Nghiên cứu hệ thống vận tải và phân phối thuốc 3 Curcumin của Bacterial cellulose lên men từ nước vo gạo định hướng sử dụng qua đường uống

Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hà TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN --- NGUYỄN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI THUỐC CURCUMIN CỦA BACTERIAL CELLULOSE LÊ

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Ngọc Hoàn, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu thực hiện và hoàn thành khóa luận

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo tại Trung tâm Hỗ trợ NCKH và CGCN Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2 Đặc biệt là gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian tôi thực hiện khóa luận này

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách tôt nhất Tuy nhiên do buổi đầu làm quen với công việc nghiên cứu khoa học cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy, cô giáo để khóa luận hoàn chỉnh hơn

Hà Nội, ngày 4 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Hà

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN -

NGUYỄN THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI THUỐC CURCUMIN CỦA BACTERIAL CELLULOSE LÊN MEN TỪ NƯỚC VO GẠO ĐỊNH HƯỚNG

SỬ DỤNG QUA ĐƯỜNG UỐNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN -

NGUYỄN THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI THUỐC CURCUMIN CỦA BACTERIAL CELLULOSE LÊN MEN TỪ NƯỚC VO GẠO ĐỊNH HƯỚNG

SỬ DỤNG QUA ĐƯỜNG UỐNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

TS LÊ NGỌC HOÀN

HÀ NỘI, 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN -

NGUYỄN THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI THUỐC CURCUMIN CỦA BACTERIAL CELLULOSE LÊN MEN TỪ NƯỚC VO GẠO ĐỊNH HƯỚNG

SỬ DỤNG QUA ĐƯỜNG UỐNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

TS LÊ NGỌC HOÀN

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Ngọc Hoàn, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu thực hiện và hoàn thành khóa luận

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô tại Trung tâm Hỗ trợ NCKH

và CGCN Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2 Đặc biệt là gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian tôi thực hiện khóa luận này

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách tôt nhất Tuy nhiên do buổi đầu làm quen với công việc nghiên cứu khoa học cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy, cô giáo để khóa luận hoàn chỉnh hơn

Hà Nội, ngày 4 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Hà

LỜI CAM ĐOAN

Để đảm bảo tính trung thực của khóa luận, tôi xin cam đoan:

Khóa luận “Nghiên cứu hệ thống vận tải và phân phối thuốc Curcumin của Bacterial cellulose lên men từ nước vo gạo định hướng sử dụng qua đường uống’’ là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực

hiện dưới sự hướng dẫn của TS Lê Ngọc Hoàn Các kết quả trình bày trong

khóa luận là trung thực, khách quan và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào trước đây Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Hà Nội, ngày 4 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Hà

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

5 Nội dung nghiên cứu 3

6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 4

7 Bố cục của khóa luận 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Một vài đặc điểm của BC 5

1.1.1 Vi khuẩn sản sinh ra BC 5

1.1.2 Môi trường nuôi cấy A xynilum 5

1.1.3 Cấu trúc của màng BC 6

1.1.4 Một số đặc tính của màng BC 6

1.1.5 Sinh tổng hợp BC 7

1.1.6 Ứng dụng của màng BC 7

1.2 Sơ lược về Cur 8

1.2.1 Công thức cấu tạo 8

1.2.2 Một số tính chất lí hóa của Cur 9

1.2.3 Dược tính 10

1.2.4 Sinh khả dụng của Cur 12

1.2.5 Một số chế phẩm chứa Cur 12

1.3 Tình hình nghiên cứu về Cur 12

1.3.1 Trên thế giới 12

1.3.2 Tại Việt Nam 13

CHƯƠNG 2 15

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu nghiên cứu 15

2.1.1 Giống vi khuẩn 15

2.1.2 Nguyên liệu - hóa chất 15

2.1.3 Trang thiết bị 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Phương pháp tạo màng và xử lý màng BC 16

2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng Cur 17

2.2.3 Tạo màng BC nạp Cur 19

2.2.4 Phương pháp xác định lượng Cur nạp vào màng BC 19

2.2.5 Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống vận tải thiết kế 20

2.2.6 Khảo sát độ khuếch tán của Cur từ màng BC ở các độ dày khác nhau 21

2.2.7 Phương pháp phân tích dược động học giải phóng của Curcumin

2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 22

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Tạo màng BC của A xylinum trong môi trường nước vo gạo 23

