Nghiên cứu chế độ bổ sung môi trường dinh dưỡng thích hợp cho nuôi tảo nannochloropsis đạt mật độ cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRƯƠNG VĂN TUÂN NGHIÊN CỨU CHẾ ĐỘ BỔ SUNG MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG THÍCH HỢP CHO NUÔI TẢO Nanocholoropsis oculata ĐẠT MẬT ĐỘ CAO LUẬN VĂN THẠC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRƯƠNG VĂN TUÂN

NGHIÊN CỨU CHẾ ĐỘ BỔ SUNG MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG THÍCH HỢP CHO NUÔI TẢO

Nanocholoropsis oculata ĐẠT MẬT ĐỘ CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRƯƠNG VĂN TUÂN

NGHIÊN CỨU CHẾ ĐỘ BỔ SUNG MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG THÍCH HỢP CHO NUÔI TẢO

Nanocholoropsis oculata ĐẠT MẬT ĐỘ CAO

Người hướng dẫn khoa học:

TS NGUYỄN VĂN NGUYÊN

Chủ tịch Hội đồng:

TS LỤC MINH DIỆP

Khoa sau đại học:

KHÁNH HÒA - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên c ứu chế độ bổ sung môi trường dinh dưỡng thích hợp cho nuôi tảo Nannochloropsis oculata đạt mật độ

cao” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ

công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này

Hải Phòng, ngày 10 tháng 11 năm 2016

Tác giả

Trương Văn Tuân

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Nguyên, Phó Viện trưởngViện nghiên cứu Hải sản, Thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo mọiđiều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ths Đào Duy Thu, Ths Nguyễn Công Thành cùngcác cán bộ nghiên cứu phòng Nghiên cứu Công nghệ sinh học biển, Trung tâm Quantrắc môi trường biển, Viện nghiên cứu Hải sản đã luôn tạo điều kiện làm việc tốt nhất

để tôi hoàn thành khóa thực tập tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện nghiên cứu Hải sản đã tạo nhữngđiều kiện thuận lợi và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy giáo, Cô giáo, các cán bộ giảng dạy vànghiên cứu của Viện Nuôi trồng thủy sản, Khoa Sau đại học, Trường Đại học NhaTrang đã luôn tận tình giảng dạy trong thời gian học tập tại trường và đưa ra những lờigóp ý trong việc hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với các nhà khoa học đã đọc và đóng góp nhiều

ý kiến quý báu cho việc hoàn thiện bản luận văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè đãgiúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hải Phòng, ngày 10 tháng 11 năm 2016

Tác giả luận văn

Trương Văn Tuân

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN x

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 4

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 7

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối và chất lượng của tảo 9

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Địa điểm, thời gian và đối tượng nghiên cứu 14

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 14

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 14

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Vật liệu thí nghiệm 16

2.2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 16

2.2.3 Bố trí thí nghiệm 17

2.2.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 21

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng quần thể của tảo Nannochloropsis oculata 24

3.1.1 Biến động của một số điều kiện môi trường thí nghiệm 24

3.1.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến tốc độ sinh trưởng và mật độ của quần thể tảo Nannochloropsis oculata 26

3.2 Ảnh hưởng của thời gian bổ sung đến sinh trưởng quần thể của tảo Nannochloropsis oculata 34

3.2.1 Biến động của một số điều kiện môi trường thí nghiệm 34

3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian bổ sung đến tốc độ sinh trưởng và mật độ của

quần thể tảo Nannochloropsis oculata 35

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 41

4.1 Kết luận 41

4.2 Khuyến nghị 41

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

CI : Confidential interval - Khoảng tin cậy

dưỡng khác nhau 32Bảng 3.5 Mật độ tế bào (106 tb/mL) tảo N oculata theo thời gian bổ sung môi trường

khác nhau 36

Bảng 3.6 Tốc độ sinh trưởng quần thể của tảo N oculata theo thời gian bổ sung khác

nhau 39Bảng 4.1 Kết quả phân tích ANOVA kiểm tra sai khác về nhiệt độ, độ mặn và trị số

pH trong phòng thí nghiệm Bảng 5.1 Kết quả phân tích ANOVA kiểm tra sai khác về nhiệt độ và trị số pH trongcác túi nuôi ngoài trời

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hệ thống nuôi tảo Photobioreactor (PBR) 5

Hình 2.2 Vi tảo Nannochloropsis oculata được quan sát dưới kính hiển vi 15

Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm nội dung 1 17

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí lô thí nghiệm nội dung 1 18

Hình 2.5 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm nội dung 2 20

Hình 2.6 Vị trí bố trí lô thí nghiệm nội dung 2 21

Hình 3.1 Biến động nhiệt độ, độ mặn và trị số pH theo thời gian nuôi trong phòng thí nghiệm 25

Hình 3.2 Chu kỳ sinh trưởng của tảo N oculata trong các lô thí nghiệm bổ sung môi trường dinh dưỡng khác nhau 28

Hình 3.3 So sánh mật độ cực đại của các lô thí nghiệm ở các môi trường nuôi khác nhau (Mean±0,95CI) 30

Hình 3.4 Tốc độ sinh trưởng quần thể trung bình của tảo trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau 32

Hình 3.5 Biến động nhiệt độ và trị số pH theo thời gian nuôi ngoài trời 35

Hình 3.6 Chu kỳ sinh trưởng của tảo N oculata trong các lô thí nghiệm chế độ thời gian bổ sung môi trường 37

Hình 3.7 Biểu đồ so sánh mật độ cực đại giữa các chế độ thời gian bổ sung môi trường khác nhau (Mean±0,95CI) 38

Hình 3.8 Tốc độ sinh trưởng quần thể trung bình của tảo theo thời gian bổ sung khác nhau 40

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tảo Nannochloropsis oculata có hàm lượng dinh dưỡng cao, không chỉ có ý

nghĩa sử dụng làm thức ăn trong sản xuất giống hải sản mà còn có tiềm năng làm thực

phẩm chức năng cho người sử dụng Tảo N oculata chứa rất nhiều loại axít béo đa nối

đôi không bão hòa (PUFA) trong đó đáng lưu ý nhất là các axít béo eicosapentaenoic EPA (20:5n-3, EPA) Loài tảo này còn chứa một hàm lượng lớn các sắc tố β-carotene,một hoạt chất có vai trò rất quan trọng chống oxy hóa, chống viêm, giúp ngăn ngừa, trìhoãn sự phát triển của ung thư, trong tảo khô còn có chứa nhiều loại muối khoángquan trọng thiết yếu cho cơ thể con người Do có thành phần dinh dưỡng toàn diện vàhàm lượng dinh dưỡng cao nên các loài vi tảo thường được sử dụng làm thức ăn chođộng vật thủy sản, một số được làm thực phẩm chức năng, bổ sung các chất thiết yếucho cơ thể sống

-Việc nuôi sinh khối N oculata cho mật độ cao là một yêu cầu bức thiết Để đạt

được mục đích này, nhiều tác giả ngoài nước đã nghiên cứu tối ưu các điều kiện nuôisinh khối và chỉ ra điều kiện tối ưu là nhiệt độ (20 - 250C), độ mặn 27 - 30 ‰, pH 7,5

- 8,5, ánh sáng 80 - 130µM photon.s-1 Chế độ sục khí 25% thể tích với CO2 bổ sung 1

- 2% Tuy nhiên, mỗi tác giả sử dụng một công thức môi trường riêng mặc dù các thựcnghiệm của họ có thể nuôi tảo đạt mật độ và sinh khối khá cao

Ở Việt Nam, nghiên cứu nuôi sinh khối tảo N oculata chủ yếu phục vụ sản xuất

giống thủy sản Điều kiện nuôi tảo trong các môi trường khác nhau và các tác giả cũng

sử dụng một môi trường riêng biệt Việc bổ sung môi trường khác nhau theo từng giaiđoạn phát triển của tảo và mỗi loại môi trường cũng cần có chế độ bổ sung khác nhautheo thời gian Tỉ lệ thu hoạch phù hợp từ 10 - 15% lượng sinh khối bổ sung môitrường hàng ngày vẫn giữ nguyên tốc độ sinh trưởng quần thể Trong nuôi côngnghiệp, khi tảo đạt được mật độ cao trên 150106 tb/mL (pha cân bằng) sẽ tiến hànhthu hoạch 30% sinh khối Do đó, cần phải xác định chế độ bổ sung môi trường dinhdưỡng để tảo nhanh chóng phục hồi mật độ ở pha cân bằng nhằm duy trì năng suất thuhoạch là vô cùng quan trọng Từ những vấn đề trên, tôi đề xuất thực hiện đề tài

“Nghiên cứu chế độ bổ sung môi trường dinh dưỡng thích hợp cho nuôi tảo

Nannochloropsis oculata đạt mật độ cao” Mục tiêu của luận văn nhằm xác định được loại môi trường và khoảng thời gian bổ sung môi trường thích hợp cho nuôi tảo N oculata đạt mật độ cao Để hoàn thành mục tiêu đề ra, đề tài thực hiện 2 nội dung

nghiên cứu: (1) Nghiên cứu xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc nuôi

tảo N oculata đạt mật độ cao; và (2) Nghiên cứu xác định khoảng thời gian bổ sung môi trường dinh dưỡng thích hợp nhằm nâng cao hiệu quả nuôi tảo N oculata.

Nguồn số liệu sử dụng trong luận văn được thu thập từ kết quả nghiên cứu của đề

tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng từ tảo Nannochloropsis oculata” thuộc Viện Nghiên cứu Hải sản chủ trì thực hiện từ 2013 – 2015 do TS.

