Hoạt tính sinh học và các hoạt tính chống oxy hóa của flavanols trong chè

Phân tích THEAFLAVINS (TFs) và THEARUBIGINS (TRs) trong chè đen sử dụng phương pháp MALDITOF (PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHỐI PHỔ)Hoạt tính sinh học và các hoạt tính chống oxy hóa của flavanols trong chè sau khi uống với mẫu chè xanh (CX), chè đen (CĐ), hoặc bổ sung dịch chiết từ chè xanh (DCCX)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



Nha trang, 14 tháng 03 năm 2012

NỘI DUNG

1 Phân tích THEAFLAVINS (TFs) và

THEARUBIGINS (TRs) trong chè đen sử

dụng phương pháp MALDI-TOF (PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHỐI PHỔ)

2 Hoạt tính sinh học và các hoạt tính chống oxy hóa của flavanols trong chè sau khi uống với mẫu chè xanh (CX), chè đen (CĐ), hoặc bổ sung dịch chiết từ chè xanh

(DCCX)

1.Phân tích THEAFLAVINS (TFs) và

THEARUBIGINS (TRs) trong chè đen sử

dụng phương pháp MALDI-TOF (PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHỐI PHỔ)

1.Giới thiệu 2.Phương pháp nghiên cứu 3.Kết quả và thảo luận

1 GIỚI THIỆU

Trong những năm qua, có rất nhiều

nghiên cứu về cây chè (Camellia

sinensis) Có nhiều nghiên cứu cho thấy

uống trà giảm nguy cơ về bệnh tim mạch

và bệnh ung thư ở người Chè có chứa các chất chống oxy hóa và các hợp chất polyphenol, đặc biệt là catechin và các dẫn xuất của chúng

Các dẫn xuất của catechin có thể giúp bảo vệ cơ thể, chống lại bệnh tim và ung thư bằng cách giảm thiểu tác động của gốc tự do gây hại cho các tế bào và mô

Nghiên cứu trên chè đen, sau khi chiết xuất có thearubigins (TRs) có hiệu quả bảo vệ và chống lại các hành động

liệt của Botulinum neurotoxins

CÁC SẢN PHẨM TRÀ

Đọt chè tươi Chè đen

Chè đen có chứa hai nhóm màu chính:

Theaflavins (TFs- màu vàng) và thearubigins

(TRs- màu đỏ) TFs chứa một bis-flavan thay thế 1,2-dihydroxy-3 ,4-benzotropolone phân

nửa Không giống như các TFs, cấu trúc hóa

học của TRs vẫn còn là điều bí ẩn

Việc phân tích quang phổ MALDI-TOF (phương pháp cản trở xung ion của các ion tạo ra thông qua các kỹ thuật hỗ trợ ma trận laser giải

hấp ion hóa) các phần phân đoạn chè đen cho

thấy cấu trúc của một số TRs

Có 3 loại trà được nghiên cứu: trà xanh (không lên men), trà Ô long (bán lên men)

và trà đen (đã lên men) Quá trình lên men

lá chè gây ra sự oxy hoá enzym của

TFs-màu vàng, gồm khoảng 3-5% (m /m) của các chất rắn chiết xuất Cấu trúc của chúng

có chứa 1 nhân benzotropolone được hình

thành bởi quá trình oxy hóa của catechin với

một Vic- trihydroxyphenyl phân nửa.

