Nghiên cứu quy trình vi nhân giống lan hồ điệp mãn thiên hồng (doritaenopsip)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN --- NGUYỄN THỊ THANH THỦY NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP MÃN THIÊN HỒNG DORITAENOPSIP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC C

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN -

NGUYỄN THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG

LAN HỒ ĐIỆP MÃN THIÊN HỒNG

(DORITAENOPSIP)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

Hà Nội, 2016

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Mã, TS

La Việt Hồng – Khoa Sinh KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận

tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình

của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ, đóng

góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn

Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua trình học tập và hoàn thành đề tài

Hà Nội,25 tháng 04 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Thanh Thủy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố

Hà Nội, 25 tháng 04 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Thanh Thủy

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

LỜI CAM ĐOAN 3

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa của đề tài 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về lan Hồ điệp 4

1.1.1 Vị trí phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.3 Điều kiện sinh thái 6

1.2 Tình hình sản xuất lan Hồ điệp trên thế giới và trong nước 7

1.2.1 Tình hình sản xuất hoa trên thế giới 7

1.2.2 Tình hình sản xuất hoa lan trong nước 8

1.3 Tình hình nghiên cứu lan Hồ điệp trên thế giới và trong nước 10

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 10

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 11

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 13

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 13

2.2 Vật liệu thực vật 13

2.2.1 Trang thiết bị và dụng cụ 13

2.2.2 Môi trường nuôi cấy 13

2.2.3 Điều kiện nuôi cấy in vitro 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu 14

2.3.2 Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng 15

2.3.3 Ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh 16

2.3.4 Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 17

2.4 Phân tích thống kê dữ liệu thực nghiệm 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

3.1 Tạo vật liệu khởi đầu 18

3.2 Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng 20

3.2.1 Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ mảnh lá 20

3.2.2 Nhân nhanh chồi lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ đốt thân 22

3.3 Ra rễ tạo cây lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro hoàn chỉnh 24

3.4 Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 26

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

PHỤ LỤC 34

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả tạo vật liệu khởi đầu từ cành hoa 18

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến quá trình tái sinh 20

và nhân nhanh chồi bất định từ mô lá 20

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BAP đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro 22

từ đốt thân của lan Hồ điệp mãn thiên hồng sau 6 tuần nuôi cấy 22

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BAP và nước dừa đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân của lan Hồ điệp mãn thiên hồng sau 6 tuần nuôi cấy 23

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của NAA đến sự ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của cây lan Hồ Điệp in vitro sau 4 tuần nuôi cấy 25

Hình 3.4 Cây lan Hồ điệp in vitro ra rễ 26

Hình 3.5 Hình ảnh rèn luyện lan Hồ điệp mãn thiên hồng 26

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA: Napthlacetic acid BAP: 6-Benzyl amino purin MS: Murashige và Skoog Nxb: Nhà xuất bản

Tp.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh

1

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Hoa lan, là một trong những họ thực vật có hoa đa dang nhất, bao gồm

25000 loài và 800 chi được xác định [40] Chiếm 8% thương mại hoa trên thế giới [28] Nó không đòi hỏi diện tích trồng quá lớn nhưng lại cho giá trị kinh tế

cao Lan hồ điệp (Phalaenopsis) thuộc họ Orchidaceae, là một trong những

giống lan rất được yêu thích trên thế giới [29] Chính màu sắc đa dạng, kiểu dáng khác lạ đã tạo ra nét đẹp sang trọng và trang nhã cho hoa lan và đặc biệt

là sự bền bỉ lâu tàn đặc trưng của hoa lan càng tôn thêm giá trị cho loài hoa quý

này Lan hồ điệp (Phalaenopsis) đem lại hiệu quả kinh tế cao ở cả dạng hoa cắt

cành và trồng chậu [37] Có nhiều nước và khu vực đã thành công với công

nghệ trồng hoa lan Hồ điệp (Phalaenopsis) xuất khẩu như: Thái Lan, Đài Loan,

Trung Quốc [7]

