Lao là một trong những bệnh truyền nhiễm hàng đầu gây tỷ lệ tử vong trên thế giới ngày nay. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 1/3 dân số thế giới nhiễm lao. Mỗi năm, có thêm gần 9 triệu người mắc lao mới và khoảng 1,3 triệu người tử vong do lao. Trong đ , 81 số bệnh nhân thuộc về 22 nước c g nh n ng bệnh lao [133]. Trong khi đ , tỷ lệ ph t hiện m c dù liên tục được cải thiện nhưng chỉ đạt 66 số bệnh nhân ước tính [133], do c những hạn chế về công t c chẩn đo n, đ c biệt là lao kh ng thuốc. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được ph t hiện và chữa trị đang tiếp tục lây lan cho cộng đồng. Theo thống kê của WHO, Việt Nam là một quốc gia c tỷ lệ bệnh lao cao. Theo b o c o của Chương trình Chống lao Quốc gia (CTCLQG) năm 2013, tổng số người mắc lao là 190.000; trong đó, số người mắc lao mới khoảng 130.000, số trường hợp tử vong do lao ước t nh là 17.000 người. Tình hình kh ng thuốc của vi khuẩn lao tại Việt Nam đang là một vấn đề đ ng lo ngại. Tỷ lệ vi khuẩn lao kh ng đa thuốc ở bệnh nhân điều trị lại là 23 , ở bệnh nhân lao mới là 4% [4]. Trong c c loại kh ng thuốc của vi khuẩn lao, kh ng rifampicin và isoniazid - những thuốc chủ l c trong điều trị lao - được quan tâm nhất vì thường dẫn đến thất bại trong điều trị và tử vong. Theo định nghĩa của WHO, “lao kh ng đa thuốc” là trường hợp kh ng với t nhất đồng thời rifampicin và isoniazid [135]. S đề kh ng với 2 thuốc chống lao dòng 1 này được cho là c đột biến trên một số gen liên quan, đ c biệt là c c gen rpoB và katG. Các nghiên cứu về t nh kh ng thuốc của vi khuẩn lao cho thấy, rất hiếm c c chủng kh ng rifampicin đơn thuần mà thường c t nhất 90 c c chủng lao lâm sàng kh ng rifampicin đồng thời cũng kh ng isoniazid [15], [62]. Như vậy, việc ph t hiện c c chủng lao kh ng rifampicin cũng c nghĩa là x c định được lao kh ng đa thuốc [92]. Các nghiên cứu về phân tử của vi khuẩn lao kh ng rifampicin đã công bố cho thấy, t nh kh ng rifampicin liên quan đến đột biến ở gen rpoB, còn kh ng isoniazid thường liên quan đến đột biến ở gen katG [112], [140]. Chẩn đo n lao kh ng thuốc chủ yếu vẫn d a vào phương ph p kh ng sinh đồ và phải mất khoảng 8 tuần mới cho kết quả. Chẩn đo n nhanh vi khuẩn lao kh ng thuốc, đ c biệt là kh ng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử là cần thiết trong công t c gi m s t và ki ểm so t lao. C c kit thương mại của nước ngoài chẩn đo n lao kh ng thuốc c gi thành cao và thường chỉ nhằm vào c c điểm đột biến 526, 531 trên gen rpoB và 315 trên gen katG. Các nghiên cứu về lao kh ng thuốc ở từng khu v c lại ph t hiện thêm c c điểm đột biến ở vị tr kh c như 514, 533, 176 trên gen rpoB; đ c biệt tần số c c đột biến thay đổi giữa c c cộng đồng người và vùng địa lý [15], [52], [65], [88], [110], [140]. Đ c điểm phân tử của c c chủng kh ng thuốc phân lập được từ c c vùng kh c nhau trên thế giới, nhất là từ c c quốc gia c tỷ lệ bệnh lao và tỷ lệ lao kh ng thuốc cao s tạo điều kiện thuận lợi cho việc ph t triển c hiệu quả hơn c c phương ph p phân tử để ph t hiện nhanh ch ng t nh kh ng thuốc phù hợp với từng nước và từng khu v c. Việt Nam chưa c c c dữ kiện đầy đủ về đ c điểm phân tử của vi khuẩn lao kh ng đa thuốc trong nước nên chưa c cơ sở để p dụng nguyên bản kit chẩn đo n lao kh ng thuốc của nước ngoài. Vì vậy chúng tôi th c hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen rpoB, katG của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam” nhằm mục tiêu: ố ủ ủ ẩ phân lậ ượ năm 2008-2009. ủ ư ẩ ẩ ố ở Việ N .