Nguyễn Văn Nguyên là chủ nhiệm

Kết quả nghiên cứu cho thấy, sử dụng f/2 làm môi trường vẫn đảm bảo cho sự

sinh trưởng và phát triển cho vi tảo trong điều kiện nuôi sinh khối tảo N oculata Đối

với việc bổ sung môi trường dinh dưỡng f/2 có tăng thêm 100% hàm lượng N và P(f/2-100) cho mật độ cao nhất đạt 149,5106 tb/mL với chu kỳ sinh trưởng kéo dàikhoảng 21 ngày Các giá trị lần lượt là 127,6106

tb/mL, 124,0106

tb/mL, 119,9106

tb/mL và 110,5106tb/mL với môi trường f/2-150, f/2, Walne, f/2-50 Với môi trườngf/2 và Walne, pha cân bằng đạt ở ngày thứ 13; pha cân bằng của môi trường f/2-50,f/2-100 và f/2-150 đạt ở ngày 15, 19 và 17 Tốc độ sinh trưởng trung bình khi sử dụngmôi trường f/2-100 cho trị số cao nhất (K = 0,343), cao hơn so với 4 loại môi trườngcòn lại Theo số liệu thống kê, môi trường f/2-100 cho mật độ cực đại cao hơn rõ rệt sovới các môi trường thí nghiệm khác và giữa các môi trường thí nghiệm này cho mật độcực đại khác nhau không có ý nghĩa thống kê

Với chế độ bổ sung môi trường dinh dưỡng có tăng thêm 100% hàm lượng N và

P (f/2-100) theo chế độ thời gian bổ sung khác nhau, giá trị mật độ tảo cao nhất là179,3106

tb/mL, 164,9106

tb/mL, 160,6106

tb/mL, 148,9106

tb/mL và 138,3106tb/mL tương ứng lần lượt với 1, 3, 4, 2 và 0 ngày/lần Giá trị tốc độ sinh trưởng tại các

lô thí nghiệm khá tương đồng và đều có xu thế suy tàn vào ngày thứ 18 trong 20 ngàytheo dõi Tuy nhiên, số liệu thống kê phân tích ANOVA một nhân tố với kiểm địnhTurkey test (P value = 0,09733) chứng tỏ sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê vềmật độ cực đại giữa các chế độ bổ sung môi trường khác nhau, điều đó có nghĩa rằng

trong quá trình nuôi sinh khối tảo N oculata, chế độ thời gian bổ sung môi trường

dinh dưỡng không phải là yếu tố quyết định đến năng suất sinh khối Chính vì vậy, tùy

thuộc vào mục đích của việc nuôi tảo N oculata, cần xem xét tần suất bổ sung môi

trường dinh dưỡng trong quá trình nuôi đảm bảo kinh tế và hiệu quả

Từ khóa: Nannochloropsis oculata, mật độ, tốc độ sinh trưởng, môi trường dinh

dưỡng, thời gian

MỞ ĐẦU

Tảo Nannochloropsis oculata là loài tảo có hàm lượng dinh dưỡng cao không chỉ

có ý nghĩa sử dụng làm thức ăn trong sản xuất giống hải sản mà còn có tiềm năng làm

thực phẩm chức năng cho người sử dụng Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra N oculata chứa rất nhiều loại axít béo đa nối đôi không bão hòa (PUFA) trong đó đáng

lưu ý nhất là các axít béo eicosapentaenoic - EPA (20:5n-3, EPA), với hàm lượngchiếm đến 24,5- 40% tổng axít béo [56] Đây là những chất giúp chống suy nhược cơthể [16], ngăn chặn tình trạng máu nhiễm mỡ, chống các bệnh về tim mạch, xơ vữađộng mạch, làm giảm viêm nhiễm [51,28], giảm chứng khối huyết [37] Loài tảo nàycòn chứa một hàm lượng lớn các sắc tố β-carotene [31,47], một hoạt chất có vai trò rấtquan trọng chống oxy hóa, chống viêm, giúp ngăn ngừa, trì hoãn sự phát triển của ungthư [66] Bên cạnh đó, trong 100g tảo khô ngoài những chất được xem là nguồn dinh

dưỡng thiết yếu, Nannochloropsis oculata còn có chứa nhiều loại muối khoáng quan

trọng như Ca (972 mg), K (533 mg), Na (659 mg), Mg (316 mg), Zn (103 mg), Fe(136 mg), Mn (3,4 mg), Cu (35,0 mg), Ni (0,22 mg), and Co (<0,1 mg) thiết yếu cho

cơ thể con người [55]

Do có thành phần dinh dưỡng toàn diện và hàm lượng dinh dưỡng cao nên cácloài vi tảo thường được sử dụng làm thức ăn cho động vật thủy sản, một số được làmthực phẩm chức năng, bổ sung các chất thiết yếu cho cơ thể sống

Hiện nay, do nguồn tài nguyên xăng dầu nguồn gốc hóa thạch đang khan hiếm,

loài tảo Nannochloropsis oculata với tỷ lệ cao hàm lượng lipid cao còn được nuôi sinh

khối làm nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học Một ví dụ điển hình là dự án sản

xuất xăng dầu sinh học lớn nhất thế giới đang hoạt động tại Indonesia Ở đây tảo N oculata chủ yếu được nuôi trong các hệ thống quang sinh (photobioreactor) dạng ống

với năng suất ước tính khoảng 70 tấn/ha/năm, cao gấp ba lần năng suất thực vật bậccao hiện đạng sử dụng làm nguyên liệu sản xuất xăng dầu (http://www.algaetech.com)

Như vậy, dù với mục đích sử dụng nào, nuôi sinh khối N oculata cho mật độ cao

là một yêu cầu bức thiết Để đạt được mục đích này, nhiều tác giả ngoài nước đãnghiên cứu tối ưu các điều kiện nuôi sinh khối và chỉ ra điều kiện tối ưu là nhiệt độ (20

- 25 0C), độ mặn 27 - 30 ‰, pH 7,5 - 8,5, ánh sáng 80 – 130 µM photon.s-1 Chế độsục khí 25% thể tích với CO2 bổ sung 1 - 2% (e.g http://www.algaetech.com

[13,22,23,58,59] Tuy nhiên, mỗi tác giả sử dụng một công thức môi trường riêng, ví

dụ Cái Ngọc Bảo Anh (2010) sử dụng môi trường dinh dưỡng với nguồn nitơ dạng

NO3- và NH4+ [2]; Converti et al (2009) và Chiu et al (2009) sử dụng môi trường f/2 [22,23], Sen et al (2005) sử dụng công thức môi trường tự tạo [58], Gu et al (2012) dùng môi trường f/2 có bổ sung Ure [32], Su et al (2011) dùng môi trường Walne

[60],… mặc dù các thực nghiệm của họ có thể nuôi tảo đạt mật độ và sinh khối khácao

Ở Việt Nam, nghiên cứu nuôi sinh khối tảo N oculata chủ yếu phục vụ sản xuất

giống thủy sản Điều kiện nuôi tảo trong các môi trường khác nhau, mỗi tác giả cũng

sử dụng một môi trường riêng Cao Văn Hạnh [5] sử dụng môi trường conway-walnevới lượng 1ml/L nước nuôi hoặc môi trường f/2 cho kết quả đạt 14106 - 15106

tb/mL, trong khi đó đề tài “Nghiên cứu công nghệ nuôi thâm canh và thu sinh khối vi

tảo Isochrysis galbana và Nannochloropsis oculata phục vụ sản xuất giống hải sản” do

Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II đang tiến hành với mục tiêu xây dựng được

qui trình công nghệ nuôi thâm canh loài vi tảo N oculata đạt mật độ >150106 tb/mL.Mặt khác, việc bổ sung môi trường khác nhau theo từng giai đoạn phát triển củatảo và mỗi loại môi trường cũng cần có chế độ bổ sung khác nhau theo thời gian Chiu

et al (2009) thu hoạch 10 - 15% lượng sinh khối bổ sung môi trường hàng ngày vẫn

giữ nguyên tốc độ sinh trưởng quần thể [22] Trong nuôi công nghiệp, khi tảo đạt đượcmật độ cao trên 150106 tb/mL (pha cân bằng) sẽ tiến hành thu hoạch 30% sinh khối

Do đó, cần phải xác định chế độ bổ sung môi trường để tảo nhanh chóng phục hồi mật

độ ở pha cân bằng nhằm duy trì năng suất thu hoạch là vô cùng quan trọng

Từ những vấn đề tồn tại nêu trên, tôi đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên c ứu chế

độ bổ sung môi trường dinh dưỡng thích hợp cho nuôi tảo Nannochloropsis oculata đạt mật độ cao”.

Nội dung nghiên cứu của đề tài này cũng là một phần nội dung nghiên cứu của

đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng từ tảo Nannochloropsis oculata” do Viện Nghiên cứu Hải sản chủ trì thực hiện từ 2013 – 2015 (TS Nguyễn

Văn Nguyên là chủ nhiệm đề tài)

 Mục tiêu của đề tài

 Mục tiêu chung của đề tài:

Nâng cao hiệu quả nuôi tảo Nannochloropsis oculata đạt mật độ cao.

 Mục tiêu cụ thể:

Xác định được loại môi trường và khoảng thời gian bổ sung môi trường thích

hợp cho nuôi tảo N oculata đạt mật độ cao.

 Nội dung nghiên cứu

 Nội dung 1: Nghiên cứu xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc nuôi tảo Nannochloropsis oculata đạt mật độ cao.

 Nội dung 2: Nghiên cứu xác định khoảng thời gian bổ sung môi trường dinh dưỡng thích hợp nhằm nâng cao hiệu quả nuôi tảo Nannochloropsis oculata.

