Nghiên cứu thu nhận n acetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ penicillium oxalicum 20b định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng (tt)

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án * Ý nghĩa khoa học: Là công trình nghiên cứu có hệ thống về điều kiện lên men sinh tổng hợp, thu nhận chế phẩm enzym chitinase có hoạt tính endo

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Xuất phát từ nhu nâng cao giá trị kinh tế và giảm thiểu ô nhiễm môi trường do phế liệu ngành ngành chế biến tôm mang lại, cần tạo ra các sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế liệu tôm Một trong những sản phẩm được tạo ra từ chitin phế liệu tôm là N- acetylglucosamine (hay NAG), có tiềm năng chữa bệnh như viêm khớp, viêm dạ dày, Ngoài

ra NAG còn có đặc tính chống ung thư và được dùng trong chữa trị bệnh tự miễn dịch So với phương pháp sản xuất NAG từ chitin bằng phương pháp hóa học thì sản xuất NAG bằng chitinase từ vi sinh vật

có nhiều ưu điểm như thân thiện môi trường, tạo sản phẩm tự nhiên không chứa các dư lượng chất hóa học Các nghiên cứu về thu nhận NAG từ chitin bằng chitinase từ vi sinh vật còn khiêm tốn và chưa đầy đủ, đặc biệt là quá trình tinh sạch NAG Do đó chúng tôi tiến

hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận

N-acetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ Penicillium oxalicum

20B định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng”

2 Mục tiêu nghiên cứu:

- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật từ

Penicillium oxalicum 20B

- Thu nhận NAG từ chitin phế liệu tôm Việt Nam bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase từ P oxalicum 20B

- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật

- Nghiên cứu thủy phân chitin để thu NAG bằng chế phẩm chitinase

kỹ thuật nhận được

- Nghiên cứu thu nhận chế phẩm NAG tinh sạch hướng tới ứng dụng vào thực phẩm chức năng

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

* Ý nghĩa khoa học: Là công trình nghiên cứu có hệ thống về điều kiện lên men sinh tổng hợp, thu nhận chế phẩm enzym chitinase có

hoạt tính endochitinase và NAHase từ chủng Penicillium oxalicum

20B để ứng dụng thủy phân chitin từ phế liệu tôm và thu nhận NAG tinh sạch có tiềm năng ứng dụng làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng

* Ý nghĩa thực tiễn: Quy trình thu nhận NAG từ chitin của phế liệu tôm bằng phương pháp enzym sử dụng chitinase có tính khả thi sẽ góp phần tạo giá trị gia tăng từ phế liệu tôm bằng giải pháp công nghệ thân thiện với môi trường

5 Những đóng góp mới của luận án

- Là công trình công bố đầu tiên một cách hệ thống về đặc tính enzym

và điều kiện lên men sinh tổng hợp chitinase từ P oxalicum 20B

- Đã tạo ra chế phẩm chitinase kỹ thuật từ P oxalicum 20B và xác định

các đặc tính của chế phẩm, ứng dụng để thủy phân chitin thu acetylglucosamine Đặc biệt ảnh hưởng của từng cấu tử endochitinase

N-và N-acetylhexosaminidase trong hỗn hợp chế phẩm chitinase kỹ thuật đến hiệu suất tạo N-acetylglucosamine đã được xem xét

- Đã đưa ra qui trình tinh sạch N-acetylglucosamine từ dịch thủy phân chitin và xác định các đặc tính của chế phẩm N-acetylglucosamine phù hợp để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng

6 Cấu trúc của luận án:

Luận án bao gồm 127 trang, trong đó: Phần mở đầu: 2 trang, Chương

1 - Tổng quan tài liệu: 29 trang, Chương 2 - Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 14 trang, Chương 3 - Kết quả và thảo luận: 49 trang, phần Kết luận và kiến nghị: 1 trang, Các công trình của tác giả công bố liên quan đến đề tài luận án: 1 trang, phần Tài liệu tham

khảo: 11 trang, phần Phụ lục: 21 trang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2.1 Cấu tạo hóa học và tính chất lý hóa của chitin

