NGHIÊN cứu CHIẾT TÁCH, xác ĐỊNH cấu TRÚC các HOẠT CHẤT từ cây BÁCH bộ (STEMONA PIERREI GAGN)Ở lào

Ngày nay, với việc áp dụng các tiến bộ khoa học kỹthuật để nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học, tác dụng dược lýcủa các cây thuốc dân gian – không những làm sáng tỏ khả năng

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô trong tổ Bộ môn Hóa Hữu

cơ cũng như các thầy cô trong khoa Hóa học – Trường Đại học sư phạm HàNội đã giúp đỡ và cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Viện Khoa học và Công nghệViệt Nam đã rất nhiệt tình giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt luận văn này

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bè bạn đã động viên, tạo điềukiện để tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ này

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên K22

Lâm Thị Hải Yến

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

• HSQC: Phổ hai chiều, tương tác trực tiếp C – H

• HMBC: Phổ hai chiều, tương tác gián tiếp C – H

 Các kí hiệu khác

• N-E: Hệ dung môi n-hexan: etyl axetat

• APG II Angiosperm Phylogeny Group II (một hệ thống

phân loại sinh học thực vật hiện đại dựa trên việc phân tích phân

tử được công bố vào tháng 4 năm 2003)

• APG III Angiosperm Phylogeny Group III (được công bố

tháng 10 năm 2009)

MỤC LỤC

1.1.1 Khái quát về họ Bách Bộ (Stemonaceae) và chi Stemona 3

2.1 Đối tượng, nội dung và các phương pháp nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19

2.2.1 Thiết bị 19

2.2.2 Hóa chất 19

2.2.3 Dụng cụ 20

2.3 Thực nghiệm 20

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu và chiết tách 20

2.4 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 25

2.4.1 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 25

2.4.2 Phương pháp phổ NMR 26

2.5 Đặc trưng vật lý - phổ của các chất phân lập được 26

DANH MỤC SƠ ĐỒ, BẢNG SỐ LIỆU

VÀ HÌNH ẢNH TRONG LUẬN VĂN

 Danh sách các sơ đồ:

1.1.1 Khái quát về họ Bách Bộ (Stemonaceae) và chi Stemona 3

2.1 Đối tượng, nội dung và các phương pháp nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19

2.2.1 Thiết bị 19

2.2.2 Hóa chất 19

2.2.3 Dụng cụ 20

2.3 Thực nghiệm 20

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu và chiết tách 20

2.4 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 25

2.4.1 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 25

2.4.2 Phương pháp phổ NMR 26

2.5 Đặc trưng vật lý - phổ của các chất phân lập được 26

 Danh sách các bảng: 1.1.1 Khái quát về họ Bách Bộ (Stemonaceae) và chi Stemona 3

2.1 Đối tượng, nội dung và các phương pháp nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19

2.2.1 Thiết bị 19

2.2.2 Hóa chất 19

2.2.3 Dụng cụ 20

2.3 Thực nghiệm 20

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu và chiết tách 20

2.4 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 25

2.4.1 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 25

2.4.2 Phương pháp phổ NMR 26

2.5 Đặc trưng vật lý - phổ của các chất phân lập được 26

 Danh sách các hình:

1.1.1 Khái quát về họ Bách Bộ (Stemonaceae) và chi Stemona 3

2.1 Đối tượng, nội dung và các phương pháp nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19

2.2.1 Thiết bị 19

2.2.2 Hóa chất 19

2.2.3 Dụng cụ 20

2.3 Thực nghiệm 20

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu và chiết tách 20

2.4 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 25

2.4.1 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 25

2.4.2 Phương pháp phổ NMR 26

2.5 Đặc trưng vật lý - phổ của các chất phân lập được 26

DANH MỤC PHỤ LỤC 1.1.1 Khái quát về họ Bách Bộ (Stemonaceae) và chi Stemona 3

2.1 Đối tượng, nội dung và các phương pháp nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19

