Nghiên cứu thu nhận n acetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ penicillium oxalicum 20b định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

Các đường hướng chuyển hóa D-glucosamin và tổng hợp NAG có thể thay đổi bằng kỹ thuật di truyền nhằm tăng hoạt tính enzym, giảm các sản phẩm kìm hãm và tăng ái lực với cơ chất, nên có th

do tính không tan trong nước

Một trong những sản phẩm được tạo ra từ chitin là N- acetylglucosamine D-glucosamine, hay GlcNAc, hay NAG) NAG có tiềm năng chữa bệnh như viêm khớp, viêm dạ dày, Ngoài ra NAG còn có đặc tính chống ung thư và được dùng trong chữa trị bệnh tự miễn dịch [69]

(N-acetyl-Đa số NAG được sản xuất bằng thủy phân hóa học HCl đậm đặc ở nhiệt độ cao Xử

lý hóa học gây nhiều bất lợi như lượng phế thải acid, hiệu suất tạo NAG thấp (dưới 65%)

và giá thành cao Thêm nữa, NAG có vị mặn và hơi đắng bởi các hợp chất còn dư lại Do vậy, nhiều nghiên cứu đã tập trung thủy phân chitin sản xuất NAG bởi chitinase Công bố sản xuất NAG từ chitin bởi chitinase thô từ vi sinh vật còn khiêm tốn Xuất phát từ nhu cầu

thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận

N-acetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ Penicillium oxalicum 20B định hướng

ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng”

* Mục tiêu nghiên cứu:

- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật từ Penicillium oxalicum

20B

- Thu nhận NAG từ chitin phế liệu tôm Việt Nam bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật

* Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase từ P oxalicum 20B

- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật

- Nghiên cứu thủy phân chitin để thu NAG bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật nhận được

- Nghiên cứu thu nhận chế phẩm NAG tinh sạch hướng tới ứng dụng vào thực phẩm chức năng

* Những đóng góp mới của luận án:

- Là công trình công bố đầu tiên một cách hệ thống về đặc tính enzym và điều kiện lên

men sinh tổng hợp chitinase từ P oxalicum 20B

- Đã tạo ra chế phẩm chitinase kỹ thuật từ P oxalicum 20B và xác định các đặc tính

của chế phẩm, ứng dụng để thủy phân chitin thu N-acetylglucosamine Đặc biệt ảnh hưởng của từng cấu tử endochitinase và N-acetylhexosaminidase trong hỗn hợp chế phẩm chitinase

kỹ thuật đến hiệu suất tạo N-acetylglucosamine đã được xem xét

- Đã đưa ra qui trình tinh sạch N-acetylglucosamine từ dịch thủy phân chitin và xác định các đặc tính của chế phẩm N-acetylglucosamine phù hợp để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 N- ACETYLGLUCOSAMINE

1.1.1 Các đặc tính của N- acetylglucosamine

N-Acetylglucosamine là dẫn xuất của đường

glucoza, có nhóm amit liên kết giữa glucosamine

và axit axetic Công thức phân tử C8H15NO6, khối

lượng phân tử là 221,21 g/mol

NAG có dạng bột màu trắng, vị ngọt nhẹ,

nóng chảy ở 221oC, khả năng hoà tan của NAG là

25% trong nước NAG hiếm khi tồn tại ở dạng tự

do, ngoại trừ trong sữa người (khoảng 600 - 1500

NAG là thành phần cấu trúc chính của polysaccharide như chitin Ngoài ra nó có trong thành tế bào vi khuẩn (trong các đơn phân murein) và lipopolysaccharide của màng ngoài Ở vi khuẩn, khi murein phân hủy thì NAG lại hình thành liên quan đến sự phosphoryl hóa, vì GlcNAc-6-phosphate (GlcNAc-6-P) được sử dụng để tổng hợp murein hay lipopolysaccharide hoặc có thể được chuyển hóa bằng con đường đường phân

1.1.2 Vai trò N- acetylglucosamine trong sản xuất thực phẩm chức năng

NAG đã được ứng dụng rộng trong cung cấp dinh dưỡng sử dụng điều trị tổn thương xương khớp, để cải thiện các triệu chứng do thoái hóa khớp, tăng cường khả năng tái tạo sụn khớp, điều trị tận gốc nguyên nhân gây bệnh về khớp NAG được dùng để phục hồi lớp sụn nối, hỗ trợ chữa bệnh viêm khớp mãn tính [54]

Ở người cao tuổi khả năng tổng hợp NAG của cơ thể bị giảm sút dễ mắc bệnh viêm xương khớp, vì thế mà người ta phải đưa từ bên ngoài vào cơ thể dưới dạng thuốc, có tác dụng chống viêm và kích thích sản xuất sụn

Nhiều thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện điều trị cho bệnh nhân rối loạn khớp bao gồm các bệnh: viêm khớp, viêm xương khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn thương sụn, tổn thương khớp, thoái hóa khớp Kết quả nghiên cứu cho thấy NAG có vai trò quan trọng trong việc phòng chống tổn thương khớp, chống viêm xương khớp mãn, viêm khớp mãn tính và bệnh tổn thương sụn xương [27]

Bên cạnh đó NAG được dùng như tác nhân chống viêm chữa nhiều bệnh: nhiễm vi khuẩn mãn tính, viêm ruột và dạ dày NAG còn có khả năng tăng cường giải phóng mucopolysaccharide acid nguyên bào sợi, hình thành cấu trúc bảo vệ đường tiêu hóa do vậy làm tăng tính đàn hồi các mô xung quanh mạch và hoạt động như một tác nhân bảo vệ, khôi phục sự toàn vẹn và chức năng bình thường niêm mạc ruột ở người

Một thử nghiệm thí điểm lâm sàng để xác định hiệu quả điều trị của NAG trên bệnh viêm ruột Trẻ em bị bệnh Crohn đã cho thấy sự cải thiện rõ ràng sau khi được dùng NAG đường uống hay đường hậu môn Thực tế, trong thử nghiệm này, 8 trong số 12 trẻ em cho thấy cải thiện rõ rệt khi được cho uống NAG như là một liệu pháp song song với liệu pháp hiện hành, trong khi 4 trường hợp còn lại không thấy chuyển biến Ngoài ra, 7 trẻ bị bệnh viêm ruột khác cũng được dùng NAG đường hậu môn như là một liệu pháp duy nhất đã cho thấy cải thiện rõ rệt ở 5 em và 2 em còn lại không đáp ứng liệu pháp Đáng lưu ý là 2

em không đáp ứng với NAG đường hậu môn trước đó đã đề kháng lại các liệu pháp khác [125] Do đó, NAG hứa hẹn là một phương pháp điều trị rẻ tiền và không độc hại đối với bệnh viêm ruột mãn tính Gần đây, thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III vừa được hoàn thành [87]