TRs, màu đỏ nâu hoặc màu nâu đen, trong

đó bao gồm khoảng 20% (m/m) của các chất rắn

chiết xuất , là polymer không đồng nhất, cấu trúc

của nó vẫn còn chưa được miêu tả

Phân loại một số TRs :

1.Phân loại TRs thành ba nhóm theo khả năng hòa tan của chúng trong các dung môi khác nhau

Nhóm 1: Tan trong ethyl acetate

Nhóm 2 : Tan trong diethyl

2 Phân loại theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography - HPLC) Nhóm I : bao gồm TRs bị loại trừ từ cột HPLC,

Nhóm II : TRs được giải quyết

Nhóm III : TRs còn lại chưa được giải quyết

• Người ta đã chứng minh rằng TRs được hình

thành bởi quá trình oxy hóa và phản ứng của hai gallocatechins (epigallocatechin (EGC) và

epigallocatechin gallate (EGCG))

Sử dụng phương pháp khối phổ ion hóa theo

cơ chế giải hấp sử dụng nguồn laser MALDI ,

các phân tử trong mẫu bay hơi thì thường sử

dụng kĩ thuật phân tích thời gian bay (Time of

Flight – TOF) để tách các ion theo tỷ số khối

lượng và điện tích (m/z)

Ta có thể phân tích trực tiếp một chiết xuất thực phẩm vì phương pháp MALDI-TOF

phân tích được các tạp chất và cho phép xác

định đồng thời khối lượng trong hỗn hợp phức tạp của các hợp chất có trọng lượng phân tử

thấp và cao

Bài báo này báo cáo khả năng của MALDI phù hợp với một tuyến tính TOF bằng cách sử dụng phương pháp trì hoãn xung ion (DE) để

cung cấp thông tin cấu trúc về các hợp chất có trong trà đen và cho phép chúng ta đề xuất cấu trúc polime hóa và oxy hóa của TRs

TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU

• Thiết bị : Khối phổ MALDI-TOF thu được trên

tuyến tính, sử dụng thiết bị trì hoãn xung ion

(DE)

• Hợp chất cocrystallized ion hóa bởi một tia laser nitơ (bước sóng 337 nm, độ rộng xung 4 ns) và chiết xuất bởi 3 điện áp xung kV với thời gian trì hoãn chiết (giữa 350 và 380 ns) trước khi vào thời gian bay gia tốc dưới 20 kV

•Tất cả phổ được ghi lại với một máy phát hiện điện áp là 2,9 kV và là kết quả trung bình của 65 bức ảnh tia laser Cường độ tia laser và độ nhạy của máy dò là biến

• Chuẩn bị các phần phân đoạn trà đen:

Chè đen Vân Nam (908 g), mua từ siêu thị địa phương-Trung Quốc, được chiết xuất với

acetone 80% (5 lần) ở nhiệt độ phòng trong hai tuần Chiết xuất được cô đặc và để khô

Phần còn lại được hòa tan trong nước và phân chia bằng chất chloroform, ethyl acetate,

và n- butanol Các phần acetate ethyl Sephadex LH-20 tách rửa bởi một hệ thống dung môi

acetone / nước (30% -60%) để cung cấp cho 14 phần phân đoạn

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Nhiều hợp chất có trong trà đen đã được xác định chính xác Các nhóm nổi bật đầu tiên là các TFs TFs bao gồm các phân tử có chứa một hạt nhân benzotropolone được hình thành bởi một phản ứng oxy hóa giữa Vic-trihydroxy-benzen và ortho-dihydroxybenzene catechin (hình 1A), chẳng hạn như theaflavin, theaflavin-3-monogallate, theaflavine-3-monogallate, và theaflavin-3, 3-digallate (Hình 1B), được hình thành bởi oxy hóa các nối đôi vòng-Benzen (3, 4, 5 trihydroxyl) của một EGC hay EGCG

và vòng Benzen (3, 4 dihydroxyl) 1 EC (epicatechin) hoặc ECG (epicatechin gallate)

Hình 1.Cấu trúc của các thành phần chính trong trà

Quang phổ của phân tử TFs tiêu chuẩn

tích với sự hình thành của các ion M + H + (565

m / z ) và M +Na + ( 587 m / z)