 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Về khoa học: Kết quả của đề tài sẽ giải đáp một câu hỏi lớn về loại môi trường nào thích hợp cho nuôi công nghiệp tảo N oculata và khoảng thời gian bổ sung như

thế nào

Về thực tiễn sản xuất: Kết quả của đề tài có tiềm năng ứng dụng rất lớn vào sản xuất Hiện tại, ở Việt Nam mật độ tảo N oculata đang nuôi ở các trại sản xuất giống

thủy sản thường đạt rất thấp (dưới 50106 tb/mL) và không ổn định Các mô hình nuôi

công nghiệp sử dụng hệ thống quang sinh kín (photobioreactor) ở Việt Nam cũng chỉ

đạt mật độ cao nhất khoảng trên 150106

tb/mL Do đó, kết quả nghiên cứu có thể là

chìa khóa để nâng cao hiệu quả sản xuất sinh khối tảo N oculata phục vụ nuôi trồng

thủy sản cũng như các mục đích sử dụng khác cần có sinh khối tảo ở mật độ cao

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

 Các phương pháp kỹ thuật nuôi sinh khối tảo N oculata

Kỹ thuật nuôi sinh khối vi tảo được phát triển từ khoảng giữa thế kỷ trước [59]

và đã trở nên khá đa dạng hiện nay Có thể phân loại các hệ thống nuôi hiện nay thànhhai loại chính là hệ thống nuôi kín và hệ thống hở

Hệ thống hở sử dụng cách nuôi bằng thùng, bể, ao, cho phép tảo tiếp xúc trựctiếp với không khí bên ngoài Hệ thống hở có ưu điểm là giá thành rẻ, dễ vận hành và

có thể thực hiện được trên quy mô lớn nhưng có sự hạn chế là mật độ thu được thấp vàkhông duy trì được lâu vì nguy cơ nhiễm nấm, vi khuẩn và động vật nguyên sinh[52,61] Hệ thống hở phù hợp với mục đích nuôi tảo không cần đạt mật độ cao vàkhông cần quá tinh sạch Trong thực tế, hệ thống này được sử dụng khá phổ biến, nhất

là trong nuôi trồng thủy sản hoặc nuôi sinh khối tảo làm nguyên liệu sản xuất nhiênliệu sinh học

Hệ thống kín thường sử dụng túi nilon, ống hoặc bình kín, không cho phép tảotiếp xúc trực tiếp với không khí, trong nhiều trường hợp, chẳng hạn hệ thống quang

sinh kín (Photobioreactor) là hệ thống nuôi mà các thông số như nhiệt độ, ánh sáng,

pH, hàm lượng CO2 được kiểm soát chặt chẽ, tạo điều kiện tối ưu cho tảo phát triểnnên thường cho mật độ cao và chất lượng tảo tốt, ít bị tạp nhiễm Việc nuôi tảo làmthực phẩm chức năng đòi hỏi phải có sự kiểm soát chặt chẽ các khâu vệ sinh an toànthực phẩm và chống nhiễm khuẩn nên mô hình nuôi bằng hệ thống quang sinh kínđược đánh giá là phù hợp hơn

Photobioreactor (PBR), hay bình phản ứng quang sinh là thiết bị sinh học chophép nguồn ánh sáng xuyên qua để cung cấp năng lượng lượng tử cho các phản ứngquang hoá PBR là hệ thống nuôi khép kín, cho phép kiểm soát các yếu tố môi trườngnhư nhiệt độ, pH, cường độ ánh sáng, hạn chế nhiễm tạp, sự thất thoát CO2, sự bốc hơinước v.v… Nhờ đó, thiết bị này dùng nuôi vi tảo rất hiệu quả, cho phép nuôi tảo đạtmật độ rất cao, gấp hàng chục lần, thậm chí hàng ngàn lần so với mật độ nuôi trongcác hệ thống thông thường [50,65]

Hiện nay, có một số dạng PBR đang được sử dụng như giàn ống đứng (tubularPBR) [43], tấm panel phẳng (flat panel PBR) [20], dạng chữ V có 2 mặt phẳng (flat-

sided PBR) [41], dạng túi tổ ong (vertical alveolar PBR) [64], dạng bể hình trụ(cylinder PBR) và loại mới thiết kế gần đây nhất là dạng xoắn ốc (spiral PBR) [20].Nguồn sáng cho các hệ thống PBR có thể là ánh sáng tự nhiên (solar), ánh sáng huỳnhquang (flourescent) hoặc đèn diot (LED).

Hình 2.1 Hệ thống nuôi tảo Photobioreactor (PBR)

Briassoulis et al (2010) thử nghiệm nuôi N oculata trong PBR dạng ống với các

điều kiện tối ưu về chế độ chiếu sáng, nhiệt độ, môi trường dinh dưỡng, hạn chế nhiễmtạp kèm theo chế độ sục khí và bổ sung CO2 hợp lý đã đạt mật độ tối đa trên 350106

tb/mL [17] Hệ thống này đã đạt mức tăng mật độ khoảng 30x106 tb/mL/ngày, đảmbảo tỷ lệ thu hoạch 10%/ngày theo hình thức nuôi thu liên tục Các hệ thống PBR đặt

ngoài trời cũng cho sản lượng rất cao như PBR dạng panel nuôi N oculata đạt sản

lượng thu 12,1g/m2/ngày [57]; hệ thống tubular PBR nuôi I galbana cho mật độ tối đa

đạt 2 g/L với tốc độ sinh trưởng đặc biệt (SGR) đạt 0,38g/ngày và sản lượng thu đạt0,32g/L/ngày theo hình thức nuôi thu bán liên tục [30]

PBR hiện đang được coi là một trong những giải pháp hữu hiệu để nuôi sinh khốitảo ở quy mô lớn, phục vụ nuôi trồng thuỷ sản và làm nguyên liệu cho nhiều ngànhcông nghệ khác Tuy nhiên, bên cạnh việc lựa chọn được mô hình nuôi phù hợp theomục đích, những yếu tố, điều kiện nuôi khác nhau có ảnh hưởng rất lớn đến quá trìnhnuôi tảo cho mật độ cao và chất lượng sinh khối thu được

 Các điều kiện nuôi cấy cần chú trọng trong nuôi vi tảo N oculata

Tảo N oculata cũng giống như các sinh vật tự dưỡng khác, cần ánh sáng, CO2,muối dinh dưỡng và các khoáng chất và một trường phù hợp để sinh trưởng Trong

quá trình nuôi tảo N oculata, các nhà khoa học đã ghi nhận những điểm cần lưu ý

dưới đây

Tảo N oculata tuy có ngưỡng chịu nhiệt rất rộng (2 - 29oC) nhưng dải nhiệt độtối ưu cho loài này lại khá hẹp, khoảng 20 - 25oC [50] Bởi vậy, nhiệt độ sẽ là yếu tốquan trọng tác động đến sinh trưởng của loài tảo này Trong quá trình nuôi, cần phải

có biện pháp duy trì nhiệt độ trong khoảng tối ưu để tảo sinh trưởng tốt

CO2 không chỉ cần thiết cho quá trình quang hợp của tảo, mà còn là yếu tố thenchốt trong việc điều chỉnh độ pH Trong các hệ thống quang sinh, độ pH thường tănglên rất cao khi tảo đạt mật độ cao, do quá trình quang hợp lấy đi rất nhiều CO2 từ môitrường Độ pH lớn hơn 9 sẽ trở thành yếu tố ức chế sự phát triển của vi tảo Sử dụng

CO2bổ sung được coi là giải pháp tối ưu để ổn định pH và cung cấp nguyên liệu cho

quá trình quang hợp Chiu et al (2009) đã thử nghiệm các chế độ bổ sung CO2khácnhau từ 2 - 15% và kết luận mức 2% cho sinh khối và tỷ lệ hàm lượng lipid cao nhất[22] Ngoài việc bổ sung đủ hàm lượng CO2, các thành phần chứa nguồn C khác nhưNaC2H3O2 và NaHCO3cũng cần được bổ sung để tảo đạt được tốc độ sinh trưởng tốtnhất

Muối nitơ là yếu tố cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của tảo donitơ là thành phần cơ bản cấu tạo nên các loại protein trong tế bào, nhiều loại vitamin(B1, B2, B6, BP) Nó cũng là thành phần quan trọng của hệ enzym oxy hóa khử vànhiều enzym quan trọng khác Việc điều chỉnh hàm lượng nitơ trong môi trường cũng

có thể điều khiển được tốc độ sinh trưởng của tảo Dumaz (2007) thử nghiệm và nhận

thấy, khi giảm hàm lượng nitơ thì sự tích lũy của α-tocopherol tăng lên, đồng thời tốc

độ sinh trưởng của tảo bị giảm xuống [25]

Oxy cần cho sự sống nhưng trong điều kiện nuôi tảo mật độ cao, hàm lượng cóthể lên cao do quá trình quang hợp, khiến cho tảo sẽ bị ức chế và giảm tốc độ sinh

trưởng Theo Molina et al (1994) trong điều kiện nuôi ngoài trời, hàm lượng oxy hoà

tan có thể đạt tới 400% mức độ bão hoà, gây hiệu ứng ức chế tảo Để nuôi tảo đạt mật

độ cao theo yêu cầu, cần phải có biện pháp điều chỉnh nhằm đảm bảo hàm lượng oxy ở

mức vừa phải Hệ thống quang sinh kín được đánh giá là phù hợp để giải quyết vấn đềnày [49].

