Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc Berberin của màng Bacterial cellulose lên men từ nước dừa già định hướng sử dụng qua đường uống

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH-KTNN ĐẶNG THỊ NGA NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE LÊN MEN TỪ NƯỚC DỪA GIÀ ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG QU

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH-KTNN

ĐẶNG THỊ NGA

NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE LÊN MEN TỪ NƯỚC DỪA GIÀ ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG QUA ĐƯỜNG UỐNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

TS Nguyễn Xuân Thành

HÀ NỘI, 2016

LỜI CẢM ƠN

Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Xuân Thành, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Đặc biệt là sự giúp đỡ, động viên của gia đình, bạn bè tôi trong suốt thời gian làm khóa luận

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách tôt nhất Tuy nhiên do buổi đầu làm quen với công việc nghiên cứu khoa học cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy, cô giáo để khóa luận hoàn chỉnh hơn

Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Đặng Thị Nga

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin khẳng định những gì viết trong khóa luận “Nghiên cứu sự vận

tải và phân phối thuốc Berberin của màng Bacterial cellulose lên men từ nước dừa già định hướng sử dụng qua đường uống” là kết qủa nghiên cứu

của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS Nguyễn Xuân Thành,

giảng viên khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Tất cả những số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, không trùng với bất cứ tài liệu nào

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Đặng Thị Nga

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC BẢNG, HÌNH, SƠ ĐỒ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiến 3

5 Nội dung nghiên cứu 3

6 Phương pháp nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu 5

1.1.1 Tổng quan về màng BC 5

1.1.1.1 Vi khuẩn sản sinh BC 5

1.1.1.2 Cấu trúc màng BC 7

1.1.1.3 Đặc tính của màng BC 8

1.1.1.4 Chức năng sinh lý của BC 8

1.1.2 Thuốc Berberin 9

1.1.2.1 Tên thuốc 9

1.1.2.2 Tính chất 9

1.1.2.3 Tác dụng của thuốc 9

1.1.2.4 Chỉ định và chống chỉ định 10

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 10

1.2.1 Tình hình nghiên cứu về màng BC 10

1.2.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 10

1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 11

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về BH 11

1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 11

1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 12

1.2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về hường nghiên cứu 12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Vật liệu nghiên cứu 14

2.1.1 Giống vi khuẩn 14

2.1.2 Nguyên liệu - hóa chất 14

2.2 Thiết bị - dụng cụ 14

2.2.1 Thiết bị 14

2.2.2 Dụng cụ 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Phương pháp tạo màng BC 15

2.3.2 Phương pháp dựng đường chuẩn 16

2.3.3 Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng BC 18

2.3.4 Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng từ màng BC 19

2.3.5 Phương pháp phân tích dược động học giải phóng của BH 20

2.3.6 Phương pháp xử lí thống kê 21

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1.Tạo màng BC của A xylinum trong môi trường nước dừa già 22

3.2 Thu màng BC thô từ môi trường 22

3.3 Tinh chế màng BC 23

3.4 Màng BC hấp thụ thuốc 24

3.5 Xác định lượng thuốc BH giải phóng khỏi màng BC 26

3.6 Dược động học giải phóng thuốc của màng BC 31

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần của nước dừa già 7

Bảng 2.1 Môi trường lên men tạo màng BC 15

Bảng 2.2 Nồng độ BH và giá trị OD (n = 3) 17

Bảng 2.3 Dung dịch đệm đa năng Britton và Robinson 19

Bảng 3.1 Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng BC (n = 3) 25

Bảng 3.2 Khối lượng BH được hấp thụ, tỉ lệ hấp thụ và cường độ hấp thụ BH của màng BC (n = 3) 26

Bảng 3.3 Mật độ quang phổ màng BC đang giải phóng thuốc tại các thời điểm lấy mẫu (n = 3) 27

Bảng 3.4 Tỉ lệ thuốc BH được giải phóng tại các thời điểm lấy mẫu 29

Bảng 3.5 Hệ số tương quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau (n = 3) 32