Theo thống kê của trung tâm nghiên cứu hoa, cây cảnh – Viện Nghiên cứu Rau quả, năm 2008 trở về đây quy mô sản xuất lan Hồ điệp thương mại đã tăng lên đáng kể và tăng dần đều qua các năm cả về diện tích, số lượng, cũng như mức độ đầu tư: Diện tích toàn miền bắc trước năm 2005 là 1.200m2 và 23.000 cây, năm 2012 diện tích toàn miền bắc đã tăng lên 24.100m2 và 333.000 cây Tuy thế lượng cung vẫn không đủ cầu và vẫn phải nhập 230.000 cây từ Trung Quốc và Đài loan Nhu cầu cây giống và cây lan thương mại của Việt Nam cao như vậy nhưng thực tế phương thức sản xuất hoa lan Hồ Điệp ở miền Bắc Việt Nam chủ yếu vẫn là hình thức nhập cây con, cây nhỡ và cây đã có cành hoa về chờ hoa nở để tiêu thụ Như vậy việc sản xuất giống ở Việt Nam còn rất hạn chế, không chủ động nguồn giống trong sản xuất cả về số lượng cũng như chủng loại Lan hồ điệp là cây đơn thân, việc nhân giống trong tự nhiên gặp nhiều khó khăn Để sản xuất lan Hồ điệp theo quy mô công nghiệp,

2

bắt buộc phải nhân giống bằng con đường vô tính thông qua nuôi cấy mô Trên thế giới đã có nhiều tác giả thành công trong nhân giống vô tính lan Hồ điệp Trước đây, các nghiên cứu thường tập trung vào lai tạo giống mới, số lượng và kích thước hoa, và đã có trên 100.000 giống lai được sản xuất công nghiệp

trong đó bao gồm lan Hồ điệp mãn thiên hồng (Doritaenopsip Queen Beer “ Red Sky” là giống lai giữa Doritis pulcherrima và Phalaenopsis Meteor [36]

Lan Hồ điệp mãn thiên hồng là loài được đánh giá cao nhất về cả sắc đẹp lẫn

thời gian chơi hoa Cây phong lan Mãn thiên hồng (Doritaenopsis sp.) là loài

có giá trị kinh tế cao cả ở trong nước lẫn nước ngoài [32] Tuy nhiên, các giống lan Hồ điệp lai thường khó nhân giống vô tính và không đồng nhất [37]

Các phương pháp in vitro một số loài thuộc chi này thường sử dụng mẫu

đỉnh chồi [31], cành hoa được cắt đốt [39], đầu rễ [41], mảnh lá [32], nuôi cấy lớp tế bào biểu bì [37], hoa [45] nhằm cung cấp lượng cây giống cho thị trường

Sử dụng mảnh lá có nguồn gốc từ tái sinh từ cành hoa sẽ không gây ảnh hưởng đến cây mẹ [38], [42]

Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu quy trình vi nhân

giống lan Hồ điệp mãn thiên hồng (Doritaenopsip)”

2 Mục đích nghiên cứu

Nhân nhanh lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ mảnh lá và đốt thân

bắt nguồn từ cành hoa

3 Nội dung nghiên cứu

- Tạo vật liệu khởi dầu lan Hồ điệp mãn thiên hồng

- Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ mô lá

- Nhân nhanh chồi lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ đốt thân

- Ra rễ tạo cây lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro hoàn chỉnh

- Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên

3

4 Ý nghĩa của đề tài

4.1 Ý nghĩa lí luận

Nhằm góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu quy trình nhân

giống in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng

4

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về lan Hồ điệp

ra chồi nhánh nên không dùng phương pháp tách cây để nhân giống Thân lan

Hồ điệp ngoài tác dụng giữ cây thẳng đứng còn có chức năng tích trữ chất dinh dưỡng và nước

