Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bởi một số chủng vi khuẩn Lactobacillus

MỞ ĐẦU Axit lactic là một trong số những chất hóa học rất quan trọng được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mĩ phẩm và công nghiệp hóa học. Trong đó, hơn 70% axit sản xuất ra được ứng dụng vào trong thực phẩm và các ngành có liên quan đến thực phẩm. Hiện nay, 90% lượng axit lactic được sản xuất bằng quá trình lên men bởi vi khuẩn. Nguyên liệu truyền thống để sản xuất axit lactic thường là sản phẩm từ cây lương thực như tinh bột khoai tây, tinh bột bắp, tinh bột mì,... Tuy nhiên nguồn nguyên liệu này có giá thành cao và cạnh tranh với nguồn nguyên liệu của thực phẩm. Do đó, lên men sản xuất axit lactic từ nguồn nguyên liệu không có nguồn gốc thực phẩm như biomass đã được tập trung nghiên cứu. Ngoài ra, axit lactic được xác nhận là một trong số 30 chất hóa học có khả năng được sản xuất từ biomass. Trong số các nguồn sinh khối biomass, sinh khối lignocellulose có sẵn với số lượng lớn, phân bố rộng rãi và giá thành khá thấp. Tuy nhiên, cellulose và hemicellulose trong lignocellulose không thể trực tiếp được sử dụng bởi vi khuẩn lactic (LAB) để sản xuất axit lactic vì cấu trúc phức tạp của lignocellulose và thiếu các enzyme cellulolytic trong LAB. Dịch thủy phân của lignocellulose sau khi tiền xử lý và thủy phân chủ yếu bao gồm hỗn hợp đường glucose, cellobiose, xylose và arabinose. Như vậy, dẫn xuất đường thu được từ quá trình thủy phân lignocellulose ngoài đường glucose còn có đường xylose và cellobiose. Vì vậy, lên men sản xuất axit lactic từ đường xylose, cellobiose là một hướng nghiên cứu có tính khả thi bởi lẽ nó không những làm giảm giá thành sản phẩm, góp phần giải quyết ô nhiễm môi trường mà còn tăng hiệu quả của quá trình sản xuất axit lactic từ vật liệu lignocellulose. Việt Nam là nước nông nghiệp, phế phụ phẩm nông nghiệp thải ra hàng năm rất lớn. Trong số các loại phế phụ phẩm nông nghiệp, rơm rạ là loại nguyên liệu có sản lượng lớn và dễ thu gom. Ước tính, mỗi năm có khoảng 61 triệu tấn rơm rạ. Tuy nhiên, phần lớn rơm rạ được thải bỏ khi còn tươi hoặc phương thức phổ biến nhất hiện nay là đốt bỏ trên đồng ruộng điều này gây lãng phí nguồn nguyên liệu và ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Nghiên cứu sản xuất axit lactic từ rơm rạ cũng đã có những bước tiếp cận, tuy nhiên mới chỉ dừng lại ở nguồn đường glucose thủy phân từ cellulose mà chưa tận dụng hết được các nguồn đường khác như cellobiose (thủy phân cellulose), xylose (thủy phân hemicellulose). Do đó, đề tài “Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bởi một số chủng vi khuẩn Lactobacillus” đã được tiến hành nhằm khai thác những thế mạnh của nguồn nguyên liệu lignocellulose trong đó tập trung vào nguyên liệu rơm rạ- nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: - Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose và xylose. - Nghiên cứu lên men axit lactic từ đường xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bởi các chủng vi khuẩn đã chọn ở trên.

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC CÁC BẢNG ixx

DANH MỤC CÁC HÌNH x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Axit lactic 3

1.1.1 Đặc tính hóa học của axit lactic 3

1.1.2 Ứng dụng của axit lactic 3

1.1.3 Các phương pháp sản xuất axit lactic 5

1.1.3.1 Tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học 5

1.1.3.2 Sản xuất axit lactic bằng phương pháp lên men 5

1.2 Lignocellulose 6

1.2.1 Thành phần hóa học của lignocellulose 8

1.2.1.1 Cellulose 8

1.2.1.2 Hemicellulose 10

1.2.1.3 Lignin 11

1.2.2 Rơm rạ 12

1.3 Lên men axit lactic từ rơm rạ 13

1.3.1 Quá trình tiền xử lý 13

1.3.1.1 Tiền xử lý rơm rạ bằng axit hữu cơ 15

1.3.1.2 Tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm 15

1.3.2 Quá trình thủy phân 15

1.3.3 Quá trình lên men sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bằng vi khuẩn lactic 17

1.3.3.1 Nguồn cơ chất 18

1.3.3.2 Chủng giống vi sinh vật 23

1.3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lên men axit lactic 29

1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ trên thế giới và ở Việt Nam 34

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 38

2.1.1 Vật liệu 38

2.1.2 Môi trường 38

2.1.3 Hóa chất và enzyme 39

2.1.4 Thiết bị 39

2.2 Phương pháp nghiên cứu 40

2.2.1 Phương pháp vi sinh và sinh học phân tử 40

2.2.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn sinh axit lactic từ đường xylose và cellobiose 40

2.2.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh axit lactic 41

2.2.1.3 Quan sát đặc điểm hình thái, sinh lí và sinh hóa của chủng vi khuẩn được chọn 41

2.2.1.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp sinh học phân tử 42

2.2.1.5 Kiểm tra khả năng đối kháng của 2 chủng vi khuẩn Y6 và HC2 42

2.2.2 Phương pháp lên men 42

2.2.3 Phương pháp hóa lí - sinh 43

2.2.3.1 Định lượng đường khử bằng DNS 43

2.2.3.2 Xác định hàm lượng axit tổng theo Therner 43

2.2.3.3 Xác định hàm lượng axit lactic, hàm lượng đường theo phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) 43

2.2.3.4 Phương pháp tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm (NaOH) theo phương pháp nấu kín 44

2.2.3.5 Phương pháp thủy phân rơm rạ bằng hỗn hợp enzyme thương phẩm Cellic® Ctec2 và Cellic® Htec2 44

2.2.3.6 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men axit lactic của chủng vi khuẩn được lựa chọn 45

2.2.3.7 Ảnh hưởng của duy trì pH trong quá trình lên men 47

2.2.3.8 Xác định dạng D, L axit lactic trong dịch lên men từ dịch thủy phân rơm rạ 48

2.2.4 Phương pháp toán học 49

2.2.4.1 Tối ưu hóa quá trình lên men axit lactic từ xylose của chủng L fermentum Y6 và từ cellobiose của chủng L plantarum HC2 49

2.2.4.2 Phương pháp thống kê 52

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1 Lên men axit lactic từ xylose 53

3.1.1 Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose 53 3.1.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose 53 3.1.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose 54 3.1.1.3 Định tên chủng vi khuẩn Y6 59 3.1.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men axit lactic từ đường

xylose của chủng L fermentum Y6 61

3.1.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose

của chủng L fermentum Y6 61

3.1.2.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men axit lactic từ đường

xylose của chủng L fermentum Y6 62

3.1.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến quá trình lên men axit lactic từ đường

xylose của chủng L fermentum Y6 63

3.1.2.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống đến quá trình lên men axit lactic từ đường

xylose của chủng L fermentum Y6 64 3.1.3 Tối ưu điều kiện lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L fermentum

Y6 65 3.1.4 Ảnh hưởng của tốc độ lắc và duy trì pH ban đầu trong điều kiện tối ưu 68 3.1.4.1 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose

của chủng L fermentum Y6 69

3.1.4.2 Ảnh hưởng của duy trì pH đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose

của chủng L fermentum Y6 70

3.2 Lên men axit lactic từ cellobiose 73 3.2.1 Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose 73 3.2.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose 73 3.2.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ cellobiose 74 3.2.1.3 Định tên chủng vi khuẩn HC2 77 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH ban đầu, nồng độ đường và tỉ lệ cấp

giống đến khả năng lên men axit lactic của chủng L plantarum HC2 từ đường

3.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men axit lactic từ đường

cellobiose của chủng L plantarum HC2 80

3.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men axit lactic từ

cellobiose của chủng L plantarum HC2 81

3.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng lên men axit lactic từ

cellobiose của chủng L plantarum HC2 82

3.2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến khả năng lên men axit lactic từ

cellobiose của chủng L plantarum HC2 82

3.2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng lên men axit lactic của

chủng L plantarum HC2 83 3.2.3 Tối ưu hóa quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L plantarum

HC2 84 3.2.4 Ảnh hưởng của duy trì pH đến quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của

chủng L plantarum HC2 87

3.3 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ 90 3.3.1 Tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm (NaOH) theo phương pháp nấu kín và thủy phân rơm rạ sau tiền xử lý bằng hỗn hợp enzyme Ctec2 và Htec2 90 3.3.2 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi các chủng đơn hoặc hỗn hợp

chủng L plantarum HC2 và L fermentum Y6 91 3.3.2.1 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi chủng L plantarum HC2.