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Công thức cấu tạo của BH 9

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn BH ở bước sóng 345 nm 17

Hình 3.1 Màng BC khi nuôi cấy tĩnh ngày thứ 4 22

Hình 3.2 Màng BC với thời gian nuôi cấy khác nhau 23

Hình 3.3 Màng BC tinh chế 24

Hình 3.4 Màng BC đang hấp thụ thuốc 24

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn OD giải phóng thuốc BH của màng BC 28

Hình 3.6 Đường cong biểu diễn tỉ lệ giải phóng BH của màng BC 30

Sơ đồ 2.1 Quy trình nuôi cấy thu nhận BC 16

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BH Berberine hydrochloride Berberin hydroclorid

E coli Escherichia coli Vi khuẩn đại tràng

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Berberine hydrochloride (BH) là hoạt chất có nguồn gốc thực vật, dễ kiếm, rẻ tiền, an toàn, là thuốc có hoạt tính kháng sinh chống viêm [1] Tác dụng lâm sàng phổ biến nhất của BH là chống tiêu chảy do vi khuẩn, ký sinh trùng đường ruột [1, 19] Ngoài ra, thuốc còn có tác dụng chống lại tác hại của vi khuẩn tả và E coli ngoại độc tố bền với nhiệt Khi điều trị các bệnh nhiễm trùng đường ruột, BH không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có lợi của ống tiêu hóa Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với BH sẽ hạn chế được tác dụng không mong muốn gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột

Tuy nhiên thuốc lại có nhược điểm là khó tan trong nước làm giảm sự hấp thụ thuốc bằng đường uống, sinh khả dụng của thuốc thấp nên đã làm giảm tác dụng thuốc trong điều trị bệnh [17, 19]

Uống là một trong những đường ưa thích nhất và truyền thống để phân phối thuốc So với đường tiêm, đường uống có lợi thế hơn là độ an toàn cao, đơn giản, tiện lợi và dễ tuân thủ hơn, hiệu quả sử dụng thuốc cao hơn, làm giảm chi phí và cho phép linh hoạt hơn trong kiểm soát liều lượng thuốc [19] Trong những năm gần đây các nhà nghiên cứu đã có sự chú ý đặc biệt tới việc sử dụng các vật liệu sinh học trong chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái tạo, tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng Một trong những vật liệu sinh học được chú ý đến là cellulose Vật liệu này vượt trội so với các polymer tự nhiên và tổng hợp khác [16] Tuy nhiên, hình thái, đặc tính và các lĩnh vực ứng dụng cụ thể phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc, tức là quá trình xây dựng các loại cellulose

Bacterial Cellulose (BC) là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, đặc biệt

là chủng A xylinum BC có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose thực

vật (PC) [7, 9] BC khác với PC ở chỗ không chứa các hợp chất cao phân tử như lignin, hemicellulose, pectin và sáp nến do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bề chắc, độ đàn hồi cao, có khả năng hút nước cao ở trạng thái ẩm và độ tinh khiết cao, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ bình thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt và đặc biệt là khả năng cản khuẩn [3, 6,

7, 9] Với các đặc tính vượt trội như vậy, màng BC được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: công nghệ thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ pin, dùng làm màng lọc vi khuẩn [9] Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét

da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các bệnh tim mạch, làm ống thông niệu quản (Wan và Millon 2005) [9], làm mặt nạ dưỡng da cho con người [6, 7, 9] Ngoài ra, màng BC còn có tác dụng giữ thuốc và kéo dài thời gian giải phóng thuốc [10] Bên cạnh đó, các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trường acid

Các nghiên cứu cho thấy màng BC được tạo ra từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp Môi trường nuôi cấy

vi khuẩn A xylinum rất đa dạng như nước dừa già, rỉ đường, nước mía, … Trong đó nước dừa già được coi là môi trường kinh điển trong nuôi cấy A xylinum [9]

Với mục đích khảo sát khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc BH qua màng BC định hướng sử dụng qua đường uống, đồng thời giúp thuốc BH giải phóng kéo dài điều này có thể giúp tăng sinh khả dụng của thuốc, chúng tôi

