Hoàn thiện quy trình nhân giống lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Hoàn thiện quy trình nhân giống lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào” là kết quả nghiên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

(ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)

BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ

BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

(ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)

BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến

TS La Việt Hồng đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường học Sư phạm Hà Nội 2, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành khóa luận này

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận

tình của cô Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ,

đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành khóa luận này, nhân đây tôi cũng xin chân thành cảm ơn

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng như hoàn thành khóa luận

Mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng do điều kiện thời gian và trình độ chuyên môn còn nhiều hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để khóa luận của tôi có thể hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2016

Sinh viên Phạm Thị Nhung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Hoàn thiện quy trình

nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) bằng kỹ

thuật nuôi cấy mô tế bào” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do TS La Việt

Hồng hướng dẫn Các số liệu, kết quả trong nghiên cứu này là trung thực và

chưa được ai công bố

Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2016

Sinh viên Phạm Thị Nhung

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA: Napthlacetic acid

BAP: 6-Benzyl amino purin

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Phạm vi nghiên cứu 3

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

NỘI DUNG 4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về cây lan Kim tuyến 4

1.1.1 Phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm thực vật học 4

1.1.3 Sinh học và sinh thái 5

1.1.4 Phân bố 5

1.1.5 Công dụng của lan Kim tuyến 5

1.1.6 Thực trạng khai thác và phát triển cây lan Kim tuyến ở Việt Nam 8

1.1.7 Các loài lan Kim tuyến có ở Việt Nam 8

1.2 Tình hình nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến 10

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 10

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 12

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu thực vật 15

2.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 15

2.2.1 Dụng cụ 15

2.2.2 Thiết bị 15

2.3 Môi trường nuôi cấy 15

2.4 Điều kiện nuôi cấy in vitro 15

2.5 Phương pháp nghiên cứu 16

2.5.1 Bố trí thí nghiệm 16

2.5.3 Phương pháp phân tích thống kê kết quả thực nghiệm 18

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 Hoàn thiện giai đoạn tái sinh lan Kim tuyến in vitro 19

3.2 Hoàn thiện giai đoạn ra rễ tạo cây lan Kim tuyến in vitro hoàn chỉnh 22

3.3 Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện cây lan Kim tuyến với điều kiện tự nhiên 24

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 26

TÀI LIỆU THAM KHẢO 27

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi

cây lan Kim tuyến 17

Bảng 2.2: Ảnh hưởng của α - NAA đến tạo rễ của cây lan Kim tuyến in vitro 17

Bảng 2.3: Ảnh hưởng của giá thể tới tỉ lệ sống của lan Kim tuyến

in vitro 18

Bảng 3.1 Kết quả tái sinh chồi lan Kim tuyến (số chồi/mẫu) 19

Bảng 3.2 Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro lan Kim tuyến 23

Bảng 3.3 Rèn luyện cây in vitro ngoài tự nhiên 24

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume 4

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 16

Hình 3.1 Cụm chồi lan Kim tuyến 21

Hình 3.2 Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro từ chồi lan Kim tuyến 23

Hình 3.3 Rèn luyện cây lan Kim tuyến ngoài môi trường tự nhiên ở các giá thể khác nhau 25

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thuộc họ Phong lan

(Orchidaceae) là loại thảo dược quý hiếm của Việt Nam [1] Ở nước ta, cây

lan Kim tuyến mọc rải rác ở trong rừng núi đá vôi, nơi ẩm, dọc theo khe suối, ở độ cao 300-1000 m như Sa Pa (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang), Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Mĩ Đức (Hà Tây)… Lan Kim tuyến được cấp báo thuộc nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại [3] và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a, c, d, trong sách đỏ Việt Nam [4]

Trong y học, lan Kim tuyến được sử dụng làm thuốc trị lao phổi, ho do phế nhiệt, phong thấp, đau nhức khớp xương, chấn thương, viêm dạ dày mãn tính, viêm khí quản, viêm gan mãn tính, suy nhược thần kinh, giúp tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn [24]

Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở

ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp, sau đây là những

ưu điểm chính: cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và đạt năng suất cao Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao Tạo được cây có gen mới (đa bội, đơn bội) Bảo quản và lưu trữ tập đoàn gen Có khả năng sản xuất quanh năm Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà [2]

Về phương diện hệ số nhân giống, nhân giống in vitro là phương pháp

không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt Theo

Phạm Thị Nhung 2

Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng một năm đối với cây khoai tây bằng phương pháp này [11]

Quá trình nhân giống cây trồng trong môi trường in vitro gồm nhiều

giai đoạn khác nhau gồm: (i) tạo vật liệu khởi đầu; (ii) nhân nhanh chồi; (iii)

ra rễ cho chồi in vitro và (iv) chuyển cây ra rèn luyện với điều kiện tự nhiên

Mỗi giai đoạn có những yêu cầu riêng Trong đó giai đoạn quan trọng nhất quyết định sự thành công của quy trình nuôi cấy là giai đoạn nhân nhanh chồi và giai đoạn rèn luyện cây con thích nghi với môi trường tự nhiên [21] Tại Việt Nam cũng đã có một số công bố về nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến như: Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2012) đã tìm ra môi trường nhân nhanh thích hợp nhất cho thể chồi và mắt đốt ngang thân là Knud* + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l α-NAA + 20 g/l sucrose + 0,5 g/l than hoạt tính + 7 g agar/l đạt hệ số nhân chồi là 6,55 chồi/mẫu [13] Năm 2014, tác giả Trần Thị Hồng Thúy và cộng sự đã tìm ra môi trường Knudson C lỏng chứa 1% saccarozơ, 100 ml.L-1 nước dừa và 0,5 mg.L-1 Kinetin, tỉ lệ hình thành PLBs đạt 86,25%, PLBs sinh trưởng tốt [14], tác giả Đỗ Mạnh Cường và cộng sự (2015) nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan Gấm

(Anoectochilus setaceus Blume) nuôi cấy in vitro [5]… Tuy nhiên, việc

nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở một số giai đoạn mà chưa hoàn thiện được quy trình nhân giống cây lan này Do vậy, tôi quyết định nghiên cứu

đề tài: “Hoàn thiện quy trình nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus

setaceus Blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào” nhằm cải thiện một

số giai đoạn của quy trình nhân giống in vitro loài lan này với mục đích bảo

tồn và phát triển được nguồn giống lan Kim tuyến, cung cấp cây giống có chất lượng cho thị trường

2 Mục đích nghiên cứu

Hoàn thiện quy trình nhân nhanh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus

setaceus Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nhằm góp phần bảo

tồn và phát triển loài lan dược liệu quý hiếm của Việt Nam, đáp ứng nhu cầu

cây lan Kim tuyến giống phục vụ nhu cầu con người

3 Nội dung nghiên cứu

Hoàn thiện giai đoạn nhân nhanh giống cây lan Kim tuyến bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Hoàn thiện giai đoạn ra rễ của lan Kim tuyến in vitro

Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện cây con lan Kim tuyến in vitro

Góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu về nhân giống in vitro

cây lan Kim tuyến

Phạm Thị Nhung 4

NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây lan Kim tuyến

Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 - 4

x 2 - 3 cm, có màu khác nhau với mạng gân thường nhạt hơn (màu lục sẫm

Hình 1.1 Lan Kim tuyến

Anoectochilus setaceus Blume

Tên Việt Nam: Lan Kim tuyến

Tên gọi khác: Lan Gấm

với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu - đỏ với mạng gân màu vàng - lục hay hồng); cuống lá dài 2 - 3 cm [3]

Cụm hoa dài 10 - 15 cm, mang 4 - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, chóp thót nhọn, dài 8 - 10 mm, màu hồng Hoa thường màu trắng, dài 2,5 - 3 cm; các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu, hốc chứa mật dài

7 mm, bầu dài 1,3 cm, màu lục, có nhiều lông mềm [3]

1.1.3 Sinh học và sinh thái

Mùa hoa tháng 2 - 4 Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt, ít và sinh trưởng rất chậm Mọc dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là nguyên thủy, rậm thường xanh nhiệt đới mưa mùa cây lá rộng trên sườn núi đá granit, riôlit, phiến sét, ở độ cao 500 - 1600 m, rải rác thành từng nhóm vài ba cây trên đất ẩm, rất giàu mùn và lá cây rụng [3]