Chế độ chiếu sáng ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng cố định CO2 và tạo sinhkhối của vi tảo [42] Theo Tzovenis et al (2003), sử dụng hệ thống quang sinh (PBR)với cường độ ánh sáng trong khoảng từ 120 - 460 µmol/m2/s, tốc độ sinh trưởng củatảo là tỷ lệ thuận với tổng cường độ chiếu sáng [65] Tuy nhiên tác giả này cũng tìmthấy, chế độ chiếu sáng gián đoạn (16h:8h và 12:12h) cho sinh khối cao hơn chế độchiếu sáng liên tục (24h:0h)

Đối với tảo N oculata nuôi trong hệ thống PBR, Zou & Richmond (1999) đã xác

định cường độ ánh sáng và khoảng cách chiếu sáng tối ưu là 10cm sẽ cho sinh khối vàsản lượng EPA cao nhất [68]

Chế độ khuấy đảo cũng rất quan trọng đối với sinh trưởng của tảo Sự khuấy đảo

sẽ giúp các tế bào tảo chuyển động, tăng khả năng tiếp xúc với ánh sáng, hạn chế hiện

tượng tự che khuất (self shading) khi mật độ tảo cao, đồng thời giúp giải phóng bớt

oxy, tăng khả năng hấp thụ CO2 và hạn chế sự kết vón, lắng đáy Theo Gudin &Chaumont (1991), mặt trái của phương pháp khấy trộn (đặc biệt khi dùng bơm) là dễlàm vỡ tế bào tảo [33] Bởi vậy cần cân nhắc khi lựa chọn phương pháp và mức độkhuấy đảo

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Vi tảo biển được nghiên cứu ở Việt Nam từ khá lâu Tuy nhiên, lĩnh vực nuôisinh khối mới chỉ tập trung vào mục đích làm thức ăn ương nuôi ấu trùng của động vậtthủy sản Từ năm 1999, Lê Viễn Chí và cs đã phân lập và nuôi giữ được hai loài tảo

Skeletonema costatum và Chaetoceros sp [3] Các nghiên cứu này đã tập trung đánh

giá ảnh hưởng một số yếu tố sinh thái như nhiệt độ, cường độ ánh sáng, độ mặn vàdinh dưỡng lên sinh trưởng và phát triển quần thể của hai loài tảo này

Trong khi đó, một số nhóm tảo khác như Chaetoceros, Chlorellasp., Platymonas sp., N oculata, Chaetoceros muelleri, Isochrysis galbana, Pavlova… cũng được sử

dụng nhiều trong nuôi trồng thủy sản Chúng là những loài thường được sử dụng làm

thức ăn cho ấu trùng và động vật hai mảnh vỏ Những năm gần đây, do N oculata

được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản, chúng đã lôi kéo được sự chú ý củacác nhà nghiên cứu trong nước

Phạm Thị Lam Hồng (1999) nghiên cứu một số thông số của quá trình nuôi như

độ mặn, ánh sáng và tỷ lệ thu hoạch lên một số đặc điểm sinh học, thành phần sinh hóa

của loài vi tảo N oculata trong điều kiện phòng thí nghiệm [7] Tác giả này đã chỉ ra rằng N oculata có thể phát triển ở độ mặn 10 - 35 ‰ nhưng phát triển tốt nhất ở 30 -

32 ‰ Nghiên cứu cũng đã ứng dụng các kỹ thuật để nuôi bán liên tục loài tảo này,cung cấp tảo cho sản xuất động vật phù du phục vụ quy trình ương các loại ấu trùngđộng vật biển

Trần Văn Tựa (2002) nghiên cứu điều kiện thích hợp cho sinh trưởng của N oculata để nhân nhanh trong điều kiện phòng thí nghiệm [12] Theo đó, tác giả đã

nhân nhanh vi tảo này trong điều kiện phòng thí nghiệm và đạt mật độ từ 50 - 150×106tb/mL

Đặng Diễm Hồng (2008) đã thử nghiệm thành công các mô hình nuôi N.oculata

ở các điều kiện khác nhau, từ điều kiện nuôi trong nhà với thể tích 1 - 5 lít đến túinilon với thể tích 50-60 lít và nuôi bể composit 1 - 2 m2 để phục vụ sinh sản nhân tạo

ngao Bến Tre (Meretrix lyrata) [6] Tất cả các lô thí nghiệm đều sử dụng môi trường

nuôi Walne 30% Kết quả cho thấy, ở môi hình nuôi 1 - 5 lít trong nhà, mật độ cực đại

đạt được của N oculata là 30×106 tb/mL và thời gian đạt mật độ cực đại là 4 ngày Ở

mô hình nuôi túi nilon 50 - 60 lít mật độ cực đại đạt được là 24,8×106tb/mL với thờigian mật độ đạt cực đại là 3 ngày Ở mô hình bể composite, mật độ cực đại đạt được là20×106 tb/mL với thời gian mật độ đạt cực đại là 2 ngày

Chu Chí Thiết và Martins Kumar (2008) đã sử dụng vi tảo N oculata kết hợp với hai loài tảo khác là Isochrysis galbana, Chaetoceros sp để làm thức ăn cho ấu trùng ngao (Meretrix lyrata Sowerby, 1851) trong quá trình sản xuất giống [10] Tỷ lệ cho

ấu trùng ngao ăn được duy trì với mật độ 100.000 tb/mL hỗn hợp của cả ba loài tảotrên Sau 8 - 10 ngày cho ăn tảo, ấu trùng sẽ chuyển sang giai đoạn sống đáy đạt hiệusuất cao

Bùi Bá Trung và cs (2009) đã tiến hành một nghiên cứu khá bài bản tìm hiểu ảnh

hưởng của mật độ nuôi ban đầu và tỷ lệ thu hoạch lên sinh trưởng của tảo N oculata

[11] Theo đó, tảo được nuôi trong hệ thống ống dẫn trong suốt, nước chảy liên tục Hệthống nuôi bao gồm 10 ống thủy tinh được lắp đặt ngoài trời và có một hệ thống làmmát đi kèm để đảm bảo nhiệt độ trong suốt quá trình nuôi luôn ở mức độ thích hợp

Nghiên cứu đã xác định được mật độ ban đầu thích hợp nhất cho nuôi sinh khối N oculata là 8×106tb/mL Tác giả đã nuôi tảo N oculata đạt mật độ cực đại là 61,07×106tb/mL - mật độ rất cao so với các hệ thống nuôi N oculata khác ở Việt Nam hiện nay,

như túi nilon và bể composite Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tỉ lệ thu hoạch10% thể tích nuôi là phù hợp nhất

Cái Ngọc Bảo Anh và cs (2009) đã nghiên cứu điều chỉnh nồng độ và thay đổi

một số muối nitơ trong môi trường f/2 để đánh giá sinh trưởng quần thể tảo N oculata.

Kết quả cho thấy, hàm lượng nitơ giảm (1/2 lần) kéo theo mật độ tảo ở đầu pha cânbằng giảm đáng kể Tuy nhiên, khi tăng hàm lượng nitơ (1,5 - 2 lần) hầu như khônglàm thay đổi mật độ tảo khi thu hoạch Hơn nữa, trong điều kiện nuôi cấy ở Việt Nam,hoàn toàn có thể sử dụng (NH4)2SO4 để thay thế NaNO3 trong môi trường f/2 màkhông làm sai khác mật độ tảo so với điều kiện tiêu chuẩn ban đầu [1]

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối và chất lượng của tảo

Tương tự như các loài vi tảo khác, sinh trưởng của N oculata phụ thuộc rất nhiều

vào các yếu tố như dinh dưỡng môi trường nuôi, độ mặn, nhiệt độ, pH, hàm lượng

CO2, cường độ ánh sáng,… [39]

- Yếu tố nhiệt độ: Nhiệt độ là yếu tố môi trường quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp

đến khả năng sinh trưởng và sản xuất các hoạt chất có trong tế bào tảo Vi tảo có thểsống được trong khoảng nhiệt độ từ 16 – 270C Chúng sinh trưởng chậm ở dưới 160C

và một số loài bị chết ở ngưỡng nhiệt độ trên 35 0C [24] Một số kết quả nghiên cứu

cho thấy, mặc dù N oculata có ngưỡng chịu nhiệt rộng nhưng dải nhiệt tối ưu cho loài

này khoảng 20 - 25°C, trong đó nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nó ở 25oC [50].Nếu nhiệt độ cao hơn 35,0 oC thì tảo có thể bị chết và nếu thấp hơn 16,0 oC sẽ làmgiảm tốc độ sinh trưởng của tảo Trong quá trình nuôi, nếu tăng nhiệt độ từ 20 lên

25°C thì hàm lượng lipid trong tế bào N oculata tăng gấp đôi (từ 7,9 - 14,92%) [23] Đồng thời, khi tăng nhiệt độ, hàm lượng acid béo tổng số trong tế bào N oculata tăng

nhưng hàm lượng acid béo không no lại giảm [38] Vì vậy, tùy theo mục đích nuôi đểtảo sinh trưởng tốt cần có biện pháp tối ưu nhiệt độ sao cho thích hợp Trong các hệthống nuôi quang sinh kín, người ta thiết kế hệ thống làm mát thông qua hệ thống bểnông, phun sương hoặc qua hệ thống ống nhỏ ngâm trong bể nước [17]

- Yếu tố độ mặn: Độ mặn là một trong số những yếu tố chính ảnh hưởng đến sự phát triển của vi tảo nói chung và N oculata nói riêng Mỗi loài tảo khác nhau có khả

năng thích nghi với một khoảng độ mặn khác nhau Hầu hết các loài tảo đơn bào sinhtrưởng trong khoảng độ mặn 12 - 40 ‰, nhưng phát triển tốt nhất ở độ mặn 20 - 24 ‰

[23] Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Lam Hồng (1999) tảo N oculata phát

triển tốt nhất ở độ mặn 30 - 35 ‰ [7] Sự biến đổi của độ mặn ảnh hưởng tới sự tích

lũy lipid trong tế bào tảo Hàm lượng lipid tối đa thu được trong tảo N oculata ở độ

mặn 35 ‰ và thêm 5 ppm NaH2PO4 là 37,68 %, ở độ mặn 36 ‰ hàm lượng lipid trong

tảo N oculata rất thấp do chúng không thích ứng được [26] Độ mặn cao sẽ kìm hãm

sự phát triển hoàn chỉnh của Nannochloropsis sp., độ mặn thấp thì sự tích lũy EPA diễn ra tốt hơn [53] Theo nghiên cứu của Gu et al [32] khi tăng độ mặn thì tốc độ

sinh trưởng đặc biệt (SGR) của tảo giảm đáng kể nhưng hàm lượng các axit béomethyl este (FAME) tăng Thí nghiệm còn cho thấy sự sốc độ mặn cũng ảnh hưởngđến sắc tố của tảo, chlorophyll a và hàm lượng carotenoid của tảo giảm khi tăng độmặn từ 45 lên 55‰ Ngoài ra, sinh khối khô và sự hấp thụ của tảo tăng khi độ mặngiảm và hàm lượng TFA và PUFA cũng tăng khi giảm độ mặn [32,38]