đã chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc

Berberin của màng Bacterial cellulose lên men từ nước dừa già định hướng sử dụng qua đường uống”

2 Mục đích nghiên cứu

Thiết kế chế tạo hệ thống vận tải và phân phối thuốc BH nhằm tạo ra hệ thống kéo dài thời gian giải phóng thuốc, điều này có thể giúp tăng lượng thuốc hấp thụ vào cơ thể, phát huy được tối đa hiệu quả của thuốc trong điều trị bệnh đường ruột

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Hệ thống vận tải và phân phối thuốc BH dựa trên màng BC qua đường uống

Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu invitro

Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiến

Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu này giúp tăng thêm hiểu biết về ứng

dụng của màng BC Mở ra những hướng nghiên cứu mới về khả năng vận chuyển và phân phối thuốc của màng BC trên nhiều các loại thuốc khác nhau nhằm kéo dài thời gian giải phóng và tăng sinh khả dụng của các loại thuốc

đó

Ý nghĩa thực tiễn: Xây dựng được quy trình tạo màng BC từ chủng A

xylinum; Từ màng BC đã được tạo ra được dùng làm hệ thống vận tải phân

phối thuốc BH

5 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu quy trình nuôi cấy A xylinum từ các nguyên liệu sẵn có

Thu sản phẩm BC từ dịch nuôi cấy

Chế tạo màng BC dùng để hấp thụ thuốc

Thử nghiệm tác dụng hấp thụ và giải phóng BH của BC

6 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nuôi cấy và thu màng BC từ chủng A xylinum

Phương pháp dựng đường chuẩn

Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng BC Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng khỏi màng BC Phương pháp phân tích dược động học giải phóng của BH Phương pháp xử lí thống kê

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu

1.1.1 Tổng quan về màng BC

1.1.1.1 Vi khuẩn sản sinh BC

BC là sản phẩm của một số loại vi khuẩn, đặc biệt là chủng A xylinum

A xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất

cellulose ngoại bào [9]

Theo khóa phân loại của Bergey, A xylinum thuộc [9]:

Lớp: Schizomycetes Bộ: Pseudomonadales

Bộ phụ: Pseudomonadieae Họ: Pseudomonadaceae

A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang

khoảng 0,6 - 0,8 µm, dài khoảng 2 - 3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram

âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [9]

Trong môi trường nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3 - 7 ngày nuôi cấy, sẽ thu được khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đường kính hạt từ 2 - 5 mm, tròn, nhày, rìa mép trơn, có màu kem, hơi trong Nhưng sau một tuần khuẩn lạc to, đục, có màu cafe sữa rồi khô dần [15]

A xylinum là loài vi khuẩn hiếu khí Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát

triển từ 25 - 30oC Ở nhiệt độ 37oC tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn Nhiệt độ thích hợp nhất là 25o

C Vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3 - 8, pH tối

ưu để sản xuất cellulose là 5,5 [15]

A xylinum sử dụng cacbon từ nhiều loại đường khác nhau, tùy thuộc vào

chủng mà lượng đường có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và cho hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose [8, 9]

A xylinum có thể tích tụ acid acetic trong môi trường nuôi cấy Các tế

bào vi khuẩn kháng lại được sự thay đổi pH của môi trường Trong lúc nuôi cấy pH môi trường có thể giảm đi từ 1 - 2 đơn vị do sự tạo ra acid acetic, acid gluconic, do đó, người ta thường bổ sung acid acetic vào môi trường nuôi cấy

để tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ [15]

Vi khuẩn có khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, phản ứng catalase dương tính, không tạo sắc tố nâu, có khả năng tổng hợp cellulose, chuyển hóa glucoso thành acid acetic, chuyển glycerol thành dihydroxyaceton [9]

Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đường để chuyển hóa thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường Sau 36 - 48 giờ lớp màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7 - 10 ngày [15]

Môi trường nuôi cấy A xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn

dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [9]

A xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn cacbonhydrat Nguồn cacbonhydrat mà A xylinum sử dụng là glucose,

fructose, manitol, sorbitol, nếu sử dụng glcerol, galactose, lactose, sucrose cho hiệu suất thấp hơn, không nên sử dụng mantose, cellobiose, erythriol, acetate [15]