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
Nguyễn Thị Thu Thái
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN rpoB, katG
CỦA VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành: Vi sinh Y học Mã số: 62.72.01.15
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HÀ NỘI - 2017
Trang 2kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện nhanh chóng tính kháng thuốcphù hợp với từng nước và từng khu vực Đề tài nghiên cứu này nhằmmục tiêu:
1 Xác định đặc điểm phân tử gen rpoB và katG liên quan đến kháng đa thuốc của các chủng vi khuẩn lao phân lập được năm 2008-2009.
2 Xác định giá trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Xác định được đặc điểm phân tử gen rpoB và katG của vi khuẩn
lao kháng đa thuốc phân lập được từ các bệnh viện đại diện cho 3miền Bắc, Trung và Nam của Việt Nam
- Góp phần bổ sung thông tin về các đột biến liên quan đến kháng
đa thuốc ở vi khuẩn lao và là cơ sở khoa học cho việc khuyến cáo lựachọn một bộ các đột biến có thể sử dụng để sàng lọc lao kháng đathuốc với độ nhạy và độ đặc hiệu cao
Trang 3- Đề xuất sử dụng 4 codon đột biến (rpoB531, rpoB526, rpoB516
và katG315) đưa vào sử dụng trong test phân tử sàng lọc lao kháng
đa thuốc ở các trường hợp nghi ngờ lao kháng đa thuốc ở Việt Nam
BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN
Luận án gồm 114 trang: Đặt vấn đề: 02 trang, Tổng quan: 31trang, Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 18 trang, Kết quảnghiên cứu: 25 trang, Bàn luận: 35 trang, Kết luận: 02 trang, Kiếnnghị: 01 trang Luận án có 29 bảng, 01 biểu đồ, 16 hình minh họa,
142 tài liệu tham khảo trong đó có 12 tài liệu tiếng Việt, 130 tài liệutiếng Anh
Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh lao
Lao là căn bệnh truyền nhiễm xuất hiện từ lâu Sự tương tác giữalao, đại dịch HIV/AIDS và sự phát triển của các chủng lao khángthuốc gây ra những thách thức vô cùng to lớn cho cuộc chiến chống
lao của loài người.
1.1.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới: Hiện nay, trên thế giới có
khoảng 2,2 tỷ người nhiễm lao Theo công bố của WHO, năm 2012
có thêm khoảng 8,6 triệu người mắc lao mới và 1,3 triệu người tửvong do lao Trong số các trường hợp tử vong , có 170 000 trườnghợp lao kháng đa thuốc
1.1.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam: Năm 2012, Việt Nam đứng
thứ 12/22 nước có gánh nặng bệnh lao cao trên toàn cầu Năm 2013,tỉ lệ mắc lao mới các thể là 144/100.000 dân; tỉ lệ hiện mắc lao cácthể là 209/100.000 dân; tỉ lệ tử vong do lao là 19/100.000 dân
1.2 Vi khuẩn lao
Tác nhân gây bệnh lao là một phức hợp gồm nhiều loài được gọi
chung là Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) Khả năng
gây bệnh của các loài là khác nhau, trong đó loài gây bệnh thường
xuyên trên người là Mycobacterium tuberculosis (MTB)
Trang 41.2.1 Đặc điểm hình thể, cấu trúc: Vi khuẩn lao có hình trực mảnh,
khó bắt màu các thuốc nhuộm thông thường Thường nhuộm theophương pháp Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao bắt màu đỏ
1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy: Vi khuẩn lao ưa khí bắt buộc, khó nuôi
cấy và là vi khuẩn mọc chậm, phải 4-6 tuần sau mới hình thànhkhuẩn lạc điển hình, dạng R