1.1.5 Công dụng của lan Kim tuyến

Theo các tài liệu của Đài Loan thì lan Kim tuyến là một loại cây thuốc

vô cùng quý giá, có bán tại các tiệm thuốc Bắc và được sử dụng phổ biến trong nhân dân Cây lan Kim tuyến có các tác dụng như: tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thông; có tác dụng kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính; chữa thần kinh suy nhược, chữa ho khan,

Phạm Thị Nhung 6

đau họng, cao huyết áp, suy thận, chữa di tinh, đau lưng, phong thấp, làm tiêu đờm, giải độc, giải nhiệt Và thường dùng cả cây tươi hoặc khô để sắc

uống, liều thường dùng trong ngày là khoảng 20 g tươi hoặc 5 g khô [25]

Ông Tả Mộc Thuấn - học giả người Nhật (năm 1924), nghiên cứu về Trung y đã cho biết: Kim tuyến liên là một trong những cây thuốc quý trong dân gian; toàn thân cây thuốc được dùng để làm tăng cường sức khỏe, chủ trị bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tỳ và các vết thương do rắn cắn; còn có tác dụng bổ máu, giải nhiệt [25]

Ông Sơn Điền Kim Trị (1932) cũng đã cho biết: Người dân tộc miền núi thường dùng Kim tuyến liên sắc uống để trị đau ruột, đau bụng, sốt cao, đắp bên ngoài để trị các chỗ sưng vết thương và chỗ bị rắn cắn [25]

Trong sách Thanh thảo gia đình tự liệu pháp của ông Trần Đào Thích

có viết: Trẻ em hay khóc dùng Kim tuyến liên sắc uống sẽ khỏi [25]

Trong sách Khoa học quốc dược quyển I kỳ 2 (năm 1958) của ông Tạ

A Mộc và Trần Kiến Đào đăng tải trong tạp chí Đài Loan dân gian dược dụng thực vật, có nói đến Kim tuyến liên là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan [25]

Trong báo cáo điều tra năm 1964, ông Cam Vĩ Tùng đã cho biết: Kim tuyến liên là một vị thuốc hết sức quý giá trong các tiệm thuốc bắc Đài Loan, là cây thuốc mang tính mát và có vị ngọt, thanh nhiệt, thanh huyết, bổ phổi, giải trừ u uất, thông trung khí, bồi dưỡng sức khỏe, chủ trị lục phủ ngũ tạng đẩy lùi tâm hỏa, nóng gan, bệnh phổi, thổ huyết, ho hen, đau ngực, đau

lá lách, đau cuống họng, cao huyết áp, trẻ con chậm lớn, suy thận [25] Trung y sư Thái Cát Hùng, Chủ tịch Hội đồng quản trị của Hội nghiên cứu cây thuốc thực vật thành phố Gia Nghĩa cho biết: Kim tuyến liên tiêu đờm, giải độc, hạ huyết áp, trợ tim, lợi tiểu, trị bệnh đái đường, chữa viêm gan, trị mụn và thường dùng cây tươi sắc uống [25]

Trong y học hiện đại bằng nhiều công trình nghiên cứu khoa học, các nhà khoa học ở nhiều Viện và Trường đại học Y trên thế giới đã cung cấp các bằng chứng cho thấy nhiều công dụng của lan Gấm – lan Kim tuyến như [26]:

Điều trị ung thư: “Các chất chiết xuất từ thực vật Chi Lan Kim Tuyến

A formosanus và các thành phần có nguồn gốc từ nó được sử dụng như là

các loại thuốc thảo dược hoặc các chất bổ sung dinh dưỡng để ngăn ngừa hóa chất (chemoprevention) hoặc điều trị bệnh lý ác tính của con người” Nghiên cứu này đã được cấp bằng sáng chế ở Mỹ (US 7033617 B2)