Nhu cầu sử dụng đường của A xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan

trọng trong quá trình tổng hợp BC nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ đường,

nước dừa già, nước mía, để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A xylinum

Trong đó nước dừa già được xem là môi trường kinh điển trong nuôi cấy A xylinum [8, 9, 15] Thành phần nước dừa già [15] được trình bày trong bảng

- diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol, Vì vậy A xylinum

rất phát triển trong môi trường này [9, 15]

Nước dừa sau khi thu hoạch được sử dụng không quá 3 ngày, tránh để lâu làm cho đường và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất kém [9]

1.1.1.2 Cấu trúc màng BC

BC được cấu tạo bởi những chuỗi polimer β - 1, 4 glucopyranose mạch

thẳng được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, chủ yếu là A xylinum Màng BC

do A xylinum tạo ra có cấu trúc hóa học đồng nhất với PC, tuy nhiên chúng

khác nhau về cấu trúc đại thể [7, 9]

Theo AJ Brown (1886) [12], BC bao gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất

là hemicellulose, đường kính 1,5 nm, kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng khoảng 3 - 8 nm

1.1.1.3 Đặc tính của màng BC

Trong nuôi cấy tĩnh, BC tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01 - 0,5 nm Sản phẩm này có những tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh

và độ bền cơ học cao, khả năng thấm hút nước cao, độ polymer hóa lớn, đường kính sợi nhỏ, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, có thể bị phân hủy bởi enzym, không chứa các hợp chất cao phân tử như lignin, hemicellulose, pectin và sáp nến, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt

là khả năng cản khuẩn [7, 8, 9]

Với các tính chất này BC được ứng dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học BC đã dược sử dụng thành công để băng vết thương và cho cấy ghép tim mạch [13] Ở Brazil, màng BC ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thị trường như một loại da nhân tạo dùng đắp vết thương [9]

1.1.1.4 Chức năng sinh lý của BC

A xylinum là vi khuẩn tổng hợp polysaccharid ngoại bào, những tế bào

vi khuẩn này nằm trong mạng lưới polymer giúp tế bào bám chặt vào bề mặt môi trường và thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với tế bào vi khuẩn không nằm trong mạng lưới polymer [9]

BC có các đặc tính như độ bền cơ học cao, tính thấm và tính hút cao,

trạng thái kết tinh giúp A xylinum kháng lại sự thay đổi của môi trường như

việc thay đổi xuống 1 hay 2 đơn vị pH trong thời gian nuôi cấy hay do lượng nước bị giảm đi, các chất chuyển hóa được sinh ra [9]

1.1.2 Thuốc Berberin

1.1.2.1 Tên thuốc

Tên quốc tế: Berberine hydrochloride Công thức hóa học: C20H18NO4Cl.2H2O Khối lượng phân tử: 371,82 [17]

Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của BH

Tên khoa học: 5,6 - dihydro - 8,9 - dimethoxyl - 1,3 - dioxa - 6a - azoniaindeno (5,6 - a) anthracen clorid dihydrat

Tác dụng lâm sàng phổ biến nhất của BH là chống tiêu chảy do vi khuẩn,

ký sinh trùng đường ruột [1, 17] Ngoài ra, BH với liều nhỏ có tác dụng kích

thích tim, làm giãn mạch vành, với liều lớn gây ức chế hô hấp làm tê liệt trung khu hô hấp trong khi tim vẫn đập BH còn có tác dụng hạ nhiệt, gây tê, lợi mật, kháng lợi niệu, an thần, hạ huyết áp Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh BH có tác dụng chống bệnh tiểu đường, chống viêm, bảo vệ tim mạch, bảo vệ thần kinh [19] Khi điều trị các bệnh nhiễm trùng đường ruột,

BH không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có lợi của ống tiêu hóa Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với BH sẽ hạn chế được tác dụng không mong muốn gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với

hệ vi sinh vật đường ruột

1.2.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Từ năm 2000, Bộ môn Vi Sinh - Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành

phố Hồ Chí Minh đã bước đầu nghiên cứu dùng màng BC từ A xylinum phối

hợp với hoạt chất tái sinh mô của dầu mù u điều trị vết bỏng thực nghiệm cho kết quả tốt [9]