Hình 2- A: quang phổ theaflavin (chất phản

ứng,2,4,6-trihydroxy-acetophenone, 10 mg / ml, dung môi: methanol / nước (07:03, v / v); nồng độ theaflavin , 0,2 g / L; năng lượng laze, 228m/z, độ nhạy:7)

Hình 2- B: quang phổ theaflavin-3, 3-digallate (chất phản

ứng,2,4,6-trihydroxyacetophenone 10 mg / ml, dung môi: methanol /

nước (07:03, v / v);nồng độ theaflavin-3, 3 -digallate 0,2 g / L; năng lượng

laser ( 603 m/z)

• Hình 2B cho thấy quang phổ của

theaflavin-3,3- digallate (868 Da) Nó là

kết quả của sự ion hóa với sự hình thành của các ion M + H + ( 869 m / z), M + Na +

Da gốc gallate có mặt trong phân tử và

427Da khi nó là một chất tam phân

theaflavate.

Hình 3 Cơ chế phân mảnh

Hình 4 cho thấy quang phổ thu được

từ hai phân số, phân số 13 (Hình 4A) và

một phần n-butanol (Hình 4B)

Theaflavin trong phần phân đoạn 7 -11 với một đỉnh đặc trưng được phát hiện 565

m / z (M+H+), theaflavate B trong phần 12 với một đặc trưng đỉnh cao được phát

hiện tại 701 m / z (M+H+), theaflavin

monogallates trong phần phân đoạn 11-

13 với một đỉnh đặc trưng 717 m / z (M+ H+)

Theaflavate A trong phần 13 đặc trưng đỉnh tại 853 m / z (M+H+) và 700 m / z (F +H+) ion được hình thành sau khi phân

Hình 4-A: quang phổ của phần 13 (chất phản ứng,

2,4,6-trihydroxyacetophenone, 10 mg / ml, dung môi, methanol / nước (07:03, v / v); nồng

độ, 0,82 g / L; năng lượng laser, 248; độ nhạy, 6).

B1 và B2: quang phổ của phần n-butanol (CHCA chất phản ứng, nồng độ

bão hòa, dung môi, methanol / nước (07:03, v / v); nồng độ, 30 g / L; năng lượng laser, 174; độ nhạy, 8 TFs theaflavin, PA, proanthocyanidin type)

Hình 5 Đề xuất cấu trúc và cơ chế hình thành một số

thearubigins

Quang phổ của các phần n-butanol cho thấy một đỉnh cao tại 1431 m / z Cấu trúc của hợp

chất 1430 m / z được đề xuất cho trong hình 5 Quang phổ của n-butanol cũng cho thấy các hợp chất chất có khối lượng phân tử khác nhau đó là 1430m / z , từ 16 và 32 Da, 1447 và 1463 m/z ​​

tương ứng

Những kết quả này cho thấy rằng những hợp chất loại theaflavin có thể được tạo ra từ sự ngưng tụ giữa một nhóm ester gallate của

theasinensin hoặc proanthocyanidin và EC / C

và một EGC / GC cho hợp chất 1446 m / z và

EGC hai hợp chất 1462 m / z

Một phần của TRs bao gồm một hỗn hợp của các phân tử tạo thành từ sự

ngưng tụ của 3,4,5-trihydroxyl gallates của quá trình trùng hợp (chẳng hạn như

theasinensin hoặc proanthocyanidin) và

các dẫn xuất của catechin ECG / CG, EC /

C, EGC /CG, hay EGCG / CGC.

