Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây mán đỉa

chưa đầy đủ về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của loài Mán đỉa.Nhằm góp phần làm sáng tỏ về cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc này,chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên c

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Lý do chọn đề tài

Các dạng oxy hoạt động, bao gồm các gốc tự do và các phân tử chứa oxy, cóhoạt tính oxy hóa cao như OH., HOO., O2-,…có năng lượng cao và kém bền nên dễdàng tấn công các đại phân tử như lipit, ADN, protein,… sinh ra nhiều loại bệnhnhư ung thư, tim mạch, tiểu đường, béo phì,… và tăng nhanh sự lão hoá Vì vậy, đểbảo vệ sức khỏe, cần phải bổ sung các chất kháng oxy hóa để kiểm soát hàm lượng

ổn định của các gốc tự do trong cơ thể Tác dụng kháng oxy hoá mang lại nhiều lợiích tốt cho cơ thể như bảo vệ sự toàn vẹn của tế bào, ngăn ngừa một số tai biến, làmchậm quá trình lão hoá cơ thể, bảo vệ chức năng gan, hạn chế các tác nhân gâyviêm Như vậy, việc tìm kiếm các dược liệu, định hướng nghiên cứu các hoạt chất

có khả năng kháng oxy hoá là cần thiết trong nỗ lực tìm kiếm thuốc mới phục vụcông tác phòng và chữa bệnh cho nhân dân

Việt Nam có nhiều dân tộc sinh sống với nhiều ngôn ngữ khác nhau Mỗi dântộc có một nhóm các cây thuốc chăm sóc sức khỏe và chữa bệnh đặc thù của dântộc mình Tộc người Pako và Vân Kiều là những cư dân có mặt sớm nhất ở vùngTrường Sơn trải dài từ Quảng Nam đến Quảng Bình, nhiều nhất là ở địa bàn miềnnúi Quảng Trị Tri thức bản địa về sử dụng cây thuốc có vai trò quan trọng trong

đời sống của người dân nơi đây Trong đó, cây Mán đỉa (Archidendron clypearia (Jack) I.Niels) là cây thuốc đã được sử dụng trong y học dân tộc cổ truyền của

Trung Quốc và trong các bài thuốc kinh nghiệm chữa bệnh của các đồng bào dântộc Pako, miền Trung Việt Nam [5] Một số công trình đã công bố cho thấy, thành

phần hóa học chủ yếu của Archidendron clypearia là các hợp chất flavonoid,

saponin, acid hữu cơ [17], [23], [26] Tộc người Pako,Vân Kiều và một số nơikhác đã sử dụng Mán đỉa để điều trị các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp, viêm gan,

xơ gan, bệnh gan mật, tiêu hóa kém, viêm họng, viêm thanh quản, viêm amidan cấptính [5] Theo một số tài liệu, Mán đỉa còn có tác dụng kháng nấm, kháng vi khuẩn[38], kháng virus [14],[15],[23], tác dụng gây độc tế bào ung thư [27],[30], khảnăng kháng oxy hóa [32], [38]

Cho đến nay, ở Việt Nam mới có công trình nghiên cứu của tác giả NguyễnThị Hoài về sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết metanol [5] nhưng vẫn

chưa đầy đủ về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của loài Mán đỉa.Nhằm góp phần làm sáng tỏ về cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc này,

chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của cây Mán đỉa Archidendron clypearia (Jack) I Niels”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Cung cấp thông tin về hoạt tính sinh học và thành phần hóa học, quy trình chiếtxuất, phân lập hợp chất và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là thành phần trên mặt đất của cây Mán đỉa (Archidendron clypearia (Jack) I Niels).

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp sàng lọc và đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa

+ Phương pháp nghiên cứu in vitro hoạt tính kháng oxy hóa- bảo vệ gan của

cao toàn phần và các cao phân đoạn của cây Mán đỉa - Archidendron clypearia

(Jack) I Niels

+ Phương pháp xác định lực kháng oxy hóa tổng (Total antioxidant capacity)theo mô hình phospho molybden

+ Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa theo mô hình DPPH

4.2 Phương pháp chiết cao toàn phần và cao phân đoạn

+ Phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng

+ Phương pháp chiết lỏng – lỏng

+ Phương pháp chiết pha rắn

4.3 Phương pháp phân lập cấu tử

+ Phương pháp sắc ký cột

+ Phương pháp sắc ký lớp mỏng

4.4 Phương pháp xác định cấu tạo của cấu tử đã phân lập được.

+ Phương pháp phổ: 1H – NMR, 13C – NMR, HSQC – NMR, HMBC – NMR,COSYGP

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài

Kết quả nghiên cứu này cung cấp thông tin khoa học đầu tiên về thành phần hóa

học và hoạt tính sinh học của cây Mán đỉa (Archidendron clypearia (Jack) I Niels)

thu hái ở vùng rừng núi của huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị, Việt Nam Các nghiêncứu đều dựa trên các phương pháp thường quy và được xử lí số liệu thống kê

6 Cấu trúc luận văn

Luận văn chia thành các chương sau:

Mở đầu

Chương 1 Tổng quan: Giới thiệu vài nét về họ trinh nữ, thuộc chi

Archidendron F.Mueller, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Archidendron F.