- Trị số pH: pH là một yếu tố môi trường quan trọng, nó ảnh hưởng đến sự tích lũy lipid trong tế bào [44] Sự tích lũy lipid trong N oculata chịu ảnh hưởng chủ yếu

bởi pH, hàm lượng lipid trong tế bào vi tảo sẽ giảm khi pH giảm [22] Khi pH môitrường tăng cao có thể dẫn đến hiện tượng kết vón các tế bào tảo [42] Theo Coutteau(1996) giá trị pH cho nuôi thu sinh khối tảo là trong khoảng 7,0 - 9,0 nhưng phạm vitối ưu 8,2 - 8,7 [24] Tuy nhiên, trong nuôi thu sinh khối tảo ngoài trời với các hệthống kín có cường độ chiếu sáng cao (như các hệ thống quang sinh) thì pH thườngvượt quá 9, đây là một hạn chế của hệ thống, hiện tượng này có thể khắc phục bằngcách bổ sung CO2 vào nước nuôi [24]

- Cường độ sáng: Ánh sáng rất quan trọng đối với vi tảo trong quá trình quang

hợp Quang hợp diễn ra bất thường nếu thiếu ánh sáng, từ đó ảnh hưởng đến các quátrình sinh tổng hợp tiếp theo của tế bào [18] Ánh sáng được xét trên hai khía cạnh:cường độ ánh sáng và chu kỳ chiếu sáng Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sinh khốitảo bị mất đi trong thời gian không được chiếu sáng [64] Các tế bào tảo có xu hướngtăng cường sản xuất polysaccarite khi cường độ ánh sáng cao Tế bào tảo

Nannochloropsis dưới điều kiện hạn chế ánh sáng cho hàm lượng lipid và tỷ lệ EPA

cao, trong khi đó axit C16:0 và C16:1 chiếm ưu thế khi cường độ ánh sáng tăng đếnmức bão hòa [62] Theo nghiên cứu của Coutteau [24], cường độ chiếu sáng quá cao

có thể dẫn đến ức chế trong quang hợp Theo Budiman [18], cường độ ánh sáng 4.500

lux là tối ưu cho sự phát triển của N oculata Đèn huỳnh quang phát ra ánh sáng màu

xanh hoặc quang phổ ánh sáng đỏ nên được sử dụng phổ biến trong nuôi tảo Thờigian chiếu sáng nhân tạo tối thiểu 18 giờ sáng mỗi ngày cho năng suất sinh khối cao[24]

- Chu kỳ chiếu sáng: Chất béo triacylglycerol được tổng hợp và tích lũy trong kỳ

sáng và được tiêu thụ để bảo trì thành tế bào cùng với carbohydrate trong kỳ tối.Galactolipids cũng được tổng hợp trong kỳ sáng, nhưng không xuất hiện trong kỳ tối.Như vậy, kỳ tối được đặc trưng bởi sự gia tăng tương đối tỷ lệ EPA liên kết với các

galactolipids [62] Chini Zittelli et al (1999) cũng chứng minh rằng Nannochloropsis

sp cũng sử dụng acid béo kết hợp với chất béo dự trữ (chủ yếu là C14:00 và C16:00)trong kỳ tối khi nuôi trong điều kiện chu kỳ sáng - tối tự nhiên [21] Do đó, buổi sáng

sớm là thời điểm thích hợp thu hoạch Nannochloropsis sp sinh khối để có được một

hàm lượng EPA cao [62]

- Hàm lượng CO 2 : N oculata chứa tỷ lệ phần trăm tổng số axit béo n3 và n6 ở

nồng độ CO2 cao cao hơn ở nồng độ CO2 thấp [66] Theo nghiên cứu của Hoshida et

al (2005), nuôi N oculata trong điều kiện không khí bình thường (0,037% CO2), hàmlượng EPA trong tế bào tăng lên trong 1,5 ngày đầu tiên rồi giảm ngay mặc dù trong

giai đoạn này số lượng tế bào tăng theo cấp số nhân [36] Chiu et al (2009) đã thử

nghiệm các chế độ bổ sung CO2 khác nhau từ 2 - 15% và kết luận mức 2% cho sinhkhối và tỷ lệ hàm lượng lipid cao nhất [22] Ngoài việc bổ sung CO2, các thành phầnchứa nguồn C khác như NaC2H3O2 và NaHCO3cũng cần được bổ sung để tảo đạt đượctốc độ sinh trưởng tốt nhất Hàm lượng EPA tối đa khi được cung cấp 2% CO2 trong

12 giờ trước khi kết thúc pha logarit [36] Ngoài việc bổ sung CO2, bổ sung nguồn Chữu cơ cũng có thể làm tăng hàm lượng lipid trong nuôi sinh khối tảo, tuy nhiên lạilàm giảm lượng EPA Hàm lượng EPA trong nuôi quang tự dưỡng là 21,9 mg/L, nuôitrong môi trường hỗn hợp sử dụng đường hay ethanol như một nguồn C tương ứng là23,4 mg/L và 23 mg/L [27]

- Chế độ khuấy đảo: chế độ khuấy đảo cũng là một yếu tố tác động đến sự phát

triển của tảo trong nuôi sinh khối Theo Coutteau (1996), khuấy đảo giúp ngăn chặn sự

lắng đọng của tảo, đảm bảo tất cả các tế bào đều được tiếp xúc với ánh sáng và chấtdinh dưỡng, để tránh phân tầng nhiệt (nuôi ngoài trời) và cải thiện trao đổi khí giữamôi trường nuôi cấy và không khí [24] Đối với nuôi mật độ cao, lượng CO2 từ khôngkhí (có chứa 0,03% CO2) khuếch tán vào nước nuôi rất hạn chế, ảnh hưởng sự pháttriển của tảo Có thể bổ sung CO2 tinh khiết vào nước nuôi để giải quyết hiện tượngnày (ví dụ như ở mức 1% khối lượng không khí).

- Môi trường nuôi: Dinh dưỡng có tác động trực tiếp đến sinh khối, tỷ lệ thành

phần dinh dưỡng của vi tảo Thông thường, mật độ tảo trong nuôi sinh khối thường lớngấp nhiều lần so với mật độ tảo trong tự nhiên Vì vậy, chỉ sau một thời gian chất dinhdưỡng trong môi trường sẽ bị giảm sút, do đó cần phải bổ sung thêm các chất dinhdưỡng khi nuôi sinh khối tảo để bù đắp sự thiếu hụt trong môi trường nước Các yếu tốdinh dưỡng được bổ sung vào môi trường nuôi nhằm cung cấp chất dinh dưỡng thiết yếucho tảo sinh trưởng và phát triển Trong đó, một số yếu tố đóng vai trò quan trọng nhưnhóm muối nitơ (NaNO3 hoặc KNO3), nhóm muối phốt pho (KH2PO4, NaK2PO4),vitamin, nhóm nguyên tố khoáng vi lượng… Môi trường nuôi ảnh hưởng rất nhiều đếnquá trình sinh trưởng của vi tảo Nghiên cứu cho thấy môi trường f/2 và pH = 8 thích

hợp cho sự phát triển của vi tảo N occulata [54] Môi trường nuôi tảo thường bao gồm

nhóm muối nitơ, nhóm muối phốt pho, nhóm vitamin, nhóm khoáng vi lượng và một

số hợp chất khác [4]

Nitơ rất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của tảo Nó là thànhphần cơ bản cấu tạo nên các loại protein, trong đó có protein cấu trúc và protein chứcnăng [40] Nitơ là thành phần thiết yếu của protein cấu trúc và protein chức năng trong

tế bào tảo, nó chiếm khoảng 7 - 10% trọng lượng khô của tế bào [39] Nếu giảm 75%nồng độ nitơ trong môi trường thì hàm lượng lipid trong tế bào tăng 7,9 - 15,1%,nhưng tốc độ sinh trưởng giảm 7,88 - 15,86% [23] Durmaz (2007) đã nghiên cứu ảnhhưởng của các nguồn nitơ và hàm lượng của chúng lên sự tích lũy α-tocopherol của vi

tảo N oculata, giảm nồng độ nitơ dẫn đến sự gia tăng tích lũy α-tocopherol nhưng lại giảm tốc độ sinh trưởng của N oculata [25] Natri nitrat và chlorua amoni được sử

dụng như những nguồn nitơ vô cơ với nồng độ 882 µmol/l và môi trường f/2 Hàmlượng α-tocopherol lớn nhất là 2.325,8 ± 39 µg/g trọng lượng khô trong môi trường cóN-NO3- Theo Hu & Gao (2006), nếu tăng nồng độ NaNO3 và KH2PO4 trong môitrường thì hàm lượng protein và các axit béo không bão hòa (PUFA) tăng nhưng hàm

lượng carbohydrate, tổng số lipid và tổng số axit béo (TFA) giảm [38] Vì vậy, tùy theomục đích để điều chỉnh nồng độ nitơ trong môi trường nuôi tảo f/2 sao cho phù hợp.Phospho là thành phần quan trọng cần thiết cho sự sinh trưởng và trao đổi chấtcủa tế bào tảo [40] Ngoài ra, phốt pho tham gia hình thành nhiều thành phần cấu trúc

và chức năng cần thiết cho sự phát triển của vi tảo Nhu cầu của tảo về phospho khôngcao nhưng nếu thiếu nó tảo sẽ không phát triển được Phospho chiếm 1% khối lượngkhô của tảo [39], khi giảm nồng độ phospho trong môi trường nuôi thì hàm lượng và

năng suất lipid tăng [61] Theo Elida Purba (2012), sinh trưởng của N oculata sẽ bị ức

chế nếu bổ sung vào môi trường >10 ppm NaH2PO4[26].