Các nghiên cứu hiện nay cho thấy phương pháp MALDI-TOF, liên kết với DE, là một kỹ thuật để

phân tích các TFs tiêu chuẩn và để cung cấp cho

các mô hình ion hóa các phân tử này, đặc biệt là ion

và phân mảnh của các chức ester Những đặc điểm này cho phép phát hiện trực tiếp TFs tiêu chuẩn

trong dịch chiết trà đen và chỉ ra cấu trúc TRs

Nghiên cứu này là một bước trong việc tìm hiểu cấu trúc TRs

Khi phân tích bằng MALDI-TOF-DE sẽ cung cấp

thông tin thú vị về mô hình ion hóa các phân tử

để xác nhận cấu trúc của TRs trong chè đen

TỔNG KẾT

2 Hoạt tính sinh học và các

hoạt tính chống oxy hóa

của flavanols trong chè

GIỚI THIỆU

- Trà xanh (CX) và chè đen (CĐ) được bắt nguồn từ cây chè có tên khoa học là

Camellia sinensis.Việc sản xuất chè đen

cần thêm một bước lên men, tạo

Galocatechingalat (GCG) và catechin

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu

- 30 người khỏe mạnh (14 nam ,

16 nữ) từ 20 và 39 tuổi đã được lựa chọn Các đối tượng được yêu cầu không uống trà, các sản phẩm liên quan đến trà, sinh tố, khoáng

chất, và bổ sung chế độ ăn uống hoặc thảo

dược dược trong suốt thời gian nghiên cứu.

- Những đối tượng thường xuyên uống trà

và người sử dụng hormone hoặc thuốc kháng sinh đã được loại trừ.

• Một thiết kế thí nghiệm ngẫu nhiên 3x 3 đã được

sử dụng cho nghiên cứu trong 1 tuần Các đối

tượng được phân ngẫu nhiên 3 trình tự khác nhau của CX, CĐ, hoặc DCCX

• Những người tham gia phải ăn chay và đã được cung cấp với một bữa ăn sáng với hàm lượng

flavonoid thấp Sau khi ăn sáng, lấy mẫu máu

chuẩn được rút ra, và các đối tượng đã có 30 phút

để hấp thụ chè

• Đối tượng được phép uống nước không giới hạn

và đã được cung cấp lượng flavonoid thấp với một bữa ăn trưa và ăn tối Máu được thu thập sau 1, 2,

4, 6, và 8 giờ sau khi uống trà

Hóa chất và dung môi

EGCG, EGC, EC, ECG,

D-glucuronidase loại XA

Escherichia coli, Arylsulfatase loại VIII từ

ruột bào ngư, 2,2-azinobis

(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)

- Muối diammo-nium (ACĐS), mangan

dioxide

- 6-hydroxy-2, 5,7,8 - carboxylic acid ( trolox ).

tetramethylchroman-2 Trà xanh và chè đen dạng túi.

Chuẩn bị mẫu

- Flavanol trà, theaflavin, caffeine ở các

nồng độ được đo trong các đồ uống

sử dụng phương pháp sắc ký lỏng để

phân tích.

- Các mẫu trà được chuẩn bị bởi đội ngũ kĩ thuật viên được đào tạo

- Bốn túi CĐ hoặc 3 túi CX đã được pha

vào 426 ml nước sôi và để trong 5 phút.

- Số lượng các túi trà đã được lựa chọn để phù hợp với hàm lượng EGCG Trà đã

được uống ngay lập tức mà không

có đường hoặc bổ sung 45ml sữa

• Thu thập mẫu và lưu trữ

Các mẫu máu được thu thập ngay sau mỗi lần pha được bảo quản trong môi trường lạnh và vận chuyển đến Trung tâm dinh dưỡng con người để

xử lý và lưu trữ

Máu trong các ống chân không EDTA được ly tâm ở 4 ° C trong 10 phút với một máy ly tâm GS-6R , 0,8 mL dịch huyết tương đã được lưu

trữ ở 70 ° C mà không cần bổ sung hoặc với

80 mL ascorbic 20%, dung dịch acid 0,1%

EDTA (0,4mmol / L Na2PO4, pH 3,6)