1.2.2 Nguồn thu nhận chitin

1.3 CHITINASE

1.3.1 Hệ chitinase

1.3.2 Đặc tính sinh hóa

1.3.3 Cơ chế thủy phân chitin bởi chitinase thành NAG

1.3.4 Một số giải pháp kỹ thuật thủy phân chitin thu nhận NAG 1.3.4.1 Các giải pháp tiền xử lý chitin

1.3.4.2 Điều kiện thủy phân chitin ra NAG bởi chế phẩm chitinase

1.4 SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ VI SINH VẬT

1.4.1 Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase

1.4.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp chitinase 1.4.3 Ảnh hưởng của nguồn và nồng độ nitơ tới sinh tổng hợp chitinase 1.4.4 Ảnh hưởng của nguyên tố khoáng tới sinh tổng hợp chitinase

1.4.5 Ảnh hưởng của pH tới sinh tổng hợp chitinase

1.4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp chitinase

1.4.7 Ảnh hưởng của thời gian tới sinh tổng hợp chitinase

1.4.8 Ảnh hưởng của tốc độ lắc và cường độ khuấy tới sinh tổng hợp chitinase 1.5 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CHITINASE TỪ VI SINH VẬT 1.5.1 Phân tách tạp chất rắn thu dịch chiết enzym

1.5.2 Cô đặc dịch chiết enzym

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH NAG TỪ DỊCH THỦY PHÂN CHITIN 1.6.1 Ly tâm, siêu lọc loại tạp chất

1.6.2 Cô đặc

1.6.3 Kết tinh

1.6.4 Tinh sạch NAG bằng dung môi

1.6.5 Qui trình tinh sạch để thu nhận NAG

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp xác định sinh khối nấm mốc

2.2.2 Phương pháp phân tích hóa lý

2.2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm

2.2.2.2 Phương pháp định lượng (NAG)i

2.2.2.3 Phương pháp xác định Nitơ tổng số của mẫu chitin

2.2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein của mẫu chitin 2.2.2.5 Cách tính hàm lượng chitin

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzym

2.2.3.1 Hoạt độ chitinase được xác định theo phương pháp Binod cải tiến 2.2.3.2 Hoạt độ endochitinase được xác định theo phương pháp Yabuki cải tiến

2.2.3.3 Hoạt độ -N-acetyl-D-hexosaminidase

2.2.3.4 Hoạt độ chitobiosidase

2.2.4 Phương pháp xác định cấu trúc bề mặt của chitin, NAG 2.2.5 Phương pháp xác định đặc tính vật lý của chitin, NAG

2.2.6 Phương pháp xác định cấu trúc của chitin, NAG

2.2.7 Phương pháp xác định sai số trung bình

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp chitinase 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thu nhận chế phẩm chitinase kỹ thuật 2.3.3 Khảo sát đặc tính cơ bản của chế phẩm chitinase kỹ thuật 2.3.4 Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu thủy phân chitin

2.3.5.1 Phương pháp tiền xử lý chitin

2.3.5.2 Phương pháp nghiên cứu điều kiện phản ứng thủy phân

2.3.6 Phương pháp nghiên cứu thu nhận N-Acetylglucosamine tinh sạch

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ P OXALICUM 20B

3.1.1 Ảnh hưởng của môi trường lên men

3.1.1.1 Ảnh hưởng của dạng chitin tới sinh tổng hợp chitinase

Dạng chitin ảnh hưởng không nhiều đến hoạt tính chitinase thể hiện trên kết quả Hình 3.1 Trong quá trình lên men, hoạt độ chitinase nhận được với cả 03 dạng chitin chỉ dao động từ 0,062 U/ml tới 0,065 U/ml và đạt cao nhất ở thời điểm 120 h Do đó, chitin dạng thô được lựa chọn làm chất cảm ứng nhằm giảm công sức, hóa chất và năng lượng