92

3.3.2.2 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi chủng L fermentum Y6 93 3.3.2.3 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng L plantarum HC2 và L fermentum Y6 93 3.3.3 Nghiên cứu động học của quá trình lên men axit lactic bởi hỗn hợp chủng L plantarum HC2 và L fermentum Y6 từ dịch thủy phân rơm rạ 101

3.3.4 Xác định dạng D, L axit lactic 102 3.3.4.1 Thu hồi và tinh sạch axit lactic từ dịch lên men thu được từ quá trình lên

men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng L fermentum Y6 và L plantarum HC2 102

3.3.4.2 Phân tích sản phẩm axit lactic bằng sắc kí lỏng cao áp HPLC 102 3.3.4.3 Phân tích so sánh xác định thành phần D, L lactic và độ quay phân cực của axit lactic 103

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 105

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO 108 PHỤ LỤC 122

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Chú thích

16SF Mồi xuôi (Forward primer)

16SR Mồi ngược (Reverse primer)

ADP Adenosine diphosphate

ATP Adenosine triphosphate

EMP Embden - Meyerhof pathway

GAP Glyceraldehyde 3 - Phosphate

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) LAB Vi khuẩn lactic (Lactic acid Bacteria)

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase chain reaction)

PLA Polylactic axit

PP Pentose phosphate pathway

SDS Sodium dodecyl sulfate

SSF Simultaneously saccharification and fermentation

SHF Separate hydrolysis and fermentation

TAE Tris-acetate- Ethylenediaminetetraacetic acid

TE Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid

YE The mineral salts solution

Detector RI Đầu dò chiết xuất RI (Reflective index detector)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong các nguồn lignocellulose 8

Bảng 1.2 Một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ đường xylose 24

Bảng 1.3 Một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ cellobiose 26

Bảng 2.1 Hóa chất, dụng cụ chính và enzyme 39

Bảng 2.2 Máy, thiết bị 40

Bảng 2.3 Các yếu tố tối ưu trong nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose của chủng

L fermentum Y6 50

Bảng 2.4 Các yếu tố tối ưu trong nghiên cứu lên men axit lactic từ cellobiose của chủng

L plantarum HC2 50

Bảng 2.5 Ma trận thực nghiệm tối ưu hóa lên men axit lactic từ xylose 51

Bảng 2.6 Ma trận thực nghiệm tối ưu hóa lên men axit lactic từ cellobiose 51

Bảng 3.1 Đặc điểm các chủng lên men axit lactic từ đường xylose 53

Bảng 3.2 Đặc điểm các chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ đường xylose bằng phương pháp đục lỗ thạch, cấy chấm điểm và định lượng axit 57

Bảng 3.3 Hàm lượng axit lactic tạo thành của 2 chủng bằng phương pháp HPLC 58

Bảng 3.4 Đặc tính sinh lý – sinh hóa của chủng Y6 59

Bảng 3.5 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken với ba yếu tố và hàm lượng axit thu được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau 66

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm DX 7.1.5 66

Bảng 3.7 Đặc điểm các chủng lên men axit lactic từ đường cellobiose 73

Bảng 3.8 Đặc điểm của các chủng lên men axit lactic từ đường cellobiose bằng phương pháp đục lỗ thạch, cấy chấm điểm và định lượng axit 76

Bảng 3.9 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken với 3 yếu tố và hàm lượng axit thu được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau 84

Bảng 3.10 Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm DX7.1.5 85

Bảng 3.11 Thành phần đường trong dịch thủy phân rơm rạ 91

Bảng 3.12 Tỉ lệ hỗn hợp của các đồng phân quang học trong sản phẩm lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi chủng L plantarum HC2 và chủng L fermentum Y6 103

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Đồng phân quang học của axit lactic 3

Hình 1.2 Cấu trúc của lignocellulose 7

Hình 1.3 Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose 9

Hình 1.4 Phân tử xylan và cơ chế thủy phân thành xylose 10

Hình 1.5 Các dạng của đường xylose 11

Hình 1.6 Các đơn vị cơ bản của lignin 12

Hình 1.7 Sơ đồ sản xuất axit lactic từ rơm rạ 14

Hình 1.8 Cơ chế thủy phân của cellulose 16

Hình 1.9 Cơ chế thủy phân của hemicellulose 17

Hình 1 10 Cơ chế lên men axit lactic từ đường xylose 20

Hình 1 11 Cơ chế lên men axit lactic từ đường cellobiose 21

Hình 2.1 Sơ đồ qui trình tiền xử lý và thủy phân rơm rạ 45

Hình 2.2 Sơ đồ qui trình thu hồi axit lactic 48

Hình 3.1 Định tính axit lactic bằng thuốc thử Uffelmann của các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose 55

Hình 3.2 Hình ảnh cấy chấm điểm của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ xylose 55

Hình 3.3 Hình ảnh đục lỗ thạch của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ xylose 56

Hình 3.4 Hàm lượng axit tạo thành của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ xylose 56

Hình 3.5 Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng Y5 58

Hình 3.6 Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng Y6 58

Hình 3.7 Hình thái tế bào và khuẩn lạc của chủng Y6 59

Hình 3.8 Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ sinh khối chủng Y6 60

Hình 3.9 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA từ DNA tổng số chủng Y6 60

Hình 3.10 Vị trí phân loại của chủng Y6 với các loài có quan hệ họ hàng gần 61

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L fermentum Y6 62

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L fermentum Y6 63

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nồng độ đường xylose đến quá trình lên men axit lactic của

chủng L fermentum Y6 64

Hình 3.14 Ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L fermentum Y6 64

Hình 3.15 Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và pH ban đầu 67

Hình 3.16 Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và nồng độ đường 67

Hình 3.17 Ảnh hưởng đồng thời của pH ban đầu và nồng độ đường 67

Hình 3.18 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu để lên men axit lactic từ xylose của chủng

L fermentum Y6 68

Hình 3.19 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L fermentum Y6 69

Hình 3.20 Ảnh hưởng của việc duy trì pH và không duy trì đến mức độ sử dụng đường trong lên men axit lactic từ xylose của chủng L fermentum Y6 70

Hình 3.21 Ảnh hưởng của duy trì và không duy trì pH đến sự hình thành axit và sử dụng đường khi kết thúc quá trình lên men 70

Hình 3.22 Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng………

L fermentum Y6 71

Hình 3.23 Định tính axit lactic bằng thuốc thử Uffelmann của các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose 75

Hình 3.24 Hình ảnh cấy chấm điểm của 5 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose 75

Hình 3.25 Hình ảnh đục lỗ thạch của 5 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose 76

Hình 3.26 Hàm lượng axit tạo thành của 5 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose 76

Hình 3.27 Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ cellobiose của chủng HC2 77

Hình 3.28 Hình thái tế bào và khuẩn lạc của chủng HC2 78

Hình 3.29 Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ sinh khối của chủng HC2 78

Hình 3.30 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA từ DNA tổng số chủng HC2 78

Hình 3.31 Vị trí phân loại của chủng HC2 với các loài có quan hệ họ hàng gần 79

Hình 3.32 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose của chủng L plantarum HC2 80

Hình 3.33 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men axit lactic từ

cellobiose của chủng L plantarum HC2 81

Hình 3.34 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường cellobiose đến khả năng lên men

axit lactic của chủng L plantarum HC2 82

Hình 3.35 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến khả năng lên men axit lactic từ

cellobiose của chủng L plantarum HC2 83

Hình 3.36 Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng lên men axit lactic từ

cellobiose của chủng L plantarum HC2 83

Hình 3.37 Ảnh hưởng đồng thời của pH ban đầu và nhiệt độ đến quá trình lên men axit

lactic từ cellobiose của chủng L plantarum HC2 85

Hình 3.38 Ảnh hưởng đồng thời của nồng độ đường và nhiệt độ đến quá trình lên men axit

lactic từ cellobiose của chủng L plantarum HC2 86

Hình 3.39 Ảnh hưởng đồng thời của nồng độ đường và pH ban đầu quá trình đến lên men

axit lactic từ cellobiose của chủng L plantarum HC2 86

Hình 3.40 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu để lên men axit lactic từ cellobiose 87Hình 3.41 Ảnh hưởng của duy trì pH đến quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của

chủng L plantarum HC2 87

Hình 3.42 Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ đường cellobiose của chủng

L plantarum HC2 88

Hình 3.43 Sắc kí đồ HPLC của dịch đường thủy phân rơm rạ với các điều kiện tối ưu 90

Hình 3.44 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ của chủng L plantarum HC2 92 Hình 3.45 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ của chủng L fermentum Y6 92

Hình 3.46 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm

rạ của hỗn hợp chủng L plantarum HC2 và L fermentum Y6 94

Hình 3.47 Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến quá trình lên men axit lactic của

L fermentum Y6 99

Hình 3.52 Động thái quá trình lên men axit của 2 chủng L plantarum HC2 và…………

L fermentum Y6 từ dịch thủy phân rơm rạ 101

Hình 3.53 Qui trình thu hồi và tinh sạch axit lactic từ dịch lên men 102

Hình 3.54 Phổ HPLC mẫu axit lactic của sản phẩm lên men 103

Hình 3.55 Phổ HPLC mẫu L- axit lactic chuẩn 103

MỞ ĐẦU

Axit lactic là một trong số những chất hóa học rất quan trọng được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mĩ phẩm và công nghiệp hóa học Trong đó, hơn 70% axit sản xuất ra được ứng dụng vào trong thực phẩm và các ngành có liên quan đến thực phẩm

Hiện nay, 90% lượng axit lactic được sản xuất bằng quá trình lên men bởi vi khuẩn Nguyên liệu truyền thống để sản xuất axit lactic thường là sản phẩm từ cây lương thực như tinh bột khoai tây, tinh bột bắp, tinh bột mì, Tuy nhiên nguồn nguyên liệu này có giá thành cao và cạnh tranh với nguồn nguyên liệu của thực phẩm Do đó, lên men sản xuất axit lactic từ nguồn nguyên liệu không có nguồn gốc thực phẩm như biomass đã được tập trung nghiên cứu Ngoài ra, axit lactic được xác nhận là một trong số 30 chất hóa học có khả năng được sản xuất từ biomass Trong số các nguồn sinh khối biomass, sinh khối lignocellulose có sẵn với số lượng lớn, phân bố rộng rãi và giá thành khá thấp Tuy nhiên, cellulose và hemicellulose trong lignocellulose không thể trực tiếp được sử dụng bởi vi khuẩn lactic (LAB) để sản xuất axit lactic vì cấu trúc phức tạp của lignocellulose và thiếu các enzyme cellulolytic trong LAB Dịch thủy phân của lignocellulose sau khi tiền xử lý và thủy phân chủ yếu bao gồm hỗn hợp đường glucose, cellobiose, xylose và arabinose Như vậy, dẫn xuất đường thu được từ quá trình thủy phân lignocellulose ngoài đường glucose còn có đường xylose và cellobiose