3.2 Thu màng BC từ môi trường 24

3.3 Tinh chế màng BC 25

3.4 Màng BC hấp thụ thuốc Cur 25

3.5 Xác định lượng thuốc Cur giải phóng khỏi màng BC 28

3.6 Dược động học giải phóng thuốc của màng BC 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC

Escherichia coli Plant cellulose Doctor

Vi khuẩn Acetobacter xylinum Màng cellulose vi khuẩn

Curcumin

Vi khuẩn đại tràng Cellulose thực vật Tiến sĩ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Cur

Bảng 2.1 Môi trường nuôi cấy A xylinum

Bảng 2.2 Bảng nồng độ Cur và giá trị OD427 nm (n = 3)

Bảng 2.3 Dung dịch đệm đa năng Britton và Robinson

Bảng 3.1 Giá trị OD hấp thụ thuốc Cur của màng BC ( n = 3)

Bảng 3.2 Khối lượng Cur được hấp thụ, tỷ lệ hấp thụ và cường độ hấp thụ Cur của màng BC (n =3 )

Bảng 3.3 Nồng độ Cur và giá trị quang phổ (OD) của Cur (n = 3)

Bảng 3.4 Mật độ quang phổ màng BC đang giải phóng thuốc ở các thời điểm lấy mẫu (n = 3)

Bảng 3.5 Tỉ lệ thuốc Cur giải phóng tại các thời điểm lấy mẫu (n =3)

Bảng 3.6 Hệ số tương quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tinh chế màng BC

Hình 2.2 Đồ thị đường chuẩn Cur OD 427nm

Hình 3.1 Màng BC khi nuôi cấy tĩnh ngày thứ 4

Hình 3.2 Màng BC với thời gian nuôi cấy khác nhau

Hình 3.3 Màng BC tinh chế

Hình 3.4 Màng BC đang hấp thụ thuốc Cur

Hình 3.5 Phương trình hồi quy của mẫu Cur

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn khả năng giải phóng thuốc Cur của màng BC Hình 3.7 Đường cong biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc Cur của màng BC

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Trong những năm gần đây, cùng với xu hướng quay về sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên, việc phát triển các hoạt chất có nguồn gốc thảo dược ngày càng trở thành mối quan tâm lớn đối với ngành Y dược Việt Nam Một trong những hoạt chất có nguồn gốc thảo dược được quan tâm nhiều hiện nay đó là Curcumin

Curcumin (Cur) là một hoạt chất polyphenol của thân rễ cây Nghệ vàng

(Curcuma longa L.) Cur đã được sử dung rộng rãi trong suốt hơn 5000 năm

qua trong nhiều bài thuốc y học cổ truyền ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là tại Ấn Độ và Trung Quốc [8] Chúng được sử dụng như một chất tạo màu, làm đẹp da và liền sẹo Cur đã được nghiên cứu và chứng minh với các tác dụng dược lý quan trọng như: tính kháng khuẩn, chống viêm, chống virus, chống oxy hóa và chống ung thư [2] Gần đây, nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng Cur có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào trên nhiều dòng tế bào

ung thư in vitro và đã được dùng để ngăn ngừa và điều trị nhiều bệnh ung thư

in vivo [8] Quan trọng hơn, Cur không độc hại với các tế bào khỏe mạnh

Tuy nhiên, rào cản lớn khiến tinh chất nghệ Cur chưa được ứng dụng rộng rãi

là do Cur tan rất ít trong nước (0.001%), sinh khả dụng thấp [12] Vì vậy, khi dùng theo đường uống Cur hòa tan một phần rất nhỏ vào các dịch thể của ống tiêu hóa, chỉ 7 - 10% [5] Cur được hấp thu vào máu, lại bị chuyển hóa nhanh chóng tại ruột và gan đã làm sinh khả dụng thực tế của Cur chỉ đạt 2 - 3% [5]

Vi khuẩn từ các chi Gluconacetobacter sản xuất ra nhiều loại Bacterial

cellulose (BC) tinh khiết Nét cấu trúc quan trọng trong dạng kết tinh của BC khác với cellulose ở thực vật (Plant cellulose - PC) ở chỗ chúng không có sự kết hợp hemicellulose, lignin, hay những thành phần phụ khác, mà được cấu tạo từ những sợi microfibril tạo nên những bó sợi song song cấu thành mạng

lưới cellulose với độ bền cơ học, độ tinh khiết, khả năng thấm hút, khả năng polymer cao và đường kính sợi nhỏ Ngoài ra, màng BC còn là hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và

sự tác động của UV, có tiềm năng cao cho các ứng dụng trong các hệ thống vận chuyển thuốc, cho cả thẩm thấu qua da, qua đường miệng, mô kỹ thuật và một số ứng dụng y sinh học khác [1, 4, 15, 17],