5

cho hoa màu đỏ Thông thường bề mặt trên của lá không có khí khổng, lan Hồ điệp là loài thực vật CAM, nên khí khổng thường mở ra vào ban đêm để thu nhận CO2 dự trữ trong cơ thể, vào ban ngày, CO2 được giải phóng để tham gia vào quá trình quang hợp Do đó ban ngày cây ít bị mất nước, thoát hơi nước Nếu gặp phải điều kiện khô hạn thì khí khổng sẽ đóng lại, quá trình quang hợp chỉ xảy ra vừa đủ cho lượng CO2 tạo ra trong quá trình hô hấp Đây chính là nguyên nhân làm cho lan Hồ điệp mặc dù không có giả hành nhưng lại có khả năng chịu hạn tốt

 Rễ

Rễ lan Hồ điệp không phân nhánh rễ chính, rễ phụ, rễ nhánh, rễ dạng hình tròn, to, mập, có lông hút rõ ràng Lan có rễ khí sinh phát triển mạnh, màu xanh có khả năng quang hợp Số lượng rễ khá nhiều, rễ to, bám chặt vào giá thể

có lớp mô xốp, dễ dàng cho việc hút nước, muối khoáng và chất dinh dưỡng

1.1.2.2 Cơ quan sinh sản

 Hoa

Cành hoa của lan Hồ điệp thường mọc ở nách lá trưởng thành thứ 3 hoặc thứ 4 [34] Cành hoa đơn hay phân nhánh, mang hoa ở hai bên, hoa đính vào trục nhờ cuống hoa Bao hoa dạng cánh, rời nhau, xếp thành hai vòng: ba mảnh vòng ngoài và hai mảnh vòng trong bé hơn, mảnh thứ ba có sắc khác hẳn gọi

là cánh môi Gốc cánh môi thường kéo dài ra, chứa tuyến mật Nhị và nhụy dính liền thành cột nhị nhụy Hạt phấn thường dính lại thành khối phấn, có chuôi và gót dính ở phía dưới Hai khối phấn ngăn cách nhau bởi trung đới Bộ nhụy gồm ba lá noãn dính nhau thành bầu dưới, mang nhiều noãn, đính bên(Hoàng Thị Sản, 2003)

Trong giai đoạn trổ hoa sự phát triển của cơ quan dinh dưỡng bị chậm lại nhưng nếu tưới nước và chất dinh dưỡng đầy đủ thì cây vẫn tăng trưởng tốt Những đoạn lóng mang mầm hoa thay kích thước chiều dài khác nhau, tùy thuộc vào giống và chế độ trồng trọt (Troll, 1974)

6

 Quả

Quả của lan Hồ điệp thuộc loại quả nang, mở bằng các khe nứt dọc theo hai bên đường của giá noãn Quả có nhiều hạt, hạt nhỏ li ti không chứa nội nhũ, phôi không phân hóa, tùy vào giống, loài hạt có thể từ vài trăm đến vài nghìn hạt Hạt cần trải qua 130-150 ngày để trưởng thành, hạt mở sau 90 ngày Hạt nhỏ được gió mang xa như hạt bụi, phần lớn hạt bị chết vì chứa phôi chưa phân hóa Người ta có thể đánh thức các “phôi sơ khai” (protocorm) khi sử dụng sốc thẩm thấu bằng cách nuôi cấy hạt trên môi trường sucroser [9]

1.1.3 Điều kiện sinh thái

Hồ điệp là một loại lan của vùng nhiệt đới mà sự tăng trưởng của chúng chịu hai mùa mưa, nắng rõ rệt Tuy nhiên Hồ điệp chỉ xuất hiện ở các vùng rừng ẩm hoặc ven suối Không có sự biến động rõ rệt về độ ẩm giữa mùa mưa

và mùa khô, nơi Hồ điệp sinh sống, vì thế cây lan Hồ điệp không có mùa nghỉ, mặc dù do dự bất lợi về thời tiết trong mùa khô Cây Hồ điệp có sự tăng trưởng chậm hơn chút ít so với mùa mưa trong điều kiện tự nhiên [5]

 Độ ẩm và ánh sáng

Độ ẩm tối thiểu cần thiết là 60%, với độ ẩm này nước ta đủ thoả mãn với điều kiện yêu cầu tốt nhất, vì đây là độ ẩm thấp nhất trong những ngày mùa khô