Mueller và loài Mán đĩa Archidendron clypearia (Jack) I Niels, thành phần hóa học

và hoạt tính sinh học, tác dụng và công dụng của chi Archidendron F Mueller và

loài Mán đĩa Archidendron clypearia (Jack) I Niels.

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đưa ra đối tượng nghiêncứu và sử dụng một số phương pháp nghiên cứu như xác định hoạt tính kháng oxyhóa, định tính các nhóm chức hữu cơ bằng các phản ứng hóa học đặc trưng, tiếnhành phân lập bằng sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, xác định cấu trúc của các hợp chấtdựa trên dữ liệu các phổ

Chương 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận: Trình bày các kết quả nghiên cứubao gồm kết quả thử hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng metanol và các cao phânđoạn, chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các cấu tử từ phân đoạn có hoạttính kháng oxy hóa cao nhất

Kết luận

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây Mán đỉa - Archidendron clypearia (Jack) I Niels

1.1.1 Vị trí phân loài cây Mán đỉa - Archidendron clypearia

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009, cây Mán đỉa có tên

khoa học là Archidendron clypearia (Jack) I Niels, có vị trí phân loài như sau[16]:

cây khét, hông linh, lim sẹt, ràng ràng và cũng được sử dụng với một số tên khoa học

đồng nghĩa như Pithecellobium clypearia, Abarema clypearia, Inga clypearia [16], Inga clypearia Jack ở Malay, Abarema angulata (Bentham) Kostermans, Pithecellobium angulatum Bentham [16].

1.1.2 Sơ lược về đặc điểm họ Trinh nữ - Mimosaceae

Là họ nguyên thủy nhất và có nhiều loài trong bộ Đậu, có dạng cây gỗ, câybụi, cây thảo và dây leo gỗ, cây nhẵn hay có gai Lá kép lông chim 1-2 lần, lá chétnhỏ, lá kèm hình sợi hay biến thành gai Hoa nhỏ, tập hợp thành cụm hoa hình đầuhay hình bông, hoa đều, mẫu 5 hoặc 4, đài 5, thường dính lại ở dưới Tràng 5 có tiềnkhai van Nhị nhiều gấp đôi số cánh hoa hoặc bằng số cánh hoa Hạt phấn thườngdính lại thành khối 4-16 hạt Quả thuộc loại đậu [29]

Họ Mimosaceae gồm khoảng 60 chi, 2800 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệtđới và cận nhiệt đới Theo “Cây cỏ Việt Nam” của Phạm Hoàng Hộ [7], họMimosaceae ở Việt Nam có khoảng 16 chi với 85 loài, trong đó bao gồm:

Acacia P Miller (28 loài) Enterolobium C Martius (1 loài) Adenanthera C Linnaeus (2 loài) Leucoena J Lamarck (1 loài) Albizia A Durazzini (17 loài) Mimosa C Linnaeus (4 loài)

Archidendron F Mueller (18 loài) Neptunia J Loureiro (1 loài) Calliandra G Bentham (2 loài) Parkia R Brown (1 loài) Cathormion (Benth.) Hassk (1 loài) Pithecellobium C Martius (2 loài) Desmanthus C Willdenow (1 loài) Samanea (DC.) Merrill (1 loài) Entada M Adanson (4 loài) Xylia W Roxburgh (1 loài)

1.1.3 Sơ lược về đặc điểm chi Archidendron F Mueler

Chi Archidendron F Mueller thuộc phân họ Mimosaceae tập trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Á với khoảng 100 loài [16] Ở Việt Nam, chi Archidendron có

18 loài phân bố khắp cả nước [7]

Bảng 1.1 Các loài trong chi Archidendron có ở Việt Nam [7]

1 Archidendron pellitum

(Gagn.) I Niels Doi da Gia Lai, Kontum, Lâm Đồng

2 Archidendron clypearia

(Jack.) I Niels

Giác, Mán đỉa Đồng Nai, Bạc Liêu, Phú

Quốc, Quảng Trị, Huế.