Uống là một trong những đường ưa thích nhất và truyền thống để phân phối thuốc So với đường tiêm, đường uống có lợi thế hơn là độ an toàn cao, đơn giản, tiện lợi và dễ tuân thủ hơn, ngăn chặn nguy cơ lây truyền bệnh, hiệu quả sử dụng thuốc cao hơn, làm giảm chi phí và cho phép linh hoạt hơn trong kiểm soát liều lượng thuốc

Gần đây, các nhà nghiên cứu đã có sự chú ý đặc biệt tới việc sử dụng các vật liệu sinh học trong chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái tạo, tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng Một trong những vật liệu sinh học

đó là màng BC Một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm hệ thống phân phối và vận chuyển thuốc qua đường uống với một số loại thuốc có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường Aminetal [10] đã báo cáo việc sử dụng màng BC làm màng bao bọc cho Paracetamol bằng cách sử dụng kỹ thuật phun phủ Kết quả cho thấy màng BC giúp cho thuốc được giải phóng một cách kéo dài làm tăng hiệu quả

sử dụng của thuốc

Cur có thể được phát triển như một loại thuốc điều trị thông qua thay đổi công thức hoặc gắn lên hệ vận chuyển, cho phép nâng cao khả năng hấp thụ của tế bào Để vận chuyển cur đến các cơ quan đích, cần cải thiện độ hòa tan

và sinh khả dụng của nó

Xuất phát từ các nghiên cứu về màng BC và Cur nêu trên, chúng tôi tiến

hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hệ thống vận tải và phân phối thuốc

Curcumin của Bacterial cellulose lên men từ nước vo gạo định hướng sử dụng qua đường uống’’

2 Mục đích nghiên cứu

- Thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc nhằm tạo hệ thống giải phóng thuốc kéo dài, điều này có thể làm tăng sinh khả dụng của và tăng hiệu quả điều trị của thuốc

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Màng BC làm từ môi trường nước vo gạo, thuốc Cur dạng tinh khiết 95%

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu tiềm năng vận tải và phân phối thuốc Cur dựa trên màng BC định hướng sử dụng qua đường uống

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Tạo màng và xử lý màng BC

- Thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc qua màng BC

- Khảo sát, đánh giá khả năng vận tải và phân phối thuốc thông qua hệ thống vận tải được thiết kế

5 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu quy trình nuôi cấy A xylinum từ các nguyên liệu sẵn có Thu sản phẩm BC từ dịch nuôi cấy

Chế tạo màng BC dùng để hấp thụ thuốc

Thử nghiệm tác dụng hấp thụ và giải phóng Cur của BC

6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

6.1 Ý nghĩa khoa học

Tiếp tục nghiên cứu tiềm năng của màng BC để áp dụng chúng vào nhiều các lĩnh vực khác nhau trong thực tiễn đời sống Mở ra hướng nghiên cứu mới về khả năng vận tải và phân phối thuốc của màng BC trên các loại thuốc khác nhau nhằm tăng sinh khả dụng sinh học của loại thuốc đó

6.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sử dụng màng BC làm hệ thống vận tải và phân phối thuốc Cur để tạo ra

hệ thống giải phóng thuốc kéo dài

7 Bố cục của khóa luận

Gồm 40 trang, 11 bảng, 9 hình được chia thành các phần chính như sau:

Mở đầu (4 trang), chương 1 (Tổng quan tài liệu: 10 trang), chương 2 (Vật liệu

và phương pháp nghiên cứu: 9 trang), chương 3 (Kết quả và thảo luận: 15 trang), Kết luận và kiến nghị: 1 trang, tài liệu tham khảo: 26 tài liệu, phụ lục:

3 trang

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một vài đặc điểm của BC

1.1.1 Vi khuẩn sản sinh ra BC

- Màng BC được tổng hợp từ một số loại vi khuẩn như: Acetobacter,

Achromobacter, Agrobecterium, Pseudomonas,…

- Acetobacter xylinum là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất Giống

vi khuẩn A Xylinum sử dụng được lấy từ Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường

ĐHSP Hà Nội 2

1.1.2 Môi trường nuôi cấy A xynilum

Môi trường nuôi cấy A Xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn

dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng

Trong đó, nước vo gạo được xem là môi trường thích hợp trong nuôi

cấy A xylinum Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo được trình bày như

Nước vo gạo là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong nước vo gạo chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và các chất kích thích tố tăng trưởng như nhóm vitamin B1, B3, B5; nhóm khoáng chất như sắt, đồng, kẽm

và các acid amin

Nước vo gạo sau khi vo được sử dụng không quá 3 giờ, tránh để cho nước bị chua làm cho đường, vitamin và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất kém

1.1.3 Cấu trúc của màng BC

Cấu trúc hóa học cơ bản của BC giống PC, tuy nhiên chúng khác nhau

về cấu trúc đại thể Các sợi mới sinh ra của BC kết lại với nhau để hình thành

nên các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng khoảng 1.5 nm Các sợi sơ cấp này kết lại thành các vi sợi, các vi sợi nằm trong các bó, cuối cùng hình thành các dải Các dải có chiều dày 3 - 4 nm, chiều rộng 70 - 80 nm; 3.2 x133 nm Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy [17]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học cơ bản của BC

1.1.4 Một số đặc tính của màng BC

Màng cellulose sản xuất bởi các chủng A Xylinum có độ tinh sạch cao

với nguồn gốc thực vật như hemicellulose, pectin và lignin (Kurosumiet al 2009) [1] Nó thể hiện tính độc nhất và cấu trúc đặc tính sinh hóa như sợi nano siêu mịn với cấu trúc mạng (1,5 - nm chiều rộng) [23] BC thể hiện độ hấp thụ nước tốt do cấu trúc mặt lưới của nó cung cấp một diện tích bề mặt lớn đảm bảo cho nó hấp thụ nước một cách tốt nhất (khoảng 200 lần trọng lượng của nó) [26] Sản phẩm này có những tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, giữ ẩm tốt, không độc và không gây dị ứng, có khả năng

chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản khuẩn mà không làm thay đổi cấu trúc hay tính chất [13].Với các tính chất này BC rất phù hợp để chọn lựa cho ứng

dụng vận tải và phân phối thuốc

1.1.5 Sinh tổng hợp BC

Cellulose được tổng hợp từ một số nhóm vi khuẩn và đặc biệt là

A.xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự biến dưỡng cacbon, phụ thuộc vào

trạng thái sinh lý của tế bào bao gồm cả chu trình pentose phosphate hoặc chu trình Krebs, kết hợp với quá trình tạo glucose

Ngày nay, quá trình tổng hợp cellulose ở A.xylinum gồm nhiều bước

liên tiếp, gồm 2 giai đoạn chính: giai đoạn polyme hoặc giai đoạn kết tinh

Phương pháp sản xuất BC: lên men tĩnh và lên men động

1.1.6 Ứng dụng của màng BC

Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều những công trình nghiên cứu ứng dụng màng BC vào các lĩnh vực khác nhau như: công nhệ thực phẩm (màng bảo quản trái cây, chất ổn định thực phẩm, ), lĩnh vực y học (màng điều trị bỏng, làm da giả, mạch máu nhân tạo, mặt nạ dưỡng da, )

Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng

BC trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo [19], trong đó có 9 nghiên cứu với màng BC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng

BC và 7 với các vật liệu nanocomposite Như vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp tục được tiến hành nghiên cứu

Một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm hệ thống phân phối và vận chuyển thuốc qua đường uống với một số loại thuốc

đã cho thấy có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường Nghiên cứu của Wei B và cộng sự (2011) cho thấy màng khô

BC thu được sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng khuẩn; Merck KGaA, Darmstadt, Đức) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi

đơn vị diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116 kg/cm2, và tác dụng của

thuốc kéo dài ít nhất 24h chống lại hoạt động của S aureus và B subtilis Sợi

BC với các hạt nano bạc đã sản xuất thành công lên đến 99,99% hoạt tính

kháng khuẩn chống lại E.coli và S.Aureus [25] Nghiên cứu khác cho thấy

việc sử dụng nanocomposites bạc với BC đã cho hiệu quả kháng khuẩn cao [22] Các S- enantiomer của propranolol, một loại thuốc chống cao huyết áp,

có được giải phóng từ một lớp composite của BC với methacrylate, và đã thử

nghiệm in vivo cho kết quả tốt [1, 6] Một miếng dán có thể giải phóng thuốc

Enantiomeric đã được chứng minh bằng cách sử dụng một bể chứa gel và polyme in dấu phân tử (MIP) màng