7

Giai đoạn sinh trưởng dinh dưỡng: ẩm độ 70 – 75%, ánh sáng 8000lux [8]

Giai đoạn nở hoa: ẩm độ 65 – 75%, ánh sáng 8000 – 12000lux [8]

1.2 Tình hình sản xuất lan Hồ điệp trên thế giới và trong nước

1.2.1 Tình hình sản xuất hoa trên thế giới

Hiện nay tình hình sản xuất hoa trên thế giới đang phát triển một cách mạnh mẽ và trở thành một ngành thương mại có lợi ích kinh tế các nước trồng

và xuất khẩu hoa Diện tích trồng hoa trên thế giới ngày được mở rộng và không ngừng tăng lên, nhiều tạp chí về hoa lan được xuất bản, nhiều cuộc hội thảo về lan được tổ chức Trước đây việc nuôi trồng và xuất khẩu chủ yếu là lan rừng nên nguy cơ khoảng 13 loài tuyệt chủng, ngày nay việc trồng lan đã đạt dần theo quy mô công nghiệp, việc xuất khẩu hoa lan đạt đến hàng trăm ngàn giỏ, hàng vạn cành lan trong một năm nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường

Việc sản xuất hoa lan ngày càng tăng với quy mô lớn, nhiều nước đã trở thành cường quốc xuất khẩu hoa lan như Thái Lan, Đài Loan Nhờ khả năng thực hiện công nghệ mới trong nuôi cấy mô và lai tạo, Thái Lan là nước đứng đầu thế giới về xuất khẩu hoa lan Năm 2012 tổng diện tích trồng 7420 mẫu với sản lượng xuất khẩu đạt 2403 kg/mẫu cho 148 nước thu về 17,8 triệu USD, trong đó thị trường xuất khẩu chính là Nhật Bản, Mỹ, Ý và Trung Quốc [33]

Đài Loan là Quốc gia có khí hậu ấm áp, mưa nhiều và gần giống với khí hậu Việt Nam nên có thể sản xuất hoa tươi quanh năm, Đài Loan đang tăng

nhanh sản xuất Phalanenosis và cho tạo nhiều giống mới, hiện nay đã tạo ra

được một số giống lan quý có khả năng cắt hoa và trồng trong chậu (Segrback, 1985) Hiện nay, Đài Loan có diện tích sản xuất lan Hồ Điệp khoảng 200 ha chiếm 1/3 tổng diện tích trồng lan Vùng sản xuất chính tập trung ở Đài Nam,

8

Gia Nghĩa, Vân Lâm và Đài Đông Sản lượng trung bình hàng năm đạt 150 triệu cây Theo số liệu số liệu thống kê của uỷ ban nông nghiệp và tổng cục thuế - Bộ tài chính Đài Loan cho thấy, kim ngạch xuất khẩu mặt hàng hoa năm

2010 đạt 149 triệu USD, trong đó lan Hồ Điệp chiếm 55% tổng kim ngạch ngành hoa tương đương 82,55 triệu USD tăng 32% so với 2009 (62,68 triệu USD) Các dạng sản phẩm xuất khẩu là cây giống đã ra ngôi, cây con nuôi cấy

mô chưa ra ngôi và hoa cắt cành Cây giống thương phẩm có giá trị xuất khẩu cao nhất, năm 2010 ước đạt 80% tổng kim ngạch xuất khẩu (Lê Đặng Trung Tuyến, 2007)

Malaysia là Quốc gia có được sự quan tâm của chính phủ và sự phát triển nhanh chóng của nghề trồng hoa, đến nay đã có đủ khả năng cạnh tranh với thế giới và chiếm phần đáng kể ở Châu Á, công nghiệp lan cắt cành tăng khoảng 7 triệu USD năm 1998 và 20 triệu USD năm 1994, thị trường xuất khẩu chủ yếu

là Singapore, Nhật, Úc…[10]