1.2.3 Đặc điểm phân tử vi khuẩn lao: Bộ gen hoàn chỉnh của MTB
chủng H37Rv có chiều dài 4.411.532 bp, bao gồm 3974 gen, trong đó có
3924 gen mã hóa cho protein, 50 gen mã hóa cho các RNA chức năng
1.3 Vi khuẩn lao kháng thuốc
1.3.1 Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao hiện nay
Vi khuẩn lao kháng thuốc, đặc biệt kháng đa thuốc đang là mộtthách thức lớn cho công tác phòng chống lao toàn cầu Việt Nam là 1trong 27 nước có gánh nặng bệnh lao kháng đa thuốc trên toàn cầu.Năm 2013, tỷ lệ kháng đa thuốc ở bệnh nhân điều trị lại là 23%, ởbệnh nhân lao mới là 4%
1.3.2 Phân loại kháng thuốc của vi khuẩn lao
Trong các trường hợp lao kháng thuốc cần phải phân biệt: laokháng đơn thuốc, lao kháng đa thuốc, lao kháng đa thuốc mở rộng.Lao kháng đa thuốc (MDR-TB) là vi khuẩn lao kháng ít nhất với cả 2loại thuốc là isoniazid và rifampicin, và có thể kháng thêm một số tácnhân hoá trị liệu khác
1.3.3 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao
Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao được cho là có sự đột biến ởcác gen liên quan
1.3.3.1 Kháng rifampicin: Kháng rifampicin thường do đột biến ở
vùng lõi 81 bp, vùng "hot-spot mutation" (vùng quyết định kháng
rifampicin - RRDR) của gen rpoB, với khoảng 96% chủng MTB
kháng rifampicin phân lập được Kháng đơn với rifampicin rất hiếm
Trang 5gặp, mà hầu hết các chủng lao kháng rifampicin cũng kháng với cácthuốc khác, đặc biệt là isoniazid – kháng đa thuốc
1.3.3.2 Kháng isoniazid: Cơ sở phân tử của tính kháng với isoniazid
phức tạp và do sự đa dạng đột biến ở 5 gen khác nhau của MTB
Trong đó, chủ yếu là do các đột biến ở gen katG Đề kháng isoniazid
là dạng kháng thuốc thường gặp nhất, có thể là kháng đơn độc hoặckết hợp với thuốc khác
1.4 Các phương pháp chẩn đoán lao kháng thuốc
1.4.1 Phương pháp kiểu hình: dựa trên cơ sở sự sinh trưởng của vi
khuẩn lao trên môi trường chứa thuốc kháng sinh Có nhiều phươngpháp kiểu hình, tuy nhiên phương pháp tỷ lệ trên môi trườngLoewenstein-Jensen được sử dụng rộng rãi nhất
1.4.2 Phương pháp xác định kiểu gen: dựa trên cơ sở xác định đột biến
ở các gen có liên quan kháng thuốc tương ứng bằng kỹ thuật sinh họcphân tử Đây là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, rút ngắnthời gian xác định vi khuẩn lao kháng thuốc (1-2 ngày) Trong đó, kỹthuật giải trình tự gen được coi là rất hữu ích và chuẩn xác trong việcphát hiện các đột biến liên quan kháng thuốc của vi khuẩn lao
1.5 Nghiên cứu giá trị chẩn đoán của các phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng đa thuốc
1.5.1 Trên thế giới
Nhiều nghiên cứu đã đánh giá các phương pháp sinh học phân tửkhác nhau trong chẩn đoán lao kháng thuốc và kháng đa thuốc ở cáckhu vực khác nhau trên thế giới Các tác giả trên thế giới đều đánhgiá các kỹ thuật sinh học phân tử có giá trị cao trong việc phát hiệnnhanh tính kháng thuốc, đặc biệt kháng đa thuốc của vi khuẩn lao với
độ nhạy và độ đặc hiệu cao Kỹ thuật giải trình tự ra đời đã được coi làtiêu chuẩn vàng cho việc xác định các đột biến kháng thuốc Vì vậy,nhiều nghiên cứu trên thế giới đã lấy kỹ thuật giải trình tự làm cơ sở để
Trang 6phát triển, thiết kế cũng như đánh giá các kỹ thuật phân tử xác địnhnhanh tính kháng thuốc của vi khuẩn lao.