Vì vậy, lên men sản xuất axit lactic từ đường xylose, cellobiose là một hướng nghiên cứu có tính khả thi bởi lẽ nó không những làm giảm giá thành sản phẩm, góp phần giải quyết ô nhiễm môi trường mà còn tăng hiệu quả của quá trình sản xuất axit lactic từ vật liệu lignocellulose

Việt Nam là nước nông nghiệp, phế phụ phẩm nông nghiệp thải ra hàng năm rất lớn Trong số các loại phế phụ phẩm nông nghiệp, rơm rạ là loại nguyên liệu có sản lượng lớn và dễ thu gom Ước tính, mỗi năm có khoảng 61 triệu tấn rơm rạ Tuy nhiên, phần lớn rơm rạ được thải bỏ khi còn tươi hoặc phương thức phổ biến nhất hiện nay là đốt bỏ trên đồng ruộng điều này gây lãng phí nguồn nguyên liệu và ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Nghiên cứu sản xuất axit lactic từ rơm rạ cũng đã có những bước tiếp cận, tuy nhiên mới chỉ dừng lại ở nguồn đường glucose thủy phân từ cellulose mà chưa tận dụng hết được các nguồn đường khác như cellobiose (thủy phân cellulose), xylose (thủy phân hemicellulose)

Do đó, đề tài “Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân

rơm rạ bởi một số chủng vi khuẩn Lactobacillus” đã được tiến hành nhằm khai thác

những thế mạnh của nguồn nguyên liệu lignocellulose trong đó tập trung vào nguyên liệu rơm rạ- nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose và xylose

- Nghiên cứu lên men axit lactic từ đường xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm

rạ bởi các chủng vi khuẩn đã chọn ở trên

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose và xylose

- Khảo sát và tối ưu các điều kiện thích hợp lên men axit lactic từ xylose và cellobiose bởi các chủng được chọn

- Khảo sát các điều kiện thích hợp lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng vi khuẩn, xác định dạng D, L axit lactic tạo thành

Những đóng góp mới của đề tài

- Luận án phân lập được 2 chủng vi khuẩn từ các sản phẩm lên men truyền thống ở

Việt Nam: L fermentum Y6 có khả năng lên men axit lactic từ xylose và chủng L plantarum HC2 có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose

- Luận án nghiên cứu một cách có hệ thống về quá trình lên men sinh axit lactic từ xylose và cellobiose (phân lập, tuyển chọn, định tên chủng vi khuẩn, tối ưu hóa các điều kiện lên men axit lactic) và lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi 2 chủng đã được lựa chọn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Axit lactic

1.1.1 Đặc tính hóa học của axit lactic

Axit lactic (2-hydroxypropanoic, CH3CHCOOH) là một axit hydroxycacboxylic xuất hiện rộng rãi nhất trong tự nhiên và được phát hiện bởi nhà hóa học Thụy điển - Scheele vào năm 1780 [31]

- Công thức hoá học: C 3 H 6 O 3

- Công thức tổng quát: CH 3 –CHOH–COOH

- Khối lượng phân tử: 90,08 g/mol

- Axit lactic không màu ở dạng lỏng, ở dạng bột hoặc chất rắn có màu từ màu trắng đến màu vàng Ở dạng lỏng, axit tan được trong nước và etanol Ở dạng rắn, axit ít hòa tan trong nước nhưng tan được trong acetone Axit lactic có pKa = 3,86 ở 25oC, điểm sôi: 52,7

- 52,8oC đối với dạng tinh khiết L hoặc D - axit lactic và 16,4oC đối với hỗn hợp racemic

DL - axit lactic có chứa 50% của mỗi đồng phân [51]

Axit lactic được sản xuất trong cơ thể người, động vật, thực vật và vi sinh vật Trong cấu tạo phân tử của chúng có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai đồng phân quang học: D - axit lactic và L - axit lactic Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa

lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải (D - axit lactic) và một sang trái (L - axit lactic) Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau Đồng phân dạng D - axit lactic có hại cho cơ thể con người nhưng đồng phân dạng L lại thích hợp trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm bởi vì cơ thể con người chỉ hấp thụ loại đồng phân này [32]

L - axit lactic D - axit lactic

Hình 1.1 Đồng phân quang học của axit lactic [51]

1.1.2 Ứng dụng của axit lactic

Axit lactic là một trong số những chất hóa học rất quan trọng, được sử dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm, dược phẩm, mĩ phẩm, và ngành nông nghiệp,… [31, 43,

83] Trong đó, ứng dụng chính của axit lactic vẫn là thực phẩm và các ngành liên quan đến thực phẩm (chiếm tới 85%) [103]

- Ứng dụng trong thực phẩm bao gồm [126]

+ Kiểm soát pH: Kiểm soát độ pH của sản phẩm có thể kéo dài thời hạn sử dụng Ngoài ra, axit lactic được sử dụng trong món salat và nước sốt để làm tăng tính axit của sản phẩm

+ Tạo mùi: Tăng cường và bảo vệ hương vị thịt Tạo hương vị chua nhẹ trong bánh kẹo, nước giải khát, bia, súp, các sản phẩm sữa,…

+ Tác dụng kháng khuẩn: Kiểm soát vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli,

Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes trong thực phẩm

+ Tác nhân trong các sản phẩm muối: Ô-liu xanh, dưa chuột và những sản phẩm khác thường đóng gói trong dung dịch muối, axit lactic và nước Axit lactic đóng vai trò như một chất bảo quản và cải thiện độ trong của dung dịch ngâm muối và hương vị của sản phẩm Hỗn hợp của axit axetic và axit lactic trong các sản phẩm muối chua: dưa chuột bao

tử, hành muối,… tạo ra mùi và vị nhẹ hơn, cải thiện sự ổn định của vi sinh vật Muối canxi lactate được ghi nhận là muối có tác dụng làm săn chắc sản phẩm, đã được sử dụng cho các loại trái cây và rau đóng hộp

+ Tác nhân tạo nhũ tương: Este của axit lactic và axit béo mạch dài có tác dụng tạo

hệ nhũ tương đặc biệt trong các sản phẩm bánh qui

- Ứng dụng trong y học

Trong phẫu thuật chỉnh hình, người ta thường sử dụng loại vật liệu là purasord, được sử dụng như những đinh ghim, gắn các phần xương lại với nhau, khi xương định hình purasord sẽ tự tiêu hủy Axit lactic có khả năng trùng hợp thành polymer là polylactic axit (PLA) PLA được dùng làm chỉ tự tiêu, nó cũng được dùng làm thiết bị cố định các vết gãy xương nhỏ và sau đó nó tự phân hủy Nhờ khả năng này của PLA mà chúng đang được nghiên cứu để có thể thay thế các polymer có nguồn gốc từ dầu mỏ [126]

- Ứng dụng làm mỹ phẩm

Các muối lactat kim loại (như lactat natri) được sử dụng trong thành phần của một

số mỹ phẩm chăm sóc da như punosal của hãng mỹ phẩm Punac Mỹ phẩm này có tác dụng chống lại các vi sinh vật có trên bề mặt da, làm ẩm và làm sáng da [126]

- Ứng dụng trong ngành công nghiệp hóa học

Trong những năm gần đây, axit lactic thu hút được sự quan tâm rất lớn của các nhà nghiên cứu do nó là nguyên liệu cho sản xuất polylactic axit (PLA) PLA là một polyeste

vào khuôn đúc.PLA là thành phần chính trong bao bì thực phẩm ( bao bì đựng salat, bao bì gói kẹo, chai,…) Năm 2008, khối lượng PLA đạt 0,26 triệu tấn/năm, ước tính vào năm

2020 sẽ đạt 15 triệu tấn [53]

Trong công nghiệp nhẹ: Axit lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm, thuộc da,…

1.1.3 Các phương pháp sản xuất axit lactic

1.1.3.1 Tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học

Tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học dựa trên lactonitrile, bao gồm các bước sau [22]:

- Bổ sung hydrogen cyanide (HCN) vào dung dịch acetaldehyde (trong môi trường kiềm) để tạo ra lactonitrile Phản ứng này xảy ra trong pha lỏng ở áp suất cao Lactonitrile thô được thu lại và tinh sạch bởi quá trình chưng cất

CH3COONa + HCN CH3CHOHCN

Acetaldehit Hydrogencianua Lactonitrile

- Thủy phân lactonitrile bằng HCl hoặc H2SO4 tạo ra axit lactic cùng với muối amonium

CH3CHOHCN + H2O + 1/2H2SO4 CH3CHOHCOOH + 1/2(NH4)2SO4O Lactonitrile Axit sulphuric Axit lactic Muối ammonium

- Este hóa axit lactic với methanol để tạo ra methyl lactate Methyl lactate được thu

và tinh sạch bằng chưng cất

CH3CHOHCOOH + CH3OH CH3CHOHCOOCH3 + H2O Axit lactic Methanol Methyl lactate

- Thủy phân methyl lactate bằng nước dưới xúc tác của axit để tạo ra axit lactic và methanol Methanol được tạo ra từ quá trình trên lại được quay vòng cho quá trình tiếp sau

CH3CHOCOCH3 + H2O CH3CHOHCOOH + CH3OH Methyl lactate Axit lactic Methanol

Sản xuất axit lactic theo phương pháp tổng hợp hóa học xuất phát từ nguồn nhiên liệu dầu mỏ, tuy nhiên nguồn nguyên liệu này đang ngày một cạn kiệt Ngoài ra, sản xuất axit lactic bằng phương pháp hóa học tạo ra hỗn hợp racemix DL - axit lactic, quá trình phân tách hai đồng phân đòi hỏi chi phí lớn [43]