Mặc dù với hàm lượng rất nhỏ nhưng các nguyên tố khoáng vi lượng cũng rấtcần thiết đối với tảo như: sắt, mangan, Cô-ban, kẽm, đồng Trong đó, sắt là nguyên tố

vi lượng được bổ sung nhiều nhất so với các nguyên tố khoáng vi lượng khác trongmôi trường nuôi, nó hoạt động như chất xúc tác oxy hóa khử trong quá trình quanghợp, quá trình đồng hóa nitơ và làm trung gian cho các phản ứng vận chuyển electron

trong cơ chế quang hợp Nồng độ sắt cao trong môi trường nuôi cấy Chlorella vulgaris

làm tăng hàm lượng lipid Giảm hàm lượng sắt sẽ khử thành phần carotenoid trong tảo[45] Ngoài ra, vitamin cũng được sử dụng khá phổ biến để bổ sung vào môi trườngnuôi tảo, chỉ với một lượng rất nhỏ nhưng có thể thúc đẩy sự gia tăng sinh khối củatảo Các vitamin cần thiết cho sinh trưởng của tảo là vitamin B12, B1 và biotin [34]

Bên cạnh đó, mật độ ban đầu cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tảo TheoNguyễn Thị Hương [8], khi nuôi trong phòng thí nghiệm nếu mật độ ban đầu quá thấp(5105 tb/mL) thì tốc độ sinh trưởng của tảo Chaetoseros calcitrans chậm và sinh

khối đạt cực đại thấp (10 - 15106 tb/mL) Bùi Bá Trung và cs [11] cũng đã tiến hành

nuôi tảo N oculata trong hệ thống ống dẫn trong suốt nước chảy liên tục nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ ban đầu đến sinh trưởng của N oculata với 4 mức mật độ

ban đầu lần lượt là: 4×106 ; 6×106; 8×106; 10×106 tb/mL Kết quả cho thấy mật độ banđầu thích hợp nhất là 8×106 tb/mL và quần thể tảo đạt mật độ cực đại 61,07 ±1,27×106 tb/mL vào ngày nuôi thứ 8 Trong nghiên cứu cải tiến kỹ thuật nuôi tảo

Isochrysis galbana, Cholorella sp., Nannochloropsis oculata mật độ cao làm thức ăn nuôi vỗ ngao Meretrix lyrata, Bùi Trọng Tâm và cs [9] đã xác định được mật độ ban đầu thích hợp cho nuôi sinh khối tảo N oculata là 3×106 tb/mL

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm, thời gian và đối tượng nghiên cứu

2 1.1 Địa điểm nghiên cứu

Quá trình nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh họcbiển, Viện Nghiên cứu Hải Sản (số 224, Lê Lai – Ngô Quyền – Hải Phòng)

2.1.2 Th ời gian nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu nội dung 1: từ tháng 6/2014 đến tháng 8/2014

- Thời gian nghiên cứu nội dung 2: từ tháng 11/2015 đến tháng 12/2015

2 1.3 Đối tượng nghiên cứu

Vi tảo biển Nannochloropsis oculata nguồn gốc từ Úc được Viện nghiên cứu Nuôi

trồng thủy sản I – Bắc Ninh nhập về và thuần chủng từ những năm 2000 và hiện đang đượclưu giữ giống tại Viện nghiên cứu Hải sản

Nannochloropsis oculata là một loài vi tảo tự dưỡng kích thước rất nhỏ Chúng được mô tả lần đầu bởi Droop (1955), khi đó được đặt dưới chi Nannochloris, là một

chi thuộc lớp tảo lục Chlorophyceae Sau đó dựa trên những nghiên cứu sâu về vi cấu

trúc tế bào, Antia et al., (1975) nhận thấy chúng phù hợp với lớp Eustigmatophyceae

hơn là lớp Chlorophyceae Đến 1981, Hibberd chuyển loài này thành chi mới là

Nannochloropsis, thuộc lớp Eustigmatophyceae và vị trí phân loại này tồn tại đến ngày

nay [35]

Do có giá trị dinh dưỡng cao, đặc biệt là hàm lượng acid béo không no EPA nên

N oculata được sử dụng làm nguyên liệu để bào chế biệt dược và thực phẩm chức

năng ở nhiều nơi trên thế giới [62,63,67]

Hãng dược phẩm Almega cùng với David Wolfe của Mỹ đã phối hợp sản xuất vàthương mại hóa sản phẩm thực phẩm chức năng bổ sung hoạt chất ω3 dạng viên nang

từ nguồn nguyên liệu là tảo N.oculata Sản phẩm này được đóng gói dạng hộp 60 viên

và bán với giá 50USD/hộp (http://www.qualitas-health.com/) Công ty Aqua HealthLabs (Chicago) đã cho thương mại hóa sản phẩm mang tên Phytoriginal dạng dung

dịch bổ sung ω3 bằng tảo N.oculata dạng sống có thể uống liền hoặc cho vào nước

ngọt đóng chai supply/).

(http://www.aquahealthlabs.com/product/phytoriginal-one-month-Ở Việt Nam, tảo N oculata hiện nay chủ yếu được nghiên cứu và ứng dụng trong

sản xuất giống thủy sản Những nghiên cứu mang tính ứng dụng tảo này làm thựcphẩm chức năng cho người còn rất mới mẻ Năm 2012, Viện Thực phẩm chức năngphối hợp với Công ty Tư vấn Y dược quốc tế đã bước đầu thành công bào chế thực

phẩm chức năng sử dụng tảo N.oculata dạng viên nang Do sản phẩm này phối trộn

nhiều tá dược nên không thể hiện được giá trị của tảo nguyên liệu và chưa thể thương

mại Với những ưu điểm về thành phần và hàm lượng các chất dinh dưỡng, tảo N oculata hứa hẹn sẽ là đối tượng tiềm năng trong lĩnh vực sản xuất thực phẩm chức

năng cho người ở nước ta trong những năm tới

Hệ thống phân loại của loài tảo nghiên cứu:

Giới: Chromista T.Cavalier-Smith

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 V ật liệu thí nghiệm

- Vi tảo biển N oculata.

- Môi trường dinh dưỡng bổ sung trong quá trình nuôi tảo (f/2, f/2-50, f/2-100,f/2-150 và Walne): được pha chế từ các loại hóa chất tinh khiết phân tích của Sigma,Merck theo Andersen RA [14]

- Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm: Bình tam giác Duran dung tích 1.000 ml; túinilon PE trong suốt với thể tích nước nuôi 30 L được treo và cố định trên giàn giá thépcao 1,5m; dụng cụ cấp khí bao gồm: máy sục khí, van khí, ống dẫn khí, quả đá khí; nồihấp khử trùng (Tomy SS325), tủ sấy dụng cụ (Memmert), kính hiển vi (Nikon E600),lux kế, máy đo thông số nhiệt độ, pH, độ muối

- Nước biển có độ mặn 27,0 ‰, nước cất 2 lần

- Hóa chất để pha môi trường f/2, Walne's và các hóa chất khác…

2.2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Một số môi trường dinh dưỡng

khác nhau

Nghiên cứu chế độ bổ sung môi trường dinh dưỡng thích hợp cho nuôi tảo

Nannochloropsis oculata đạt mật độ cao

Bổ sung môi trường dinh dưỡng

theo thời gian

K ết luận và đề xuất

Bổ sung các môi trường dinh

dưỡng khác nhau: f/2, Walne,

2.2.3 B ố trí thí nghiệm

a N ội dung 1: Nghiên cứu xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc

nuôi tảo Nannochloropsis oculata đạt mật độ cao.

Để đánh giá ảnh hưởng của một số môi trường dinh dưỡng khác nhau đến sự phát

triển của tảo N oculata, một thí nghiệm được thiết kế bao gồm 4 lô riêng biệt, được bổ

sung môi trường dinh dưỡng khác nhau và 1 lô đối chứng (chỉ bổ sung môi trườngf/2) Mỗi lô thí nghiệm được lặp lại ba lần và bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên Toàn bộ lôthí nghiệm được đặt trong phòng điều hoà cài chế độ nhiệt độ ổn định trong suốt quátrình thí nghiệm Nguồn sáng sử dụng trong thí nghiệm là 4 bóng đèn huỳnh quang cócường độ chiếu sáng từ 6.700 – 7.200 lux tùy theo từng vị trí tiếp xúc (đo bằng Luxkế) với chế độ chiếu sáng ngày:đêm = 12:12 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm được mô tảtrong hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm nội dung 1

+ Chuẩn bị thí nghiệm:

Tảo được nuôi trong các bình tam giác Duran thể tích 1.000 ml, đặt trên bàn gỗphẳng Các bình được xếp thành 3 hàng và được đặt ở giữa của 2 bóng đèn huỳnhquang 1,2m Khoảng cách vuông góc từ bóng đèn đến thành bình là 2 cm (hình 2.4).Các bình thí nghiệm được sắp xếp tập trung về phần giữa của bóng đèn Vị trí đặt cácbình thí nghiệm được xác định bằng cách bốc thăm ngẫu nhiên

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí lô thí nghiệm nội dung 1

- Bình nuôi tảo: được cọ rửa sạch, miệng bọc kín bằng giấy nhôm Sau đó, bình

được hấp khử trùng ở 121 °C trong 20 phút (nồi hấp Tomy SS325) và sấy khô ở nhiệt

độ 105 °C bằng tủ sấy Memmert (Đức) Trước khi cho tảo vào nuôi, các bình này đượctráng lại bằng nước biển sạch