3.1.1.2 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng chitin tới sinh tổng hợp chitinase

0.064

0.050

0 0.02 0.04 0.06 0.08

Hình 3.1 Ảnh hưởng dạng chitin tới hoạt

tính chitinase tại các thời điểm lên men

Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ chitin

thô tới hoạt tính chitinase tại các thời

điểm lên men

Khảo sát nồng độ chitin thô từ 0 đến 6 (g/l) cho thấy khả năng sinh tổng hợp chitinase đạt cực đại 0,064 U/ml ở nồng độ chitin thô 4 (g/l) (Hình 3.2) 3.1.1.3 Ảnh hường của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp chitinase

Nguồn nitơ ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp chitinase được thực hiện trên 05 nguồn khác nhau (CNM, NaNO3 và urea, CNM kết hợp với NaNO3 hoặc urea) với cùng lượng 10 g/l Định kỳ thu dịch lên men để xác định hoạt độ chitinase cho kết quả Hình 3.3 Nguồn nitơ là CNM cho hoạt độ chitinase đạt cao nhất (0,066 U/ml) Nên CNM 10 (g/l) là nguồn nitơ

thích hợp nhất cho sinh tổng hợp chitinase từ P oxalicum 20B

3.1.1.4 Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men tới sinh tổng hợp chitinase

Chọn CNM làm nguồn nitơ bổ sung, kết quả Hình 3.4 cho thấy khi nồng độ CNM từ 5 g/l đến 15 g/l, hoạt tính chitinase đạt cao nhất ở nồng độ 10 g/l là 0,065 U/ml

Hình 3.3 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ

tới hoạt tính chitinase tại các thời điểm

lên men

Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ cao nấm

men tới hoạt tính chitinase tại các thời

điểm lên men

3.1.2 Ảnh hưởng điều kiện lên men

3.1.2.1 Ảnh hưởng của pH môi trường lên men tới sinh tổng hợp chitinase

P.oxalicum 20B sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở pH 5, hoạt độ

enzym nhận được 0,064 U/ml chitinase tại thời gian 120 h lên men 3.1.2.2 Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới sinh tổng hợp chitinase

Hình 3.5 Ảnh hưởng pH môi trường tới khả năng

sinh tổng hợp chitinase trong quá trình lên men

Hình 3.6 Ảnh hưởng tốc độ lắc khả năng sinh

tổng hợp hitinase trong quá trình lên men

Nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp enzym từ P

oxalicum 20B được thực hiện với các thông số như thí nghiệm trên, nhưng tốc

độ lắc được thay đổi từ 100 v/p - 180 v/p Định kỳ lấy dịch lên men để xác định hoạt độ chitinase cho kết quả Hình 3.6 Khảo sát tốc độ lắc từ 100 v/p tới 180 v/p cho thấy hoạt độ chitinase đạt cao nhất 0,074 U/ml tại lắc 160 v/p Do vậy sinh tổng hợp chitinase tốt nhất đạt 0,074 U/ml ở môi trường lên men thích hợp chứa

4 g/l cảm ứng chitin thô, 10 g/l cao nấm men và pH 5; lắc với tốc độ 160 v/p

3.1.3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp chitinase Nghiên cứu được tiến hành với các điều kiện thích hợp nhất đã lựa chọn Trong quá trình lên men, pH giảm dần từ pH 6,67 xuống pH 5,50 và giữ ổn định tới khi kết thúc lên men Sinh khối tăng nhanh chóng đạt cực đại sau 48 h (0,75 g/l), rồi giảm liên tục tới cuối quá trình lên men Hoạt tính chitinase tăng lên đáng kể tại pha sinh trưởng cân bằng và đạt cao nhất khi cuối pha cân bằng Hoạt tính chitinase bắt đầu tăng sau lên men

24 h và đạt cực đại 0,074 U/ml tại 120 h, sau đó giảm nhanh và còn 0,051U/ml tại 144 h lên men (Hình 3.7)