Tăng cường miễn dịch: Chi Lan Kim Tuyến có tiềm năng tăng cường

hệ miễn dịch Các kết quả nghiên cứu cho thấy những tác dụng tăng cường

hệ miễn dịch rất quý của dịch chiết Chi Lan Kim Tuyến

Bảo vệ gan - Giải độc rượu: tác dụng bảo vệ gan, giải độc rượu của Chi Lan Kim Tuyến đã được chứng minh bằng nhiều công trình khoa học Dung dịch nước chiết xuất của Chi Lan Kim Tuyến formosanus đã cho thấy hoạt động bảo vệ gan đáng kể so với silymarin tiêu chuẩn Các nghiên cứu độc tính cấp đã kết luận rằng nó có thể được coi là an toàn trong một thời gian dài

Điều trị tiểu đường: kinsenoside là một hợp chất hoạt tính sinh học cơ bản có trong lan Gấm Nó thể hiện các hiệu ứng dược lý như chống mỡ máu, chất chống oxy hóa, chống viêm, tăng cường miễn dịch, và các hoạt động bảo vệ gan và gần đây đã được phát triển như là một ứng cử viên thuốc trị đái tháo đường

Chống loãng xương: chiết xuất Chi Lan Kim Tuyến formosanus (arabinogalactan prebiotic) làm tăng hấp thu canxi và ngăn chặn sự tiêu xương

Bồi bổ cơ thể: rất nhiều khoáng chất hữu cơ và axit amin có trong lan Kim tuyến giúp bồi bổ cơ thể phục hồi khí huyết

Phạm Thị Nhung 8

1.1.6 Thực trạng khai thác và phát triển cây lan Kim tuyến ở Việt Nam

Ở Việt Nam, lan Kim tuyến có phân bố rộng nhưng với số lượng cá thể không nhiều, tái sinh chậm đòi hỏi điều kiện sống ngặt nghèo ngày càng hiếm

Theo khảo sát, nước ta có tới 15 loài lan Gấm phân bố rải rác ở rừng nhiều tỉnh, có thể tập hợp lại, trồng, xuất khẩu thu lợi nhuận Tuy nhiên, cách khai thác loại dược liệu quý này mới chỉ là dạng nhỏ lẻ [27]

Đặc biệt, cách đây vài năm, rộ lên cơn sốt lan Gấm khi các đầu mối Hàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc mua lại với giá khoảng 3,5 – 4 triệu đồng /1 kg tươi Vì vậy, rất nhiều người dân đã lặn lội trong rừng sâu, lùng hái lá lan Gấm để bán cho các đầu mối thu mua với giá khoảng 500 ngàn đồng 1/kg lá tươi, dần dần khi khan hiếm, cạn kiệt, giá của lan Gấm được đẩy lên 1,2 - 1,6 triệu đồng/1 kg lá tươi [27]

Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, lan Kim tuyến được xếp trong nhóm IA của Nghị Định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại [3]

Phải chăng, đã đến lúc chúng ta phải có những đánh giá nghiêm túc, công trình nghiên cứu chính thức về giá trị tài nguyên của dược liệu quý, chẳng hạn như cây lan Gấm… Để từ đó, có được những hướng phát triển cũng như khai thác các loại dược liệu quý, thay vì để các doanh nghiệp nước ngoài lợi dụng sự thiếu hiểu biết của ta để trục lợi

1.1.7 Các loài lan Kim tuyến có ở Việt Nam

Theo GS Phạm Hoàng Hộ (Cây cỏ Việt Nam, tập III), ở Việt Nam chi lan Kim tuyến gồm có những loài sau [6]:

+ Loài Anoectochilus daoensis Gagnep Còn gọi là Giải thùy tam đảo,

phân bố ở Tam Đảo

+ Loài Anoectochilus elwesii (Hook.f.) King & Pantl Còn gọi là Giải

thùy Elwes, phân bố ở Lào Cai, Vĩnh Phúc, Phú Thọ

+ Loài Anoectochilus lanceolatus Lindl Còn gọi là Giải thùy thon,

phân bố ở SaPa, Ba Vì

+ Loài Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie Còn gọi là Giải thùy

Lyle; phân bố ở Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Gia Lai, Kontum, Bảo Lộc, Đà Lạt