- Nước biển nuôi tảo: được lấy từ vùng biển Cát Bà có độ mặn 27,0 ‰, được lọc

thô qua hệ thống lọc với cột lọc có đường kính mắt lọc 1 µm và 5 µm Sau đó, nướcbiển được khử trùng bằng chlorine với nồng độ 30 ppm để trong 2 ngày, rồi trung hòabằng Na2S2O3 với nồng độ 30 ppm (trong thời gian khử trùng và trung hòa cần lắp sụckhí) Trước khi nuôi, nước biển được lọc bằng bình lọc chân không cầm tay (GlassMicrofible Filiers) với kích thước mắt giấy lọc là 0,7 µm và điều chỉnh về độ mặn27‰ bằng cách pha thêm nước cất 2 lần

- Tảo N oculata làm thí nghiệm: là tảo giống VNPT cấp 2 đang được nhân nuôi

tại Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu Hải sản Môi trường dinh dưỡng

sử dụng trong thí nghiệm là môi trường f/2, Walne và f/2 biến đổi (tăng 50%, 100% và150% hàm lượng NaNO3 và NaH2PO4.H2O, các hợp chất khác không thay đổi) Côngthức và tỉ lệ pha các loại môi trường dinh dưỡng được mô tả trong Phụ lục 1 Trướckhi nuôi, bổ sung dinh dưỡng vào bình thí nghiệm theo liều lượng được liệt kê ở bảng2.1

Bảng 2.1 Lượng bổ sung môi trường và ký hiệu cho từng lô thí nghiệm

Môi trường f/2 tăng 50% N, P f/2-50 1 ml/L

Môi trường f/2 tăng 100% N, P f/2-100 1 ml/L

Môi trường f/2 tăng 150% N, P f/2-150 1 ml/L

+ Phương pháp nuôi tảo:

- Các lô thí nghiệm được đặt trong phòng thí nghiệm, nơi có nhiệt độ dao độngkhoảng 27,5±0,30C (nhiệt độ được duy trì bằng hệ thống điều khiển nhiệt độ) Mỗi lôtảo là một bình thủy tinh Duran trong suốt dung tích 1 lít với mật độ ban đầu là 3106

tb/mL Lắp hệ thống sục khí sục khí 24/24 có bổ sung CO2 để duy trì pH đạt > 7,5 vớilượng khí sục vào mỗi bình là 1,67 l/phút/bình Dây sục, quả đá khí trước đó đã đượcrửa sạch, sấy khô ở 105°C rồi đem khử trùng bằng đèn cực tím từ 3 - 5 giờ Các lô tảođược đều được bổ sung môi trường nuôi 3 ngày/lần với hàm lượng 1 ml môitrường/bình Độ mặn nước nuôi tảo ban đầu là 27,0 ‰ Sử dụng nước biển và nước cất

để duy trì thể tích và độ mặn trong suốt quá trình nuôi Thời gian nuôi khoảng 30ngày

- Mẫu vi tảo được lấy 1 lần/ngày vào lúc 8 giờ sáng, mỗi lần lấy 1 mL Mẫu vitảo được đựng trong hộp đựng mẫu (ống falcon), bảo quản ở nhiệt độ 40C với nhữngmẫu chưa kịp xử lý và xác định mật độ

- Các yếu tố môi trường: nhiệt độ, độ mặn, pH và ánh sáng được ghi chép cùngthời gian; sử dụng Lux kế, máy đo pH và độ mặn

b N ội dung 2: Xác định khoảng thời gian bổ sung môi trường dinh dưỡng thích

hợp

Dựa trên kết quả ngiên cứu sơ bộ của nội dung 1, sau khi tiến hành phân tích, thuthập dữ liệu đã nhập dữ liệu, tính toán đánh giá hiệu quả sơ bộ về loại môi trường dinhdưỡng phù hợp (f/2-100), sử dụng môi trường dinh dưỡng đó để nuôi sinh khối của tảotrong nội dung nghiên cứu 2 Và tương tự như nội dung 1, tiến hành bố trí thí nghiệmkiểu ô vuông latin để đảm bảo tính ngẫu nhiên Vị trí đặt các lô nuôi tảo đánh số và

bốc thăm ngẫu nhiên Yếu tố đánh giá là khoảng thời gian bổ sung môi trường nuôi.

Phương pháp nuôi tảo tương tự như phương pháp tiến hành ở nội dung 1 nhưngmôi trường nuôi là môi trường được lựa chọn từ kết quả nghiên cứu của nội dung 1(f/2-100) Thời gian bổ sung môi trường ở các lô thí nghiệm theo các nghiệm thức đãđịnh 1, 2, 3, 4 ngày trong đó không bổ sung thêm môi trường sử dụng làm đối chứng.Mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp Thời gian nuôi khoảng 20 - 30 ngày Sơ đồ thiết kế thínghiệm được mô tả trong hình 2.5

Hình 2.5 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm nội dung 2

- Hệ thống giá cố định treo túi nhựa: là các ống thép cố định song song cách nhau0,5m, cách nền đất 1,5m (Hình 2.6)

- Nguồn sáng sử dụng ánh sáng mặt trời trong thí nghiệm, có cường độ chiếusáng từ 5.500 – 8.900 lux tùy theo thời gian đo (đo bằng Lux kế) với chế độ chiếu sángngày:đêm = 12:12

- Lưới cắt nắng: là các tấm lưới căng trên cao 3,5m có tác dụng giảm bớt nhiệt độtrong những ngày nắng gắt.

- Môi trường dinh dưỡng: sử dụng kết quả nghiên cứu trong nội dung 1 (f/2-100)

- Nước biển: như nội dung 1

- Vật liệu cho hệ thống cấp khí: đá bọt khí, dây cấp khí; hệ thống lọc khí và ốngPVC dẫn khí Lắp hệ thống sục khí sục khí 24/24 với lượng khí sục vào mỗi túi là 7lít/phút Bổ sung CO2 để duy trì pH trong khoảng 7,5 – 8,5

- Các yếu tố sinh trưởng và môi trường (nhiệt độ, pH và ánh sáng) được xác địnhhàng ngày vào lúc 12h00’; sử dụng máy đo nhiệt độ, pH và Lux kế

Bảng 2.2 Khoảng thời gian bổ sung môi trường và ký hiệu cho từng lô thí nghiệm Khoảng thời gian bổ sung môi trường Ký hiệu Liều lượng

Hình 2.6 Vị trí bố trí lô thí nghiệm nội dung 2

2.2 3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

 Phương pháp xác định các thông số môi trường, sinh trưởng quần thể:

+ Phương pháp xác định các thông số môi trường:

- Nhiệt độ không khí: được xác định bằng nhiệt kế thủy ngân gắn ở gần khu vựcthí nghiệm, dải đo 0 - 1000C, độ chính xác 0,10C;

- Nhiệt độ nước: được xác định kèm theo máy đo độ mặn hoặc trị số pH, dải đo 0

 Xác định mật độ tế bào tảo và tốc độ sinh trưởng quần thể:

Tại mỗi lô nuôi tảo, 1 ml mẫu sẽ được thu bằng pipet man Các mẫu thu được sẽđem bảo quản tươi trong tủ lạnh với nhiệt độ bảo quản là 40C nhằm ức chế sự pháttriển của tảo trong thời gian đếm mẫu Mẫu sẽ được đếm dưới kính hiển vi NikonE600 với độ phóng đại tối đa 1.000x sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer Độ sâubuồng đếm là 0,100mm và diện tích một ô đếm mini là 0,0025mm2 Mật độ tảo đượcxác định theo công thức sau:

) (

0

0

t t B

B Ln

 Phương pháp xử lý số liệu:

Số liệu được nhập vào Excel 2003 và phân tích bằng phần mềm SPSS16.0 Ápdụng phương pháp phân tích ANOVA một nhân tố với kiểm định Turkey test để phântích với mức ý nghĩa α = 0,05 [53] Trong trường hợp số liệu không tuân theo phânphối chuẩn (không theo giả thuyết của phương pháp phân tích), các số liệu sẽ đượcchuyển đổi (transform) theo logarit biến mật độ Phân tích số liệu phi tham số (phươngpháp bootrap với tần suất 500 lần) có thể được áp dụng nếu việc chuyển đổi dữ liệukhông đạt yêu cầu mong muốn

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng quần thể của tảo

Nannochloropsis oculata

3.1.1 Bi ến động của một số điều kiện môi trường thí nghiệm

Trong thiết kế thí nghiệm, các yếu tố môi trường có khả năng làm sai lệch kếtquả thí nghiệm như biến động ánh sáng, chế độ sục khí,… đã được khống chế ổn định.Tuy nhiên, nhiệt độ, độ mặn và trị số pH là ba yếu tố môi trường khó kiểm soát hơn

Do đó, các yếu tố này được xem xét kỹ lưỡng nhằm đánh giá ảnh hưởng của chúngđến kết quả thí nghiệm

Yếu tố nhiệt độ: Kết quả giám sát nhiệt độ ở các bình nuôi tảo trong quá trình thí

nghiệm chỉ ra sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê về nhiệt độ giữa các bình Thínghiệm được bố trí trong điều kiện nhiệt độ phòng 27,5 °C, trong khi nhiệt độ nước đođược tại các bình thí nghiệm vẫn có thể dao động từ 27,4°C - 27,8 °C, chênh lệch từ0,4 °C - 0,8 °C so với điều kiện ban đầu Phân tích thống kê AVOVA một nhân tố chothấy sự khác biệt này về nhiệt độ trong suốt quá trình nuôi giữa các bình thí nghiệmkhông có ý nghĩa thống kê với P - value thuộc khoảng từ 0,974 – 0,999 > 0,05 (Hình3.1, Bảng 4.1, Phụ lục 5)