Cổ ôm, giác Quảng Bình, Quảng Trị,

Thừa Thiên Huế

8 Archidendron utile (Chun

& How) I Nielsen Doi hữu ích Vĩnh Phúc, Phú Thọ

9 Archidendron eberhardtii I.

Niels

Doi Eberhardt Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hà

Tây, Hòa Bình, Thanh Hóa

10 Archidendron ellipticum

(Bl.) Niels

Doi bầu dục Gia Lai, Kon Tum

11 Archidendron kerri (Gagn.)

12 Archidendron balansae

(Oliv) I Niels

Cứt ngựa Từ Cao Bằng, Lạng Sơn,

đến Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế

15 Archidendron robinsonii

(Gagn.) I Niels Dái heo Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Bình, Quảng Trị,

Thừa Thiên Huế, Phú Yên, Khánh Hòa, Đà lạt

(Kost.) I Niels Doi Đà Lạt Gia Lai, Kontum, Lâm Đồng

Các loài Archidendron phân bố khắp cả nước, tập trung nhiều ở miền Bắc,

miền Trung và khu vực Tây Nguyên Tại khu vực Quảng Trị, Thừa Thiên Huế có

thể tìm thấy một số loài như A clypearia (Jack) I Niels, A bauchei (Gagn.) I.Niels, A lucidum (Benth.) I Niels, A balansae (Oliv) I Niels, A robinsonii (Gagn.) I Niels, A poilanei (Kost.) I Niels, A occultatum (Gagn.) I Niels.

1.1.4 Sơ lược về đặc điểm cây Mán đỉa – Archidendron clypearia

Cây thường thấy trong các rừng đầm lầy, rừng phủ xanh trên đất sét, rừng thưa

và các rừng hỗn giao rụng lá, vùng núi ở độ cao giữa 0 đến 1700m Cây ưa sáng,mọc nhanh, ưa đất chua, ưa ẩm, nảy chồi mạnh Tái sinh hạt khỏe dưới tán rừng có

độ tán che thấp

Ở Việt Nam, cây mọc hoang ở nhiều tỉnh phía Bắc, các tỉnh miền Trung chotới các tỉnh Nam bộ như Đồng Nai, Bạc Liêu, Phú Quốc, Quảng Trị, Huế [4].Mán đỉa thuộc loại cây nhỡ hay cây gỗ cao 10-15m, nhánh ngang, có cạnh Lákép, mang 4-5 cặp cuống bậc hai, mỗi cuống bậc hai mang 3-8 đôi lá chét hình bìnhhành, hình trái xoan hay hình ngọn giáo ngược, gốc hình nêm không cân đối Đầu lánhọn và thường có mũi, hơi có lông mịn ở hai mặt hoặc có lông tơ ở mặt dưới

Ra hoa vào tháng 3-4, cụm hoa chùm tán hay chùy ở ngọn, phân nhánh đến 3lần, có lông Các cuống mang tán gồm khoảng 10 hoa có cuống 1-3mm Đài hìnhchén hay hình phễu, tràng hình phễu hay hình chuông, ống nhị bằng ống tràng Bầu

có lông mịn hay lông tơ

Có quả vào tháng 6-8, quả cỡ 20 x 1 cm, dẹp, xoắn theo hình trôn ốc, màu camvàng ở mặt ngoài, đỏ ở mặt trong, có lông mềm hay lông tơ Hạt hình bầu dục hayhình cầu, có vỏ màu đen lam

1.1.5 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Archidendron

và loài Archidendron clypearia

1.1.5.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Archidendron Chi Archidendron (hay còn được gọi với tên Pithecellobium) đã được đưa vào

sử dụng với mục đích chữa bệnh từ lâu, nhưng các nghiên cứu về thành phần hóahọc của chi chỉ mới phát triển trong những năm gần đây, trong đó phải kể đến cácnghiên cứu từ Trung Quốc, Ấn Độ, Hàn Quốc và một số nước Đông Nam Á Cácnhóm chất chính có trong chi là flavonoid, saponin và một số dẫn chất khác [17],[23], [26]

a Nhóm flavonoid

Bảng 1.2 Các hợp chất flavonoid chính có trong chi Archidendron

3’- Prenylapigenine 7-O-rutinoside A.dulce [37]

Quercitrin

RutinKaempferolNaringinDaidzein

b Nhóm saponin

Bảng 1.3 Các hợp chất saponin có trong chi Archidendron

(1-6)]2-acetoamido-2-deoxy-beta-D-glucopyranosyl echinocystic acid

O(3)- (2-acetylamino-2-deoxy-beta-D- A.cubense [20]

glucopyranosyl)-oleanolic acid A.arboreum

c Các nhóm khác

Ngoài flavonoid, saponin, thành phần trong chi Archidendron còn có các

diterpenoid, acid hữu cơ, các dẫn xuất của axit,…

Bảng 1.4 Các hợp chất khác có trong chi Archidendron

Hợp chất

khác

Djenkolic axit (S,S’methylenebiscysteine)

-A jiringa [39]

3-O[6’spinasta-7,22(23)-dien

-O-palmitoyl-β-D-glucosyl]-A.cauliflorum

[17]

3-O[6’spinasta-7,22(23)-dien

(2) Rutin

(1) Quercitrin

(4) Naringin

(3) Kaempferol

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số cấu tử đã phân lập được từ các loài

thuộc chi Archidendron F.Mueller.

Thành phần hóa học chính của chi Archidendron là flavonoid và các

saponin Flavonoid thường có hoạt tính chống độc, tạo phức với ion kim loại, bảo

vệ chức năng gan, kháng oxy hóa tốt; còn các saponin có tác dụng chống viêm, một

số có tác dụng ức chế virus [14], [23], kháng nấm và kháng khuẩn [38] Từ các

thành phần đó phần nào đã giải thích các tác dụng kháng oxy hóa, kháng viêm,

chống dị ứng và kháng nấm… của các loài trong chi Archidendron.