Da người gồm hai lớp là lớp sừng (lớp ngoài) và lớp hạ bì (lớp bên trong) để bảo vệ

cơ thể khỏi các điều kiện khắc nghiệt của môi trường như thời tiết khô, tia cực tím…Tầng lớp sừng đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì độ ẩm, độ săn chắc cho da Lớp hạ

bì bao gồm collagen, elastin… được tạo ra bởi các nguyên bào sợi giúp làm tăng khả năng phục hồi, độ bền, độ đàn hồi, giúp cho làn da luôn khỏe mạnh Một trong những nhóm carbonhydrate phức tạp như acid hyaluronic (HA) và proteoglycan có khả năng giữ nước cao và là thành phần quan trọng trong việc duy trì độ ẩm cho da Lượng cabonhydrate giảm dần theo lứa tuổi, khả năng giữ nước và phục hồi của da giảm và do đó làm cho da khô, xuất hiện các nếp nhăn Bổ sung NAG giúp tăng cường sự phát triển và biểu hiện collagen của nguyên bào sợi, thúc đẩy sự gia tăng của tế bào sừng có tác dụng giữ ẩm, giảm sự xuất hiện các sắc tố da trên khuôn mặt, cải thiện nếp nhăn trên da [29]

NAG còn có đặc tính chống ung thư và được dùng trong chữa trị bệnh tự miễn dịch [69] Ngoài ra, dùng NAG trong mỹ phẩm, băng bó vết thương, và như phụ gia thực phẩm sữa Lợi ích và ứng dụng NAG thể hiện trên Bảng 1.1

Bissett và cs (2007), Chen và cs (2010) công bố nghiên cứu lâm sàng về NAG lên người bệnh khi uống như: sự hấp thụ, phân phối và đào thải khi uống nó [15] Nghiên cứu của Chen và cs (2010) đã chỉ ra tỷ lệ hấp thụ đạt 98% và mỗi khi NAG được hấp thụ, nó sẽ phân phối chính vào tế bào khớp nhằm kết nối chặt chẽ thành ma trận tế bào khớp nối của sụn, dây chằng, gân [27]

Trong cơ thể người, NAG giữ nguyên dạng glucoprotein, như chất kích hoạt hàng loạt các chất trong huyết tương có thể hoạt hóa thành plasma [143]

Chế phẩm chứa NAG được sử dụng bằng đường tiêm, uống NAG bị phân giải một cách từ từ và giữ cấu trúc giống như chất có trong cơ thể người nên khả năng hấp thu cao gấp 3 lần so với glucosamine thông thường Một liều lượng lớn NAG (20 g) tiêm tĩnh mạch không hề độc tính và không thay đổi nồng độ glucose trong máu [133] Người ta cũng đã chứng minh rằng: 54% NAG cung cấp được bài tiết qua đường nước tiểu trong 1 ngày, điều đó chỉ rõ trong chuỗi các phản ứng sinh hóa của NAG

Bảng 1.1 Ứng dụng và lợi ích của NAG

tham khảo

Điều trị

bệnh

Ung thư và di căn Bệnh đường ruột Bệnh rối loạn đường ruột Tổn thương khớp

Động vật, con người Con người Con người Con người

[176] [177] [153] [90] Phòng ngừa

bệnh

Ngộ độc thuốc và chất hóa học Thuốc kháng sinh Tác dụng phụ của điều trị hóa trị và điều trị sóng vô tuyến

Say tàu xe

Tế bào vi sinh vật, động vật

Vi khuẩn Con người

Con người

[178] [175] [176]

[174] Bệnh ngoài

[173] [167] Làm mỹ

phẩm

Giữ độ ẩm cho da Tăng tính đàn hồi và màu sắc Giảm sản xuất melanin

Con người Con người Con người

[27] [130] [15] Các phép thử độc tố cho thấy NAG không độc Ngoài ra NAG được tạo ra bởi enzym

có vị ngọt và bền nhiệt Chính vì vậy, gần đây NAG và dẫn xuất từ NAG đã được sử dụng

để bổ sung vào chế độ ăn uống, phát triển rộng trong chữa bệnh cho con người [7]

1.1.3 Các phương pháp sản xuất N- acetylglucosamine

1.1.3.1 Phương pháp hóa học

Theo phương pháp hóa học, NAG được sản xuất bằng cách dùng axit HCl đậm đặc

để thủy phân chitin ở nhiệt độ cao Nhiệt độ và nồng độ axit cần phải kiểm soát một cách chặt chẽ, đủ cao để thủy phân chitin và tránh phân hủy NAG Thường quá trình thủy phân diễn ra ở nhiệt độ khoảng từ 40 - 80ºC và nồng độ HCl từ 15 - 36% Sản lượng NAG có thể đạt 6,42 g/l trong 1 h [22] Phương pháp này thường đạt hiệu suất thủy phân thấp (dưới 65%), giá thành cao và thải ra một lượng lớn axit gây ô nhiễm môi trường xung quanh, sản phẩm cuối có vị mặn và có tác dụng phụ do quá trình hóa học [128] Đặc biệt nhóm axetyl

bị mất đi nên lại phải axetyl hóa trở lại khá phức tạp Do vậy sản phẩm không được coi là

tự nhiên bởi sự có mặt các chất hóa học (như O-axetyl, diaxetyl, dung môi) trong sản phẩm

đã gây vị đắng [71]

1.1.3.2 Phương pháp chuyển hóa sinh học

Sản xuất NAG qua quá trình chuyển hóa trực tiếp chitin bởi vi sinh vật tổng hợp

chitinase không thông qua giai đoạn thu các chế phẩm trung gian Phương pháp có ưu điểm

là ít công đoạn nhưng quá trình khó kiểm soát do sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất khác ngoài NAG Theo Li và cs (2005) nếu dùng 2% gel chitin làm cơ chất nuôi cấy vi khuẩn

Aeromonas caviae DYU-BT4 từ mẫu đất ở Taiwan có thể thu NAG với hàm lượng 7,8 g/l [83] Theo nghiên cứu khác của Chen và cs (2011), Chitinibacter tainanensis phân lập từ

đất phía Nam Taiwan thủy phân cơ chất -chitin và ß-chitin cho hiệu suất thu hồi NAG lần lượt là 76% và 98% Kết tinh dịch lên men thu NAG với độ tinh sạch trên 99% [30] Các nhân tố phân giải chitin (CDFs) có thể thủy phân chitin và được tạo ra trong suốt thời kỳ

phát triển của C tainanensis khi có mặt chitin Hoạt tính NAHase và endochitinase được

tìm thấy trong vi khuẩn sống và phần tế bào chết Hoạt độ riêng NAHase cao hơn nhiều so với endochitinase Cơ chế hoạt động các nhân tố phân giải chitin được minh họa trên Hình 1.2

Hình 1.2 Sản xuất NAG bằng chuyển hóa sinh học [71]

Ngoài ra NAG được sản xuất thông qua chủng biến đổi di truyền sử dụng glucose làm cơ chất Các đường hướng chuyển hóa D-glucosamin và tổng hợp NAG có thể thay đổi bằng kỹ thuật di truyền nhằm tăng hoạt tính enzym, giảm các sản phẩm kìm hãm và tăng ái lực với cơ chất, nên có thể tạo ra sản phẩm nồng độ cao Dùng vi sinh vật biến đổi gen và không tận dụng được nguồn chitin là nhược điểm của phương pháp

1.1.3.3 Phương pháp enzym

Chitinase là hệ enzym thủy phân chitin để thu nhận NAG bằng phương pháp enzym

Ở qui mô công nghiệp lớn, có thể sản xuất NAG bằng chitinase tinh sạch Tuy nhiên chitinase tinh sạch rất đắt kể cả từ các chủng biến đổi gen Nên trong thực tế hay dùng enzym thô thu nhận NAG