Hình 3.7 Động thái sinh tổng hợp chitinase

Bảng 3.1 Động thái sinh tổng

hợp chitinase, endochitinase, NAHase trong quá trình lên men của P oxalicum 20B

Hình 3.8 Khả năng thủy phân dịch gel chitin 50% thành

đường khử bằng dịch lên men chứa chitinase lấy ở các thời

điểm lên men khác nhau (dịch lên men pha loãng 02 lần

Hình 3.9 Sắc ký TLC của các

sản phẩm thủy phân từ gel chitin 50% bởi dịch lên men được pha loãng 2 lần (1) NAG chuẩn; (2) Đối chứng;( 3), (4), (5), (6), (7), (8) tương ứng thời gian lấy mẫu dịch lên men 72 h; 96 h; 108 h;

120 h; 132 h; 144 h.

Kết quả Bảng 3.1 chỉ ra thời gian lên men từ 24 h đến 144 h, hoạt tính chitinase, endochitinase, NAHase tăng và đạt cực đại 0,074 U/ml, 5,058 U/ml, 0,683 U/ml tương ứng tại 120 h lên men Sự kiểm định hoạt tính tại các thời điểm lấy mẫu dịch lên men được xác định bằng thủy phân gel chitin 50% (ở điều kiện pH

5, nhiệt độ 35oC, tỷ lệ dịch lên men/ dịch gel chitin là 1/1) thành đường khử (Hình 3.8) cũng như thành NAG tăng tương ứng (Hình 3.9)

Từ cơ sở nghiên cứu trên điều kiện pH 5, lắc với tốc độ 160 v/p, 4 g/l chitin thô,

10 g/l CNM và thời gian lên men 120 h được lựa chọn để sinh tổng hợp enzym

từ P oxalicum 20B cho nghiên cứu tiếp theo

3.2 NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CHẾ PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu hồi Dịch nổi chứa chitinase nhận được sau lên men trong điều kiện tối ưu được loại tạp chất và cô đặc Do ảnh hưởng lớn của độ nhớt nên mức

cô đặc cao nhất có thể là cô đặc 4 lần Hoạt tính chitinase, NAHase, endochitinase của các phân đoạn enzym nhận được thể hiện ở Bảng 3.2 Tỷ lệ cô đặc tăng, hoạt tính chitinase, NAHase và endochitinase

ở các phân đoạn trên màng đều tăng Ngoài ra, khi tỷ lệ cô đặc tăng

từ 2 đến 4 lần thì tỷ lệ H/E ở các phân đoạn trên màng cao hơn hẳn từ 0,141 đến 0,170 và cao hơn so với tỷ lệ H/E trong dịch nổi enzym là 0,129 Và tại tỷ lệ cô đặc 4 lần thì tỷ lệ H/E của enzym trong phân đoạn trên màng lớn gấp 17 lần so với tỷ lệ H/E của enzym trong phân đoạn dưới màng

Bảng 3.2 Ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hoạt

tính và tỷ lệ chitinase, NAHase và endochitinase

(endo) trong các phân đoạn khi lọc màng

Bảng 3.3 Ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hiệu

suất thu nhận chitinase, NAHase và endochitinase trong chế phẩm khi lọc màng

Hiệu suất thu hồi (HSTH) enzym khi cô đặc bằng hệ thống lọc dòng ngang QuixStandTM màng lọc MWCO 10kDa thể hiện Bảng 3.3 Mức độ cô đặc càng cao, HSTH enzym trên màng càng giảm Trong đó giảm mạnh nhất là endochitinase chỉ còn 61,66%, tiếp theo là chitinase còn 76,39% và giảm ít nhất là NAHase còn 81,27% sau khi cô đặc 4 lần Sự giảm HSTH do một phần enzym đi qua màng lọc, thể hiện ở mức độ tăng HSTH của chitinase ở dịch qua màng Tuy nhiên, tính HSTH tổng của các enzym trên và dưới màng đều thấp hơn 100% Chứng tỏ một phần enzym đã bị vô hoạt trong quá trình siêu lọc Nên mức cô đặc