1.1.5.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Archidendron clypearia

Cây Mán đỉa mới được nhà khoa học Trung Quốc quan tâm nghiên cứu trong vài năm trở lại đây Cây được người dân đưa vào sử dụng làm thuốc từ lâu Năm

2013, ở Việt Nam đã có nghiên cứu về thành phần hóa học và một số tác dụng sinh

học của cây Mán đỉa của tác giả Nguyễn Khánh Thùy Linh [8], với sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Hoài Cho đến nay, tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa

học cũng như tác dụng sinh học cây Mán đỉa Archidendron clypearia (Jack) I Niels

được tìm thấy không nhiều

(6) Kaempferol-3-O-alpha-L-rhamnopyranoside

(5) Daidzein

(7) Flavan 3-ol gallate (8) Djenkolic acid (S,S’-methylenebiscysteine)

Qua các tài liệu tham khảo được, thành phần chủ yếu của Mán đỉa

(Archidendron clypearia) là flavonoid, saponin, acid hữu cơ [23] Theo tổng quan

tài liệu, các hoạt chất đã phân lập từ Mán đỉa được trình bày ở bảng 1.5

Bảng 1.5 Một số hoạt chất phân lập được từ Mán đỉa

đã góp phần nào vào việc giải thích tác dụng chữa các bệnh liên quan đến khángoxy hóa, bảo vệ gan của dược liệu

1.1.6 Hoạt tính sinh học của chi Archidendron và loài Archidendron clypearia

1.1.6.1 Hoạt tính sinh học của chi Archidendron

Các loài trong chi Archidendron phân bố ở nhiều nơi trên thế giới, được sử

dụng để làm thực phẩm hay làm thuốc

a Hoạt tính kháng oxy hóa

Tác dụng chính của các loài trong chi này là khả năng kháng oxy hóa Theo

một nghiên cứu đã công bố, dịch chiết methanol từ lá và vỏ quả Archidendron ducle

có tác dụng kháng oxy hóa mạnh với khả năng thu dọn các gốc tự do [29] Dịch

chiết nước từ quả của A ducle có khả năng chống lại quá trình oxy hóa làm tổn

thương thận do CCl4 gây ra [33],[34] và theo các nhà nghiên cứu Ấn Độ, chưa phát

hiện bất kỳ độc tính nào từ dịch chiết nước của A ducle nên có thể sử dụng dược liệu này trong điều trị [32] A jiringa có nguồn gốc từ Đông Nam Á, dịch chiết

etanol của cây chứa thành phần chính là các hợp chất polyphenol có tác dụng ngănchặn sự hình thành mạch máu do ức chế sự tăng sinh tế bào nội mô trong các bệnhtăng sinh mạch máu [38]

b Hoạt tính kháng nấm, kháng vi khuẩn

Một protein có cấu trúc tương tự với lysozyme lòng trắng trứng gà với hoạt tính

kháng nấm được phân lập từ những hạt giống của A dulce Protein này thể hiện hoạt động kháng nấm Macrophomina phaseolina với khả năng chịu đựng nhiệt độ khá cao

đến lên đến 80 0C trong 15 phút (ở pH = 8,0) Trong khi dịch chiết metanol từ lá A jiringa với nồng độ ức chế tối thiểu (100mg/mL) tác dụng chủ yếu trên Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Microsporum gypsum, hạt của A jiringa chứa lectin, có khả năng ức chế các loài nấm Exserohilum turcicum, Fusarium oxysporum, Corynespora cassicola và các loài vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans [30] Lectin có tác dụng trên

cả vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương [21] Vỏ cây A racemosum chứa

3-O-[alpha-L-arabinopyranosyl (1-2)]3-O-[alpha-L-arabinopyranosyl

(1-6)]-2-acetoamido-2-deoxy-beta-D-glucopyranosyl acid oleanolic, có khả năng chống lại Trichophyton mentogrophytes, Candida albicans và Saccharomyces cerevisiae [38].

c Hoạt tính chống ung thư, gây độc tế bào ung thư

Với tình hình bệnh ung thư gia tăng hiện nay thì tác dụng gây độc tế bào ungthư đang là vấn đề nhận được quan tâm của nhiều nhà khoa học Dịch chiết metanol

của hạt A jiringa ở nồng độ 200mg/mL được cho rằng có khả năng ức chế tối thiểu

là 30% virus Epstein-Barr [31] A ellipticum ở đảo Great Nicbar, Ấn Độ [36] chứa

các saponin ester elliptoside A-J có khả năng gây độc tế bào đặc biệt đối với tế bào

ung thư thận [15] Rễ loài A lucidum cũng có khả năng gây độc tế bào chọn lọc trên

