit lactic từ đường xylose và cellobiose: Quá trình lên men axit lactic được tiến hành như sau: Bình thủy tinh 200 ml nút cao su chứa 150ml môi trường YE - xylose hoặc YE - cellobiose, tỉ lệ cấp giống, nồng độ đường, nhiệt độ, pH ban đầu, tốc độ lắc là các yếu tố được thay đổi theo từng thí nghiệm khảo sát, lên men thực hiện trong 120 giờ Sau

đó, thu dịch và đem xác định lượng axit tổng tạo thành và phân tích lượng axit lactic tạo thành bằng phương pháp HPLC

- Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ qui mô 200ml: Bình thủy tinh 200 ml nút cao su chứa 150ml môi trường YE sử dụng đường từ dịch thủy phân rơm rạ (cellobiose 11,3 g/l; glucose 16,9 g/l và xylose 8,16 g/l), điều kiện: Duy trì pH 6,2 bằng NaOH 2N, lượng giống cấp 10% theo

thể tích trong đó tỉ lệ L plantarum HC2 : L fermentum Y6, nhiệt độ, tốc

độ lắc, nồng độ đường và nồng độ cao nấm men thay đổi theo từng thí nghiệm khảo sát

- Lên men axit lactic qui mô 2 lít Thiết bị lên men 2 lít chứa 1500 ml môi trường YE - dịch thủy phân rơm rạ trong đó hàm lượng đường (cellobiose 11,3 g/l; glucose 16,9 g/l và xylose 8,16 g/l), hàm lượng cao nấm men 3 g/l, pH 6,2 được duy trì bằng NaOH 2N, tỉ lệ giống cấp 10%

theo thể tích trong đó tỉ lệ L plantarum HC2 : L fermentum Y6 bằng 2:1;

nhiệt độ 37oC Lên men diễn ra trong 48 giờ, canh trường thu được sẽ xác định lượng axit lactic tạo thành và lượng đường dư

Xác định hiệu suất lên men axit lactic

Hiệu suất lên men = (A/D) × 100

Trong đó: A: Lượng axit lactic thu được sau quá trình lên men (g/l); D: Lượng đường tiêu thụ trong quá trình lên men (g/l)

2.2.3 Phương pháp hóa lí - sinh

Thu hồi và tinh sạch axit lactic theo phương pháp truyền thống có cải tiến (Vũ Thị Thuận và cộng sự (2012))

Phương pháp hiệu quả để xác định dạng D, L axit lactic đó là đo góc quay cực của hỗn hợp đồng phân đó Các mẫu được đo bằng máy quang phổ kế phân cực Jasco - j - 710 - spectropolarimeter, cách đo theo TCVN

8446 - 2010

2.2.3.7 Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy trong lên men axit lactic

từ đường xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bởi các chủng đã chọn ở trên

Đối với quá trình lên men axit lactic của chủng L fermentum Y6 từ

xylose với nhiệt độ ở các mức 30oC, 35oC, 37oC, 40oC và 45oC pH ban đầu bằng (4,5; 5; 5,5;6; 6,5; 7; 7,5); nồng độ đường xylose (5 g/l; 10g/l; 15 g/l; 20 g/l; 25 g/l); tỉ lệ cấp giống( 5%; 10%; 15%; 20%) Nghiên cứu ảnh

hưởng của tốc độ lắc và duy trì pH ở điều kiện tối ưu

Đối với quá trình lên men axit lactic của chủng L plantarum HC2 từ

cellobiose với nhiệt độ ở các mức 30oC, 35oC, 37oC, 40oC và 45oC pH ban đầu bằng (4,5; 5; 5,5;6; 6,5; 7; 7,5); nồng độ đường cellobiose (5 g/l; 10g/l;

15 g/l; 20 g/l; 25 g/l); tỉ lệ cấp giống (5%; 10%; 15%; 20%), tốc độ lắc 0; 50; 100; 150 vòng/phút Khảo sát ảnh hưởng của duy trì pH và lắc ở điều kiện tối ưu

Đối với quá trình lên men axit lactic của hỗn hợp chủng L fermentum Y6 và L plantarum HC2 từ dịch thủy phân rơm rạ: Nhiệt độ khảo sát ở các mức 33oC; 35oC; 37oC và 39oC Nồng độ đường dịch thủy phân (10 g/l; 20 g/l; 30 g/l; 38 g/l; 76 g/l); tỉ lệ cấp giống 10% (HC2 : Y6 = 1:1; 2:1; 3:1; 4:1), tốc độ lắc 0; 50, 100; 150; 200 vòng/phút pH 6,2 duy trì bằng NaOH 2N

Tối ưu hóa quá trình lên men axit lactic theo phương pháp bề mặt đáp ứng và quy hoạch Box-Benken, sử dụng phần mềm Design-Expert 7.15