1.2 Sơ lược về Cur

1.2.1 Công thức cấu tạo

- Tên IUPAC:(1E, 6E) - 1,7- bis (4- hydroxy- 3- metoxyphenyl) - 1,6- heptadien- 3,5- dion

Demetoxy - Curcumin + Bis - Demetoxy - Curcumin chiếm 14%:

Bis – Demetoxy - Curcumin + Và một hợp chất mới phát hiện là Xiclocurcumin chiếm khoảng 1%:

Xiclocurcumin

1.2.2 Một số tính chất lí hóa của Cur

- Cur là một polyphenol và là sắc tố tạo nên màu vàng đặc trưng của củ

nghệ

- Màu của Cur bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng và khi có sự

hiện diện của SO2 với nồng độ ≥ 10 ppm

- Cur là chất màu tan trong môi trường kiềm, cồn, acetone, benzene, axit acetic, hầu như không tan trong nước ở môi trường acid và trung tính

- Dung dịch Cur trong dung môi hữu cơ etanol có độ hấp thu cực đại ở bước sóng khoảng từ 420 - 430 nm

- Sự điện ly của Cur [16]:

+ Môi trường pH < 1: Cur có màu đỏ thể hiện trạng thái proton hóa

Nghiên cứu ở kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cho kết quả điện ly theo pH của Cur được thể hiện như bảng 1.2 [26]

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Cur

pH Màu của dung dịch Dạng ion tồn tại

- Khi đun Cur với kiềm tạo thành vanilic acid và ferulic acid

- Oxy hóa bằng pemanganat tạo thành vanilic

- Tác dụng với hydroxylamin tạo dẫn xuất isoxozol

- Hydro hóa dẫn xuất diacetyl của Cur cho hỗn hợp dẫn xuất hexahydro

và tetrahydro hóa học

1.2.3 Dược tính

- Cur là chất hủy diệt tế bào ung thư vào loại mạnh nhất theo cơ chế

hủy diệt từng bước các tế bào ác tính Cur được coi là chất tiêu biểu nhất cho

thế hệ mới các chất chống ung thư vừa rất hiệu lực vừa an toàn, không gây tác dụng phụ [9]

- Cur có khả năng giải độc và bảo vệ gan, bảo vệ và làm tăng hồng cầu, loại bỏ cholesterol xấu, điều hòa huyết áp, hạ mỡ máu, ngăn chặn béo phì, làm cho da dẻ hồng hào, tăng cường sắc đẹp, sức lực và cả tuổi thọ, …

- Cur giúp cơ thể chống lại các vi khuẩn sống kí sinh trong ruột, đặc biệt tốt cho hệ tiêu hóa Các nghiên cứu cho thấy, nghệ có thể kích thích tiêu hóa và giải phóng các enzim tiêu hóa, phá vỡ liên kết cacbonhydrat và các chất béo Chất Cur có tự nhiên trong củ nghệ được các nhà khoa học chứng minh có khả năng dễ dàng thẩm thấu và tiếp cận tới từng tế bào viêm do có khả năng [5]:

+ Tăng tiết chất nhầy mucin, bảo vệ niêm mạc dạ dày khỏi tác động ăn mòn gây loét của acid dịch vị

+ Ức chế và tiêu diệt tới 65 chủng vi khuẩn Hp (Helicobacter pylori) nguyên nhân của hơn 90% trường hợp đau dạ dày mà không sợ kháng thuốc

+ Tái tạo niêm mạc dạ dày , giúp các vết loét nhanh chóng được phục hồi Tuy nhiên, do vi khuẩn Hp rất dễ lây qua đường ăn uống và đường miệng nên khả năng tái nhiễm vi khuẩn này là rất cao Vì vậy, cần phải phối hợp Cur với nhiều chất khác ví dụ như Thymomodulin để ngăn chặn viêm loét dạ dày một cách hiệu quả [5]

- Mặc dù, các nghiên cứu thử nghiệm cho thấy khả năng trị liệu tuyệt vời đó của Cur, tuy nhiên thách thức lớn nhất là Cur ít tan trong nước Khi dùng theo đường uống, Cur hòa tan một phần rất nhỏ vào các dịch thể của ống tiêu hóa, chỉ 7 - 10% Cur được hấp thu vào máu, lại bị chuyển hóa nhanh qua gan, làm cho sinh khả dụng thực tế của Cur chỉ đạt 2 - 3%, nên Cur chưa được ứng dụng nhiều trong phòng và trị bệnh [5]