Phân giải chitin thành NAG bởi chitinase diễn ra theo hai giai đoạn Đầu tiên endochitinase (EC 3.2.1.14) phân giải chitin thành các oligomer, sau đó các oligomer bị phân giải thành các monomer bởi NAHase (EC 3.2.1.96) [127] Sáng chế của Haynes và cs

(1999) tại nước Mỹ đã thu nhận NAG bằng chitinase (bao gồm chitinase và chitobiosidase) thủy phân vỏ loài giáp xác [51]

Pichyangkura và cs (2002) đã dùng chitinase thô từ Burkholderia cepacia TU09 và Bacillus licheniformis SK-1 thủy phân bột mịn α-chitin, β-chitin tạo NAG Chitinase từ B cepacia TU09 thủy phân β-chitin trong 1 ngày và α-chitin trong 7 ngày đều có hiệu suất thu nhận NAG hơn 85% Chitinase từ B licheniformis SK-1 thủy phân β-chitin trong 6

ngày cho hiệu suất thu nhận NAG khoảng 75% Ngoài ra, hiệu suất thu nhận NAG đạt

41% khi thủy phân α-chitin bằng B licheniformis SK-1 [110]

Bohlmann và cs (2004) dã đưa ra sáng chế: NAG thu được với độ tinh sạch cao bằng cách thủy phân chitin bởi sinh khối nấm sợi [22]

Aiba (2005) đã dùng dịch enzym thô (gồm NAHase và chitinase) từ A hydrophila

H-2330 để sản xuất NAG với quy mô lớn [7]

Jung và cs (2007) công bố sản xuất NAG và N-acetylchitooligosaccharide bởi dịch

enzym thô từ Paenibacillus illinoisensis KJA-424 [60]

Sau thời gian 48h thủy phân β – chitin bằng chitinase từ nấm Aspergillus sp, hiệu suất thủy phân (HSTP) NAG đạt 65% Pha trộn hai enzym thô từ Trichoderma viride và Acremonium cellulolyticus thủy phân tốt β - chitin dạng bột [57, 132]

Hiện nay, tiềm năng sản xuất NAG là sử dụng hệ enzym tái tổ hợp chitinase được

nhân lên trong E.coli [76]

So với phương pháp hóa học, phương pháp thủy phân chitin bằng enzym diễn ra trong điều kiện nhẹ nhàng, không gây ô nhiễm môi trường và sản phẩm NAG có thể tinh sạch gần 100% nên được ưa thích hơn [74]

Đối với phương pháp thủy phân chitin bằng enzym thì phần chitin vô định hình thủy phân một cách dễ dàng, còn chitin liên kết chặt chẽ được thủy phân từ từ Hỗn hợp endochitinase, exochitinase (chitobiosidase và NAHase) là cần thiết cho sự thủy phân hoàn toàn chitin, khi hàm lượng NAHase cao thì NAG tạo ra có độ tinh khiết cao Do vậy, cấu trúc tinh thể chitin và thành phần enzym là hai yếu tố quan trọng trong sản xuất NAG bằng phương pháp enzym [27]

1.2 CHITIN

1.2.1 Cấu tạo hóa học và tính chất lý hóa của chitin

Chitin là 1 polysaccharide mạch thẳng gồm các glucose Hay nói cách khác: Chitin được cấu tạo từ các đơn phân là NAG liên kết bởi liên kết 1,4- β-glucoside và hình thành một mạng lưới các sợi có tổ chức Cấu trúc hóa học chitin giống với cấu trúc hóa học cellulose, chitosan Chúng chỉ khác nhau bởi các nhóm -

β-(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-D-OH, -NH2, -NHCOCH3 (Hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan, cellulose [70]

Chitin có màu trắng, cứng, không đàn hồi, không tan trong nước và các dung môi hữu cơ thông thường nhưng có thể được hòa tan trong các dung môi như hexafluoro-2-propanol, N,N-dimethylacetamid, hexafluroacetone, lithium thiocyanate Ngoài ra, chitin

có thể tan trong acid trichloroacetic (TCA), acid dichloroacetic (DCA) Muối LiCNS, Ca (CNS)2…có khả năng hydrat hóa mạnh mẽ để phân giải chitin [112]

Khi ở trong dung dịch HCl đậm đặc, chitin bị phân hủy hoàn toàn thành 88,5% Glucosamine và 11,5% axit acetic, quá trình thủy phân bắt đầu xảy ra ở mối nối glucoside, sau đó là sự loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3)

D-Đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc sẽ tạo thành chitosan vì chitin bị mất gốc acetyl: Chitin + n NaOH (đậm đặc) Chitosan + n CH3COONa

Trong cấu trúc tinh thể chitin, các chuỗi chitin tạo thành các tấm qua liên kết hydro Cấu trúc tinh thể chitin ổn định là do liên kết hydro, tương tác kỵ nước trong phân tử và giữa các phân tử Mỗi một chuỗi có nhiều liên kết hydro giữa các phân tử đường lân cận gọi là liên kết nội phân tử gồm liên kết hydro giữa nhóm cacbonyl với nhóm hydroxyl ở vị trí cacbon - 6 và một liên kết hydro thứ hai giữa nhóm OH ở cacbon - 3 và vòng oxi, tương

tự như liên kết hydro trong chuỗi cellulose Ngoài ra, các chuỗi còn được giữ vững bởi liên kết hydro mạnh giữa C = O và N – H [97] Liên kết hydro lớn làm tăng cường độ cứng chuỗi tinh thể chitin

Hình 1.4 Liên kết hydro nội phân tử chitin [97]

Chitin có trình tự sắp xếp cao, cấu trúc tinh thể Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X [97], người ta đã chứng minh chitin tồn tại ba dạng cấu hình: α-chitin, β-chitin và γ-chitin [45], các dạng này khác nhau về trình tự sắp xếp chuỗi trong vùng tinh thể Dạng chitin khác nhau chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (NAG) trong mạch thể hiện Hình 1.5 Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ- chitin được

Cấu trúc -chitin có thêm các liên kết hydro (được tạo bởi các nhóm hydroxymethyl (CH2OH) của các chuỗi liền kề nhau), trong khi đó không tìm thấy liên kết này ở cấu trúc β – chitin [100]

β-chitin (có nhiều trong mai mực) gồm các chuỗi song song, trong khi γ-chitin (nhiều trong nấm và nấm men) có hai chuỗi song song theo một hướng kết hợp chuỗi thứ ba với hướng đối diện song song, giữa các lớp không có loại liên kết hydro Loại γ-chitin rất ít nghiên cứu vì nó được cho là cấu trúc lỗi của một trong hai dạng α hoặc β – chitin chứ không phải là một dạng cấu trúc thứ ba của chitin hoặc có thể coi nó là biến thể của α-chitin [13]

Sự phân bổ các dạng này không liên quan tới nguyên tắc phân loại vì các dạng khác nhau có thể xuất hiện trong một cơ thể, mặc dù đặc tính chức năng khác nhau: α-chitin là dạng đầy đủ nhất, rất cứng [121] So sánh -chitin với ß-chitin, ß-chitin dễ bị thủy phân bởi enzym hơn nhưng -chitin tồn tại trong tự nhiên phổ biến hơn β-chitin và γ-chitin có tính bền, mềm dẻo và nhiều chức năng sinh lý hơn Dạng β có thể chuyển đổi sang dạng α bằng xử lý với kiềm nhưng không thể chuyển ngược lại và dạng γ-chitin có thể chuyển đổi sang α-chitin bằng cách xử lý với lithium thiocyanate [99]