4 lần được chọn để lấy phần trên màng thu chế phẩm enzym kỹ thuật 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ NAHase/Endochitinase tới khả năng tạo NAG

Ở mức độ cô đặc enzym 4 lần, phân đoạn trên màng được pha loãng tới cùng nồng độ enzym với phân đoạn dưới màng (nồng độ enzym 0,0024 U/ml chitinase) Phản ứng thủy phân gel chitin 10% thực hiện với cùng liều lượng enzym ở điều kiện pH 5 và nhiệt độ 35oC Tại các thời điểm thủy phân ta có phổ sản phẩm tạo thành theo phương pháp TLC thể hiện Hình 3.10 Phân đoạn enzym trên màng cho sản phẩm thủy phân trên vệt từ đường 1 đến đường 4 chủ yếu là NAG, nhưng sản phẩm thủy phân của phân đoạn dưới màng là hỗn hợp NAG và NAGi (với i khác 1) thể hiện đường 6 - 9 Trên cơ sở tỷ lệ H/E của 02 phân đoạn enzym nghiên cứu rất khác nhau (0,170 và 0,010), vai trò của NAHase trong thủy phân chitin triệt thành NAG được khẳng định rõ rệt Ngoài ra, ảnh hưởng tỷ lệ H/E tới khả năng thủy phân chitin thành NAG của các phân đoạn enzym trên màng (tương ứng tỷ lệ cô đặc 2; 3; 4 lần) đã được pha loãng về cùng đơn vị hoạt độ chitinase 0,037 U/ml, có cơ cấu NAHase và endochitinase ở Bảng 3.4 để thủy phân 50% gel chitin điều kiện 35 oC, pH 5, tỷ

lệ E/S là 1/1 (v/v) Sau 15 h thủy phân, NAGi (với i từ 1 – 3) tạo thành được định lượng bằng phương pháp HPLC cho thấy tất cả dịch thủy phân đều không chứa 2NAG (tức NAG2), không chứa 3NAG (tức NAG3), chỉ chứa duy nhất NAG với hàm lượng tăng khi tỷ lệ H/E tăng thể hiện Bảng 3.4 Tỷ lệ cô đặc càng cao (từ 1 đến 4 lần) làm tỷ lệ H/E càng tăng (từ 0,129 lên 0,170) và giúp lượng NAG tạo thành càng lớn dần (từ 5,16 lên 9,49 mg/ml) Nên quá trình cô đặc làm tăng hoạt độ chitinase, NAHase, endochitinase (U/ml) cũng như tỷ lệ H/E nên giúp HSTP chitin

ra NAG tăng Như vậy, enzym cô đặc 4 lần trên màng được gọi là chế phẩm enzym

kỹ thuật và được lựa chọn dùng trong nghiên cứu thủy phân chitin ra NAG

Hình 3.10 Sắc ký đồ sản phẩm thủy

phân gel chitin 10% bởi phân đoạn

cô đặc 4 lần trên màng và dưới màng

(cùng hoạt độ 0,0024 U/ml chitinase)

C

Bảng 3.4 Cơ cấu NAHase và endochitinase

(endo) trong các phân đoạn enzym (cùng chung hoạt độ chitinase 0,037 U/ml) từ các

phân đoạn enzym

Mô tả Hình 3.10: 1, 2, 3, 4: sản phẩm thủy phân bởi phân đoạn trên màng cô đặc 4 lần trong thời gian lần lượt 24 h; 12 h; 6 h; 3 h; 5: Chất chuẩn NAG; 6, 7, 8, 9: sản phẩm thủy phân bởi phân đoạn qua màng cô đặc 4 lần trong lần lượt 3 h; 6 h; 12 h; 24 h

3.2.3 Lựa chọn điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật Bảo quản ở nhiệt độ 4oC, thời gian từ 30 đến 120 ngày, hoạt tính chitinase ổn định nhất (hoạt tính chitinase còn lại khoảng 85% đến 82,5%) khi bảo quản bởi NaCl 3%, tiếp đến 0,1% Benzoat natri, kém