Cur ở nhiều nước trên thế giới được coi như vừa là thuốc vừa là thực phẩm điều trị gần 20 loại ung thư khác nhau Riêng đối với ung thư máu các nhà khoa học cho biết Cur có tác dụng tăng hồng cầu, chống suy kiệt sức lực

1.2.4 Sinh khả dụng của Cur

Cur được hấp thụ một lượng rất nhỏ sau khi ăn Cur không bền vững trong ruột và chỉ một lượng nhỏ đi qua đường tiêu hóa và nhanh chóng bị thoái hóa hoặc liên hợp thành glucuronidation

Nghiên cứu của Shoba G., Joy D., Joseph T và các cộng sự tại khoa Dược, Đại học Y St John, Bangalore, Ấn Độ đã cho thấy hoạt chất piperine chiết xuất từ hạt tiêu đen có tác dụng tăng hấp thu và giảm đào thải của Cur trong máu lên rõ rệt Một nghiên cứu của nhóm này được đăng tải trên tạp chí Pubmed của Thư viện y khoa quốc gia và Viện sức khỏe quốc gia Hoa Kỳ tháng 5 năm 1998 đã chứng minh được sinh khả dụng của Cur trên cơ thể người khi kết hợp với piperine từ hạt tiêu theo tỉ lệ 1% đã tăng lên tới 2000%

so với khi không dùng piperine [21]

1.3 Tình hình nghiên cứu về Cur

1.3.1 Trên thế giới

Bằng sáng chế đầu tiên về Cur dạng nano được mang mã số EP 103266 A2 ngày 30/5/2001 (Ib - 8), và tài liệu nghiên cứu đầu tiên về nano Cur dành cho mục đích y học được công bố vào năm 2005 [10]

Kể từ đó là sự bùng nổ các nghiên cứu và bằng phát minh về nano Cur (năm 2005 có 18 bằng thì đến năm 2010 đã lên đến gần 100 bằng) Để đánh giá tiềm năng ứng dụng của Cur dạng nano trong lĩnh vực y học, 254 bằng phát minh có liên quan đã được phân tích, cho thấy 24% bằng liên quan đến điều trị ung thư, sau đó là các bệnh tim mạch 13%, các chứng viêm 12%, bệnh tiểu đường 11%, bệnh khớp 10% và bệnh tiêu hóa 9%, …[12]

Những nghiên cứu trên thực nghiệm đầu tiên để chứng minh tác dụng điều trị của Cur, đó là tác dụng chống tăng đường huyết (Srinivasan, M 1972), tác dụng chống viêm (Srimal, R.C 1973), tác dụng chống oxy hóa (Sharma, O.P 1976), tác dụng chống thấp khớp (Deodhar, S.D 1980), tác dụng bảo vệ gan (Kiso, Y 1983), tác dụng chống ung thư (Kuttun R 1985), tác dụng kháng khuẩn (Jordan, W.C 1996), tác dụng bảo vệ thận (Venkatesan, N 2000), tác dụng chống viêm loét dạ dày (Ronita De, 2009) [13]

Aggarwal B.B và cộng sự (2007) [13] đã chứng minh tác dụng chống ung thư tá tràng thực nghiệm trên chuột nhắt và ung thư dạ dày thực nghiệm trên chuột cống của Cur Cho chuột nhắt chế độ ăn có 2 - 5% Cur, hoặc cho uống Cur 2 tuần trước, trong và sau khi gây ung thư dạ dày bằng benzopyren

đã cho thấy tác dụng ức chế rất có ý nghĩa hiệu quả gây ung thư của benzopyren.