2.2.1 Thiết bị 19

2.2.2 Hóa chất 19

2.2.3 Dụng cụ 20

2.3 Thực nghiệm 20

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu và chiết tách 20

2.4 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 25

2.4.1 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 25

2.4.2 Phương pháp phổ NMR 26

2.5 Đặc trưng vật lý - phổ của các chất phân lập được 26

MỞ ĐẦU

Lào là một trong số ít những quốc gia còn nhiều rừng nguyên sinh vớicác thảm thực vật đa dạng, phong phú Dựa vào kinh nghiệm thực tiễn, nguồntài nguyên quý giá này đã được người dân sử dụng để phòng và chữa bệnhtrong nhiều năm qua Tuy nhiên đó mới chỉ là những kinh nghiệm dân gian,chưa có cơ sở khoa học Ngày nay, với việc áp dụng các tiến bộ khoa học kỹthuật để nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học, tác dụng dược lýcủa các cây thuốc dân gian – không những làm sáng tỏ khả năng chữa bệnhcủa cây thuốc, mà còn nâng cao giá trị, hiệu quả sử dụng và khả năng khaithác các loài cây thuốc một cách hiệu quả hơn

Hiện nay, các hợp chất có hoạt tính sinh học được phân lập từ thực vậtngày càng được chú ý, nghiên cứu do chúng có những hoạt tính sinh học rấtgiá trị như chống viêm nhiễm, chữa ung thư … và làm chất dẫn đường chocác quá trình tổng hợp qui mô lớn các dẫn xuất mới với những hoạt tính sinhhọc mới, phong phú và hiệu quả hơn

Cây Bách bộ thuộc loại cây bụi, mọc hoang ở các vùng đồng bằngNam Bộ Việt Nam, Lào, Đông Bắc Thái Lan, Campuchia, Trung Quốc là mộtloài cây thuốc quí Theo kinh nghiệm dân gian ở Nam bộ Lào, người ta đã sửdụng phần củ của cây Bách bộ để làm thuốc chữa nhiều loại bệnh có hiệu quảnhư các bệnh về da, ung thư gan … Ngoài ra củ Bách bộ còn có khả năng làmthuốc diệt sâu bọ, mối mọt… So với các loài Bách bộ ở Việt Nam, TrungQuốc và Thái Lan, cây Bách bộ ở Lào chưa được nghiên cứu nhiều, số lượngcác công trình nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của loàicây này còn ít

Vì những lý do trên đây, trong khuôn khổ Luận văn Thạc sĩ Hóa họcnày, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc các hoạt

chất từ cây Bách bộ (Stemona pierrei Gagn) ở Lào”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu cây Bách bộ

1.1.1 Khái quát về họ Bách Bộ (Stemonaceae) và chi Stemona

1.1.1.1 Giới thiệu chung

Họ Bách bộ (tên khoa học là Stemonaceae), là một họ trong thực vật có

hoa, bao gồm 3-4 chi và khoảng 25-35 loài dây leo hay cây thân thảo Hệthống APG II năm 2003 và hệ thống APG III năm 2009 đặt nó trong bộ Dứa

dại (Pandanales) của nhánh một lá mầm (Monocots) ngành hạt kín (Angiosperms).

Họ Bách Bộ được chia thành 4 chi:

Trong đó, chi Stemona là lớn nhất: có khoảng 30 loài, thường mọc

hoang dại ở những vùng trung du, miền núi, tập trung ở các các nước Châu Ánơi có khí hậu nóng ẩm như Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Thái Lan, [21, 34]

Các loài thuộc chi Stemona thường có đặc điểm chung như sau: [1,7,9]

• Thân thảo, mọc đứng, bò hoặc leo, lá mọc đối, so le hay mọcvòng,

thường hình tim

• Cụm hoa ở kẽ lá, riêng lẻ hay nhiều hoa, có cuống hoặc không cuống, lưỡng tính Bao hoa 4 mảnh, hai ngoài, hai trong giống nhau và đều

nhau, đôi khi mảnh ngoài rộng hơn, nhiều gân hơn Nhị 4, bằng nhau, mọcđối xứng với các bộ phận của hoa.Chỉ nhị ngắn, bao phấn hướng trong, trungđới có phần

phụ dài hình đùi Bầu trên một ô, đôi khi tiêu giảm Vòi nhụy phân biệt rõràng với bầu Đầu nhụy tận cùng gần như phân đôi Noãn 2-11, mọc đứng,dính ở phía dưới của ô