1.1.3.2 Sản xuất axit lactic bằng phương pháp lên men

Lên men lactic là quá trình ôxy hóa- khử sinh học nhờ vi khuẩn lactic Qua quá trình lên men này, một lượng đáng kể axit lactic được tích tụ trong môi trường làm giảm mạnh pH của môi trường, tạo ra hiệu ứng ức chế mạnh mẽ các vi sinh vật khác Vì vậy, lên

men bởi vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi như một phương pháp để bảo quản thực phẩm và quá trình này thường không có hoặc cần ít nhiệt [22]

Nguồn carbon cho sản xuất axit lactic theo phương pháp lên men có thể là đường ở dạng tinh khiết như glucose, saccarose, lactose,… hoặc các vật liệu chứa đường như rỉ đường, bã mía, bã sắn, tinh bột và nguyên liệu giàu tinh bột từ khoai tây, khoai mì, lúa mì, lúa mạch, cà rốt [14, 88] Lên men sản xuất axit lactic là một phương pháp thân thiện với môi trường và axit tạo ra có độ tinh khiết cao [37] Tuy nhiên, các loại nguyên liệu tinh bột

và các loại đường tinh khiết lại có giá thành cao, điều đó làm tăng giá thành sản xuất axit, đây chính là một trong những hạn chế khi so sánh sản xuất axit lactic bằng phương pháp lên men với phương pháp tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học [32] Do đó, việc nghiên cứu tìm kiếm nguồn nguyên liệu giá rẻ là hướng đi cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn Gần đây, quá trình lên men axit lactic từ nguyên liệu không có nguồn gốc thực phẩm, chẳng hạn như sinh khối tái tạo đã được tập trung nghiên cứu, do chúng không có bất kì tác động nào tới chuỗi cung cấp thực phẩm cho con người và giá thành thấp

Lignocellulose là dạng vật liệu hữu cơ có nguồn gốc sinh học, đại diện cho nguồn nguyên liệu phong phú nhất trong biomass nhưng vẫn chưa được sử dụng rộng rãi Lignocellulose chiếm hơn 90% sinh khối thực vật trên trái đất Hàng năm, ước tính 200 ×

109 tấn sinh khối thực vật được tạo ra, trong đó 8 - 20× 109 tấn có khả năng sử dụng [66] Lignocellulose có nguồn gốc từ nông nghiệp và nguồn rừng đại diện cho nguồn nguyên liệu có khả năng tái tạo, giá thành thấp và có nguồn carbohydrate sẵn có với hàm lượng

Thành phần hóa học của lignocellulose có nguồn gốc từ nông nghiệp bao gồm khoảng 10% - 25% lignin, 20% - 30% hemicellulose và 40% - 50% cellulose [102]

Hemicellulose và cellulose là những phân đoạn giàu đường và những đường này có thế lên men tạo ra các sản phẩm có giá trị như ethanol, phụ gia thực phẩm, các chất hóa học, enzyme,…[21]

Hình 1.2 Cấu trúc của lignocellulose [21]

Nói chung, tỉ lệ các thành phần hóa học của lignocellulose cao hay thấp phụ thuộc vào loại thực vật, điều kiện canh tác,… Lignocellulose có một cấu trúc bên trong phức tạp

và bao gồm số lượng lớn các thành phần chính cũng có cấu trúc phức tạp Bảng 1.1 cho thấy phần trăm các thành phần hóa học trong các nguyên liệu lignocellulose khác nhau

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong các nguồn lignocellulose [47]

Nguồn lignocellulose

Lignin (%)

Hemicellulose (%)

Cellulose (%)

35 - 40% trong rơm lúa mì và rơm rạ Cellulose gồm những đơn vị (1, 4) - D- glucopyranose gắn bởi liên kết β1,4 - glycosidic, với trọng lượng phân tử trung bình khoảng 100.000 Dalton Công thức hóa học của cellulose là (C6H10O5)n (n, được gọi là mức độ trùng hợp (DP), đại diện cho số lượng các nhóm glucose, từ hàng trăm đến hàng ngàn hoặc thậm chí hàng chục ngàn) Cellulose gồm các đơn vị D - glucose lặp đi lặp lại ( hình 1.3) và đơn vị lặp lại của cellulose được gọi là cellobiose

Hình 1.3 Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose [146]

Cellobiose là disaccharide được hình thành bởi 2 phân tử β - D - glucose liên kết

với nhau bởi mối liên kết β -1,4 - glycosodic Cellobiose là đơn vị cấu trúc của các phân tử cellulose và cũng là sản phẩm chính trong quá trình thủy phân cellulose Tuy nhiên nồng

độ cellobiose cao có thể ức chế phản ứng thủy phân của cellulase [144]

Công thức hóa học: C12H22O11

Công thức tổng quát: [HOCH2CHO(CHOH)3]2O

Tính chất của cellobiose

Tính chất vật lý

- Khối lượng phân tử: 342,3 g/mol

- Trạng thái: Cellobiose ở dạng kết tinh là bột màu trắng, không mùi, vị ngọt nhẹ

- Khối lượng riêng: 1,768 g/cm3 (20oC)

- Nhiệt độ nóng chảy: 203,5oC

- Độ hòa tan trong nước: 12g/ 100ml

- Tan ít trong rượu, không tan trong ete, cloroform

Tính chất hóa học

- Tính khử: Khả năng nhường điện tử của nhóm –OH và –CO

- Tính oxy - hóa: Dưới tác nhân khử, nhóm CHO hay –CO bị khử thành polyalcol

- Phản ứng tạo liên kết glycoside: Nhóm –OH glycoside của đường đơn tham gia phản ứng với OH glycoside/alcol tạo este tương ứng

Sinh khối cellulose đã thu hút được sự chú ý trên toàn thế giới như là một nguồn tài nguyên có thể được chuyển đổi thành các sản phẩm có ích [102] Ngoài ra, sinh khối cellulose là nguồn nguyên liệu phong phú, giá thành rẻ, có khả năng tái tạo, dễ dàng có sẵn nguồn đường và có khả năng đáp ứng nhu cầu ngày càng lớn của thị trường về nguồn nguyên liệu sản xuất axit lactic [130] Vì vậy, cellulose đã được sử dụng như một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho quá trình lên men axit lactic

1.2.1.2 Hemicellulose

Hemicellulose là polymer phổ biến thứ 2 (sau cellulose), chiếm từ 20 - 30% trong sinh khối lignocellulose, có trọng lượng phân tử trung bình < 30.000 Dalton Hemicellulose là một polymer dị thể có độ phân nhánh cao, ngắn, có thể tồn tại ở bốn loại cấu trúc là xylan, mannan, β-glucan với hỗn hợp các mối liên kết và xyloglucan Bốn nhóm này có sự thay đổi về cấu trúc trong từng loại chuỗi, được phân theo vị trí hay loại liên kết của glycosid trong mạng lưới phân tử Hemicellulose được thủy phân dễ dàng hơn so với cellulose vì tính chất phân nhánh và vô định hình của nó Các đường pentose và hexose trong hemicellulose tạo thành một cấu trúc hoạt động lỏng lẻo, rất ưa nước như một chất keo giữa cellulose và lignin[42, 134]

Xylan là một heteropolymer được tạo thành bởi một chuỗi các nhóm xylose liên kết với nhau qua liên kết β-1,4-glycosidic và phân nhánh bởi các chuỗi carbohydrate ngắn Xylan chiếm phần lớn khối lượng trong hemicellulose Trong quá trình xử lý lignocellulose, xylan ít bị phá vỡ cấu trúc hơn nên điều này sẽ góp phần nâng cao hiệu quả thu hồi đường sau quá trình thủy phân Sau thủy phân xylan người ta thu được monomer là đường xylose [35]

Hình 1.4 Phân tử xylan và cơ chế thủy phân thành xylose [35]

Xylose được phân loại là một monosaccharide của nhóm aldopentose, có nghĩa là

nó có năm nguyên tử carbon và một nhóm formyl Xylose là đường chủ yếu của hemicellulose trong gỗ cứng và phế thải của nông nghiệp [111]

Công thức phân tử: C5H10O5

Công thức tổng quát: HOCH2(CH(OH))3CHO

Giống như hầu hết các loại đường, xylose có nhiều đồng phân cấu trúc khác nhau Với nhóm carbonyl tự do, xylose là một loại đường khử

- Trong tự nhiên thường có 2 dạng: Mạch vòng và mạch thẳng Đối với dạng mạch thẳng, người ta chia thành 2 dạng đồng phân: Đồng phân dạng D - xylose (nhóm OH của

carbon bất đối xứng ở phía bên phải) và đồng phân dạng L - xylose (nhóm OH của carbon bất đối xứng ở phía bên trái)

D - xylose L - xylose Xylose dạng mạch vòng

Hình 1.5 Các dạng của đường xylose [111]

Tính chất của xylose

Tính chất vật lý

- Khối lượng phân tử: 150,13 g/mol

- Trạng thái: Xylose ở dạng kết tinh là bột màu trắng, có vị ngọt

- Khối lượng riêng: 1,525 g/cm3 (20oC)

- Nhiệt độ nóng chảy: 144 -145oC

- Góc cực quay: 22,5o (CHCl3)

- Tan trong nước và cồn

Tính chất hóa học

- Tính khử: Khả năng nhường điện tử của nhóm –OH và –CO

- Tính oxy-hóa: Dưới tác nhân khử, nhóm CHO hay –CO bị khử thành polyalcol

- Phản ứng tạo liên kết Glycoside: Nhóm –OH glycoside của đường đơn tham gia phản ứng với OH glycoside/alcol tạo ester tương ứng

1.2.1.3 Lignin

Lignin là một trong các polymer hữu cơ có nguồn gốc sinh học phổ biến nhất trong

tự nhiên Lignin là hợp chất cao phân tử có cấu trúc mạng không gian và không có cấu tạo hóa học nhất định [111]

Lignin là một phức hợp gồm các đơn vị phenylpropan phức tạp tuyến tính và liên kết ngẫu nhiên; ba monomer chính là rượu p-coumaryl, rượu coniferyl và rượu sinapyl [131]