dòng tế bào ung thư buồng trứng A2780 ở người với giá trị IC50 là 1,72 mol/l [31].Bên cạnh các tác dụng nêu trên, các loài trong chi này còn có nhiều tác dụngkhác Một nghiên cứu của Ibrahim cùng cộng sự cho thấy việc sử dụng trước dịch

chiết A jiringa ở trên chuột giúp đẩy lùi các tổn thương dạ dày do etanol gây ra [21], ngoài ra quả A jiringa còn dùng để chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp, sỏi bàng quang Theo nghiên cứu của một số nhà khoa học ở Malaysia, quả A jiringa

có tác dụng điều trị đái tháo đường hiệu quả, tuy nhiên nếu dùng ở liều cao có thể

gây nên phì đại và tổn thương tim, thận, gan và tuyến tụy [36] Lá cây A.ducle có

tác dụng điều trị loét dạ dày nhưng cẩn thận với phụ nữ có thai vì có chất làm se cóthể gây sẩy thai [29], hạt của nó có khả năng kiểm soát được đường huyết trongmáu, đặc biệt là sự tăng đường huyết sau ăn [32] Đặc biệt, dịch chiết từ lá và hạt

giống A dulce có tiềm năng sử dụng như phương pháp tiếp cận thân thiện môi

trường lý tưởng cho việc kiểm soát muỗi

1.1.6.1 Hoạt tính sinh học của loài Archidendron clypearia

a Công dụng

Mán đỉa được sử dụng làm thuốc ở nhiều nước trên thế giới

Ở Trung Quốc, lá Mán đỉa là vị thuốc y học cổ truyền dùng để trị đau họng,đau thượng vị, tiêu chảy nhiệt, đắp trên vết thương trị bỏng lửa, bỏng nước, sưngnhọt, ghẻ lở [27]

Ở Ấn Độ và Malaixia, lá được dùng trị đau chân, sưng tấy, thủy đậu, ho và đậumùa Ở Lào, lá Mán đỉa phơi khô và tán bột dùng để điều trị các vết thương Lá, vỏ câydùng để nhuộm lưới, nấu nước gội đầu, tắm trị ghẻ Dùng điều trị các bệnh nhiễm trùngđường hô hấp trên, viêm họng, viêm thanh quản, viêm amidan cấp tính [26]

Ở Việt Nam, Mán đỉa được dùng trị ho, sưng nhọt, thủy đậu, bên cạnh đó lácòn được dùng để nhuộm đen, nấu tắm trị ghẻ [15] Nghiên cứu gần đây về tri thứcbản địa, lá Mán đỉa được đồng bào Pako, Vân Kiều (Quảng Trị) dùng trong chữabệnh về gan như viêm gan, xơ gan, các bệnh gan mật hay tiêu hóa kém [1]

b Hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý

Cho đến nay, các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Mán đỉa chủ yếu củaTrung Quốc với một số tác dụng đã được chứng minh như điều trị viêm dạ dày,chống viêm, chống dị ứng và kháng virus.

- Tác dụng kháng viêm

Mán đỉa được coi như là một cây thuốc cổ truyền trong việc điều trị các bệnhviêm nhiễm khác nhau Dịch chiết metanol của Mán đỉa thể hiện tính kháng viêmmạnh trên chuột đại thực bào dòng RAW264.7 do dịch chiết có tác dụng phong bếyếu tố nhân hoạt hóa (NF)-κB [19] dẫn đến ức chế tiết NO và làm mất hoạt tính củamen Cyclooxydase, hạn chế sản xuất prostaglandin - là chất trung gian gây viêm.Kết quả phân tích HPLC còn cho thấy một thành phần trong dịch chiếtmetanol Mán đỉa là Quercetin có hoạt tính ức chế sản xuất prostaglandin [18]

- Tác dụng kháng virus

Trong một nghiên cứu về 21 loại thảo dược truyền thống sử dụng ở miền N amTrung Quốc trong hoạt động chống lại virus Herpes simplex type 1 (HSV-1) đã chothấy dịch chiết nước của Mán đỉa có khả năng chống lại virus Herpes simplex type 1

do có chứa nhiều chất thuộc nhóm polyphenol [14] Bên cạnh đó, dịch chiết nước củadược liệu này cũng có khả năng ức chế virus viêm gan B vịt trong ống nghiệm [14].Hai dẫn xuất flavan được phân lập từ dịch chiết metanol của Mán đỉa là 7-O-galloyltricetifavan và 7,4’-di-O-galloyltricetifavan có khả năng chống lại virus hợpbào hô hấp (RSV), virus cúm A (H1N1), virus Coxsackie B3 (Cox B3), virusHerpes simplex type 1 (HSV-1) với các giá trị IC50 lần lượt là 5 và 10 µg/ml, 15,7

và 30 µg/ml, 12,5 và 25 µg/ml, 30 và 20 µg/ml [14] Ngoài ra dịch chiết Mán đỉacòn có Quereetin cũng có khả năng chống lại virus hợp bào hô hấp [23]