• Quả nang hình trứng hoặc hình mác dẹt, mở bằng hai van Hạthình trứng, phôi thẳng, có nội nhũ

• Rễ củ dài, thịt rễ nạc

1.1.1.2 Giới thiệu về Bách bộ Lào và cây Bách bộ lá nhỏ

Theo các tài liệu [5,28] tại Lào hiện có 11 loài thuộc chi Stemona là : Stemona tuberosa, Stemona phyllantha Gagnep, Stemona squamigera Gagnep, Stemona cochinchinensis Gagnep, Stemona pierrei Gagnep, Stemona saxorum Gagnep, Stemona collinsae Craib, Stemona aphylla Craib, Stemona burkillii Prain, Stemona griffithiana Kruz và Stemona kerrii Craib.

Các loài này phân bố rải rác ở các vùng núi miền bắc, đồng bằng miền trung

và miền nam nước Lào

Cây Bách bộ lá nhỏ có tên khoa học là Stemona pierrei Gagnep thuộc

họ Bách bộ (Stemonaceae).

• Mô tả: Dây leo có thân mảnh, dài từ 10-15m, ở gốc có nhiều rễ

củ mọc thành chùm Lá mọc đối hay so le

• Bộ phận dùng nghiên cứu:Cây Bách bộ lá nhỏ được thu hái tại

tỉnh Savannakhet, CHDCND Lào, tháng 5/2012 Sau khi thu hái, củ rễ đượcphơi sấy khô, thái nhỏ

• Nơi sống và thu hái: Cây Bách bộ nói chung - ưa khí hậu ôn hòa,

cây thường mọc hoang ở đồi núi hay ven suối, ẩm mát, thích đất pha cát,

nhiều mùn Có thể trồng bằng cách gieo hạt hoặc bằng chồi gốc Bách bộđược tìm thấy ở: Việt Nam, Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản, Lào,…

1.1.2.Tác dụng dược lý của cây Bách Bộ

Theo lý luận y học cổ truyền, Bách bộ vị cam khổ, tính vi ôn, quy kinhphế, công năng nhuận phế hạ khí chỉ khái, sát trùng, được sử dụng phổ biến ởdạng sống hoặc qua chế biến trong điều trị chứng ho hoặc dùng điều trị bệnhgiun sán Bách bộ sống tác dụng thiên về chỉ khái hoá đàm, sát trùng, dùngtrong các trường hợp ngoại cảm dẫn đến ho, nhưng có tác dụng phụ gây kíchứng dạ dày Chích mật có thể hoà hoãn tính kích thích dạ dày, đồng thời tăngcường tác dụng nhuận phế chỉ khái, dùng trong trường hợp ho lao (ho lâungày), bách nhật khái, phế âm hư khái thấu, trong đờm có máu [11]

Ngoài ra, theo phương pháp cổ truyền, Bách bộ còn có thể được chếbiến với các phụ liệu dịch chiết cam thảo, mật ong, rượu như sau [10]:

• Bách bộ phiến: Rễ bách bộ sau khi thu hái rửa sạch đất cát, cắt

bỏ đầu đuôi, thái phiến chéo, dài 3-5 cm, dày 5-6 mm, sấy ở 50-60oC cho đếnkhô

• Bách bộ chưng rượu: Lấy rượu 40% tẩm đều vào bách bộ phiến theo tỉ lệ 1/5 (thể tích/khối lượng) Cho vào một cốc có dung tích phù hợp,đậy kín, đặt vào nồi cách thuỷ sôi, tiếp tục đun sôi 1 giờ, lấy ra phơi, sấy ở50-60oC cho đến khô

• Bách bộ chích mật ong: Cân mật ong và bách bộ phiến theo tỉ lệ 1/10, thêm nước pha loãng mật ong theo tỉ lệ 1:1 rồi trộn đều vào bách bộphiến, ủ cho ngấm đều Sấy khô qua, sao lửa nhỏ đến khi miếng bách bộchuyển màu vàng đậm, sờ không dính tay, mùi thơm, vị đắng ngọt

• Bách bộ chích cam thảo: Cân cam thảo và bách bộ theo tỉ lệ 1/8 Sắc cam thảo với lượng nước gấp 15 lần lượng cam thảo hai lần, đun sôi 1,5

giờ/lần, gộp dịch nước sắc Đem ngâm bách bộ phiến trong nước sắc camthảo 4 giờ, vớt ra phơi, sấy khô.