Nguyễn Văn Thanh và cs (2006) [9] đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và

thu màng BC từ A xylium đạt hiệu cao Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng dụng màng BC điều trị bỏng

với 2 loại màng BC gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn Kết quả cho thấy màng BC có cho thêm hoạt chất tái sinh mô từ dầu

mù u làm gia tăng hiệu quả trị bỏng là ưu điểm mà các loại màng khác trên thế giới không có

Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh [7] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn

Acetobacter xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, kết quả cho thấy màng BC tạo bởi A xylinum BNH2 tổng hợ có sợi

cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao; độ hút nước tốt có triển vọng ứng dụng làm màng trị bỏng

1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A xylinum và những ứng dụng

của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới Tác giả Brown (1989), dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào Brown (1989), Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm [9]

Czaja và cs (2006) sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí

bản quyền về làm màng BC từ A xylinum dùng trị bỏng Các tác giả Jonas và

Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [9]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về BH

1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Vũ Bình Dương, Nguyễn Trọng Diệp, Nguyễn Thị Thùy, Hoàng Văn Lương [1] (2010), Nghiên cứu bào chế viên nén Berberin giải phóng tại đích đại tràng, kết quả đã nghiên cứu bào chế viên nén Bereberin clorid 100 mg

giải phóng tại đích đại tràng theo cơ chế phân hủy bởi hệ vi sinh vật đại tràng Hồ Cảnh Hậu, Hoàng Văn Thêm, Nguyễn Thị Lan Hương, Nguyễn Văn Thuận, Nguyễn Cẩm Vân, Nguyến Tuấn Quang [2] (2015), Nghiên cứu định lượng Berberin chlorid trong viên nén đại tràng 105 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2009, Jun Yin, Huili Xing, Jianping Ye [14] đã nghiên cứu đề tài

“Hiệu quả của Berberin ở bệnh nhân tiểu đường typ 2”, đề tài cho thấy Berberin là một tác nhân hạ đường huyết mạnh, ít có tác dụng chuyển hóa lipid Có thể coi Berberin như là một ứng cử viên thuốc mới trong điều trị bệnh tiểu đường loại 2 Năm 2004, Yin Jun, Chen Ming - Dao, Tang Jin - Feng [21] đã nghiên cứu đề tài “Ảnh hưởng của Berberin đến quá trình chuyển hóa glucose và lipid ở động vật”, kết quả cho thấy Berberin giúp hạ

đường huyết ở chuột có lượng chất béo cao

Năm 2012, Jun Yin, Jianping Ye, Weiping Jia [13] đã công bố công trình nghiên cứu “Tác dụng và cơ chế của Berberin trong điều trị bệnh tiểu đường”, kết quả cho thấy Berberin tăng cường sự hấp thu glucose thông qua cảm ứng của quá trình đường phân, ức chế quá trình hô hấp hiếu khí

1.2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về hường nghiên cứu

Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng BC trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo [10], trong đó có 9 nghiên cứu với màng BC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng BC và 7 với các vật liệu nanocomposite Như vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp tục được tiến hành nghiên cứu

Amin và cs [11] (2012) đã báo cáo việc sử dụng màng BC làm màng phân phối thuốc bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ Kết quả cho thấy màng

BC có thể làm thành một màng phim dẻo, trong suốt để phân phối thuốc, giúp

cho thuốc được giải phóng một cách kéo dài làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc Gần đây hơn, Lin Huang và cộng sự [17] (2013) nghiên cứu việc sử

dụng màng BC cho việc kiểm soát in vitro của Berberin Ngoài thẩm thấu qua

da, thí nghiệm kiểm soát sự giải phóng thuốc qua màng BC còn được thử nghiệm mô phỏng trong dạ dày, ruột Các kết quả thu được cho thấy rằng thuốc đã được giải phóng với một tốc độ chậm