Ma trận thực nghiệm bao gồm 17 thí nghiệm với khoảng chạy của 3 yếu tố khảo sát là nhiệt độ (30 – 44oC), pH (4,5 – 7,5), nồng độ đường cellobiose

và xylose (5 – 15 g/l)

2.2.3.8 Phương pháp thống kê

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần để lấy giá trị trung bình Kết quả được xử lý thống kê với mức ý nghĩa α = 0,05

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose

3.1.1 Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose

3.1.1.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose

Từ 20 mẫu sản phẩm lên men lấy từ các nguồn khác nhau trên địa bàn Hà Nội đã phân lập được 26 chủng trên môi trường YE - xylose agar

có bổ sung CaCO3 Quan sát vòng phân giải D1 nhận thấy rằng cả 26 chủng đều có khả năng sinh axit, tuy nhiên chỉ có 9 chủng: Y1, Y5, Y6, Y7, MC2, MC5, DC3, HX3, HX10 có tỉ lệ D1/d1 ≥ 3 Vì vậy, 9 chủng vi khuẩn này được lựa chọn để tiến hành các tuyển chọn tiếp theo

Tiếp tục tuyển chọn chủng có khả năng sinh axit lactic cao nhất từ 9 chủng trên theo phương pháp định tính axit lactic bằng thuốc thử Uffelman, phương pháp cấy chấm điểm, đục lỗ thạch và định lượng axit bằng NaOH 0,05N chọn ra 2 chủng Y5, Y6 có khả năng sinh axit cao

(bảng 3.2) và tiến hành xác định khả năng sinh axit lactic của 2 chủng

bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC (hình 3.5 và hình 3.6) Kết

quả chọn chủng Y6 cho hiệu suất sinh axit lactic đạt 56 % cao hơn chủng Y5( 54%) Do đó, chủng Y6 được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo

Bảng 3.2 Đặc điểm các chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ đường

xylose bằng phương pháp đục lỗ thạch, cấy chấm điểm và định lượng axit

96 giờ (g/l)

Khuẩn lạc tròn, kích thước

từ 1,0- 1,4 mm, bề mặt trơn, nhẵn bong, hơi nhầy, trắng trong, không tâm

Khuẩn lạc tròn có kích thước từ 0,6 – 0,8 mm, bề mặt trơn, nhẵn bóng, không mép, màu trắng

đục

Khuẩn lạc tròn, kích thước từ 0,8-1,1 mm, không mép, bề mặt trơn, nhẵn bóng, màu trắng

đục

Khuẩn lạc to tròn kích thước từ 1,5 – 1,8 mm, trắng đục, nhày

(D1: đường kính vòng phân giải (mm), d1: đường kính khuẩn lạc (mm))

(d2 đường kính lỗ đục (mm), D2 đường kính vòng phân giải)

Hình 3.5 Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng Y5

Hình 3.6 Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng Y6

3.1.1.2 Định tên chủng vi khuẩn Y6

a Đặc điểm sinh lý – sinh hóa của chủng Y6

Quan sát bằng kính hiển vi về hình thái điển hình, đặc tính của chủng Y6 cho thấy: chủng vi khuẩn Y6 thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương và có

tế bào hình que ngắn, có khả năng axit hóa môi trường, không sinh bào tử, không sinh khí và không di động

b Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử

DNA hệ gen của chủng nghiên cứu được tách chiết và đoạn gen mã cho 16S rRNA được khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi phổ biến 27F/1492R Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S của Y6 cho thấy đoạn gen gồm 1447 bp và đoạn gen này được so sánh với các gen 16S rRNA vi khuẩn trên Genbank với phần mềm Blastn Kết quả cho thấy đoạn gen 16S rRNA của chủng Y6 có độ tương đồng 99.92% với trình tự

16S rADN của Lactobacillus fermentum (AJ575812) (1279/1280 bp); tương đồng 97.89% Lactobacillus gorilla (AB904716) (1253/1280 bp) (hình 3.10)

Hình 3.10 Vị trí phân loại của chủng Y6 với các loài có quan hệ họ hàng gần

Kết hợp các đặc điểm sinh học phân tử và sinh lí, sinh hóa có thể xếp

chủng Y6 thuộc loài Lactobacillus fermentum và được đặt tên là Lactobacillus fermentum Y6