Năm 2010, Nguyễn Mạnh Tuyển, trường đại học Dược Hà Nội đã tiếnhành thử tác dụng giảm ho của bách bộ trước và sau chế biến Kết quả chothấy, ở liều thử 20g/kgTT trên chuột nhắt trắng, bách bộ phiến có tác dụnggiảm ho tốt, có xu hướng long đờm; bách bộ chưng rượu có tác dụng longđờm tốt, có xu hướng giảm ho; bách bộ chích cam thảo có tác dụng giảm ho,long đờm đều tốt; bách bộ chích mật ong chỉ có xu hướng giảm ho, longđờm [12]

Bên cạnh đó dịch chiết từ củ bách bộ cũng được xác định là có tác dụngtrong việc điều trị côn trùng cũng như ngoại ký sinh trùng hiệu quả cho giasúc Cụ thể: dùng nồng độ 5% đã diệt chết được bọ gậy – một pha biến tháitrong vòng đời phát triển của muỗi; dùng nồng độ 3% diệt ve chó, phun lần 1diệt 52,4%, phun lần 2 sạch ve; nếu dùng nồng độ 5% chỉ phun 1 lần đã diệtđược 91,04% ve chó [11]

1.2 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Bách Bộ

1.2.1 Nghiên cứu về Bách bộ nói chung

Bách Bộ là một loại dược liệu quí nên được nhiều nhà khoa học quantâm nghiên cứu Cho đến nay đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về Bách

bộ được công bố Nhìn chung, trong rễ cây Bách bộ (Stemona) thường có

nhiều ancaloit khác nhau Ngoài ra còn có gluxit (2,3%), lipit (0,84%), protit(9,25%) và axit hữu cơ (axit xitric, malic, oxalic )

1.2.1.1 Hợp chất Ancaloit [19]

Tính đến năm 2006, có khoảng hơn 80 hợp chất ancaloit đã được phânlập từ các loài bách bộ Các ancaloit này có cấu trúc hoá học phức tạp, đặc

trưng cho thực vật họ bách bộ (Stemonaceae) và hầu như không thể tìm thấytrong bất kì loài thực vật nào khác Vì vậy, trước năm 1980 việc xác định cấutrúc của phần lớn các hợp chất này đều dựa vào phương pháp đo X-ray Xét

về cấu trúc, các ancaloit từ Bách bộ đặc trưng bởi một nhân

pyrrolo[1,2-a]azepine thường liên kết với 2 cầu cacbon tạo thành các vòng lacton

đầu-đuôi (terminal lactone rings)

Các ancaloit từ Bách bộ được phân loại theo nhiều cách khác nhau:thành 8 nhóm theo Ye et al hoặc thành 5 nhóm theo Pilli và Ferreira deOliveira Tuy nhiên năm 2006, Harald Greger, đại học Vienna, Áo khi xemxét sự sinh tổng hợp và sự phân bố trong các loài Bách bộ của 82 dẫn xuấtancaloit khác nhau đã đưa ra một cách phân loại mới dựa vào sự khác nhaucủa các mạch cacbon liên kết với C-9 của nhân pyrroloazepine Cụ thể, cácancaloit từ Bách bộ được chia thành 3 kiểu cấu trúc: kiểu Croomine, kiểuStichoneurine và kiểu Protostemonine

10 11 13

O

O

10 16

O O

O

10 11 17

12

13 14 16

15

Protostemonine-type

Hình 1.1 Các khung cơ bản của ancaloit từ cây Bách Bộ

a Kiểu cấu trúc Stichonerine (tuberostemonine)

Chủ yếu là các ancaloit có nhánh etyl (C-16-C-17) liên kết với C-10của mạch ngoài như: tuberostemonine, tuberostemoenone, tuberostemoniol,oxotuberostemonine, stenine, parvineostemonine, parvistemonine,stemoninine