1.5.2 Tại Việt Nam
Các nghiên cứu trong nước đều có chung nhận xét rằng, việc ápdụng xét nghiệm sinh học phân tử với độ nhạy và độ đặc hiệu cao rất
có lợi ở những nơi có tỉ lệ kháng thuốc cao như Việt Nam; đặc biệt
ưu tiên với các trường hợp nghi ngờ lao kháng đa thuốc cao, nhưbệnh nhân HIV (+), các trường hợp tiếp xúc với lao kháng đa thuốc
và các trường hợp lao tái phát, lao điều trị lại cho phép phát hiện sớmcác trường hợp lao kháng đa thuốc, sẽ là công cụ hỗ trợ hữu hiệu choviệc xây dựng chế độ điều trị phù hợp với bệnh nhân lao, đặc biệtbệnh nhân lao kháng đa thuốc, góp phần hạn chế sự lây lan các chủng
vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt kháng đa thuốc trong cộng đồng
1.6 Gen rpoB và katG liên quan đến kháng thuốc ở vi khuẩn lao
1.6.1 Gen rpoB
Gen rpoB mã hoá cho tiểu phần β của ARN polymerase (một
enzyme quan trọng trong quá trình phiên mã và biểu hiện gen ở
MTB), là đích tác động của kháng sinh rifampicin Gen rpoB có
chiều dài 3534bp, mã hoá cho protein với 1178 acid amin
1.6.2 Gen katG
Gen katG có kích thước 2223bp với 741 codon mã hoá, nằm trên
nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao, chịu trách nhiệm mã hóa cho enzymecatalase – peroxidase (enzyme duy nhất hoạt hoá isoniazid thànhdạng hoạt động)
1.7 Nghiên cứu gen rpoB và katG ở các chủng vi khuẩn lao
1.7.1 Trên thế giới
1.7.1.1 Nghiên cứu trên gen rpoB với kháng rifampicin
Nhiều nghiên cứu ở các khu vực khác nhau trên thế giới đã xácđịnh được phần lớn cơ chế phân tử kháng rifampicin với khoảng 69
Trang 7đột biến điểm thay đổi 1 nucleotid, 3 đột biến thêm đoạn, 16 đột biếnmất đoạn và 38 đột biến thay thế nhiều nucleotid Trong đó, các độtbiến ở các vị trí 531, 526 và 516 là thường gặp nhất và thường gắnliền với các chủng kháng đa thuốc Các kiểu đột biến thường gặpnhất là Ser531Leu, His526Tyr và Asp516Val
1.7.1.2 Nghiên cứu trên gen rpoB với kháng isoniazid
Các nghiên cứu trên thế giới đã đã xác định được hơn 100 loại đột
biến trên gen katG Trong đó, đột biến hay gặp nhất ở vị trí 315, chủ
yếu là kiểu đột biến Ser315Thr, chiếm tới 30-95% các chủng lao lâmsàng kháng isoniazid Vị trí đột biến này được coi là một dấu ấn quantrọng của đề kháng với isoniazid
Tuy nhiên, các nghiên cứu từ nhiều khu vực khác nhau trên thế
giới cũng cho thấy rằng, tần xuất các đột biến trên gen rpoB và katG
rất khác nhau ở các chủng phân lập từ các vùng địa lý khác nhau
1.7.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Tại Việt Nam, cũng đã có nghiên cứu xác định các đột biến xảy ra
trên gen rpoB và katG ở các chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin và
isoniazid Các nghiên cứu trong nước cũng đã sử dụng các kỹ thuậtphân tử khác nhau để xác định các đột biến kháng thuốc Các nghiên
cứu phân tử trên gen rpoB và katG ở các chủng vi khuẩn lao kháng
thuốc mới chỉ tập trung tại một vùng miền nhất định mà chưa baophủ trên toàn quốc, các nghiên cứu cũng thường đánh giá các kỹthuật chẩn đoán áp dụng được và thiết kế thử nghiệm các kỹ thuật ápdụng trên chủng lao được phân lập tại một địa điểm nào đó
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng vi khuẩn lao được phân lập từ các mẫu bệnh phẩmthu thập từ 3 bệnh viện: Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện Đa
Trang 8khoa Trung ương Huế, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - thành phố Hồ ChíMinh trong thời gian 2008-2009
- 143 chủng vi khuẩn lao giải trình tự phát hiện đột biến trên gen
rpoB và katG , trong đó: 30 chủng nhạy cảm với các thuốc chống lao;