- Tác dụng chống dị ứng

Dịch chiết etanol của Mán đỉa đã được chứng minh là có tác dụng chống dị ứng

do đặc điểm giàu các chất polyphenol, bên cạnh đó còn ức chế các dinitrofluorobenzene gây ra phản ứng quá mẫn chậm Hợp chất2(-)-epigallocatechin-7-gallate, 3(-)-5,7,3’,4’,5’-pentahydroxyflavan, 5(-)-tetrahydroxyflavan-7-gallate có trongMán đỉa đã được chứng minh có khả năng ức chế đáng kể sự giải phóng histamin vàtham gia vào quá trình chống dị ứng [15]

2,4-1.2 Tổng quan về hoạt tính kháng oxy hóa

1.2.1 Khái niệm về chất kháng oxy hóa

Trong khoa học thực phẩm, chất kháng oxy hóa là một chất hoặc một nhómhợp chất có trong thực phẩm, khi hiện diện ở nồng độ thấp có khả năng làm giảmđáng kể hoặc ngăn ngừa các tác động có hại của các loại phản ứng oxy hóa trongchức năng sinh lý bình thường ở người [19]

Theo định nghĩa này, không phải các chất khử tham gia vào phản ứng hóa học

là chất kháng oxy hóa mà chỉ đề cập đến những hợp chất có khả năng bảo vệ cácmục tiêu sinh học chống lại quá trình oxy hóa

Về bản chất, gốc tự do có một electron độc thân Các gốc tự do rất không ổn định

và nhạy cảm Chúng tìm kiếm những electron khác để hình thành một cặp electron mới.Các gốc tự do gây hại khi chúng kéo những electron từ các tế bào bình thường

Chất kháng oxy hóa cũng có thể gián tiếp tạo phức với các ion kim loạichuyển tiếp trong phản ứng Fenton hoặc ức chế các enzyme xúc tác cho các quátrình sinh ra gốc tự do nhằm ngăn cản sự hình thành gốc tự do trong cơ thể [28]

1.2.3.2 Cơ chế hoạt động của chất kháng oxy hóa

- Cơ chế chuyển electron:

+ AH

Ch t kháng oxy hóa ấ

Chuy n H ể

+ A.

Hình 1.2 Cơ chế chuyển electron của chất kháng oxy hóa.

- Cơ chế chuyển hydro:

Hình 1.3 Cơ chế chuyển H của chất kháng oxy hóa.

Chất kháng oxy hóa chuyển electron hoặc hydro cho gốc tự do làm cho gốc tự

do trở nên bền [46] Khi một phân tử gốc tự do nhận thêm một electron từ một phân

tử kháng oxy hóa, các gốc tự do trở nên ổn định và không còn khả năng gây ra hạinữa Ngoài ra chất kháng oxy hóa còn giúp hạn chế sự phân hủy các hydroperoxide

1.2.3.3 Một số chất kháng oxy hóa hay sử dụng

a Axit gallic [35]

Axit gallic thuộc nhóm axit trihydroxybenzoic (là dạng axit phenolic), là mộtaxit hữu cơ, danh pháp là 3,4,5- trihydroxylbenzoic axit, có trong lá chè và nhiềuloại thực vật khác Axit gallic có thể ở cả dạng tự do hay là một phần của tannin

Gốc tự doChất kháng oxy hóa

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của axit gallic

Axit gallic là tên thông dụng trong ngành công nghiệp dược Nó được sửdụng làm chất chuẩn để xác định hàm lượng phenol trong một số phép phântích sử dụng thuốc thử Folin- Ciocalteu; kết quả phân tích được đưa ra dướidạng đương lượng axit gallic

Axit gallic có tính kháng nấm và kháng khuẩn Axit gallic hoạt động nhưmột chất kháng oxy hóa và giúp bảo vệ các tế bào khỏi nguy cơ bị oxy hóa.Axit gallic cũng có khả năng kháng các tế bào ung thư mà không gây hại đếncác tế bào khỏe mạnh

b Curcumin

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của curcumin

Curcumin là một chất kháng gốc oxy hóa tự do mạnh Các nghiên cứu trên thếgiới đã chứng minh curcumin ức chế sự phát sinh của nhiều tác nhân gây oxy hóa(ROS) như: anion superoxit, H2O2, gốc nitrit, đồng thời làm giảm lượng ROS

invivo.

c BHT (Butylated hydroxyl toluene) [48]

BHT có công thức phân tử là C15H24O, danh pháp hóa học là 2,6 – bis (1,1–

dimetyletyl) –4–metylphenol; 2,6–di–tert–butyl–p–cresol; 2,6–di–tert–butyl–4–

BHT được tạo thành từ phản ứng 4–metylphenol với 2–metylpropen (xúc tác:axit sunfuric).