3 9

Tuberostemonine

CH3H

O

O

H

H H

H H

10

1112

13 14

H

CH3

CH3H

1

5 6 7 8

10

1112

13 14

15

16 17

9a

Stenine

b Kiểu cấu trúc Protostemonine

Bao gồm các ancaloit có một nhóm metyl (C-17) ở C-10 và thường tạothành một vòng lacton không no liên kết với C-11 bởi một liên kết đôi như:maistemonine, stemonamine, protostemonine, stemonine, stemoamide,parvistemoamide, stemokerrine, stemofoline, neostemonine

N

3 9

1

5 6 7 8

13

14 15

c Kiểu cấu trúc Croomine

Tính đến năm 2006, đã xác định được khoảng 8 ancaloit kiểu croomine.Các ancaloit này khác biệt với các ancaloit kiểu stichoneurine vàprotostemonine ở chỗ chúng chỉ có 4 nguyên tử cacbon liên kết với C-9 tạothành một vòng lacton liên kết trực tiếp với nhân pyrroloazepine trong một hệthống spiro Bao gồm: croomine, bisdehydrocroomine, 6-hydroxycroomine,stemospironine, stemonidine, stemotinine, tuberostemospironine

N O O

Croomine

CH3H

H O

H O

OMe HO

OH

Me

OMe OMe

Stibenstemine F Stibenstemine H

OMe

HO

OH Me

dihydroxy hidr oxy

OMe

MeO MeO

dihydroxy

OMe

metoxy bibenzyl _2,5_

HO

MeO

Me Stemanthren A

HO MeO

Me HO

OH MeO

Me

C

HO MeO

Stemanthren

OH MeO

Me

D

O Stemanthraquinone

HO

Stemofuran K 3

O

OMe OH

HO

Stemofuran

MeO

J

1.2.2 Nghiên cứu về Bách Bộ Lào

Năm 2013, lần đầu tiên TS Vonganantha Khamko đã nghiên cứu thành

phần hoá học và hoạt tính sinh học của ba loài Bách bộ Lào: S cochinchinenis, S pierrei, S tuberosa và đã phân lập được 24 hợp chất bao

gồm các ancaloit (maistemonine và isomaistemonine), stilbenoit,

stemanthrene, stemobenzofuran, steroit, các axit thơm trong đó tác giả đãphân lập được 9 hợp chất mới có cấu trúc như sau: [5]

1-(3-hydroxy-2-metoxyphenyl)-2-(3'-hydroxy-5'-metoxy-2',4'-dimetylphenyl)etan

O

CH3OH OCH3

3

4

1'

2' 3'

Metyl 1'-hydroxy-1'-(4-hydroxy-3-metoxyphenyl)propylat

MeO

OH HO

OMe

1 3

5

1'' 2''

1' 3' 5'

Stemophenanthren B

O O

OH

Me

1 3 5

1' 3' 5' 1'' 2''

Stemophenanthren A

1 3

5

1'' 2''

1' 3' 5'

OMe

1 3

5

1'' 2'' 1'

3

5

1'

3' 5'

3 5

1'

3' 5' Me

OH

Stemophenanthren E

1.2.3 Nghiên cứu về Bách bộ lá nhỏ Stemona pierrei

Năm 2003, các nhà khoa học Australia và Thái Lan [33] đã nghiên cứu

về Stemona pierrei Kết quả đã phân lập và xác định được cấu trúc của 7 chất:

3 dihydro phenanthrenes, 1 dihydrostilbene, 2 ancaloit kiểu protostemonin làProtostemonine và Stemonin

Năm 2012, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Thị Nhàn (ĐH Sư phạm Hà

Nội) đã nghiên cứu về Stemona pierrei GAGN mọc ở Lào và đã phân lập

được các hợp chất: maistemonine, isomaistemonine, stemanthrene A,B,C, axit

benzoic, axit p- anisic [4,8]

Năm 2013, TS Vonganantha Khamko khi nghiên cứu về Stemona pierrei đã tách được 7 hợp chất tinh sạch: Sesamin, Stemobenzofuran A,