1.2.2 Nguồn thu nhận chitin

Chitin được tách lần đầu tiên từ nấm vào năm 1811 [23] Chitin là hợp chất polimer

có mặt từ nhiều nguồn khác nhau Chitin là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Ở động vật bậc cao, chitin là thành phần chủ yếu trong mô da, nó giúp sự tái tạo và gắn liền các vết

trên da Ở thực vật, chitin có trong thành tế bào nấm họ Zygenmyctes, sinh khối nấm mốc,

một số loại tảo…

Các nguồn chitin từ công nghiệp thủy sản bao gồm vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực ống và mực nang Nhìn chung, hàm lượng chitin trong phế liệu giáp xác chiếm khoảng 10 – 60%

so với trọng lượng khô [148]

Hiện nay chitin được tách chiết từ vỏ giáp xác chủ yếu là bằng các phương pháp hóa học; ứng dụng công nghệ điện hóa để tách chiết và tinh chế chitin từ vỏ đầu tôm [6]; trong thời gian gần đây các phương pháp sinh học đã bắt đầu nghiên cứu sử dụng sản xuất chitin [14] Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản chiếm 30 – 35% tổng lượng nguyên liệu ở Việt Nam Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm 70 - 80% công suất chế biến

Các nhà máy chế biến thủy sản tiêu thụ lượng lớn nguyên liệu nên đã thải ra lượng đáng kể phế liệu trong đó phế liệu vỏ - đầu tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ là chủ yếu Ở Việt Nam, hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ lượng phụ phẩm giáp xác khá lớn khoảng 70000 tấn Riêng tỉnh Khánh Hòa, lượng phế liệu này khoảng 2257 tấn/ năm Phế liệu này thải trực tiếp ra môi trường và gây ô nhiễm lớn, nếu đem xử lý chất thải thì chi phí rất lớn Chính vì vậy, phế liệu ngành thủy sản Việt Nam (vỏ tôm, ghẹ, ) cần được tận dụng nhằm nâng cao lợi ích kinh tế, đồng thời giải quyết bài toán ô nhiễm môi trường do ngành chế biến thủy sản mang lại

1.3 CHITINASE

1.3.1 Hệ chitinase

Hệ thống chitinase thủy phân chitin gồm: Endochitinase (E.C 3.2.1.14), exochitinase (EC 3.2.1.52) gồm 1,4-β-chitobiosidase (E.C 3.2.1.30) và β-N-acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.96)

1.3.2 Đặc tính sinh hóa

Chitinase từ các nguồn khác nhau có đặc tính sinh hóa tương đối khác nhau

Chitinase (E.C 3.2.1.14) có khối lượng phân tử khoảng 20 kDa đến 90 kDa Khối lượng phân tử chitinase vi khuẩn từ 20 kDa đến 60 kDa, nhỏ hơn chitinase côn trùng (khối lượng phân tử từ 40 - 85 kDa); khối lượng phân tử chitinase thực vật giống khối lượng phân tử chitinase côn trùng (khoảng 40 kDa đến 85 kDa) [16] Khối lượng phân tử chitinase từ nấm mốc khoảng 27 kDa đến 190 kDa Chẳng hạn: khối lượng phân tử

chitinase từ Aspergillus sp và Coccidioides immitis khoảng 83 đến 97 kDa Hầu hết chế

phẩm chitinase từ nấm cho nhiều hơn 1 loại enzym như: 7 loại enzym gồm chitobiosidase (40 kDa) [50], hai loại NAHase (102 và 73 kDa) bốn loại endochitinases

1,4-β-(52, 42, 33 và 31 kDa) trong dịch chitinase từ Trichoderma harzianum [49]; ít nhất hai loại enzym từ Talaromyces flavus [81]; hai loại exochitinase và một endochitinase từ nấm

ký sinh loại lớn Stachybotrys [155] Chế phẩm chitinase chứa ít nhất sáu enzym khác nhau

từ nấm Metarhizium anisopliae [61] Endochitinase và exochitinase trong dịch enzym thô

từ Aeromonas sp PTCC 1691 [57] Dịch chitinase từ Penicillium oxalicum chứa NAHase

(132 kDa) [116] và endochitinase (54,9 kDa) [118]

Nhiệt độ tối ưu đối với chitinase từ Streptomyces sp M-20 là 30ºC [66]; từ Streptomyces rimosus là khoảng 40 - 45ºC [24]; từ Sanguibacter là 37ºC [180]; từ Penicillium ochrochloron MTCC 517 là 40oC [108]; từ Aspergillus sp là 40ºC [132], Hoạt độ chitinase từ Aspergillus sp khi để nhiệt độ ở 45ºC và 50ºC trong 63 h còn tương

ứng lần lượt 90%, 50% so với hoạt độ ở điều kiện nhiệt độ tối ưu [132]

Hoạt độ tương đối của chitinase tinh sạch từ Lactobacillus plantarum WCFS1 đạt

cao nhất ở khoảng nhiệt độ 35ºC - 40ºC trong thời gian 30 phút, nhưng giảm mạnh khi nhiệt độ trên 55ºC; ở nhiệt độ 37ºC và 50ºC, hoạt tính enzym còn lại lần lượt 82% và 58% sau thời gian 168 h; ở nhiệt độ lần lượt 37ºC và 50ºC, hoạt tính enzym còn lại ½ sau thời

gian tương ứng 20 ngày và 8,4 ngày [12] Chitinase tinh sạch từ Vibrio alginolyticus TK-22 hoạt động tối ưu ở 45ºC và ổn định ở 40ºC trong 30 phút [104]; chitinase tinh sạch từ Vibrio

sp P-6-1 ổn định ở 40ºC mất hoàn toàn hoạt tính ở 55ºC trong thời gian 30 phút [151] Nhiệt độ tối ưu của hầu hết chitinase từ nấm mốc khoảng 20 - 40ºC [50, 77, 81, 82,

111, 159] Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu của chitinase chịu nhiệt trong khoảng 45ºC đến 80ºC

như: Nhiệt độ tối ưu đối với chitinase từ Stenotrophomonas maltophilia là 45ºC [160]; từ Serratia marcescens là 50ºC [183]; từ Thermomyces lanuginosus là 55ºC, từ Aspergillus protuberus là 55ºC [48]; từ Talaromyces emersonii là 65ºC [93], hoạt độ chitinase từ Talaromyces emersonii khi để nhiệt độ 70ºC trong 20 phút hoặc để nhiệt độ 65ºC trong 25

phút đều còn 50% so với hoạt độ ở điều kiện nhiệt độ tối ưu [81] Nhiệt độ tối ưu đối với

chitinase từ Streptomyces thermoviolaceus OPC-520 là 80ºC [157] Endochitinase và

β-N-acetylhexosaminidase từ A flavus và F oxysporum đều có nhiệt độ tối ưu 62ºC, nhưng các enzym này từ P monoverticillium hoạt động tốt nhất tại 52ºC [147]