ổn định ở các giải pháp glycerol 20%, hỗn hợp glycerol 20% với NaCl 3% hay mannitol 1 M với NaCl 3% Do đó chế độ NaCl 3% ở

4oC dùng để bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật là hợp lý hơn cả 3.2.4 Xác định đặc tính sinh học của chế phẩm chitinase kỹ thuật Chế phẩm chitinase kỹ thuật có hoạt độ 0,239 U/ml chitinase, 2,152 U/ml HAHase và 12,695 U/ml endochitinase nhận được sau khi cô đặc 4 lần trên màng được đem đi xác định đặc tính

3.2.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzym

Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính enzym của chế phẩm được xem xét qua hoạt lực xúc tác và độ bền hoạt lực enzym thể hiện Hình 3.11

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính chitinase (A), endochitinase (C), NAHase (E) và tới

độ bền chitinase (C), endochitinase (E), NAHase (F) của chế phẩm enzym kỹ thuật Sự giảm hoạt độ

Khoảng nhiệt độ thích hợp cho xúc tác của chitinase là 35 C - 40 C và tối ưu ở

40oC thể hiện Hình 3.11 A Kết quả Hình 3.11 C và Hình 3.11 E cho thấy cả

endo và NAHase đều có khoảng nhiệt độ thích hợp là 35 C - 40 C

Đánh giá độ bền hoạt lực của enzym với nhiệt độ, chế phẩm enzym được giữ ở môi trường pH 5 và nhiệt độ khác nhau từ 30 - 50 C trong 5 ngày Sau đó, xác định hoạt độ enzym và kết quả biểu diễn trên Hình 3.11 B, Hình 3.11 D, Hình 3.11 F Chế phẩm chitinase không bền nhiệt Như nhiệt độ 45 C và 50 C chỉ sau 2 ngày, hoạt độ của NAHase vẫn còn khá cao lần lượt 71% và 57%, nhưng hoạt độ của endochitinase giảm về không và hoạt độ chitinase tổng không tìm thấy Ở 40oC hoạt tính chitinase tối ưu, hoạt độ chitinase chỉ còn lại khoảng 20% sau 5 ngày Do vậy để ứng dụng chế phẩm cho thủy phân chitin không nên kéo dài quá 3 ngày 3.2.4.2 Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính enzym

Ảnh hưởng pH tới hoạt tính enzym của chế phẩm enzym kỹ thuật được xem xét qua hoạt lực xúc tác và độ bền hoạt lực enzym thể hiện trên Hình 3.12

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính chitinase (A), endochitinase (C), NAHase (E) và tới độ bền chitinase (C), endochitinase (E), NAHase (F) của chế

pH tối ưu cho xúc tác của chitinase, endochitinase, NAHase lần lượt là pH 5, pH

4, trong khoảng pH 5 - pH 6 Chitinase có khoảng giá trị pH thích hợp trong vùng axit (pH 5 - pH 6) (Hình 3.12 A) Endochitinase thể hiện rõ hơn là một enzym axit (pH 4 - pH 5) (Hình 3.12 C) Khác với 02 loại enzym trên NAHase tương đối bền với sự thay đổi của pH (Hình 3.12 E)

3.3 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT THỦY PHÂN CHITIN 3.3.1 Khảo sát lựa chọn chitin phế liệu thủy sản

Khảo sát chitin (từ tôm mũ ni, sú và mai mực) thì chitin tôm mũ ni cho hiệu suất thủy phân cao hơn cả Nên chitin mũ ni được chọn để nghiên cứu tiếp theo 3.3.2 Lựa chọn phương pháp tiền xử lý chitin tôm mũ ni