N H

O O

O O

Stemanthren B, Syrigaresinol, axit benzoic, axit benzoic, axit p- anisic, metyl

1’-hydroxy-1’-(4-hydroxy-3-metoxyphenyl)propylat Trong đó có 2 hợp chấtmới là Stemobenzofuran A và metyl 1’-hydroxy-1’-(4-hydroxy-3-metoxyphenyl)propylat [5]

O

CH3OH OCH3

3' 5'

3

4

1'

2' 3'

Metyl 1'-hydroxy-1'-(4-hydroxy-3-metoxyphenyl)propylat

1.3 Hoạt tính sinh học

Theo các tài liệu [5,14], dịch chiết etanol của củ bách bộ S tuberosa có

tác dụng ức chế sử phát triển của một số loài nấm và vi khuẩn kiểm định Một

số dẫn xuất của bibenzyl (3,5-dihydroxy-4-methylbibenzyl), có khả năng ứcchế sử phát triển của tế bào ung thư máu P338 và gan của chuột

Ở Việt Nam, TS Vũ Ngọc Kim đã tiến hành thử nghiệm tác dụng sinh

học củ dịch chiết S.tuberosa, ancaloit toàn phần và tuberostemonine L-G và

đã được nhận thấy chúng không độc, có tác dụng làm liệt cơ giun đũa, giảm

ho và long đờm trên chuột Ngoài ra tuberostemonine L-G còn có tác dụng ức

chế một số vi khuẩn thử nghiệm như: Bacillus subtillis, Bacillus pumilius, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Klebsiella [27] Nghiên cứu khả năng gây độc tế bào của các dịch chiết thô từ ba loài như: S tuberosa, S saxorum,

S cochinchinensis, cho thấy: dịch chiết thô từ S cochinchinensis có hoạt tính

kháng cả bốn dòng tế bào ung thư gan, ung thư màng tử cung, ung thư màngtim và ung thư thận người Chỉ sau khi được làm giàu theo định hướng các

dẫn chất bibenzyl, các mẫu S tuberosa và S saxorum mới xuất hiện hoạt tính

gây độc tế bào đối với ba dòng tế bào ung thư trên [27]

Năm 2003, các nhà khoa học Australia và Thái Lan [30] đã nghiên cứu

về Stemona pierrei Hợp chất Stemanthren C phân lập được từ loài Stemona pierrei có hoạt tính kháng tế bào ung thư dòng KB mức độ trung bình với giá

trị IC50 là 82.03 µg mL-1

Về Bách bộ Lào, năm 2013 TS Vonganantha Khamko đã tiến hành thửhoạt tính sinh học của 13 hợp chất tinh sạch phân lập được từ ba loài Bách bộ:

S.cochinchinenis, S pierrei, S tuberosa Kết quả cho thấy có 3 chất

(stemophenanthren C, D, E) có hoạt tính kháng sinh, gây độc 4 dòng tế bàoung thư ở mức độ khá (IC50 từ 4,49 đến 63,65 µg/ml); có 5 chất (stemanthren

C, A; stemophenanthren A, B; 5’-metoxy-2’,4’-đimetylphenyl)etan) gây độc tế bào ung thư KB ở mức trungbình (IC50 từ 20,67 đến 82,30 µg/ml) [5]

1-(3-hydroxy-2-metoxyphenyl)-2-(3’hydroxy-CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU

2.1 Đối tượng, nội dung và các phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây Bách bộ lá nhỏ được thu hái tại tỉnh Savannakhet, CHDCND Lào,tháng 5/2012 ThS.Nguyễn Thế Anh, Viện Hóa học, Viện KHCN Việt Nam

giúp xác định tên khoa học của mẫu cây Bách bộ lá nhỏ là Stemona pierrei.