Chitinase từ Penicillium thường hoạt động ổn định ở nhiệt độ khá cao tới 45ºC; chitinase từ P aculeatum hoạt động ổn định ở 50ºC [20]

Rodriguez và cs (1993) khẳng định nhiệt độ tối ưu đối với chitobiosidase và chitinase

từ P oxalicum lần lượt là 45ºC và 50ºC Cả chitobiosidase và chitinase đều bền ở 45ºC trong thời gian 20 h [117] Rodriguez và cs (1995) cho rằng chitinase tinh sạch từ P oxalicum hoạt động tối ưu tại nhiệt độ 35ºC và ổn định ở nhiệt độ lên tới 45ºC trong thời

gian 120 phút Hoạt tính chitinase bị mất một nửa ở 45ºC và 50ºC trong khoảng thời gian tương ứng 53 phút và 23 phút [116]

Chitinase từ chủng vi sinh vật khác nhau hoạt động trong khoảng pH khác nhau

Khoảng pH hoạt động của chitinase tinh sạch từ Aeromonas hydrophila H- 2330 là pH 5,0

- 8,0 [52]; từ Aeromonas sp No 10S-24 chitinase là pH 4,0 - 9,0 [158]; từ Bacillus sp BG-11 là pH 7,5 - 9,0 [17]; từ Bacillus 13.26 là pH 7,0 - 8,0 [182]; từ Bacillus sp NCTU2

là pH 6,8 - 8,0 [165]; từ Vibrio sp là pH 4,0 - 9,0 [184]; từ Myrothecium verucaria là pH

4,0 - 6,5 [163] Chitinase nấm mốc hoạt động trong vùng pH 4 - 7 Theo Lee và cs (2009) công bố chitinase từ nấm sợi hoạt động tốt trong vùng axit nhẹ pH 4,0 - 7,0 [80]

Chitinase từ từng chủng vi sinh vật hoạt động tốt nhất tại pH tối ưu riêng Chitinase hoạt động tốt nhất tại pH tối ưu trong khoảng pH 3,5 - 5,5 như: pH tối ưu đối với chitinase

từ Aspergillus sp là 3,5 [132], từ Aeromonas sp No 10S-24 là pH 4,0 [158]; từ Sanguibacter là 4,6 [146]; từ Aspergillus protuberus [48] và Streptomyces sp M-20 đều là 5,0 [66]; từ Talaromyces emersonii CBS81470 là pH 5,0 - 5,5 [93]; từ Bacillus cereus

[113] Chitinase hoạt động cao nhất tại pH tối ưu trong khoảng pH 6,0 - pH 7,5 như: từ

Enterobacter sp G-1 là 6,0 [106]; từ Serratia marcescens là 6,0 [183]; từ Bacillus sp NCTU2 là pH 6,3 [165]; từ Vibrio alginolyticus H-8 [104] và Vibrio sp [184] đều là 6,5; từ Stenotrophomonas maltophilia là 6,8 [160]; từ Stenotrophomonas maltophilia là 6,8 [160];

từ Streptomyces rimosus [24] cũng như từ Penicillium ochrochloron MTCC 517 là 7,0; Chitinase tinh sạch từ Lactobacillus plantarum WCFS1 hoạt động tối ưu tại pH 7,5, bị vô

hoạt khi pH < 5, nhưng hoạt tính chitinase còn lại 80% ở 37ºC và khoảng pH 5 - 10 [12]

Ngoài ra chitinase ưa kiềm hoạt động ở pH tối ưu như pH 8,0 từ Bacillus circulans No.4.1; pH 9,2 từ Beauveria bassianse [146]; pH 11,0 từ Streptomyces sp [114]

So sánh với một số chitinase từ các chủng Penicillium, ta thấy chitinase từ P aculeatum có pH tối ưu là 5,5 [20]; chitinase từ P citrinum có hoạt tính mạnh nhất tại pH

6, bền ở khoảng pH từ 6 - 7 [4] β- N - acetylglucosaminidase và chitinase từ P oxalicum

có pH hoạt động tối ưu lần lượt 4,5 và 6,5; bền trong khoảng pH lần lượt 3,5 đến 7,0 và 4,0

đến 8,0 [117] Chitinase tinh sạch từ P oxalicum hoạt động tối ưu ở pH 5,0 và ổn định ở

khoảng pH từ 4,0 đến 6,0 trong thời gian 120 phút Enzym này bị vô hoạt nhanh khi pH < 4

hoặc pH > 7 [116]

Chitinase bị mất hoạt tính, nhiễm vi sinh vật trong khoảng thời gian bảo quản nhất định, nên với mục đích bảo quản enzym các chất phụ gia như NaCl, glycerol, benzoat natri, được bổ sung kết hợp với giải pháp nhiệt độ thấp Pradeep và cs (2015) đã đưa ra

các phương pháp bảo quản chitinase từ Streptomyces sp CS147: chế độ nhiệt độ 4ºC, nhiệt

độ phòng từ 25 - 30ºC kết hợp với chất phụ gia như Na2S2O4 (0,1% w/v), KCl (15% w/v)

và glycerol (30% v/v) để bảo quản chitinase từ Streptomyces sp CS147 Ở nhiệt độ 4ºC,

chitinase tinh sạch vẫn giữ nguyên 100% hoạt tính trong 18 tuần; nhưng còn lại 80% hoạt tính khi bổ sung chất phụ gia bảo quản như Na2S2O4, KCl và glycerol và còn lại 60% hoạt tính khi bảo quản bởi chất phụ gia NaN3 Mặt khác ở nhiệt độ phòng (từ 25 - 30ºC), không dùng chất phụ gia bảo quản thì chitinase mất hoàn toàn hoạt tính sau thời gian 14 tuần, nhưng hoạt tính chitinase vẫn giữ gần như 100% khi bảo quản bởi Na2S2O4, KCl và glycerol trong thời gian 14 tuần, hoặc bảo quản bằng NaN3 trong thời gian 11 tuần [114]

1.3.3 Cơ chế thủy phân chitin bởi chitinase thành NAG

Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo thành là hỗn hợp các chitooligomer trọng lượng phân tử khác nhau (di-acetylchitobiose, chitotriose, chitotetraose,…), nhưng chiếm đa số là các di-acetylchitobiose (NAG)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa [123] Sau đó 1,4-β-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(NAG)n với n ≥ 3] từ đầu không khử và cho sản phẩm chính là diacetylchitobiose (NAG)2 [38], không chứa NAG hoặc chitooligomer β-N-acetylhexosamindase phân cắt diacetylchitobiose cũng như các polymer chitin cao hơn gồm chitotriose và chitotetraose thành NAG [76] Chính vì thế, nên phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, 1,4-β-chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là NAG (Hình 1.6)

Cơ chế thủy phân chitin thành NAG qua 2 giai đoạn: đầu tiên chitinase thủy phân chitin mạch dài thành các chitooligosaccharide ngắn mạch hơn, sau đó NAHase thủy phân chitooligosaccharide ngắn mạch ngắn thành NAG [57]

Tương tự, một số tác giả đã nghiên cứu quá trình thủy phân chitin bởi chế phẩm enzym chứa cả endochitinase và NAHase thành NAG và đều cho rằng đầu tiên endochitinase thủy phân chitin thành N-acetyl chitooligosaccharides, sau đó N-acetyl chitooligosaccharides tiếp tục lần lượt được thủy phân bởi NAHase thành NAG [19, 145, 146] Mặt khác, Binod và cs (2007) cho rằng thủy phân chitin thành NAG qua một giai