Hà Lan là nước đã đầu tư 20 triệu USD vào Ấn Độ để lắp đặt các thiết bị máy móc đầu tư cho sản xuất hoa lan xuất khẩu Tính đến năm 2003, kim ngạch xuất khẩu hoa phong lan của Hà Lan đạt 1,8 tỷ USD Hoa phong lan của Hà Lan được trồng trong nhà kính với tổng diện tích là 3081,75ha

Nhật Bản là Quốc gia đã đầu tư 6,6 triệu USD cho Thái Lan để mở rộng

cơ sở sản xuất với công suất 10 triệu cây lan mỗi năm và hiện nay Nhật cũng

là khách hàng lớn nhất của Singapore với khả năng tiêu thụ 60% số cây lan của nước này [2]

1.2.2 Tình hình sản xuất hoa lan trong nước

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm rất thuận lợi cho việc trồng hoa, cây cảnh Tuy nhiên chưa được đầu tư thích đáng nên ngành trồng hoa nói chung và ngành trồng lan nói riêng vẫn chưa thực sự phát triển, sản xuất lan ở Việt Nam mới chỉ phát triển mạnh mẽ ở

9

các tỉnh phía Nam, đặc biệt là Đà Lạt và Thành phố Hồ Chí Minh Thành phố

Hồ Chí Minh có khí hậu ấm áp quanh năm là trung tâm văn hóa kinh tế, chính trị, khoa học kỹ thuật của miền Nam có một tiềm năng lớn về nuôi trồng và kinh doanh hoa lan Từ năm 1980 Việt Nam đã xuất khẩu lan sang Liên Xô, Tiệp Khắc Hội Hoa Xuân là nơi hội tụ những tác phẩm đặc sắc và độc đáo nhất của các vườn lan Mới đây thành phố Hồ Chí Minh dự kiến, giai đoạn 2005 –

2006 thực hiện đầu tư 20ha nuôi trồng hoa lan và 20ha trồng cây cảnh (Dự án đầu tư, cây và cá cảnh tại thành phố Hồ Chí Minh, T7/2005), đặc biệt là phải

kể đến trang trại Risun tại Gia Hiệp – Di Linh – Lâm Đồng đã đầu tư trang thiết

bị hiện đại có thể tự tạo ra nguồn cây giống để sản xuất, sản phẩm đặc biệt ở đây là lan Hồ Điệp với 16 – 17 màu khác nhau Ở Hà Nội, mười năm gần đây, khi đời sống người dân thủ đô nâng cao, nhu cầu thưởng thức hoa lan tăng, nhiều khi cung không đủ cầu và phong trào nuôi trồng lan tự phát lan rộng cả đến các vùng phụ cận khiến các nhà khoa học phải vào cuộc, đi sâu nghiên cứu

và sản xuất, kinh doanh hoa lan Tại Viện Sinh học Nông nghiệp thuộc Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã cho ra đời hàng vạn cây giống hoa lan có giá trị kinh tế như: Hồ Điệp (Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), lan Thái (Dendrobium)… Ngoài ra viện còn làm cố vấn kỹ thuật, chuyển giao quy trình nuôi trồng một số giống lan có hiệu qủa kinh tế ở các tỉnh như Hải Phòng, Bắc Giang, Lạng Sơn… và tại Trung tâm Kỹ thuật Rau – Hoa – Quả Hà Nội, 2 năm trở lại đây, phòng nuôi cấy mô hoạt động cho ra đời mỗi năm hàng vạn cây lan

Hồ điệp giống và hàng vạn cây giống khác, đặc biệt đã thành công trong việc nhân giống (Lê Đặng Trung Tuyến, 2007)

Ngành sản xuất hoa lan ở các tỉnh, thành phố phía Nam phát triển mạnh hơn miền Bắc Nói chung vấn đề sản xuất – kinh doanh – xuất khẩu hoa lan ở Việt Nam từ trước đến nay vẫn còn ở mức tiềm tàng, trong khi đó sức cạnh tranh thị trường trên thế giới là rất lớn, những hoạt động, kinh doanh và xuất