Sau khi thu hái, củ rễ được phơi sấy khô, thái nhỏ

Hình 2.1 Cây Bách bộ lá nhỏ

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

1 Xác định tên khoa học của cây Bách bộ lá nhỏ

2 Khảo sát định tính các lớp chất có trong củ Bách bộ lá nhỏ

3 Chiết tách, xác định cấu trúc một số hợp phần trong củ Bách bộ lá nhỏ

4 Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của chất sạch

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu

1 Phương pháp thu hái và xử lí mẫu

2 Phương pháp ngâm chiết để thu lấy dịch chiết

3 Phương pháp hóa học định tính các lớp chất từ hạt xà sàng

4 Phương pháp sắc kí cột và sắc kí bản mỏng để chiết tách các lớpchất

5 Phương pháp HPLC điều chế

6 Xác định cấu trúc của các cấu tử phân lập được bằng một số phương

pháp vật lý hiện đại như đo nhiệt độ nóng chảy, phổ 1H NMR,

2 Đèn soi bản mỏng với ba bước sóng (254nm, 302nm và 365nm)

3 Thiết bị đo điểm chảy GallenKamp tại Bộ môn Hóa học hữu cơ,khoa hóa học, Trường ĐHSP Hà Nội

4 Thiết bị máy HPLC điều chế của Bộ môn Hóa học hữu cơ, khoa hóahọc, Trường ĐHSP Hà nội

5 Thiết bị đo cộng hưởng từ hạt nhân Brucker Avance 500MHz củaViện hóa học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam

2.2.2 Hóa chất

- Dung môi: Metanol, n- hexan, clorofom, etylaxetat, etanol.

- Thuốc thử : Dragendoff, Mayer, Wagner, Liebermann – Burchard,…

và các hóa chất: dung dịch H2SO4đặc, dung dịch H2SO4 5%, dung

dịch NaOH 10%, dung dịch CH3COOH 5%, dung dịch HCl đặc,dung dịch FeCl3,…

- Thuốc hiện hình: vanilin trong H2SO4 5%

2.2.3 Dụng cụ

- Sắc ký cột, chất hấp thụ silicagel( hãng Merck-60), kích thước hạt

40-60 với hệ dung môi rửa giải là n- hexan:etylaxetat tăng dần độ phân

- Ngâm chiết mẫu:

Lấy 8 kg mẫu củ Bách bộ lá nhỏ (đã sấy khô) đem ngâm chiết liên tụcbằng dung môi metanol khoảng 3 tuần Lọc để thu lấy dung dịch có màu vàngcam Phần bã còn lại đem ngâm lại trong metanol Tiến hành tương tự như thế

6 lần Thu lấy tất cả các dung dịch lọc được đem cất cô quay chân không đểcất đuổi dung môi thu được cao tổng

Để phân đoạn các hợp chất tự nhiên từ cao tổng thu được ở trên chúngtôi sử dụng qui trình chiết bằng phễu chiết thực hiện ở điều kiện nhiệt độ

phòng, với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl axetat và

metanol Qui trình chiết như sau:

+ Lấy cao tổng hòa trong hexan, dùng phễu chiết để chiết lấy dịch hexan Phần bã còn lại tiếp tục chiết với n-hexan tương tự như thế thêm 2 lần Dịch chiết n-hexan qua 3 lần chiết được gom lại Phần bã còn lại gọi là bã 1.

n-+ Tiếp tục chiết bã 1 bằng etyl axetat Làm 3 lần sau đó gom dịch chiếtetyl axetat vào Phần bã còn lại sau khi chiết etylaxetat gọi là bã 2

+ Phần bã 2 đem chiết 3 lần bằng metanol Làm 3 lần sau đó gom dịchchiết metanol

Các dịch chiết thu được đều có màu nâu sẫm Sau khi cất đuổi dungmôi thu được các cặn chiết tương ứng: cặn n-hexan, cặn etyl axetat, cặnmetanol

Dưới đây là khối lượng các cặn chiết thu được và hàm lượng % các cặnchiết:

Bảng 2.1 Hàm lượng % các cặn chiết so với mẫu khô

2.3.2 Sơ đồ thực nghiệm

Sơ đồ 2.3.1 Sơ đồ chiết lấy cặn etyl axetat từ củ Bách bộ lá nhỏ

2.3.3 Phân lập các chất từ cặn chiết Etylaxetat

Việc phân lập các chất từ cặn chiết Etylaxetat được thực hiện bằng các

phương pháp sắc kí khác nhau như phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC),

phương pháp sắc kí cột (CC), sắc kí lỏng điều chế (prep HPLC)