54 chủng có kiểu hình kháng với rifampicin (03 chủng kháng đơn vớirifampicin và 51 chủng MDR); 59 chủng có kiểu hình kháng vớiisoniazid (13 chủng kháng đơn với isoniazid và 46 chủng MDR)
2.2 Địa điểm nghiên cứu
Bệnh viện Phổi Trung ương, Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế,Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - TP Hồ Chí Minh, Học viện quân Y,Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Viện Công nghệ sinh học
2.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.3.1 Vật liệu: Các sinh phẩm, hóa chất dùng tách chiết DNA vi
khuẩn lao, tách dòng và giải trình tự gen
2.3.2 Thiết bị: tách chiết DNA vi khuẩn lao, tách dòng và giải trình
tự gen
2.3.3 Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu
Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng cho phản ứng PCR có trình tự tương ứng như sau:
katG_seq katG-F 5’ GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG 3’ 684
katG-R 5’ GTC TCG GTG GAT CAG CTT GT 3’
2.3.4 Phần mềm: Phân tích kết quả giải trì nh tự bằng phần mềm
BioEdit
Trang 92.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Thiết kế nghiên cứu
Tiến hành nghiên cứu bằng phương pháp mô tả cắt ngang vàphương pháp thực nghiệm labo có đối chứng
2.4.2 Phương pháp thu thập số liệu
- Các số liệu về tính kháng thuốc được thu thập và làm kháng sinh
đồ bổ sung tại Bệnh viện Phổi Trung Ương và Bệnh viện Phạm NgọcThạch -TP Hồ Chí Minh
- Kỹ thuật tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn lao được thựchiện tại Học viện quân Y
- Thực hiện kỹ thuật giải trình tự phân tích đặc điểm phân tử gen
rpoB được tiến hành tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, gen katG
tại Viện công nghệ sinh học
Sơ đồ nghiên cứu
2.5 Kỹ thuật xét nghiệm
2.5.1 Kỹ thuật kháng sinh đồ phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc
Được thực hiện tại Bệnh viện Phổi Trung Ương và Bệnh việnPhạm Ngọc Thạch TP Hồ Chí Minh theo quy trình thống nhất củaChương trình chống lao Quốc gia
Trang 102.5.2 Tách chiết DNA từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu
2.5.3 Kỹ thuật PCR nhân đoạn DNA
* Phản ứng PCR nhân đoạn gen rpoB và katG:
Khuếch đại DNA trên gen rpoB (sản phẩm PCR có chiều dài 528
bp, chứa vùng RRDR của gen rpoB) và khuếch đại DNA trên gen
katG (sản phẩm PCR có chiều dài 684 bp, chứa vị trí codon 315 của
gen katG) với cặp mồi đặc hiệu.
2.5.4 Tách dòng gen rpoB và katG phục vụ cho giải trình tự
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đưa vào plasmid vectortách dòng plasmid pGEM®-T hoặc pBT, sau đó được biến nạp vào tế
bào khả biến E coli DH5 Sản phẩm biến nạp sau đó được cấy trải
trên môi trường LB Agar có bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicilin,chọn những khuẩn lạc màu trắng là những khuẩn lạc của vi khuẩnmang plasmid tái tổ hợp DNA plasmid tái tổ hợp được tách chiết và
kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chèn vào plasmid (đoạn gen rpoB có kích thước 528bp và đoạn gen katG có kích thước 684 bp).
2.5.5 Phương pháp đọc trình tự DNA theo Sanger trên máy đọc trình tự tự động phân tích kết quả bằng các phần mềm chuyên dụng
Sử dụng nguyên liệu là lượng gen rpoB và gen KatG, tiếp tục giải
trình tự bằng máy phân tích trình tự DNA ABI 3130XL-Avant Xử lý,
phân tích các trình tự đoạn gen rpoB và katG của các chủng vi khuẩn lao
bằng phần mềm BioEdit từ đó phân tích rút ra các đặc điểm phân tử củacác chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam
2.6 Xác định giá trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc.
Coi kết quả kháng sinh đồ là tiêu chuẩn vàng; tính độ nhạy,
độ đặc hiệu, giá trị dự báo âm tính, giá trị dự báo dương tính và
độ phù hợp (chỉ số Kappa) giữa phương pháp sinh học phân tử
và kháng sinh đồ trong phát hiện lao kháng thuốc theo bảng dưới đây:
Trang 11Giải trình tự gen
rpoB (katG)
giải trình tự gen
2.7 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
- Các số liệu được quản lý và phân tích bằng chương trình SPSS 13.0
- Test 2được sử dụng để đánh giá sự khác biệt giữa hai tỷ lệ
- Giá trị p<0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Đặc điểm phân tử gen rpoB và gen katG của các chủng vi
khuẩn lao kháng thuốc
3.1.1 Kết quả thu thập và lựa chọn chủng nghiên cứu
Đề tài thu thập được 700 chủng vi khuẩn lao; trong đó, số chủngnhạy cảm với các thuốc chống lao dòng 1 là 255 chủng, số chủngkháng đơn thuốc là 116 chủng (trong đó có 3 chủng kháng đơn vớirifampicin, 22 chủng kháng đơn với isoniazid và 91 chủng kháng đơnvới streptomycin), và số chủng kháng đa thuốc là 318 chủng 143chủng vi khuẩn lao được giải trình tự phát hiện đột biến trên gen
rpoB và katG; trong đó: 30 chủng nhạy cảm với các thuốc chống lao,
54 chủng có kiểu hình kháng với rifampicin (03 chủng kháng đơn vớirifampicin và 51 chủng kháng đa thuốc), 59 chủng có kiểu hìnhkháng với isoniazid (13 chủng kháng đơn với isoniazid và 46 chủngkháng đa thuốc)
Trang 123.1.2 Đặc điểm phân tử gen rpoB
Bảng 3.3 Kết quả giải trình tự đoạn 528bp trên gen rpoB
Chủng vi khuẩn lao Xác định đột biến
Đặc tính kháng thuốc của
chủng vi khuẩn lao
Số lượngchủng
96,3% số chủng lao kháng rifampicin xuất hiện ít nhất 1 đột biến
trên gen rpoB Trong đó, 96,1% chủng kháng đa thuốc có xuất hiện đột biến Các chủng nhạy cảm thuốc không có đột biến trên gen rpoB.
- Tỷ lệ đột biến trong vùng RRDR ở các chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin: 94,4% số chủng kháng rifampicin có đột biến trong vùng
RRDR trên gen rpoB Đột biến trong vùng RRDR ở các chủng kháng
TTC Phe 2
Arg 5
Gln 1 AGC
Ser 1 ACC Thr 1
Trang 13Hình 3.2 Số lượng và kiểu đột biến trong vùng RRDR
Có 15 kiểu đột biến ở 7 vị trí riêng biệt Tại codon 531, kiểu độtbiến TCG → TTG (Ser → Leu) chiếm ưu thế; codon 526 có sự đadạng về kiểu đột biến nhất (6 kiểu); chỉ gặp 1 kiểu đột biến GAC →GTC (Asp → Val) ở codon 516
- Các kiểu kết hợp vị trí đột biến xảy ra trên đoạn gen rpoB (n=54): Trong
số 54 chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin; tỷ lệ chủng mang 1, 2, 3
vị trí đột biến lần lượt là 72,2%; 16,7%; 5,6%; 1 chủng mất đoạn ởcodon 511-515 Các đột biến đơn thường chỉ xuất hiện trong vùng
RRDR của gen rpoB, với các chủng có sự kết hợp nhiều vị trí đột biến thì đều xuất hiện đột biến trong vùng RRDR của gen rpoB.
3.1.3 Đặc điểm phân tử gen katG
Bảng 3.11 Kết quả giải trình tự đoạn 684bp trên gen katG
Chủng vi khuẩn lao Xác định đột biến Đặc tính Số lượng
Trong 59 chủng kháng isoniazid; 48 81,4% chủng đột biến trên
gen katG; 18,6% chủng có kiểu hình kháng isoniazid nhưng không phát hiện được đột biến trên đoạn 684bp của gen katG.
Bảng 3.12 Tỷ lệ đột biến trong các chủng kháng đơn với isoniazid