10

khẩu trong thời gian qua chỉ có ý nghĩa khởi động và hứa hẹn sự phát triển trong tương lai

1.3 Tình hình nghiên cứu lan Hồ điệp trên thế giới và trong nước

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nhân giống Mãn thiên hồng bằng cách tạo cây con trên cành hoa Chồi của Mãn thiên hồng được tạo ra ngay trên cành hoa có mang mầm ngủ bằng cách bao quanh đốt một lớp rêu nước để giữ ẩm (Shara, 1938, 1952) Trong những năm gần đây, chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng để cảm ứng tạo

cây con trên cành hoa trong in vitro

Cành hoa có mang mầm ngủ của cây Mãn thiên hồng được cắt thành từng đoạn được khử trùng và đặt trên môi trường nuôi cấy Kết quả ghi nhận được từ nuôi cấy đoạn cành hoa có mang mầm ngủ của nhiều tác giả cho thấy

từ các mầm ngủ của đoạn cành hoa sẽ phát triển tạo cây con trực tiếp [25], [39] Khi dùng phương pháp này không phá hủy và gây nguy hiểm đến cây mẹ, phương pháp này bị giới hạn chỉ có giá trị cho nhân giống tạo chồi từ cành hoa nên hệ số nhân giống không [25]

Năm 1993, Tokuhara và Mii kết luận rằng BAP kết hợp NAA cùng muối khoáng đa lượng và vi lượng ảnh hưởng đến quá trình vi nhân giống lan Hồ điệp Tuy nhiên, tác giả Tse và cộng sự, (1971) [44] cho rằng NAA hiện diện trong môi trường nuôi cấy làm giảm sự hình thành chồi IAA, KNA (auxin – potassium α naphtaleneacetate) và 2,4D làm tăng chiều dài của chồi sơ cấp nhưng lại ức chế các giai đoạn sau đó (Koch, 1974) Để kích thích tăng lượng

số chồi thì các mầm ngủ trên các đoạn của cành hoa được cảm ứng khi nuôi cấy trên môi trường REM có bổ sung 25mg/l BA

Park et al (2003) đã nghiên cứu về sự hình thành chồi bất định từ rễ lan

Hồ điệp Rễ được cảm ứng khi chuyển chúng sang môi trường không chứa chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhưng có chứa 10% dịch chiết chuối [25]

11

Nhân giống lan Mãn thiên hồng thông qua việc tạo mô sẹo Protocorm các mảnh lá của chồi được tạo thành từ cành hoa [37], [44] Một vài chồi hoa lan Mãn thiên hồng không tăng trưởng tiếp tục mà được cảm ứng để tạo thành

mô sẹo [30], [44] Mỗi đoạn mang chồi trước khi đặt vào môi trường Knudson

C hay môi trường Mureshige – Skoog có hoặc không bổ sung 2,0 mg/l NAA, phải gây viết thương bằng cách cắt theo hướng chéo và song song với trục thân hoặc đâm vào đỉnh chồi mầm ngủ bằng dao cấy vô trùng Kết quả mô sẹo được

hình thành [25] Takana (1976), nuôi cấy chóp rễ từ cây gieo hạt in vitro và thu

nhận được dạng mô sẹo màu vàng, các mô sẹo tếp tục phát triển thành PLB và

tái sinh tạo cây con Sakawa (1990), đã tạo được mô sẹo Phalaenopsis và đề

nghị quy trình nhân giống Kim và cộng sự (1994) đã thu được dạng mô sẹo tơi

xốp có màu vàng sáng khi nuôi cấy lát cắt mỏng của cành hoa Phalaenopsis,

các mô sẹo này tiếp tục phát triển PLB và tái sinh thành cây con

Ngoài ra còn các công trình nghiên cứu khác: Sử dụng mẫu đỉnh chồi (Intuwong và Sagawa, 1974); nuôi cấy lớp tế bào biểu bì (Park, 2002), dùng môi trường MS lỏng bổ sung IAA – ala và BAP để tạo ra số lượng lớn PLB từ chồi con có hai lá được phát triển từ mầm ngủ Kết quả PLB được phát triển từ phần gốc lá [25]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Cytokinin được trộn với chất mang và xử lí trực tiếp lên cành hoa (Võ