BHT hoạt động tương tự như là một vitamin tổng hợp, chủ yếu ngăn chặn quátrình oxy hóa

RO 2 + ArOH → ROOH + ArO

d Axit L – ascorbic (Vitamin C) [47]

Axit L – ascorbic có nhiều trong thực phẩm tươi, rau quả và trái cây, đóng vaitrò hết sức quan trọng trong nhiều hoạt động của cơ thể

O

OH

HOHO

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của axit L – ascorbic

Vitamin C là một chất kháng oxy hóa rất quan trọng, giúp làm lành vếtthương, tăng sức đề kháng cho cơ thể

Vitamin C cũng có hoạt động cùng với các chất kháng oxy hóa khác và có khảnăng tăng cường hiệu lực kháng oxy hóa của vitamin E vì vitamin C phục hồi, táitạo vitamin E từ dạng bị oxy hóa trong cơ thể

Tuy nhiên, trong vài trường hợp, vitamin C gây hại cho cơ thể vì nó có thểđóng vai trò là chất tiền oxy hóa Đặc biệt, khi ở nồng độ cao và có các ion kim loạichuyển tiếp (Fe3+, Cu2+), vitamin C sẽ đóng vai trò là chất tiền oxy hóa xúc tác chophản ứng Fenton, tạo các gốc tự do HO. và H2O2

1.2.4 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp hóa học

1.2.4.1 Đánh giá dựa vào khả năng cho electron

a Phương pháp đánh giá qua khả năng kết hợp với Fe(II) [5]

Fe(II) ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác cho phản ứng sinh ra gốc tự do.

Khi cho Fe(II) tác dụng với thuốc thử Ferrozin sinh ra phức màu, có cực đạihấp thụ tại bước sóng 562 nm

Mẫu thử sẽ khóa Fe(II) vào dạng phức, không cho Fe(II) tồn tại ở dạng tự donên làm mất khả năng xúc tác của Fe(II)

Hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu thử sẽ được thể hiện qua việc ngăn chặn sựtạo thành phức chất có màu của Fe(II) với thuốc thử Ferrozin

b Phương pháp đánh giá qua lực kháng oxy hóa tổng (Total antioxidant capacity) theo mô hình phospho molybden [35]

Dựa trên quá trình khử Mo(VI) về Mo(V) trong môi trường axit, tạo thànhphức Mo(V) có màu xanh lá cây, độ hấp thụ quang của dung dịch sau phản ứngđược đo ở bước sóng 695 nm

Lực kháng oxy hóa tổng được biểu diễn theo độ hấp thụ của phức tạo thànhgiữa mẫu và Mo(V)

1.2.4.2 Đánh giá dựa vào khả năng cho H

a Phương pháp đánh giá qua hàm lượng malonyldialdehyde (MDA) [40]

Đánh giá khả năng nhường H của chất kháng oxy hóa nhằm ngăn chặn quátrình peroxy hóa lipit

Khi không có chất kháng oxy hóa, MDA được sinh ra trong quá trình peroxyhóa lipit phản ứng với axit thiobarbituric tạo phức màu hồng, hấp thụ cực đại ởbước sóng 532 nm trong môi trường pH = 2 – 3, nhiệt độ 90 – 100 0C trong vòng 10đến 15 phút

Khi có chất kháng oxy hóa thì quá trình peroxy hóa lipit bị ngăn chặn, lượngMDA tạo thành giảm dẫn đến cường độ màu của phức giảm

b Phương pháp sử dụng DPPH (1,1–diphenyl–2–picrylhydrazyl)

DPPH là chất tạo ra gốc tự do, được dùng trong trắc quang đo cường độ màu

để sàng lọc tác dụng kháng oxy hóa của các chất nghiên cứu

Chất kháng oxy hóa nhường H cho gốc DPPH, khả năng kháng oxy hóa thểhiện qua việc làm giảm cường độ màu, được đo ở bước sóng 517 nm

Khi không có chất kháng oxy hóa, gốc tự do peroxyl hình thành kết hợp vớifluorescein làm giảm cường độ phát huỳnh quang Chất kháng oxy hóa có khả năngtác dụng với gốc tự do peroxyl mạnh hơn fluorescein, vì vậy, cường độ phát huỳnhquang thay đổi.

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Phần trên mặt đất của cây Mán đỉa được TS Nguyễn Thế Cường, Viện Sinhthái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, xác

định tên khoa học là Archidendron clypearia (Jack) I Niels.

Mẫu được thu hái tại huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị vào tháng 6/2013 Saukhi thu mẫu, nguyên liệu được rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khô ở 50 – 60 0C, sau đó

xay thành bột thô và bảo quản nơi khô thoáng.

Hình 2.1 Hình ảnh cây Mán đỉa 2.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Mán đỉa Archidendron clypearia

(Jack) I Niels thu thập theo định hướng kháng oxy hóa bảo vệ gan

2.3 Cách tiếp cận và nội dung nghiên cứu

2.3.1 Cách tiếp cận

- Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa của cao toàn phần, các cao phân đoạn

và chất phân lập được từ cây Mán đỉa Archidendron clypearia (Jack) I Niels.