đoạn thủy phân thì chế phẩm enzym thô từ Penicillium aculeatum NRRL 2129 và từ Trichoderma harzianum TUBF 927 phải chứa cả endochitinase và chitobiosidase Endochitinase hoạt tính cao nhất từ Penicillium aceleatum NRRL 2129 và chitobiosidase hoạt tính cao nhất từ Trichoderuma harzianum TUBF 927 thủy phân chitin thành NAG

đạt hiệu suất thu nhận cao [19] Ngoài ra, để thủy phân chitin bằng enzym thành NAG đạt hiệu suất thu nhận cao chỉ qua một giai đoạn thì chế phẩm enzym phải chứa đồng thời cả endochitinase và NAHase, đặc biệt hoạt tính NAHase cao và hoạt tính endochitinase phải tương đối thấp [9, 19, 148]

Binod và cs (2007) sản xuất NAG bằng cách dùng endochitinase hoạt tính cao nhất

từ Penicillium aceleatum NRRL 2129 và chitobiosidase hoạt tính cao nhất từ Trichoderuma harzianum TUBF 927 để thủy phân chitin thành NAG đạt hiệu suất thu

nhận cao [19]

Sashiwa và cs (2002) cũng khẳng định endochitinase và exochitinase trong dịch

enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 đều hỗ trợ nhau trong thủy phân cơ chất

chitin thành NAG [129]

Hình 1.6 Minh họa cơ chế hoạt động của chitinase

1.3.4 Một số giải pháp kỹ thuật thủy phân chitin thu nhận NAG

1.3.4.1 Các giải pháp tiền xử lý chitin

Chitin không hòa tan trong nước bởi tính kỵ nước, độ kết tinh cao, các liên kết hydro bền vững, nên nó khó bị thủy phân bởi enzym Sự thủy phân chitin tự nhiên bởi enzym bị hạn chế có thể là do khả năng tiếp cận với liên kết β-glycosidic trong nội mạch cấu trúc tinh thể gặp khó khăn [27].Mặt khác, khi thủy phân chitin bằng enzym thì phần chitin cấu trúc vô định hình dễ bị thủy phân hơn phần chitin cấu trúc tinh thể liên kết chặt chẽ [27]

Do đó để nâng cao hiệu quả thủy phân chitin thành NAG bởi chitinase, nhiều công trình nghiên cứu đã sử dụng phương pháp xử lý chitin bằng hóa học [64], nghiền bi [101], bằng sóng siêu âm [43] Ajavakom và cs (2012) cho thấy sóng siêu âm và vi sóng làm tăng quá trình thủy phân chitin thành NAG bằng acid [10]

A) Xử lý bởi tác nhân hóa học

Karube và cs (1993) đã nghiên cứu thấy rằng tác động nhiệt lên chitin trong dung môi kỵ nước hoặc chất hoạt động bề mặt sẽ làm suy yếu liên kết hydro, tương tác kỵ nước của cấu trúc tinh thể và do đó tạo thuận lợi cho hoạt động của các enzym phân hủy [64] Nới lỏng cấu trúc chitin bằng xử lý bởi các hydrocacbon mạch thẳng hoạt động bề mặt (như: Triton X-100, Tween 20, hexane, heptane, nonane, decane), hydrocacbon vòng thơm (benzene, toluene, o-oxylene, m-xylene, p-xylene), hoặc xử lý kết hợp làm nóng như đun sôi, nồi hấp, khuấy nhiệt, hoặc kết hợp siêu âm đã được nghiên cứu Phương pháp xử lý như vậy giúp phá hủy cấu trúc tinh thể và tăng tỷ lệ chuyển đổi của chitin Chitin khuấy nhiệt ở 100ºC với urea 0,1 M; 0,2 M; 0,3 M; trong thời gian lần lượt 30 phút và 2 h làm tăng tỷ lệ chuyển đổi chitin từ 7% đến 13,9% so với nguyên liệu ban đầu không qua xử lý khi thủy phân bằng lysozyme Ngoài ra xử lý chitin với dodecane kết hợp siêu âm giúp tăng tỉ lệ chuyển đổi từ 4,4% đến 13,1% [64]

Bên cạnh đó, liên kết hydro và tương tác kỵ nước là cần thiết để duy trì cấu trúc ba chiều của enzym Các enzym phân hủy chitin có thể bị bất hoạt trong điều kiện nghiêm ngặt Vì vậy cần sử dụng nồng độ thấp các chất hóa học để hoạt động xúc tác enzym vẫn diễn ra trong phản ứng thủy phân chitin [27]

Gần đây, endochitinase chịu nhiệt nóng tốt đã được tìm thấy trong dịch dùng lên men của vi khuẩn, và có khả năng tương thích cao với chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl sulfate (SDS) [27] Trong tương lai, những enzym này có thể được áp dụng để nâng cao hiệu quả thủy phân chitin

B) Xử lý bởi tác nhân cơ học

Cellulose từ rơm rạ là polysaccharide với cấu trúc tinh thể giống chitin có thể thay đổi mức độ tinh thể từ 74,2% xuống 4,9% bằng nghiền búa và hơn 50% cellulose từ rơm bị chuyển hóa thành glucose khi thủy phân enzym trong điều kiện nhẹ nhàng Rơm cắt ngắn 5 – 8 cm đưa đi nổ hơi sau đó nghiền thành bột mịn kích thước 60 µm giúp quá trình thủy phân thu đường khử cao nhất Tiến hành nghiền kết hợp nổ hơi có thể thủy phân 100% các chất lignocellulose bằng enzym [150]

Nghiền tác động làm chitin thay đổi cấu trúc và mức độ tinh thể [105] Bên cạnh đó, sau xử lý bằng phương pháp nghiền, kích thước chitin thường giao động từ 50 µm đến 500

µm [27] Do vậy, nghiền đã làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc của chitin với enzym nên giúp thủy phân tốt

Chitin có kích thước khác nhau bị thủy phân bởi dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 trong thời gian 10 ngày thành NAG đạt hiệu suất thu nhận khoảng 64%

- 77% Hầu hết NAG có độ tinh sạch 100% được sản xuất bởi dịch enzym này [129] Ảnh hưởng giải pháp xử lý cơ học hoặc xử lý hóa học lên khả năng thủy phân chitin được Kim và cs (1998) nghiên cứu so sánh và khẳng định chitin cua hoặc chitin tôm đã xử

lý hóa học (gel chitin) cho lượng NAG tạo thành cao hơn so với bột chitin cua hoặc tôm kích thước từ 180 - 250 μm [67]

Cùng chung nồng độ cơ chất chitin và thời điểm thủy phân 24 h, chế phẩm chitinase

thô đã được cô đặc từ Penicillium monoverticillium CFR 2, từ Aspergillus flavus CFR 10

và từ Fusarium oxysporum CFR 8 thủy phân cơ chất gel chitin (chitin được xử lý bằng

phương pháp hóa học) thành NAG với nồng độ lần lượt 95,6; 96,6 và 96,1 mmol/l Trong khi đó, các chủng này lần lượt thủy phân cơ chất tinh thể α-chitin thành NAG đạt nồng độ lần lượt 10,11; 6,85 và 10,7 mmol/l [147]