Thị Bạch Mai, 1996) Năm 2011, Nguyễn Thị Nga cùng các cộng sự nghiên cứu nuôi cấy mầm ngủ cành hoa lan Hồ điệp (Phalanenosis), cành hoa sau khi

khử trùng được cắt thành mẫu cấy là những đoạn dài 1-1,5 cm có mang mầm ngủ; mẫu cấy được nuôi trên môi trường tạo chồi và rễ Kết quả, các vị trí khác nhau của mầm ngủ trên cành hoa ảnh hưởng khả năng tạo chồi và sau 2 giai đoạn tạo chồi và ra rễ hình thành cây hoàn chỉnh

12

Bước đầu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong giống

lan Hồ Điệp lai – Phalaenopsis hybrid (Cung Hoàng Phi Phượng, Nguyễn Văn

Hiếu, Nguyễn Quốc Thiện, Dương Hoa Xô, 2007) kết quả cho thấy trong giai đoạn nhân chồi ở hệ thống TIS cao gấp 3,6 lần so với nuôi cấy trên thạch, từ đó giúp gia tăng tỉ lệ cây con lên đếm 10,3 lần so với phương pháp truyền thống [6]

Nguyễn Thị Sơn và cộng sự (2014) đã nghiên cứu thăm dò khả năng phát sinh hình thái soma từ các vật liệu khác nhau của lan Hồ điệp hoa trắng nhị vàng Kết quả cho thấy các mảnh lá và đầu rễ in vitro có khả năng hình thành protocorm

Ngoài ra còn nghiên cứu của các tác giả khác như: Tạo phôi từ vài cơ

quan Phalanenopsis trong nuôi cấy in vitro (Lê Văn Hướng, 2005)

13

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ 10/2014 – 11/2015, tại phòng Sinh lí Thực vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Cân kĩ thuật: GM612 (Đức), tủ lạnh sâu: FRIGO, máy đo pH:

HM30G/TOA (Đức), nồi hấp khử trùng: HV – 110/HIRAYAMA (Nhật), máy cất nước hai lần (Trung Quốc), buồng cấy vô trùng: AV-100/TELSTAR, micropipet Jinson các loại 200-1000µl (Pháp), máy khấy từ ra nhiệt

ARE/VELP (Italia)

Dụng cụ: các loại bình tam giác, cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50ml, 15ml ), nút bông, giấy báo, giấy thấm, giấy bạc, túi nilon, dao, khay cấy, panh, kéo

2.2.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường sử dụng nuôi cấy là MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962) Chất điều hòa sinh trưởng: BAP, NAA do hãng Duchefa của Hà Lan cung cấp

2.2.3 Điều kiện nuôi cấy in vitro

Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo

- Ánh sáng: các mẫu đều được nuôi cấy với cường độ chiếu sáng 8000lux

5000 Quang kì: 16 giờ/ngày

14

- Nhiệt độ phòng: 250C – 270C

- Độ ẩm trung bình: 70% - 74%

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu

Chọn cành hoa có chồi ngủ, cắt thành các đoạn (2-3 cm) chứa mắt ngủ Rửa sạch dưới vòi nước, khử trùng bề mặt của mẫu cấy bằng etanol 70% và dung dịch javel (5%, 7%, 10%, 15%) trong thời gian (5 phút và 7 phút ), cuối cùng rửa lại bằng nước cất khử trùng 2-3 lần Mẫu được nuôi cấy trên môi trường ½ MS (Murashige và Skoog, 1962), sacarozơ 30g/l và agar 6 g/l Theo dõi tỷ lệ mẫu sạch-sống sau 7 ngày nuôi cấy

Bảng 2.1 Công thức khử trùng bề mặt các đoạn của cành

hoa lan Hồ điệp mãn thiên hồng

Công thức Chất xử lí/thời gian