3.3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng mức độ nghiền đến khả năng thủy phân chitin Chitin tôm mũ ni được nghiền máy nghiền bi, và được phân loại theo kích thước các phân tử bằng hệ rây (kích thước lỗ rây từ 63 µm đến 600 µm), sau đó xác định trọng lượng và hàm lượng chitin trong từng phân đoạn Ảnh hưởng của mức độ nghiền tới khả năng thủy phân chitin cho thấy lượng đường khử nhận được tăng tỷ lệ thuận với mức độ nghiền (Hình 3.13) Như vậy mức độ nghiền bi càng cao, càng giúp giảm kích thước và làm giảm độ kết tinh chitin trong nguyên liệu tạo điều kiện cho enzym tiếp xúc mạnh với cơ chất Do đó nghiền bi chitin cho kích thước càng bé thì hiệu quả thủy phân chitin càng cao

3.3.2.2 Ảnh hưởng xử lý phối hợp nghiền bi và siêu âm tới khả năng thủy phân chitin

Các phân đoạn bột chitin tôm mũ ni sau khi nghiền bi được đưa vào siêu âm trong thời gian 60 phút, tiếp theo bổ sung chế phẩm enzym

kỹ thuật Sau đó tiến hành thủy phân chitin ở nhiệt độ 40oC, lấy mẫu

xác định lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân

0.000 0.300 0.600 0.900 1.200 1.500

Hình 3.13 Ảnh hưởng kích thước các phần tử

chitin MN sau nghiền tới đường khử tạo thành

Hình 3.14 Ảnh hưởng xử lý siêu âm chitin

MN sau nghiền bi tới đường khử tạo thành

Nghiền bi phối hợp với siêu âm cải thiện rõ rệt HSTP ở tất cả các phân đoạn kích thước bột nghiền khác nhau (Hình 3.13 và Hình 3.14) Thật vậy, sau 120

h thủy phân, lượng đường khử nhận được cao nhất với phân đoạn <

63 m là 1,459 mg/ml có kết hợp siêu âm 60 phút cao hơn hẳn 1,329 mg/ml khi chỉ nghiền bi Kết quả này cũng được minh chứng bởi chụp SEM (Hình 3.16) Ảnh chụp SEM phân đoạn 425 μm < MN < 600 μm cho thấy sóng siêu

âm có tác dụng đáng kể trong việc phá liên kết sâu hơn vào bên trong nguyên liệu tạo nên các phần tử có kích thước nhỏ hơn so với trước khi siêu

âm (Hình 3.16 D) Thực hiện siêu âm gián đoạn các phân đoạn bột nghiền có kích thước khác nhau và enzym được bổ sung vào trước hoặc sau khi siêu âm Khi siêu âm có mặt cả enzym sẽ giúp enzym đi vào sâu hơn bên trong nguyên liệu, tăng khả năng tiếp xúc giữa enzym và chitin đẩy nhanh quá trình thủy

phân, rút ngắn thời gian thủy phân hơn so với phương pháp chỉ siêu âm nguyên liệu mà không có mặt enzym (Hình 3.15)

3.3.2.3 Ảnh hưởng các giải pháp xử lý chitin tới cơ cấu sản phẩm nhận được sau thủy phân

Cơ cấu sản phẩm nhận được sau thủy phân 120 h thể hiện Bảng 3.5 Kết quả Bảng 3.5 cho thấy xử lý chitin tôm mũ ni kích thước càng bé

và kết hợp SA gián đoạn nhiều lần cho lượng NAG cao nhất

chitin vỏ tôm mũ ni tới đường khử tạo

thành sau 120 h thủy phân

Bảng 3.5 Hàm lượng (NAG) I

trong dịch thủy phân 120 h

Các giải pháp xử lý không làm ảnh hưởng tới khả năng thủy phân đối với kích thước lớn (> 600 μm), nhưng lại cải thiện rõ rệt với kích thước nhỏ (< 600 μm)

Hình 3.16 Ảnh hiển vi điển tử quét của các loại nguyên liệu chứa chitin.A Chitin

tôm mũ ni thô (MN thô); B 425 μm < MN < 600 μm; C MN < 63 μm; D 425 μm <

MN < 600 μm + SA; E Chitin mực thô (M thô); K Chitin tôm sú thô (S thô)