3.1.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men axit lactic

từ đường xylose của chủng L fermentum Y6

Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: Nhiệt độ, pH ban đầu,

nồng độ đường xylose, tỉ lệ cấp giống đến quá trình lên men axit lactic từ

đường xylose của chủng L fermentum Y6 đã lựa chọn được các giá trị

nhiệt độ 37oC; pH ban đầu 6; nồng độ đường xylose 10 g/l; tỉ lệ cấp giống

10 % (v/v) và thu được 7,29 g/l axit sau 120 giờ lên men

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose

của chủng L fermentum Y6

6.66

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men axit lactic từ đường

xylose của chủng L fermentum Y6

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến quá trình lên men axit lactic từ đường

xylose của chủng L fermentum Y6

Nhận thấy rằng có 3 yếu tố tác động mạnh nhất đến quá trình đó là yếu tố nhiệt độ, pH ban đầu và nồng độ đường xylose (hình 3.11; 3.12; 3.14) Do đó, thí nghiệm chọn 3 yếu tố trên để tiến hành tiến hành tối ưu

điều kiện lên men axit lactic từ xylose của chủng L fermentum Y6

3.1.3 Tối ưu điều kiện lên men axit lactic từ đường xylose của chủng

L fermentum Y6

Theo nguyên tắc của ma trận Box - Behnken, ta tiến hành 17 thí nghiệm với sự thay đổi đồng thời của 3 yếu tố nhiệt độ, pH ban đầu và nồng độ đường xylose quanh giá trị trung bình (bảng 3.5)

Từ những phân tích phương sai, phần mềm đã đưa ra phương trình hồi quy theo giá trị của mô hình nghiên cứu như sau:

Y = 8,06 - 0,38X1 + 0,73X2 + 1,51X3 - 0,34 X1X2 - 0,64 X1X3 + 0,055X1X3 - 1,29X1

Bảng 3.5 Ma trận thực nghiệm Box- Behnken với ba yếu tố và hàm lượng

axit thu được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau

Thực nghiệm được tiến hành dưới các điều kiện như sau: Nhiệt độ 38

oC, pH ban đầu 6,2 và nồng độ đường là 12 g/l Sau 120 giờ lên men, hàm lượng axit đạt được là 8,51 g/l Kết quả này có độ tương thích cao so với lí thuyết, lượng axit thu được sau tối ưu đa yếu tố tăng 16,7% so với khảo sát đơn yếu tố

3.1.4 Ảnh hưởng của lắc và duy trì pH ban đầu ở điều kiện tối ưu

Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình lên men và duy trì pH6,2 bằng NaOH 2N trong điều kiện tối ưu Kết quả này cho thấy rằng

ở tốc độ lắc 50 vòng/phút kết hợp với duy trì pH6,2 dẫn đến hiệu suất lên men và mức độ sử dụng đường tăng, đồng thời rút ngắn thời gian lên men

Phân tích dịch lên men trong điều kiện duy trì pH 6,2 sau 48 giờ bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC thu được kết quả lượng axit lactic tạo thành 7,36 g/l; axit axetic 2,24 g/l Như vậy, hiệu suất lên men axit lactic 61,3%

Từ các dữ liệu tham chiếu so sánh trên cho thấy lợi thế về năng lực

lên men axit lactic từ xylose của chủng L fermentum Y6 cao hơn so với các chủng của chi Lactobacillus, đạt hiệu suất lên men axit lactic 61,3% Đồng thời, chủng L fermentum Y6 được phân lập từ sản phẩm lên men

truyền thống, nên có lợi thế về năng lực và độ ổn định về hoạt tính trong bảo quản giống Bên cạnh đó, chủng này có khả năng phát triển và lên men trên môi trường YE - là môi trường muối khoáng đơn giản và chỉ chứa 3% cao nấm men như là nguồn bổ sung nitơ hữu cơ, điều này chính là ưu điểm

của chủng so với các chủng Lactobacillus khác và Enterococcus và cũng

là ưu điểm khi sử dụng chủng L fermentum Y6 trong lên men axit lactic

từ dịch thủy phân lignocellulose

3.2 Nghiên cứu lên men axit lactic từ cellobiose

3.2.1 Phân lập, tuyển chọn chủng và định tên chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose

3.2.1.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose

Từ 22 chủng vi khuẩn phân lập được, dựa vào kết quả phân lập đã lựa chọn sơ bộ ra được 5 chủng thể hiện khả năng sinh axit cao nhất với tỉ

lệ D1/d1≥ 3,0 (D1- đường kính vòng phân giải, d1- đường kính khuẩn lạc) Tiếp tục tuyển chọn chủng có khả năng sinh axit lactic cao nhất theo phương pháp định tính axit lactic bằng thuốc thử Uffelman; phương pháp cấy chấm điểm, đục lỗ thạch và định lượng axit bằng NaOH 0,05N Kết quả chọn ra chủng HC2 có khả năng sinh axit cao (hình 3.24, 3.25, bảng 3.8) Tiến hành xác định lượng axit lactic tạo thành bằng phương pháp sắc

kí lỏng cao áp kết quả thu được lượng axit lactic tạo thành là 4,2 g/l; lượng đường cellobiose dư là 3,79 g/l