Amineda.I.F và cs [10] (2014) đã nghiên cứu việc sử dụng màng BC làm

hệ thống phân phối thuốc thử nghiệm in vitro trên da, kết quả nghiên cứu cho thấy BC có thể sử dụng làm hệ thống phân phối thuốc qua da, tuy nhiên vẫn cần kiểm tra sự tương thích với da trong điều kiện bình thường Viêc bổ sung glycerol vào màng BC giúp màng linh động hơn, giúp giữ ẩm cho da

Ở Việt Nam việc ứng dụng màng BC làm hệ thống phân phối thuốc vẫn còn là hướng đi mới, cần được nghiên cứu thêm

Hiện chưa có công trình nào công bố về việc sử dụng BC từ dừa già làm

hệ thống phân phối BH qua đường uống

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Giống vi khuẩn

Giống vi khuẩn A xylinum thuần chủng được cung cấp bởi phòng thí

nghiệm vi sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.1.2 Nguyên liệu - hóa chất

Nguyên liệu: Nước dừa già

Hóa chất: BH dạng tinh khiết (98%)

Pepton, đường glucose

(NH4)2SO4, KH2PO4

Acid boric, NaOH, HCl

Nước cất, cồn 960 CH3COOH, H3PO4

Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức)

Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh)

Bể rung siêu âm S60/H

Bể ổn nhiệt 1013

Tủ sấy, máy ép màng

2.2.2 Dụng cụ

Hộp nhựa để lên men tạo màng BC, cốc đong 500 ml, 1000 ml, pipet, bình định mức, bình tam giác, bình xịt cồn, kéo, giấy bạc, giấy thấm, giấy quỳ tím và một số dụng cụ khác

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tạo màng BC

Tạo màng BC từ môi trường chuẩn Hestrin - Schramm [19] có cải tiến bằng cách thay cao nấm men bằng nước dừa già được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Môi trường lên men tạo màng BC

C thu được sản phẩm màng BC thô [7]

Sau khi nuôi cấy tĩnh từ 6 - 14 ngày ở 26oC màng BC được tách ra rửa sạch bằng nước cất sau đó tinh chế theo quy trình ở sơ đồ 1 [9]

Sơ đồ 2.1 Quy trình nuôi cấy thu nhận BC

Tách BC: Trong môi trường nuôi cấy tĩnh BC tạo thành màng dày ở mặt môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường

Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm màng trong NaOH 3% trong 48 giờ để pha vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc

tố của vi khuẩn [9]

Ngâm HCl: Màng sau khi được ngâm NaOH rửa nước rồi ép màng Sau

đó ngâm với HCl 3% trong khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH [9]

Ngâm nước: Màng sau khi ngâm HCl rửa nước rồi ép màng Ngâm nước đến trung hòa hết acid HCl thời gian khoảng 48 giờ thu được BC tinh chế [9]

BC tinh chế được sấy trong tủ sấy ở 90oC, áp suất thường đến khối lượng không đổi, ta được khối lượng BC tạo thành [9]

2.3.2 Phương pháp dựng đường chuẩn

Nguyên tắc: Dựa vào mẫu dung dịch chuẩn (7 mẫu):

BC tinh chế

Ngâm trong NaOH 3%

48 giờ, rửa và ép

Ngâm trong nước

48 giờ, kiểm tra tạp chất

Ngâm trong HCl 3%

48 giờ, rửa và ép

Ép loại nước Tách màng BC thô

Để kết quả đo có độ chính xác cao tiến hành pha dung dịch chuẩn 3 lần

và đo quang phổ 3 lần lấy giá trị trung bình để dựng đường chuẩn

Kết quả trung bình quang phổ của BH ở bước sóng 345 nm được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Nồng độ BH và giá trị OD (n = 3) Nồng độ

0,851 ± 0,071

1,15 ± 0,0235

1,633 ± 0,0573

2,173 ± 0,0515

2,713 ± 0,0382

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn BH ở bước sóng 345 nm

y = 0,5276x + 0,0674 R² = 0,9997

0 0,5

1 1,5

2 2,5

3

OD345nm

OD345nm Linear (OD345nm)