Hình 1.6 Các đơn vị cơ bản của lignin [131]

Lignin liên kết với hemicellulose bằng liên kết hóa trị nhưng không liên kết trực tiếp với cellulose Lignin có đặc tính polyphenol nên có tính kị nước và sát khuẩn, là thành phần gây cản trở quá trình thủy phân bằng enzyme Lignin không được vi sinh vật sử dụng như một cơ chất để lên men và ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bằng enzyme của lignocellulose [111] Chính vì vậy, trong quá trình tiền xử lý sinh khối lignocellulose nên lựa chọn phương pháp hiệu quả nhất để loại bỏ lignin

1.2.2 Rơm rạ

Rơm rạ là một sản phẩm phụ của sản xuất lúa gạo và cũng là tài nguyên sinh học có tiềm năng nhất Rơm rạ là một trong những vật liệu lignocellulose phong phú trên thế giới Theo số liệu thống kê của FAO, năm 2014, sản lượng lúa trên thế giới đạt khoảng 746 triệu tấn, theo tính toán với các giống lúa đang canh tác hiện nay thì 1 tấn lúa sẽ thu được 1 - 1,5 tấn rơm rạ Do đó, lượng rơm rạ trên thế giới có thể lên tới 746 - 1119 triệu tấn Việt Nam

là một nước nông nghiệp có sản lượng lúa lớn, theo số liệu của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, năm 2014 sản lượng lúa đạt khoảng 45 triệu tấn, tương ứng với khoảng 45

- 67,5 triệu tấn rơm rạ

Như vậy, hàng năm lượng rơm rạ trên thế giới và ở Việt Nam là khá lớn Tuy nhiên, thực tế cho thấy không chỉ trên thế giới mà cả ở Việt Nam, phần lớn rơm rạ được thải bỏ khi còn tươi Phương thức phổ biến nhất để xử lý rơm rạ đó là đốt bỏ trên đồng ruộng, điều đó sẽ lãng phí tài nguyên, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng và ảnh hưởng đến đời sống sinh hoạt của nhân dân [20]

Thành phần chính của rơm rạ chủ yếu chứa cellulose 32 - 47%, hemicellulose 27%, lignin 5-24% và chất tro 10-18% [20] Rơm rạ được tạo thành từ các carbohydrate phức tạp, phần carbohydrate chiếm khoảng 60% trọng lượng [127] Thành phần carbohydrate trong rơm rạ bao gồm: glucose 41-43,4%, xylose 14,8 - 20,2%, arabinose 2,7- 4,5%, mannose 1,8% và galactose 0,4% [70, 97] Tuy nhiên, các phương pháp tiền

19-xử lý khác nhau và đường hóa bằng enzyme khác nhau sẽ thu được hỗn hợp đường khác nhau về thành phần và tỉ lệ

Tóm lại, sử dụng rơm rạ làm nguyên liệu cho sản xuất axit lactic không những giải quyết được vấn đề tính bền vững lâu dài của nguồn nguyên liệu mà còn không có bất kì tác động nào tới chuỗi cung cấp thực phẩm cho con người Ngoài ra, còn giải quyết được vấn

đề về môi trường và xã hội

1.3 Lên men axit lactic từ rơm rạ

Sử dụng lignocellulose trong đó có rơm rạ để sản xuất axit lactic là một con đường đầy hứa hẹn Tuy nhiên, hiệu quả chuyển đổi lignocellulose thành axit lactic vẫn phải đối mặt những thách thức đáng kể Quá trình sinh hóa để biến đổi cấu trúc sinh khối thực vật thành các loại đường như: glucose, cellobiose, xylose, arabinose và mannose cần phải được thiết kế, tính toán kỹ lưỡng Những đường này có thể lên men thành axit lactic bởi chủng vi sinh vật tự nhiên hoặc tái tổ hợp [7] Quá trình chuyển hóa để sản xuất axit lactic

từ rơm rạ bao gồm 4 bước chính (Hình 1.7)

- Tiền xử lý: Mục đích của quá trình tiền xử lý là bẻ gãy các khối cấu trúc của thực vật thành những cấu trúc nhỏ hơn thuận lợi cho bước xử lý tiếp theo

- Thủy phân bằng enzyme: Mục đích của quá trình là cắt các cấu trúc polymer của thực vật thành những cấu trúc nhỏ hơn cho quá trình lên men như: glucose, cellobiose và xylose, đây là sản phẩm chính của quá trình thủy phân

- Lên men: Các loại đường glucose, cellobiose và xylose thu được từ quá trình thủy phân sẽ lên men để tạo thành axit lactic nhờ vi khuẩn lactic

- Thu hồi và tinh sạch sản phẩm: Quá trình thu hồi và tinh sạch axit lactic theo những phương pháp đã được ứng dụng và thương mại hóa

1.3.1 Quá trình tiền xử lý

Mục tiêu chính của tiền xử lý là để loại bỏ lignin, tách cellulose và hemicellulose thành những phần riêng biệt, tăng diện tích bề mặt tiếp xúc, làm tăng độ xốp của vật liệu

mà vẫn giữ được phần lớn carbohydrate cho quá trình thủy phân bằng enzyme [111]

Tiền xử lý rơm rạ bao gồm các quá trình tiền xử lý bằng các tác nhân khác nhau: Phương pháp vật lý (xay, nghiền), tiền xử lý bằng hóa chất (kiềm, axit loãng, chất oxi hóa

và các dung môi hữu cơ), tiền xử lý hóa lí (nổ hơi nước / thủy phân cao áp, nhiệt thủy phân

và oxy hóa ướt) và phương pháp sinh học (sử dụng nấm mục nâu, nấm mục trắng, vi nấm)….Tuy nhiên một số phương pháp tiền xử lý lại có nhược điểm: Phương pháp vật lí

và hóa lí (nghiền, nổ hơi,…) tiêu hao năng lượng cao, yêu cầu phải có thiết bị chuyên dụng

và năng suất thấp; phương pháp sinh học hạn chế ở điểm thời gian kéo dài và khó thực hiện ở qui mô công nghiệp, ngoài ra một số phương pháp tiên tiến như tiền xử lý bằng chất lỏng ion, nước siêu tới hạn,… thì không có tính khả thi Những phương pháp thường gặp nhất là các qui trình tiền xử lý kết hợp hai hay nhiều tác nhân với nhau như vật lí - hóa học, vật lí - sinh học,… nhưng hiệu quả còn chưa được cao [100] Tiền xử lý bằng phương pháp hóa học đã được chứng minh là phương pháp hiệu quả cho việc tách các chất vô cơ, lignin, các chất trích ly có trong rơm rạ và cải thiện bề mặt của rơm rạ, góp phần thúc đẩy quá trình thủy phân bằng enzyme [46]

Hình 1.7 Sơ đồ sản xuất axit lactic từ rơm rạ [7]

Lignocellulose (Rơm rạ)

Axit lactic

1.3.1.1 Tiền xử lý rơm rạ bằng axit hữu cơ

Tác nhân dùng để tách loại lignin trong quá trình tiền xử lý rơm rạ bằng axit hữu cơ

là một hỗn hợp của các axit mạnh như axit H2SO4 đặc, HCl đặc,… hoặc các axit hữu cơ loãng (axit axetic, axit focmic) Tuy nhiên, khi sử dụng axit loãng thì các loại đường của hemicellulose có thể tiếp tục suy thoái đến furfural và hydroxymethyl furfural, là những chất ức chế mạnh tới quá trình lên men bởi vi sinh vật Tiền xử lý bằng axit đặc có nhược điểm ăn mòn thiết bị và chi phí cao nếu như không tái sử dụng được axit [111]

1.3.1.2 Tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm

Tiền xử lý sinh khối lignocellulose bằng kiềm dựa trên tác động của một số bazơ lên vật liệu Phương pháp này làm tăng khả năng thủy phân của cellulose và tách loại lignin, ít hòa tan cellulose và hemicellulose so với phương pháp tiền xử lý axit Phương pháp này sẽ có hiệu quả cao khi xử lý chế phẩm nông nghiệp [61] Các tác nhân kiềm thường sử dụng trong phương pháp kiềm là các hydroxit của natri, kali, canxi và amoni

Parameswaran B và cộng sự đã nghiên cứu tiền xử lý rơm rạ bằng NaOH ở các nồng độ 1% đến 5%, tỉ lệ dịch : rơm rạ là 1/10 ở nhiệt độ 85oC trong 60 phút, sau đó thủy phân bằng enzyme Hàm lượng đường thu được là 24,6% so với rơm rạ khô ban đầu Tuy nhiên do nồng độ kiềm cao, quá trình tiền xử lý diễn ra ở nhiệt độ trung bình trong điều kiện dư hóa chất dẫn đến sự phân hủy cellulose và làm giảm lượng đường thu được [89]

Nutawan Y và cộng sự nghiên cứu tiền xử lý rơm rạ bằng NaOH và tìm ra được điều kiện thích hợp để thu được lượng đường glucose cao nhất đạt hiệu suất 25,45% so với rơm rạ khô ban đầu ở các điều kiện nồng độ NaOH 2,96%; nhiệt độ 81,8o

C; thời gian 56,7 phút [81]

Nguyen T.M.P và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu quá trình tiền xử lý rơm rạ bằng NaOH theo phương pháp nấu kín và đưa ra kết quả tối ưu của quá trình là: Mức dùng NaOH 0,1N 5%, nhiệt độ 100oC, thời gian xử lý 120 phút, hiệu suất đường khử thu được là

48,7% so với rơm rạ khô ban đầu [79]

1.3.2 Quá trình thủy phân

Quá trình thủy phân là một bước quan trọng để nâng cao hiệu suất thu hồi đường lên men từ lignocellulose sau quá trình tiền xử lý, đồng thời nó cũng là điều kiện cần thiết cho vi khuẩn lactic sử dụng các loại đường lên men như là nguồn carbon [66, 113, 138]