- Từ phân đoạn có hoạt tính kháng oxy hóa tốt, tiến hành phân lập các cấu tử

và xác định công thức cấu tạo của các cấu tử phân lập được

2.3.2 Nội dung nghiên cứu

- Chiết xuất cao toàn phần metanol và các cao phân đoạn có độ phân cực tăng dần

- Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao toàn phần và các cao phân đoạn

+ Sàng lọc in vitro hoạt tính kháng oxy hóa bảo vệ gan của cao toàn phần và

các cao phân đoạn

+ Đánh giá khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp lực kháng oxy hóa khử Mo(VI) về Mo(V)

+ Đánh giá khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp bắt gốc tựu do DPPH

- Phân lập và xác định công thức hóa học của một số cấu tử đã phân lập

2.4 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu, nguyên liệu và mẫu động vật thí nghiệm

2.4.1 Hóa chất và thiết bị

2.4.1.1 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn

DĐVN IV [6] Dung môi sử dụng: metanol, n-hexan, clorofom, n-butanol, etyl axetat,

axeton, nước cất, DPPH (2,2 – diphenyl – 2 – picrylhydrazyl), axit formic, axit axetic…Thuốc thử: dung dịch axit sunfuric 10%, dung dịch ammoniac đậm đặc, …Chất nhồi cột sắc ký: silicagel pha thường (Silicagel 60 0,040-0,063mm (230– 400 mesh ASTM), Merck), pha đảo (YMC, 30 - 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.),Sephadex LH - 20 và Dianion HP – 20, sắc ký lớp mỏng pha thường (TLC –Silicagel 60 F254 Merck), pha đảo (RP18 Merck)

2.4.1.2 Thiết bị và dụng cụ

Cân phân tích hiện số Mettler Toledo AB204-S, độ chính xác 0,0001g Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500 FT – NMR, máy đo phổ UV Jacob Micropipette 100, 200, 500 µL (Human), micropipette 50 µL (Excel

monopette 8000) Các dụng cụ thủy tinh: cột sắc ký, pipet, đũa thủy tinh, cốc có mỏthể tích khác nhau, bình tam giác thể tích khác nhau, bình cầu hai cổ nhám, ống sinhhàn, bình gạn, bình chạy sắc ký Bếp điện, tủ sấy Memmert, máy cô quay Yamato, bình chiết, máy lọc hút chân không

2.4.2 Nguyên liệu và mẫu động vật thí nghiệm

Phần trên mặt đất của cây Mán đỉa được lấy ở huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị

Nguyên liệu cây Mán đỉa (Archidendron clypearia) được các cán bộ của Viện Sinh

thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam xácnhận tên khoa học Sau khi rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, sấy khô ở 50 0C, xaythành bột nguyên liệu

Chuột nhắt trắng, khoẻ mạnh khoảng 8 tuẩn tuổi, nặng 25-30 gam được nuôi

ở khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam bằng thức ăn và nước uống tiêu chuẩn

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

2.5.1.1 Lấy mẫu

- Mẫu được thu hái tại huyện Đăkrông, tỉnh Quảng Trị

- Bộ phận sử dụng: phần trên mặt đất của cây Mán đĩa (lá và cành)

2.5.1.2 Định danh

- Thu mẫu có đầy đủ các bộ phận cần thiết như cành, lá, hoa, quả

- Làm tiêu bản mẫu khô, sử dụng để phục vụ công tác xác định tên khoa học

- Xác định tên khoa học dựa trên phân tích hình thái thực vật, đối chiếuvới các tài liệu phân loại thực vật

Nội dung này do TS Nguyễn Thế Cường chuyên ngành thực vật học của ViệnSinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam thực hiện

2.5.1.3 Xử lý mẫu

Sau khi thu hái, mẫu nguyên liệu được làm sạch, phơi khô tự nhiên, sấy ở 60

0C, sau đó xay thành bột thô và bảo quản nơi khô thoáng

2.5.2 Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng oxy hóa bảo

vệ gan in vitro [16], [33]

Chuột BALB/c khoẻ mạnh được sử dụng để tách tế bào gan Gây chết chuộtbằng etanol 800, sau đó sử dụng panh, kéo mổ chuột, tách lấy gan Gan chuột sau

khi tách được rửa bằng PBS (Phosphate Buffered Saline) có 10% kháng sinh PSF

(Penicillin-Streptomicin-Fungizone) (Invitrogen), sau đó dùng panh, kéo, kim tiêmgạt, tách tế bào gan trong PBS Thu dịch có tế bào gan, ly tâm, loại bỏ dịch nổi Cao

tế bào được hoà trong NH4Cl để phá vỡ hồng cầu Sau khi ly tâm, các tế bào thuđược hòa lại vào môi trường MEME có 10% FBS (Fetal Bovine Serum) và cácthành phần cần thiết khác Sau khi được phân lập, tế bào gan sẽ được đưa vào đĩathí nghiệm 96 giếng với mật độ 1 x 104 tế bào/giếng để nuôi qua đêm trong tủ ấm5% CO2, ở 37 0C Tế bào sau đó sẽ được ủ hoạt chất ở các nồng độ khác nhau trong