Trong số các dạng chitin (gel chitin, bột chitin kích thước khác nhau, chitin xử lý bởi tiệt trùng với 1,0% dimethylacetamide, chitin xử lý bởi tiệt trùng với 0,1% H2SO4), Kim và

cs (1998) cho rằng bột chitin kích thước 180 - 250 μm giúp Serratia mareescens sinh tổng

hợp chitinase cao nhất, nhưng kích thước < 180 μm hoặc > 250 μm làm giảm sinh tổng hợp chitinase [67]

C) Xử lý bởi tác nhân vật lý

Phương pháp hấp và nổ hơi được sử dụng làm phồng hạt chitin, phương pháp này tăng hiệu quả khi kết hợp với dimethyl acetimide, và H2SO4 nồng độ thấp (0,1%) để phá

vỡ liên kết hydro trong liên kết chuỗi chitin [51]

Nhiệt độ nổ hơi khoảng 160ºC đến 238ºC, giới hạn có thể lên tới 400ºC, sau thời gian

từ 1 đến 10 phút thì hơi được xả đột ngột bởi xilanh, tạo hiện tượng vỡ cấu trúc vật liệu, làm khu vực tiếp xúc bề mặt tăng lên, có thể giúp phản ứng enzym tăng đến 10 lần so với vật liệu không được xử lý Cơ chế dựa vào giảm áp suất đột ngột, nguyên liệu bị nén và nổ [46, 98]

Chitin đã được quan sát qua sự thay đổi cấu trúc sau nổ hơi cho thấy giảm 11,28% các chỉ số tinh thể khi xử lý với tỷ lệ chitin/nước là 0,1 g/ml [43]

D) Xử lý bởi tác nhân bức xạ

Chiếu xạ bao gồm các tia gamma, chùm tia điện tử (electron), tia bức xạ lò vi sóng

Vi sóng có tần số 0,3 - 300 GHz nằm giữa ranh giới tia hồng ngoại và bức xạ sóng cao tần có thể chuyển hóa năng lượng điện từ thành năng lượng nhiệt thúc đẩy phản ứng hóa học và phản ứng enzym [120]

Tia bức xạ có thể ưu tiên phân tách các liên kết glucoside trong chuỗi phân tử Chiếu

xạ ở mức cao có thể dẫn đến sự phân hủy các oligosaccharide và các cấu trúc vòng glucose Tuy nhiên, các phương pháp chiếu xạ là tốn kém và khó khăn trong việc áp dụng công nghiệp [98]

E) Xử lý bởi tác nhân sóng siêu âm

Sóng siêu âm gây biến dạng nén giãn môi trường làm cho các phân tử liên tục bị ép lại và giãn ra dao động xung quang vị trí cân bằng dẫn đến sinh nhiệt Lực tác động này đủ lớn để thắng lực hút giữa các phân tử, tạo thành lỗ vi mô trên nguyên liệu Nếu quá trình này xảy ra trong nước thì những lỗ đó sẽ bị hơi nước hoặc các khí hoà tan choán đầy, hình thành bóng bọt rồi dẫn đến hiện tượng vỡ bóng bọt, tạo nhiệt độ cao trong nguyên liệu [137] Chitosan là dẫn xuất của chitin, xử lý siêu âm làm cấu trúc của nó thay đổi bằng cách giảm liên kết hydro giữa các phân tử và nội phân tử và làm giảm trọng lượng phân tử do tạo thành lỗ hổng và hiện tượng vỡ bóng bọt Khi xử lý chitosan bằng siêu âm kết hợp hóa chất giúp giảm 22,34% đến 27,26% khối lượng phân tử ban đầu, mức độ tinh thể giảm từ 19,16% xuống 9,04% Có thể thấy nhiều yếu tố tác động lên cấu trúc tinh thể sẽ là hiệu quả hơn nếu kết hợp các tác động khi xử lý Tương tự siêu âm làm giảm mức độ tinh thể của chitin và do vậy nâng cao hiệu quả thủy phân [43]

1.3.4.2 Điều kiện thủy phân chitin ra NAG bởi chế phẩm chitinase

Chế phẩm chitinase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau có khả năng thủy phân chitin thành NAG cao nhất ở các điều kiện thủy phân khác nhau

A) Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả năng thủy phân chitin thành NAG

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới khả năng thủy phân chitin thành NAG bởi chitinase Khoảng nhiệt độ thủy phân chitin bằng chế phẩm chitinase thành NAG chính

là khoảng giới hạn nhiệt độ hoạt động chitinase Chitinase được sinh tổng hợp từ vi sinh vật khác nhau sẽ có khoảng nhiệt độ hoạt động khác nhau Ở nhiệt độ hoạt động tối ưu, chitinase có khả năng thủy phân chitin thành NAG là cao nhất Cụ thể: Nhiệt độ tối ưu cho thủy phân cơ chất gel chitin thành NAG là 40ºC bằng chế phẩm chitinase thô từ chủng vi

sinh vật như Aeromonas sp GJ-18 [74], Aspergillus sp [132], Penicillium sp LYG 0704 [80], Penicillium chrysogenum [107], hoặc bằng NAHase tinh sạch từ P oxalicum [116, 118], Chế phẩm chitinase từ Trichoderma harzianum có khả năng thủy phân chitin trong

khoảng nhiệt độ rộng từ 25 - 60ºC và nhiệt độ tối ưu cho thủy phân chitin thành NAG là

40ºC [59] Ở nhiệt độ 37ºC, chế phẩm chitinase từ Aeromonas sp PTCC 1691 thủy phân

gel chitin thành NAG cao nhất đạt hiệu suất thu nhận 79% [57],

Chế phẩm enzym thô từ Aeromonas sp chứa hoạt tính NAHase và chitobiosidase; ở

nhiệt độ trên 50ºC, NAHase bị vô hoạt, nhưng chitobiosidase lại ổn định Nên ảnh hưởng

của nhiệt độ tới thủy phân gel chitin thành NAG bởi chế phẩm enzym thô từ Aeromonas sp

đã được các nhà khoa học nghiên cứu Kuk và cs (2015) cho rằng chế phẩm enzym thô từ

Aeromonas sp GJ-18 thủy phân gel chitin ở nhiệt độ dưới 45ºC cho sản phẩm chính là

NAG, cùng với lượng nhỏ (NAG)2 và (NAG)3, nhưng nhiệt độ thủy phân trên 50ºC thì (NAG)2 là sản phẩm chính [74] Ngoài ra Kuk và cs (2005) cho rằng trong 120 h thủy phân, ở nhiệt độ 45ºC, NAG là sản phẩm chính (chiếm 94%) với hiệu suất thu nhận đạt 74%, nhưng ở 55ºC thì (NAG)2 lại là sản phẩm chính (chiếm 86%) [73] Trong 120 h thủy

phân, enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 thủy phân gel chitin cho sản phẩm tạo

thành gồm 74% NAG và 4,8% (NAG)2 ở nhiệt độ 45ºC, nhưng nhiệt độ 55ºC thì sản phẩm tạo thành gồm 3,9% NAG, 34,7% (NAG)2 và 1,6% (NAG)3 [129]