Có 2 loại enzyme cần thiết để chuyển đổi cellulose và hemicellulose thành các loại đường hòa tan: cellulase và hemicellulase [56, 121, 141]

Cellulose được thủy phân bởi hỗn hợp 3 enzyme [80, 85, 91, 120]

- Endoglucanase (EGS) thủy phân liên kết β - 1,4 glucoside của cellulose tinh thể ở

vị trí bất kì để tạo ra các đầu không khử và giải phóng ra cellodextrin, cellobiose và glucose tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme cellobiohydrolase hoạt động

- Cellobiohydrolase (CBHs) cắt chuỗi cellulose từ đầu không khử, giải phóng ra chủ yếu cellobiose

- β - 1,4 glucosidase thủy phân cellobiose và các cello - oligosaccharide thành glucose và enzyme này bị kìm hãm bởi chính glucose (sản phẩm thủy phân của nó) Do đó, sản phẩm thủy phân cellulose gồm 2 sản phẩm chính glucose và cellobiose

Như vậy, để tăng hiệu quả kinh tế và tính khả thi của quá trình lên men lactic từ sinh khối cellulose đòi hỏi phải có chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng đường cellobiose

có trong dịch thủy phân cellulose [5] Vì vậy, phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose là hướng đi tích cực

Hình 1.8 Cơ chế thủy phân của cellulose [85]

Không giống như cellulose, hemicellulose có bản chất hóa học khá phức tạp và quá trình thủy phân của nó đòi hỏi nhiều enzyme Enzyme thủy phân của hemicellulose bao gồm: endo-1,4-xylanase, β-xylosidase, β-glucuronidase, α-l-arabinofuranosidase và acetylxylan esterase, chúng tác động lên quá trình thủy phân xylan [25, 101]

Hình 1.9 Cơ chế thủy phân của hemicellulose [110]

Hiệu quả quá trình thủy phân lignocellulose của một hỗn hợp enzyme phụ thuộc vào tính chất của mỗi enzyme và tỉ lệ của chúng trong hỗn hợp enzyme [48, 54]

Nguyen T.M.P và cộng sự tối ưu hóa quá trình thủy phân rơm rạ sau tiền xử lý bằng quy hoạch thực nghiệm Box - Behnken, sử dụng phần mềm Design Expert 7.0 và đưa

ra kết luận: Nồng độ cơ chất 10,7%; mức sử dụng enzyme 15,6U/g (hỗn hợp enzyme thương phẩm Cellic® Ctec2 và Cellic®Htec2 với tỉ lệ tương ứng 4:1 về thể tích); thời gian thủy phân 94,2h thì thu được 107,86 g/l đường trong đó có 49,42% glucose, 29,41% cellobiose, 17,87% xylose, 0,32% galactose và 2,97% arabinose [79]

1.3.3 Quá trình lên men sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bằng vi khuẩn lactic

Quá trình lên men được mô tả bởi sự phân giải của cơ chất (glucose, xylose, cellobiose,…) do vi sinh vật thành các chất như axit lactic, ethanol, axit axetic,… Axit lactic được sản xuất từ các loại đường monosaccharide hoặc disaccharide qua con đường đường phân EMP Trong điều kiện yếm khí, axit piruvic sẽ tạo thành axit lactic bởi các enzyme lactate dehydrogenase [74]

Thủy phân và lên men riêng biệt (SHF) là một quá trình trong đó giai đoạn thủy phân bằng enzyme sẽ tách riêng với giai đoạn lên men Ưu điểm của SHF là mỗi giai đoạn đều thực hiện được trong điều kiện tối ưu Tuy nhiên, nhược điểm chính của phương pháp này là sự ức chế phản hồi của các loại đường monosaccharide và disaccharide lên hoạt động của các enzyme trong quá trình thủy phân [52, 92]

Lên men sản xuất axit lactic từ đường xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Chủng vi sinh vật, nguồn cơ chất và điều kiện lên men (chế độ lên men, pH, nhiệt độ, tỉ lệ cấp giống,…)[43]

hệ enzyme hemicellulase và cellulase, dịch thủy phân của lignocellulose ngoài đường glucose sẽ thu nhận được thêm 2 loại đường chiếm tỉ lệ khá lớn đó là đường xylose và cellobiose [7]

Trong số các nguồn sinh khối lignocellulose đa dạng thì rơm rạ là nguồn sinh khối chiếm số lượng khá lớn Hiện nay, nghiên cứu lên men sản xuất axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ mới chỉ tập trung vào khai thác nguồn đường glucose mà chưa sử dụng triệt để

2 nguồn đường xylose và cellobiose Như vậy, để tăng giá trị kinh tế của rơm rạ, hạn chế ảnh hưởng của rơm rạ đến môi trường và tăng hiệu quả cho quá trình sản xuất axit lactic thì hỗn hợp đường trong dịch thủy phân rơm rạ đặc biệt là 2 nguồn đường xylose và cellobiose cần phải được sử dụng đồng thời

a Cơ chế quá trình lên men axit lactic từ đường xylose

Cũng giống như lên men axit lactic từ đường glucose, lên men axit lactic từ đường xylose cũng có 2 con đường là lên men đồng hình và lên men dị hình Enzyme chìa khóa cho lên men axit lactic từ xylose là enzyme xylose isomerase và xylulokinase [112]

- Cơ chế lên men axit lactic đồng hình từ xylose (con đường pentozaphotphat (PP))

Theo con đường chuyển hóa này, ribose 5 photphat được hình thành thông qua enzyme transketolase và thông qua một loạt các phản ứng với sự tham gia của các enzyme transketolase và transaldolase để tạo ra fructose - 6P Đến giai đoạn này, quá trình chuyển

Con đường PP sản xuất ra 5 mol của axit lactic từ 3 mol của xylose mà không mất carbon, do đó cung cấp một năng suất axit lactic lý thuyết của xylose là 1,0 g/g hoặc 1,67 mol/mol [86, 112]

3Xylose + 2Pi + 2ADP 5 Lactic + 2ATP

- Cơ chế lên men axit lactic dị hình từ đường xylose (con đường phosphoketolase (PK))

Trong con đường PK, glucose 6-phosphate (6C) ban đầu được chuyển đổi sang ribulose 5-phosphate (5 carbon) và carbon dioxide (1 carbon) được xúc tác bởi một số enzyme, kết quả ribulose 5-phosphate được phân tách thành 1 mol của glyceraldehyde 3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate (acetyl-P) Sau đó GAP được chuyển thành axit pyruvic và tiếp theo thành axit lactic (3 carbon) là một sản phẩm cuối cùng, trong khi acetyl-P được chuyển hóa tổng hợp acetic axit hoặc ethanol (cả 2 nguyên tử carbon) Do

đó, năng suất chuyển hóa lý thuyết các đường xylose thành axit lactic là 0,6 g/g hoặc 1,0 mol/mol theo con đường PK [90]

Xylose + 2 ADP + 2 Pi Lactic + Acetic + 2 ATP + 2 H2O

Hình 1 10 Cơ chế lên men axit lactic từ đường xylose [8]

Các enzyme: (1) Xylose isomerase; (2) Xylulokinase; (3) Transketolase; (4) Transaldolase; (5) 6-phosphofructokinase; (6) Triosephosphate isomerase; (7) Fructose -bisphosphate aldolase; (8) Lactate dehydrogenase; (9) Phosphoketolase; (10) Acetat kinase (11) Phosphotransacetylase; (12) Aldehyde dehydrogenase; (13) Alcohol dehydrogenase

b Cơ chế quá trình lên men axit lactic từ đường cellobiose

Hình 1 11 Cơ chế lên men axit lactic từ đường cellobiose [8]

Các enzyme: (1) Hexokinase; (2) phosphate isomerase; (3) phosphatedehydrogenase; (4) 6-phosphogluconate dehydrogenase; (5) Ribolose-5-phosphate; (6) Phosphoketolase; (7) Acetate kinase; (8) Phosphotransacetylase; (9) Aldehyde dehydrogenase; (10) Alcohol dehydrogenase; (11) Lactate dehydrogenase; (12)

transketolase; (13) Transaldolase; (14) 6-phosphofructokinase; (15) Fructose - bisphosphate aldolase; (16) Triosephosphate isomerase

- Cơ chế lên men axit lactic đồng hình từ cellobiose

Dưới tác dụng của enzyme β - glucosidase, cellobiose chuyển hóa thành glucose Sau đó quá trình lên men đồng hình cellobiose tương tự như quá trình lên men đồng hình của glucose Con đường này thường gọi là con đường pentose phosphate (PP) Các enzyme tham gia chuyển hóa glucose thành axit lactic chính là glucose-6P isomerase (EC 5.3.1.9), 6-phosphofructokinase (EC 2.7.1.11) và fructose - bisphosphate aldolase (EC.4.2.1.13)

Quá trình chuyển hóa diễn ra theo 2 hướng

+ Cellobiose dưới tác dụng của enzyme β - glucosidase và hexokinase sẽ chuyển hóa thành glucose 6-P Sau đó dưới tác dụng của enzyme glucose-6-phosphate isomerase

sẽ tạo thành fructose 6-P và enzyme 6-phosphofructokinase để tạo thành fructose 1,6-P Sau đó dưới tác dụng của enzyme fructose - bisphosphate aldolase, triosephosphate isomerase và lactate dehydrogenase để tạo ra axit lactic

+ Qua 1 chuỗi các phản ứng sinh hóa, kết quả là từ xylulose 5-P tạo thành 1 phân tử glycealdehyde 3-P (GAP) Sau đó, mỗi phân tử GAP lại tạo thành 1 phân tử piruvate bằng các con đường chuyển hóa khác nhau Cuối cùng 1 phân tử piruvat sẽ tạo thành 2 phân tử axit lactic là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men

Sản phẩm của lên men đồng hình từ đường cellobiose chủ yếu là axit lactic (chiếm hơn 90%) và còn lại một số chất khác (axit acetic, rượu, CO2…) chiếm tỉ lệ nhỏ