Yếu tố độ mặn: Tương tự như nhiệt độ, kết quả giám sát độ mặn ở các bình nuôi

tảo trong quá trình thí nghiệm chỉ ra sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê về độ mặngiữa các bình Tại các bình thí nghiệm, độ mặn của nước nuôi bắt đầu chu kỳ nuôi đạt27,1 ‰, tuy nhiên trong chu kỳ nuôi có sự biến động nhưng giá trị không lớn, từ 27,2 -27,5 ‰, trung bình 27,3±0,10 ‰ Phân tích thống kê AVOVA một nhân tố cho thấy

sự khác biệt này về độ mặn trong suốt quá trình nuôi giữa các bình thí nghiệm không

có ý nghĩa thống kê với P - value thuộc khoảng từ 0,208 – 0,939 > 0,05 (Hình 3.1,Bảng 4.1, Phụ lục 4)

Trị số pH: sự khác biệt về pH giữa các bình nuôi được kiểm tra một cách ngẫu

nhiên trong một số ngày của chu kỳ nuôi cho thấy tuy có sự dao động theo thời giannhưng giá trị trong từng ngày khác biệt không đáng kể, độ pH dao động từ 8,49 - 8,98,trung bình 8,68±0,12 Kết quả phân tích ANOVA một nhân tố khẳng định rằng sự daođộng này không có ý nghĩa thống kê với giá trị P - value từ 0,131 - 0,625 > 0,05 (Hình3.1, Bảng 4.1)

Hình 3.1 Biến động nhiệt độ, độ mặn và trị số pH theo thời gian nuôi trong

phòng thí nghiệm

Các điều kiện môi trường trong thí nghiệm đều là những giá trị nằm gần khoảng

tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của tảo N oculata Theo Bùi Bá Trung và cs (2009), độ mặn nước nuôi N oculata được dùng là 27,0 ‰ [11] Nhiệt độ thích hợp

cho sự sinh trưởng của N oculata khoảng từ 20,0 - 25,0 °C [50] Độ pH các bình thí

nghiệm dao động từ 8,49 - 8,98 nằm trong khoảng pH thích hợp (7,0 - 9,0) cho sự phát

triển của vi tảo nói chung và vi tảo N oculata nói riêng [24] Sục khí 24/24 và tốc độ

sục 1,67 l/phút/bình đảm bảo các tế bào tảo được đảo đều tránh hiện tượng lắng đáy.Hơn nữa, việc sục khí mạnh sẽ cung cấp thêm 1 lượng CO2 giúp tảo có thêm nguồnnguyên liệu tổng hợp nên vật chất sống [11, 24]

Ánh sáng cũng là một yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng quang hợp và

tổng hợp chất dinh dưỡng của vi tảo nói chung và N oculata nói riêng Trong thời gian

thí nghiệm, cường độ ánh sáng dao động trong khoảng từ 6.700 – 7.200 lux tùy từng vịtrí đo xung quanh các bình nuôi và khoảng giá trị này nằm trong khoảng cường độ ánh

sáng tối ưu cho loài N oculata [18].

So với các nghiên cứu trước đây, tảo có thể phát triển ở các ngưỡng cường độsáng khác nhau tùy vào mật độ và thể tích nuôi Tuy nhiên, cường độ sáng từ 1.000 –16.000 lux phù hợp cho tảo đạt mật độ tối đa [38] Cũng có nghiên cứu nói rằng cường

độ ánh sáng được sử dụng ở các trại nuôi thủy sản khi nhân nuôi vi tảo thường trongkhoảng 2.500 - 8.000 lux [40], tương đương với 40 - 160 µmol photon/m2/s [26]

Nghiên cứu thử nghiệm sử dụng hệ thống Bio-fence của Sadnes et al (2005) cho thấy

cường độ chiếu sáng cao 1.030 µmol photon/m2/s ở nhiệt độ 24 oC đã cho năng suất

tảo N oceanica đạt cao nhất, 0,7 g/l/ngày [58] Trong quá trình bố trí thí nghiệm, các

bình tam giác được bố trí vị trí đặt sao cho lượng ánh sáng nhận được là tương đươngnhau Vì vậy, ảnh hưởng của cường độ ánh sáng cũng như thời gian chiếu sáng đãđược hạn chế đến mức thấp nhất

3.1.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến tốc độ sinh trưởng và mật độ của

qu ần thể tảo Nannochloropsis oculata

Việc đánh giá ảnh hưởng của các môi trường dinh dưỡng thử nghiệm đến hiệu

quả nuôi sinh khối tảo N oculata được phân tích trên ba khía cạnh khác nhau là: chu

kỳ sinh trưởng, mật độ cực đại và tốc độ sinh trưởng Sự đánh giá này tương tự như một số kết quả nghiên cứu như nghiên cứu của Sen et al (2005) trên tảo N oculata, Flynn et al (1993) trên tảo N oculata, Zhu & Dunford (2013) trên Picochlorum oklahomensis và N oculata [28,64,66].

Về chu kỳ sinh trưởng: Tảo N.oculata nuôi thử nghiệm ở các môi trường khác

nhau đều trải qua 3 pha sinh trưởng cơ bản là pha thích nghi, pha logarit và pha cânbằng, suy tàn với tổng thời gian theo dõi là 21 ngày Tuy nhiên, thời gian tảo đạt đếnpha cân bằng có sự khác biệt đáng kể giữa các loại môi trường thí nghiệm Ở môi

trường f/2, sau khi thả giống, tảo N.oculata tăng trưởng liên tục đến ngày thứ 11 và

sau đó tăng nhẹ rồi đạt đỉnh cực đại ở ngày thứ 19 rồi suy tàn Xu hướng tương tựcũng ghi nhận ở môi trường f/2-150 và Walne nhưng thời gian đạt mật độ cực đại sớm

hơn 2 ngày so với môi trường f/2 Với môi trường f/2-50, tảo N.oculata cũng tăng liên

tục đến ngày thứ 11 nhưng sau đó ổn định ở pha cân bằng đến ngày 19 bắt đầu suy tàn.Không giống các môi trường thí nghiệm kể trên, tảo ở môi trường f/2-100 tăng liên tục

từ sau khi thả giống đến tận ngày thứ 17 sau đó tăng nhẹ và đạt mật độ cực đại ở ngàythứ 19 rồi chuyển sang suy tàn (Hình 3.2)

0 20 40 60 80 100 120 140 160

f/2-50

0 20 40 60 80 100 120 140 160

f/2-100

0 20 40 60 80 100 120 140 160

f/2-150

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Walne

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Hình 3.2 Chu kỳ sinh trưởng của tảo N oculata trong các lô thí nghiệm bổ sung

môi trường dinh dưỡng khác nhau

Như vậy, chu kỳ sinh trưởng và phát triển của tảo N oculata trong thí nghiệm

này cũng giống như chu trình sinh trưởng và phát triển của một số loài vi tảo đơn bào

khác, một số loài vi tảo đã được một số tác giả nghiên cứu, mô tả như Chaetoceros calcitrans [15], Tetraselmis suecica, Phaeodactylum tricornutum, Chaetoceros calcitrans, Isochrysis galbana [47].

Chu kỳ sinh trưởng trong thí nghiệm kéo dài 19 ngày, chu kỳ này có sự khác biệtgiữa các nghiên cứu Nghiên cứu của Bùi Bá Trung và cs (2003), chu trình sinh

trưởng của N oculata đến đầu pha suy tàn chỉ kéo dài 11 ngày [11] Trong khi đó, ở nghiên cứu của Sen et al (2005) thời gian này lại kéo dài tới 25 – 37 ngày [58] So

sánh điều kiện nuôi giữa các nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy sự khác này là doảnh hưởng của nhiều yếu tố như mật độ giống ban đầu, điều kiện thí nghiệm CáiNgọc Bảo Anh (2010) nuôi tảo với mật độ ban đầu là 4×106tb/mL và sau 7 ngày tảođạt mật độ cực đại trong chu kỳ 9 ngày nuôi [2] Bùi Bá Trung và cs (2003) nuôi tảovới mật độ ban đầu 8×106tb/mL và sau 8 ngày tảo đạt mật độ cực đại [11] Sen et al.

(2005) thí nghiệm với mật độ ban đầu 0,25×106 tb/mL thì thời gian để tảo đạt mật độcực đại lên đến 30 ngày [58] Ở nghiên cứu này, với mật độ giống ban đầu là 3×106tb/mL thì sau 17 - 19 ngày tất cả các lô thí nghiệm đều đạt mật độ cực đại Như vậy, cóthể thấy, mật độ ban đầu càng nhỏ thì thời gian để tảo đạt mật độ cực đại và chu kỳnuôi càng kéo dài

Về mật độ cực đại: Mật độ cực đại của tảo N oculata khác biệt rõ rệt giữa các

các môi trường thí nghiệm khác nhau Kết quả phân tích ANOVA một nhân tố (môitrường >< mật độ cực đại) cho P value = 0,000769 Biểu diễn ANOVA trên biểu đồmật độ cực đại trung bình ± khoảng tin cậy 95% cho thấy các môi trường thí nghiệmchia thành ba nhóm có mật độ cực đại khác nhau Môi trường f/2-100 cho mật độ caonhất đạt 149,5106 tb/mL Môi trường f/2 và f/2-150 cho mật độ cực đại tương đươngnhau khoảng 124,0106 - 127,6106 tb/mL thấp hơn so với môi trường f/2-100 Môitrường f/2-50 và Walne có mật độ đều đạt khoảng 110,5106

- 119,9106

tb/mL, thấpnhất trong các lô thí nghiệm (Hình 3.3) Kết quả phân tích Turkey test chỉ ra các môitrường thí nghiệm có mật độ cực đại khác nhau không có ý nghĩa thống kê ngoại trừmôi trường f/2-100 có mật độ cực đại khác biệt rõ rệt với các môi trường f/2, f/2-50 vàWalne nhưng khác biệt không có ý nhĩa thống kê so với môi trường f/2-150 (Phụ lục6) Tuy nhiên, phân tích khoảng tin cậy 95% (Confidental interval - CI) của hai môi