1.3.2 Tại Việt Nam

Trong những năm gần đây, rất nhiều các nhà khoa học tại các trung tâm

nghiên cứu lớn cũng đang tiến hành thử nghiệm để chế tạo vật liệu Nano Curcumin từ củ nghệ vàng như Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam (Viện HLKHVCNVN), Trung tâm nghiên cứu và triển khai Khu công nghệ cao TP.HCM, Đại học Dược Hà Nội

PGS.TS Phạm Hữu Lý thuộc Viện Hóa học, Viện HLKHVCNVN cùng

các cộng sự đã sản xuất thành công quy mô pilot nano Curcumin Sản phẩm

này được thương mại hóa với tên đăng ký là Curmanano - có kích thước dưới 100nm, tan tốt trong nước, hấp thụ nhanh qua màng tế bào, sinh khả dụng lên tới 80 - 95%, giúp mang lại hiệu quả điều trị gấp 40 lần Cur thường [12] Curmanano chính là nguyên liệu để sản xuất, bào chế CumarGold - sản phẩm đầu tiên có chứa nano Cur tại Việt Nam, giúp phòng ngừa và điều trị hiệu quả các bệnh nan y, mạn tính

Hiện nay, vẫn chưa có bằng sáng chế nào có liên quan tới hướng ứng dụng sử dụng màng BC để làm tăng sinh khả dụng của Cur Các nghiên cứu

về Cur trên thế giới và ở Việt Nam hầu như hướng tới nghiên cứu về nano Cur và ứng dụng trong điều trị các bệnh về ung thư là chủ yếu Do đó, đề tài

mở ra một hướng đi mới trên cơ sở sử dụng màng BC làm vật liệu vận tải và phân phối thuốc để làm tăng sinh khả dụng của Cur, khắc phục các yếu điểm của thuốc trong điều trị bệnh

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Giống vi khuẩn

Giống vi khuẩn A Xylinum thuần chủng được cung cấp bởi Phòng thí

nghiệm Vi sinh, Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.1.2 Nguyên liệu – hóa chất

- Nguyên liệu: nước vo gạo

- Hóa chất:

+ Curcumin 95% xuất sứ từ Maharashtra, Ấn Độ

+ Màng BC (99% hàm lượng nước) được sản xuất bằng cách sử dụng

vi khuẩn A xylinum (Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường ĐHSP Hà Nội 2) lên

men trong môi trường dinh dưỡng

+ Dung môi là etanol 96% và chất phản ứng khác được cung cấp từ Trung tâm Hỗ trợ NCKH & CGCN Trường ĐHSP Hà Nội 2

+ Đường glucose, acid acetic, acid citric, peptone, amoni sunfat, kali đihiđrophotphat, HCl, NaOH, … đạt tiêu chuẩn phân tích

2.1.3 Trang thiết bị

- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản)

- Cân phân tích, cân kỹ thuật (Sartorius - Thụy Sỹ)

- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA

- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)

- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức)

- Bể ổn nhiệt 1013

- Máy khuấy từ gia nhiệt CC162 (IKA - Đức)

- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh)

- Bể rửa siêu âm TCP 280

- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu

- Và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tạo màng và xử lý màng BC

A xylinum được nuôi cấy trong môi trường có cải tiến từ môi trường

chuẩn Hestrin - Schramm [22] bằng cách thay cao nấm men bằng nước vo gạo được trình bày như trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Môi trường nuôi cấy A xylinum

Glucose 20g Nước vo gạo 1000ml

KH2PO4 2g Acid acetic 5ml (NH4)2SO4 3g 10% dịch giống A xylinum

Pepton 4g

Nguyên liệu nước vo gạo sau khi lọc loại bỏ cặn và tạp chất sau đó thêm các chất dinh dưỡng cần thiết tạo màng Hấp tiệt trùng ở 113⁰C, trong

15 phút Để nguội rồi bổ sung dịch giống và acid acetic

Sau khi ủ tĩnh cho 6 ~ 14 ngày ở 26℃, màng BC được nhúng vào nước cất trong 2 ngày, và sau đó các màng BC được tinh chế bằng cách rửa nhiều lần theo quy trình như hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tinh chế màng BC

- Tách BC: trong nuôi cấy tĩnh BC tạo thành màng dày ở mặt môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường [1]

- Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm màng trong NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn [1]

- Ngâm HCl: màng sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước rồi ép màng Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH [1]

- Ngâm nước: màng sau khi ngâm bằng HCl rửa nước rồi ép màng Ngâm nước để trung hòa hết acid trong thời gian 48 giờ ta thu được BC tinh khiết [1]

BC sau khi được tinh chế, sấy đến trọng lượng không đổi

2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng Cur

Nguyên tắc: sử dụng máy đo quang phổ UV - Vis 2450 để đo các mẫu dung dịch chuẩn (7 mẫu) ở bước sóng 427 nm

Pha thuốc Cur ở các nồng độ là 5%, 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1%, 0.5%