+ Loài Anoectochilus siamensis Schltr Còn gọi là Giải thùy Xiêm;

phân bố ở Mường Xen

+ Loài Anoectochilus setaceus Blume (tên khác là Anoectochilus

roxburghii (Wall.) Lindl.) Còn gọi là Giải thùy Roxburgh (còn Võ Văn

Chi gọi là Sứa hồng); phân bố ở Tam Đảo, SaPa, Quảng Trị, Bình Trị Thiên, Gia Lai, Kontun

Theo Sách Đỏ Việt Nam (Phần II Thực Vật), có 5 loài lan Kim tuyến cần phải bảo vệ vì là những loài có trong “Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1)” của nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại; trong đó có 4 loài thế giới chưa biết, được phát hiện ra vào năm 1990 và 1996 và hiện chỉ có ở Việt Nam Năm loài lan Kim tuyến đó

có tên như sau [3]:

+ Loài Anoectochilus Acalcaratus Aver; còn gọi là Kim tuyến không

cựa, mới được phát hiện năm 1996, chỉ có ở Việt Nam, mới tìm thấy tại Kon Tum (Ngọc Linh); thế giới chưa biết

+ Loài Anoectochilus Calcaretus Aver; còn gọi là Kim tuyến đá vôi,

mới được phát hiện năm 1996, chỉ có ở Việt Nam, tìm thấy tại Hà Giang ( Quản Bạ, Cán Tỷ), Hòa Bình (Mai Châu), Quảng Bình (Kẻ Bàng), Lâm Đồng (Bi Đúp), Khánh Hòa (Hòn Giao); thế giới chưa biết

Phạm Thị Nhung 10

+ Loài Anoectochilus Chapaensis Gagnep; còn gọi là Giải thùy Sa Pa,

được phát hiện năm 1931, chỉ có ở Việt Nam, tìm thấy tại Lào Cai (Sa Pa), Thừa Thiên - Huế (Bạch Mã); thế giới chưa biết

+ Loài Anoectochilus setaceus Blume (tên khác là Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.); còn gọi là Giải thùy tơ, Giải thùy Roxburgh,

Kim tuyến đỏ, Sứa hồng; được phát hiện năm 1825, phân bố ở Lào Cai (Sa

Pa, Phăng Xi Păng, Văn Bàn: Liêm Phú), Hà Tĩnh (Hương Sơn, Rào Ân), Quảng Trị, Kon Tum ( Đắk Glei, núi Ngọc Linh, Sa Thầy: núi Chư Morm Ray), Đắk Lắk (Krông Bông, núi Chư Yang Sinh), Lâm Đồng (Lạc Dương, núi Bì Đúp)

+ Loài Anoectochilus Tridentatus Seidenf Ex Aver; còn gọi là Giải

thùy Ba Răng, được phát hiện năm 1990, chỉ có ở Việt Nam, mới tìm thấy

ở Vĩnh Phúc (Tam Đảo); thế giới chưa biết

1.2 Tình hình nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trong những năm gần đây, trên thế giới đã có nhiều cơ sở nghiên cứu tìm các biện pháp nhân giống loài lan Kim tuyến quý hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng

Gangaprasad A và cộng sự (2000) nghiên cứu vi nhân giống hai loài

lan A sikkimensis và A regalis Hai loài lan Kim tuyến này được nuôi cấy

trên môi trường Woody Plant Medium (WPM) sau 12 tuần tỷ lệ callus được tạo ra 4,8 - 5,6 và số chồi tương ứng 95 - 98% Khi mẫu được cấy chuyển sang môi trường tương tự trên thì số chồi bên tăng 21,4 và chồi đỉnh là 8,2

đối với loài A regalis Còn đối với loài A sikkimensis sự bật chồi chậm hơn,

số chồi bên đạt 12,3 và chồi đỉnh là 4,3 [17]

Với công trình nghiên cứu gieo hạt in vitro cây A roxburghii, tác giả

Huang H và cộng sự (2002) đã tìm ra được môi trường Knudson C có bổ sung 0,5 mg/L BAP + 20% dịch khoai tây là thích hợp nhất cho sự phát triển

protocom từ hạt của A roxburghii [18]