- Cơ chế lên men axit lactic dị hình từ cellobiose

Không có sự tham gia của các loại enzyme transketolase mà thay vào đó là enzyme phosphoketolase, do đó con đường chuyển hóa này có tên là phosphoketolase, ngoài ra còn

có sự tham gia của 1 số loại enzyme khác

Sản phẩm của quá trình này là GAP và acetyl - P Từ GAP tạo thành 1 phân tử piruvate rồi thành 1 phân tử axit lactic

Từ acetyl - P, nếu nhường 1P cho phân tử ADP trong quá trình tạo thành 1 phân tử cao năng ATP sản phẩm sẽ tạo thành là axit acetic Nếu có sự tham gia của CoA thì sản phẩm sẽ là ethanol

Sản phẩm của lên men dị hình đường cellobiose ngoài axit lactic còn có axit axetic; ethanol;…

1.3.3.2 Chủng giống vi sinh vật

Axit lactic có thể được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu có khả năng tái tạo bởi các loài vi sinh vật (VSV) khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, vi tảo và vi khuẩn lam Lựa chọn các chủng VSV là rất quan trọng, đặc biệt ảnh hưởng đến độ tinh khiết quang học của axit lactic và hiệu suất sản xuất axit lactic [8] Ngoài ra, sử dụng tổ hợp các chủng VSV trong quá trình lên men lactic có thể tạo ra sự kết hợp của các con đường trao đổi chất và do đó nâng cao hiệu quả sản xuất axit lactic [30, 60, 76, 114]

Vi khuẩn sản xuất axit lactic bao gồm các chủng tự nhiên và chủng đột biến Những sinh vật này có thể được chia thành 4 nhóm chính: Vi khuẩn lactic (LAB), các chủng của

chi Bacillus, loài Escherichia coli và Corynebacterium glutamicum [8] Tuy nhiên trong

quá trình lên men ở qui mô công nghiệp, việc sử dụng các loài khác nhau của chi

Lactobacillus được ưa thích vì khả năng chuyển hóa, năng suất và tốc độ trao đổi chất cao

hơn [71]

a Vi khuẩn lactic (LAB)

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn thường Gram dương, không di động, không tạo thành bào tử và không có hình thái cố định (bao gồm hình que và hình cầu) nhưng về mặt sinh lí chúng tương đối đồng nhất, bao gồm 20 chi trong đó có những chi chính như

Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weisella và Streptococcus Trong đó, Lactobacillus là chi lớn nhất bao gồm 80 loài

Vi khuẩn lactic thu nhận năng lượng nhờ phân giải carbohydrat và sinh ra axit lactic Vi khuẩn lactic không chứa xitocrom và enzyme catalase, chúng là các vi khuẩn sống từ kị khí đến vi hiếu khí [132]

Vi khuẩn lactic có nhu cầu về các chất dinh dưỡng rất phức tạp bởi vì chúng không

có nhiều khả năng tự sinh tổng hợp nên các chất dinh dưỡng Nhu cầu về dinh dưỡng của

vi khuẩn lactic khác nhau là khác nhau, đặc biệt là nhu cầu về vitamin và nitơ Vi khuẩn lactic thường có ở trong sữa và các sản phẩm từ sữa, trên bề mặt của xác thực vật đang

phân giải, trong ruột và ở vài lớp màng nhầy của người và động vật Lactobacillus, Leuconostoc có nhiều trong thực vật thối rữa như rau bị hỏng hoặc phân động vật,…[140]

LAB có điều kiện phát triển trong phạm vi pH 3,5-10,0 và nhiệt độ 5- 45°C [8] Theo mô hình lên men và sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men, vi khuẩn lactic chia thành 2 loại: Vi khuẩn lên men đồng hình và vi khuẩn lên men dị hình [116] Vi khuẩn lên men đồng hình tạo ra sản phẩm cuối cùng là axit lactic chiếm hơn 85%, trong khi đó vi khuẩn lên men dị hình ngoài axit lactic chiếm khoảng 40%, còn tạo ra axit axetic, ethanol,

CO2,…Hầu hết LAB bao gồm cả chi Lactobacilli được xem là an toàn cho sức khỏe của

người tiêu dùng và người sản xuất Những chủng LAB công nghiệp quan trọng như các chi

Lactobacillus đặc biệt hữu ích do chúng có khả năng chịu axit cao và khả năng sản xuất D-

axit lactic hoặc L- axit lactic [17, 63, 64]

- Vi khuẩn lactic có khả năng lên men axit lactic từ xylose

Xylose là thành phần chính của dịch thủy phân hemicellulose của lignocellulose từ phế thải nông nghiệp, là loại đường nhiều thứ hai tiếp sau glucose trong tự nhiên [86] Tuy nhiên, xylose lại không có giá trị như là nguồn dinh dưỡng với nhiều loại vi sinh vật, do đó phần lớn vi sinh vật không thể lên men xylose [112] Vì vậy, sử dụng hiệu quả nguồn đường xylose trong lên men sản xuất axit lactic cũng là một trong những phương pháp thúc đẩy việc sử dụng nguồn nguyên liệu lignocellulose trong đó có rơm rạ [84]

Đa số các chủng LAB có thể chuyển hóa đường glucose thành axit lactic nhưng không thể chuyển hóa đường pentose (xylose) thu được từ dịch thủy phân hemicellulose [7]

Phần lớn chủng LAB dị hình chuyển hoá đường pentose để tạo thành axit lactic và các sản phẩm phụ (axit axetic, etanol, ) qua con đường PK với lượng axit lactic lớn nhất

Tài liệu tham khảo

Enterococcus mundtii QU25

sự (2011)

Nhìn chung, nhiều vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Lactococcus được công bố

có khả năng lên men xylose [7, 44, 50, 55] Tuy nhiên, những vi khuẩn phân lập từ tự nhiên hầu hết đều lên men dị hình, với năng suất lý thuyết của axit lactic 60% tính theo

trọng lượng xylose được tiêu thụ [114] chẳng hạn như các chủng L xylosus, L pentosus,

Lc lactic IO-1, Lc lactic IO-1(JCM 7638) (bảng 1.2), chỉ có chủng tự nhiên E mundtii

QU 25 và chủng đột biến L plantarum NCIMB 8826; Lc lactis IL 1403 có khả năng lên

men axit lactic hiệu suất cao (bảng 1.2)

Xylose là thành phần chính của quá trình thủy phân hemicellulose của lignocellulose, một số chủng LAB có khả năng lên men từ dịch thủy phân hemicellulose của lignocellulose, cụ thể như:

L bifermentans DSM 20003 có khả năng lên men dịch thủy phân cám lúa mì chứa

xylose 50 ± 5 g/l; glucose 18 ± 3 g/l; arabinose 29 ± 5 g/l Sau 54 giờ lên men, glucose, arabinose được tiêu thụ hết, xylose vẫn còn dư và hiệu suất lên men axit lactic đạt 83% [39]

L pentosus ATCC 8041 có khả năng lên men đường xylose thu được từ dịch thủy

phân hemicellulose của chồi cây nho, dịch thủy phân thu được chủ yếu là đường xylose 17,5 g/l; 12 g/l glucose và một phần nhỏ đường arabinose 4,3 g/l, hiệu suất lên men axit lactic là 77% [23]

Sản xuất axit lactic từ chất thải rắn của nhà máy bột giấy sử dụng chủng L delbrueckii RRL B445 có khả năng lên men sản xuất axit lactic từ xylose Thomass S đã

thu được hiệu suất lên men lactic đạt từ 88 - 92% [117]

Ngoài ra, để tăng hiệu suất lên men axit lactic từ dịch thủy phân hemicellulose của lignocellulose, một số tác giả đã kết hợp 2 chủng vi khuẩn với nhau, chẳng hạn như:

Arvid G và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất axit lactic từ dịch đường thu được từ

quá trình thủy phân hemicellulose của rơm lúa mì bằng enzyme bởi hỗn hợp loài L pentosus và L brevis Hiệu suất lên men axit lactic từ dịch thủy phân lúa mì bởi L pentosus CHCC 2355 là 88%, bởi L brevis CHCC 2097 là 51% và bởi hỗn hợp L pentosus và L brevis là 95% [15]

- Vi khuẩn có khả năng tổng hợp axit lactic từ cellobiose.

Sinh khối cellulose là một nguồn sinh khối phong phú, có khả năng tái tạo, giá thành rẻ và có chứa một lượng đường đáng kể Cellulose là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất axit lactic Do đó, để tăng hiệu quả sử dụng nguồn nguyên liệu này đòi hỏi phải có các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng các loại đường chính thu được từ quá trình thủy phân cellulose đó là đường glucose và cellobiose [6]

Một số các nghiên cứu trong lên men axit lactic từ cellobiose bằng cách sử dụng

chủng LAB bao gồm: L delberueki mutant Uc -3; L plantarum đột biến; L lactis mutant

RM 2-24 Nhưng tất cả các chủng này là đột biến hoặc tái tổ hợp chủng Gần đây, Abbel -

Rahman M.A và cộng sự đã phân lập thành công chủng hoang dại E mundtii QU 25 có

khả năng lên men đồng hình đường cellobiose (Bảng 1.3)

Bảng 1.3 Một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ cellobiose

Chủng vi khuẩn Hiệu suất lên

men lactic (%) Tài liệu tham khảo

Như vậy, ngoài chủng tự nhiên E mundtii QU25 thì chỉ có các chủng đột biến mới

lên men axit lactic từ cellobiose (Bảng 1.3) Vì vậy, phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn

có nguồn gốc tự nhiên có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose là cần thiết

- Vi khuẩn có khả năng tổng hợp axit lactic từ dịch thủy phân lignocellulose

Kim J.H và cộng sự đã nghiên cứu chuyển hóa rơm rạ thành axit lactic bởi chủng

L brevis, chủng này có khả năng sử dụng đường xylose và glucose Sau 24 giờ lên men thu