• Sắc kí bản mỏng: Sắc kí bản mỏng được thực hiện trên bản mỏng

tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merk) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở ba

bước sóng 254nm, 302nm và 365nm hoặc dùng thử là dung dịch HSO 5%

-Lọc

Dung dịch

Bã

Cặn Metanol (A3)

Cặn

n-hexan

(A1)

CặnEtylaxetat (A2)Cao tổng

1.Etylaxetat 2.cất đuổi dung môi

Vanilin bằng cách phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khihiện lên màu

• Sắc kí cột (CC): Sắc kí cột được tiến hành với chất hấp phụ làsilicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (Merk) Hệ dung môi rửagiải là các hệ dung môi hữu cơ: n-hexan/etylaxetat có độ phân cực tăng dần

• Sắc kí lỏng điều chế: Sắc kí lỏng điều chế được tiến hành trên máysắc kí lỏng điều chế (prep HPLC) của hãng Jasco (Nhật Bản), model JascoPU-2087, detector UV-2070 và RI-2031, cột sắc kí Waters 5 SL-II (10.0 x250mm), tốc độ chạy cột 1,0ml/phút Thiết bị đặt tại Bộ môn Hoá hữu cơ,Khoa Hoá Học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

Sau quá trình ngâm chiết từ mẫu củ Bách bộ chúng tôi thu được các cặnchiết: cặn n-hexan (A1), cặn etylaxetat (A2) và cặn metanol (A3) Lấy mộtlượng nhỏ mỗi cặn chiết và kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng với các hệ dungmôi rửa giải phù hợp, từ kết quả thu được chúng tôi nhận thấy sự khả quankhi phân tách cặn chiết etylaxetat bằng các hệ dung môi rửa giải n-E từ 10:1đến 1:1 (trên bản mỏng xuất hiện các chấm gần tròn tách xa nhau) Vì vậy,chúng tôi lựa chọn cặn chiết etylaxetat để tiến hành nghiên cứu, phân lập cácchất tinh sạch

Tiến hành chạy sắc kí cột với 13,05g cặn chiết etylaxetat, rửa giải bằngcác hệ n-E từ 6:1 đến 100% etylaxetat chúng tôi thu được 18 phân đoạn, kíhiệu E1-E18 Các phân đoạn này được làm khô tự nhiên cho bay hết dungmôi, cân để xác định khối lượng, thu được kết quả như sau

Bảng 2.2 Khối lượng các phân đoạn E1-E18

- Từ các phân đoạn E2, E3, E4 thu được chất kết tinh màu trắng còn lẫnbẩn, chất kết tinh này được tinh sạch bằng phương pháp kết tinh lại nhiều lầntrong dung môi Etanol 100%, chúng tôi thu được chất YE3 (20mg)

- Lấy 37mg mẫu từ phân đoạn E6 đem chạy sắc kí lỏng với hệ dung môirửa giải n-E = 3:1, detector UV 254nm, các ống nghiệm hứng mẫu theo thờigian lưu, được đánh số từ 1 đến 8 Từ ống nghiệm số 5 chúng tôi thu đượcchất YE6.5 là chất kết tinh màu trắng, hình kim, có khối lượng 6mg

- Từ phân đoạn E8 (143mg), chúng tôi tiến hành chạy sắc kí cột với các

hệ dung môi n-E từ 6:1 đến 1:10 để phân cắt thành các phân đoạn nhỏ hơnE8.1-E8.4

Lấy phân đoạn 8.1 đem chạy sắc kí lỏng với hệ dung môi rửa giải n-E =1:1, detector UV 254nm chúng tôi thu được chất YE8.3 kết tinh hình kim,màu trắng, có khối lượng 7mg

- Tiến hành tương tự với các phân đoạn còn lại, chúng tôi thu được chấtYE10.3 kết tinh hình kim, màu trắng, có khối lượng 7mg

Việc phân lập các chất được minh hoạ bằng sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 2.3.2 Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat

2.4 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

2.4.1 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy

Các chất sạch YE3, YE6.5, YE8.3, YE10.3 sau khi rửa sạch và sấy

HPLC n-E=1:2