Phân tích Flavanol trong huyết tương

23 mol catechin gallate / L tiêu chuẩn, 500 đơn

vị D -glucuronidase loại XA từ Escherichia coli ,

và 4 đơn vị của loại sulfatase VIII từ ruột bào

ngư

Hỗn hợp này được ủ ở 37 ° C trong 45 phút

• THỐNG KÊ

Các nồng độ trong huyết tương cao điểm (Cmax) và thời gian để tập trung cao

điểm (tmax) được ghi

lại các vùng thuộc huyết tương tập thời gian (0 - 8 h), đường

trung-cong(AUC) được ước tính bằng quy tắc h ình thang tuyến tính Nghiên cứu lặp đi

lặp lại với 3 trình tự, 3 giai đoạn, và

Nhận xét:

Thành phần EC không khác

nhau giữa CĐ và DCCX, không có khác

biệt trong ECG giữa CX, CĐ, và DCCX

EC trong huyết tương Cmax là cao hơn đáng kể sau khi uống CX hơn khi uống CĐ và DCCX

EGC trong CĐ nhiều hơn 4 lần là so với

DCCX, nhưng huyết tương Cmax và AUC chỉ tập trung hai lần khi uống CĐ hơn DCCX

• Những kết quả này cho thấy rằng khi cùng 1

lượng flavanols trà được pha hoặc DCCX

DCCX là hiệu quả hơn trong nâng cao hàm

flavanol trong huyết thanh, tổng số lượng của

EGC, EGCG, EC, ECG được cung cấp bởi CX, trong CĐ, và DCCX tương ứng là 679,0; 9,4;

496,5; 3,3 và 386,5; 3,2 mg Phù hợp với liều

lượng , flavanol trong huyết tương tập trung

cao nhất đạt được với CX (1,23 0,09 mol / L)

28,5% (Hình 2)

Hình 2. Huyết tương (SEM) nồng độ flavanol tổng [tổng hợp của huyết tương ()-epigallocatechin ()-epicatechin, ()-epigallocatechin-3-

gallate, và()-epicatechin-3-gallate nồng độ] việc tiêu thụ CX, CĐ, DCCX.

• Sau khi uống DCCX , tmax được kéo dài thêm 1 giờ cho tất cả 4 flavanols trà so với uống CĐ và CX (P 0,05; Bảng 2) Sự bài tiết flavanol qua nước tiểu , thể hiện tỷ lệ phần trăm của flavanol, EGC và EC là 0,2- 1,3%, trong khi EGCG và ECG là 0,01-

0,06% (Bảng 3) Tỷ lệ phần trăm các chất bài tiết đối với EGC và EC cao hơn đáng

kể ở DCCX hơn CX và CĐ (Bảng 3).

Tỷ lệ phần trăm các chất bài tiết đối với EGC và EC cao hơn đáng kể

EC 0.56 0.05a 0.23 0.02b 0.75 0.08a 0.50 0.08a 0.52 0.11a 1.26 0.28b

EGCG 0.07 0.01a 0.08 0.01a 0.14 0.01b 0.06 0.01a 0.05 0.01a 0.06 0.01a

ECG 0.12 0.01a 0.11 0.01a 0.20 0.02b 0.02 0.01a 0.01 0.01a 0.02 0.01a

Hình 3 Ảnh hưởng của thời gian (0-60 phút) về ngăn chặn hấp thụ các gốc cation 2,2-azinobis

• Nghiên cứu được tiến hành với việc sử dụng CX, CĐ, DCCX phù

hợp cho các thành phần EGCG CX và

DCCX thường có chứa một

lượng cao EGCG hơn CĐ

KẾT LUẬN

Chúng tôi kết luận rằng polyphenol trong các hình thức của DCCX mang hoạt tính sinh học tăng cường so với CX, CĐ, dẫn đến một sự gia tăng nhỏ nhưng đáng kể trong khả năng chống oxy hóa Hình

thành chất chuyển hóa flavonol có thể đã góp phần tác dụng chống oxy

hóa vì thiếu sự tương quan giữa nồng

độ flavanol huyết tương