được 30,5 g/l axit lactic; 16,7 g/l axit axetic; 5,2 g/l ethanol, hiệu suất lên men axit lactic là 53,32% [59]

Guo W và cộng sự đã chỉ ra rằng khi sử dụng dịch thủy phân cây ngô, L brevis

S3F4 tạo ra 39 g/l axit lactic từ một hỗn hợp chứa khoảng 57 g/l đường, đạt hiệu suất lên

men axit lactic là 74% Quan trọng hơn, L brevis chuyển hóa đồng thời glucose và xylose

và cho thấy không có sự ức chế tăng trưởng hoặc giảm sự hình thành sản phẩm trong sự hiện diện của 10 mM furfural và axit ferulic [41]

Trong dịch thủy phân của lignocellulose ngoài đường glucose còn có đường xylose, cellobiose và arabinose Việc lựa chọn các chủng giữ một vai trò quan trọng cho việc chuyển đổi hiệu quả của hỗn hợp đường Do đó, kết hợp các chủng vi khuẩn với nhau trong lên men axit lactic là cần thiết để nâng cao hiệu suất lên men Dựa trên điều này, một

hỗn hợp của L rhamnosus (lên men đồng hình glucose) và L brevis ATCC 367 (lên men

dị hình xylose) đã được nghiên cứu để cải thiện khả năng sử dụng các loại đường thu được

từ hemicellulose và cellulose từ cây ngô (trừ hạt ngô) Khi sử dụng hai chủng lên men

đồng thời từ sẽ tạo ra hiệu suất lên men axit lactic là 70% cao hơn khi chỉ sử dụng chủng L rhamnosus (hiệu suất lên men axit lactic 59%) hoặc chủng L brevis ATCC 367 (hiệu suất

lên men axit lactic là 54%), ngoài ra sản phẩm axit lactic thu được từ quá trình lên men của

2 chủng là hỗn hợp D, L axit lactic [30]

Zhang Y và cộng sự sử dụng kết hợp L brevis ATCC 367 và L plantarum ATCC

21028 trong quá trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân cây ngô đạt hiệu suất lên men

axit lactic là 78% cao hơn khi chỉ sử dụng đơn chủng L plantarum ATCC 21028 (hiệu suất lên men axit lactic đạt 50%) và chủng L brevis ATCC 367 (hiệu suất lên men axit lactic

đạt 39%) Sản phẩm axit lactic thu được từ quá trình lên men của kết hợp 2 chủng là hỗn hợp D,L axit lactic [142]

Sản xuất axit lactic từ dịch thủy phân của thân cây đậu tương bởi L sake và L casei Hỗn hợp đường thu được từ quá trình thủy phân bao gồm glucose, xylose và cellobiose theo tỷ lệ 3,9: 1,7: 1 Quá trình lên men của dịch thủy phân này bởi từng loài L sake và L casei tạo ra hiệu suất lên men axit lactic tương ứng là 48% và 56% nhưng hiệu suất lên men axit lactic tăng lên 71% khi sử dụng đồng thời cả hai loài L sake và L casei

[145]

Nancib A và cộng sự đã so sánh khả năng sản xuất axit lactic từ dịch quả chà là

bằng các loài đơn hoặc hỗn hợp loài L casei và L lactis Lên men axit lactic sử dụng hỗn hợp loài thì nồng độ axit lactic là 60,3 g/l, khi chỉ sử dụng L lactis thì nồng độ axit lactic đạt được 42 g/l, nếu sử dụng L casei thì nồng độ axit lactic đạt 53 g/l [76]

Tóm lại, để tăng hiệu quả sử dụng sinh khối lignocellulose nói chung và rơm rạ nói riêng trong sản xuất axit lactic đòi hỏi các loại đường chính thu được từ quá trình thủy phân lignocellulose (glucose, cellobiose, xylose,…) phải được sử dụng hiệu quả Tuy nhiên, đa số LAB có khả năng lên men glucose nhưng LAB có khả năng lên men xylose và cellobiose chưa thực sự nhiều Do đó, việc phân lập và tuyển chọn chủng LAB có khả năng lên men xylose, cellobiose là một hướng đi tích cực Ngoài ra, sử dụng kết hợp chủng LAB

với nhau trong lên men axit lactic từ dịch thủy phân lignocellulose là cần thiết để nâng cao hiệu suất lên men lactic

b Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Để đảm bảo sự tồn tại và tăng trưởng, môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic phải đảm bảo đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết: Nguồn carbon, nguồn nitơ, chất khoáng và các vi

tamin [96]

+ Nguồn dinh dưỡng carbon

Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy có thể là các loại đường, axit amin và axit hữu [30] Carbon rất quan trọng cho sự tăng trưởng của vi sinh vật hoặc lên men Trong lên men axit lactic có thể sử dụng các nguồn carbon khác nhau: glucose, fructose, saccarose, xylose, cellobiose, hoặc nguồn nguyên liệu có chứa đường như whey, rỉ đường, tinh bột, [55] Nguồn carbon được lựa chọn là quan trọng vì nó sẽ ảnh hưởng đến sản xuất axit lactic cũng như con đường chuyển hóa

Trong những năm gần đây, lignocellulose được coi như là nguồn nguyên liệu cho lên men sản xuất axit lactic, điều này đã thúc đẩy việc sử dụng nguồn đường xylose,

cellobiose có trong lignocellulose [69, 84] L xylosus và L rhamnosus đã được sử dụng

trong môi trường chứa hỗn hợp đường glucose, xylose và trong dịch thủy phân của gỗ [50, 122] L rhamnosus ATCC 7469 cũng có khả năng sử dụng cellobiose như là nguồn carbon trong lên men sản xuất axit lactic từ bùn giấy tái chế [68]

Các chi vi khuẩn có khả năng lên men dị hình đường pentose như Lactobacillus, Lactococcus, Enterococci và Pediococcus Tuy nhiên, một số loài vi khuẩn lactic lên men

xylose và tốc độ tăng trưởng trong môi trường chứa xylose thấp hơn trong môi trường chứa glucose [112]

Các loài vi khuẩn lactic khác nhau có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác

nhau L debbrueckii có thể sử dụng đường maltose, glucose, galactose, saccarose, dextrin

và không sử dụng lactose; L brevis sử dụng được glucose, xylose nhưng không sử dụng

được cellobiose, một số loài vi khuẩn lactic có thể sử dụng được dextrin và tinh bột,

Mức độ ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật khác nhau tùy thuộc vào loại cơ chất, chẳng hạn glucose có thể ức chế ở nồng độ trên 200 g/l, nguyên nhân có thể là do giảm hoạt độ nước Trong công nghiệp lên men, nồng độ đường trong môi trường ban đầu được điều chỉnh đến 5 - 20% [106]

+ Nguồn dinh dưỡng nitơ

Lên men axit lactic thường sử dụng 2 nguồn nitơ đó là nitơ hữu cơ (peptone, cao

Loại và nồng độ các nguồn nitơ ảnh hưởng đến lên men axit lactic Cao nấm men là nguồn nitơ thường được sử dụng nhất trong quá trình lên men axit lactic Nồng độ axit lactic tăng đồng thời với việc tăng nồng độ của cao nấm men Tốc độ tạo ra axit lactic cao nhất đã được tìm thấy khi bổ sung 5-15 g/l cao nấm men [40, 67] Sử dụng cao nấm men tạo ra hiệu suất lên men axit lactic cao hơn so với các nguồn nitơ khác như malt, bột đậu nành, urê, tryptone, casein thủy phân,… [44, 67]

+ Nguồn dinh dưỡng vitamin

Vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin, vì vậy cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy các vitamin Các vitamin đóng vai trò là coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào ( một vai trò quan trọng không thể thay thế được) Các vi khuẩn lactic khác nhau thì nhu cầu dinh dưỡng vitamin cũng khác nhau Các vitamin (chủ yếu thuộc nhóm B) có trong cao nấm men là nhân tố đóng vai trò quan trọng trong nhiều phản ứng enzyme và để kích thích sự phát triển của vi khuẩn [69]

+ Các hợp chất khoáng

Khoáng chất (Mg, Mn và Fe) được cung cấp trong môi trường nuôi cấy và lên men

ở dạng muối (MgSO4, MnSO4 và FeSO4)

Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển của các vi khuẩn lactic cần phức hợp các hợp chất vô cơ như: Photpho, lưu huỳnh, kali, magie, mangan, đồng, sắt, natri… đặc biệt là mangan Mangan ngăn cản quá trình tự phân của tế bào và nó cần thiết cho quá trình sống bình thường của vi khuẩn Chính vì vậy mà trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic, người ta thường bổ sung muối MnSO4 Đối với Lactobacillus thì Mn2+

, Mg2+, Fe2+

có tác dụng tích cực lên sự phát triển và sản sinh ra axit lactic

1.3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lên men axit lactic

Lên men axit lactic bởi vi sinh vật chịu ảnh hưởng bởi một số điều kiện bao gồm

pH, tốc độ lắc, nhiệt độ, nguồn carbon, thành phần môi trường, kích thước và độ tuổi của giống, tỷ lệ thông khí, nồng độ đường ban đầu và chế độ lên men (liên tục, bán liên tục hoặc lên men gián đoạn) [16, 43]

a Ảnh hưởng của nhiệt độ

Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sản xuất axit lactic đã được nghiên cứu cho các

chủng vi sinh vật khác nhau Chẳng hạn, L amylophilus được biết đến có khả năng tăng

trưởng ở khoảng nhiệt độ 15°C - 45°C nhưng nhiệt độ tối ưu là 25°C và ở nhiệt độ 35°C cho năng suất và sản lượng tối đa [139] Khoảng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic khá rộng, một số loài có thể phát triển được ở 55oC nhưng cũng có loài phát triển được ở 5o

C Nhìn chung đa số vi khuẩn lactic có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 15 –