B) Ảnh hưởng pH tới khả năng thủy phân chitin thành NAG

pH môi trường ảnh hưởng trực tiếp tới trung tâm hoạt động của enzym Chế phẩm chitinase thô từ vi sinh vật có khả năng thủy phân cơ chất chitin thành NAG trong khoảng

pH nhất định và khả năng thủy phân này đạt cao nhất tại pH tối ưu pH tối ưu cho sự thủy

phân gel chitin thành NAG bởi chế phẩm enzym từ Aspergillus sp là pH 3,5 [132], bởi chế phẩm chitinase thô từ Aeromonas sp GJ-18 là pH 5 [74], bởi chế phẩm enzym thô từ Aeromonas sp PTCC 1691 là pH 8 Khoảng pH tối ưu cho chitinase từ Penicillium oxalicum thích hợp để thủy phân chitin là 4,5 - 6,5 [116]

C) Ảnh hưởng nồng độ cơ chất tới khả năng thủy phân chitin thành NAG

Ở tỷ lệ gel chitin/ enzym là 10 mg/U trong điều kiện tối ưu và giữ nồng độ enzym

không đổi, Kuk và cs (2005) cho rằng chế phẩm chitinase thô từ Aeromonas sp GJ-18 thủy

phân gel chitin thành NAG đạt HSTP lớn nhất 94,9% [74] Jamialahmadi và cs (2011) khẳng định ở điều kiện tối ưu và tỷ lệ gel chitin/enzym là 0,5 mg/U thì chế phẩm enzym

thô từ Aeromonas sp PTCC 1691 thủy phân gel chitin thành NAG đạt hiệu suất thu nhận

lớn nhất 79%; khi giữ nồng độ enzym không đổi, nồng độ cơ chất gel chitin tăng từ 5 đến

10 mg/ml thì HSTP ra NAG tăng mạnh, nhưng nồng độ gel chitin tăng thêm nữa lại làm HSTP NAG giảm xuống [57] Sukwattanasinitt và cs (2002) khẳng định ảnh hưởng nồng

độ cơ chất lên NAG tạo thành khi dùng hỗn hợp enzym (9:1 cellulase Ac và lipase An) như sau: tăng nồng độ β-chitin và giữ nồng độ enzym không đổi dẫn đến hiệu suất thu nhận NAG giảm xuống Cụ thể nồng độ cơ chất tăng từ 10 đến 40 mg/ml làm hiệu suất thu nhận NAG giảm một nửa từ 61% xuống 28% Và điều này đã được giải thích rằng: nồng độ cơ chất tăng làm tăng độ nhớt, dẫn đến giảm sự khuếch tán giữa enzym và cơ chất nên HSTP NAG giảm [144]

D) Ảnh hưởng thời gian và nồng độ enzym tới khả năng thủy phân chitin thành NAG

Thời gian thủy phân không những ảnh hưởng đến chi phí của quá trình mà còn ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm sau thủy phân Xác định thời gian thủy phân thích hợp

sẽ giúp tiết kiệm chi phí, nâng cao hiệu suất của quá trình

Theo nghiên cứu của Pichyangkura và cs (2002), α-chitin và β-chitin có thể thủy phân hoàn toàn với chitinase (EC 3.2.1.14) và β-N-acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.52) để

sản xuất NAG Chitinase từ B cepacia TU09 thủy phân β-chitin và α-chitin tương ứng

trong vòng 24 h và 168 h cho hiệu suất thu nhận NAG lớn hơn 85%, trong khi đó chitinase

từ B licheniformis SK-1 thủy phân hoàn toàn β-chitin trong 144 h đạt hiệu suất thu nhận

NAG cuối cùng là 75% cùng 20% chitobiose [110]

Trong điều kiện thủy phân tối ưu, Kuk và cs (2005b) khẳng định chế phẩm chitinase

từ Aeromonas sp GJ-18 thủy phân gel chitin thu nhận NAG với hiệu suất thu nhận NAG

83,0% và 94,9% tương ứng thời gian thủy phân 120 h và 216 h [74] Bên cạnh đó, Kuk và

cs (2005a) cho rằng enzym thô từ Aeromonas sp thủy phân gel chitin thành NAG với hiệu

suất 74% trong 120 h thủy phân [73]

Hiệu suất thu nhận NAG khoảng 66% - 77% tại thời điểm 240 h thủy phân bột

α-chitin bởi chế phẩm enzym từ A hydrophila H-2330 được công bố bởi Sashiwa và cs

(2002) [129]

Khi thủy phân chitin thành NAG bởi chế phẩm enzym với nồng độ càng cao thì thời gian thủy phân càng giảm Để tiết kiệm thời gian và lựa chọn nồng độ enzym hợp lý, nhiều nhà nghiên cứu đã khảo sát nồng độ enzym đối với các loại chế phẩm chitinase thô khác nhau ảnh hưởng tới hiệu suất thủy phân chitin thành NAG trong khoảng thời gian khác nhau như:

Kuk và cs (2005) cho rằng nồng độ enzym của chế phẩm chitinase thô từ Aeromonas

sp GJ-18 càng cao thì NAG tạo thành càng lớn khi cùng chung nồng độ cơ chất gel chitin; tuy nhiên lượng NAG tạo thành không khác nhau đối với tỷ lệ nồng độ enzym và cơ chất khoảng 10 U/100 mg và 8 U/100 mg; hiệu suất thủy phân gel chitin ra NAG tăng mạnh ở

120 h nhưng gần như không đổi sau 168 h [74]

Jamialahmadi và cs (2011) cho rằng ở điều kiện tối ưu, chế phẩm enzym thô từ

Aeromonas sp PTCC 1691 thủy phân gel chitin thành NAG lớn nhất khi tỷ lệ enzym/gel

chitin là 2 U/mg, hiệu suất thu nhận NAG tăng dần và đạt lớn nhất 79% tại thời điểm 24 h nhưng sau đó gần như không đổi; trái lại không khác nhau khi tỷ lệ nồng độ enzym và cơ chất từ 4 U/10 mg và 8 U/10 mg [57] Ngoài ra Jung và cs (2007) công bố enzym thô từ

Paenibacillus illinoisensis KJA-424 thủy phân chitin thành NAG tăng liên tục trong 24 h

và đạt hiệu suất thu nhận NAG cao nhất 62,2% tại 24 h [60]

Chitinase từ Burkholderia cepacia TU09 thủy phân β-chitin (bột chitin mai mực kích

thước 3 µm) và α-chitin (bột chitin vỏ cua kích thước 14 μm) thành NAG với hiệu suất thu

nhận hơn 85% trong thời gian tương ứng 24 h và 168 h Chitinase từ Bacillus licheniformis

SK-1 thủy phân hoàn toàn β-chitin trong 144 h, cho hiệu suất thu nhận NAG 75% Ở tỷ lệ

enzym/cơ chất β-chitin là U/100 mg, B cepacia TU09 thủy phân β-chitin cho hiệu suất thu

nhận NAG 90% trong 24 h thủy phân [110]

Binod và cs (2007) sản xuất NAG bằng cách dùng endochitinase hoạt tính cao nhất

từ Penicillium aceleatum NRRL 2129 và chitobiosidase hoạt tính cao nhất từ Trichoderuma harzianum TUBF 927 để thủy phân chitin thành NAG đạt hiệu suất thu

nhận cao [19]

Jamialahmadi và cs (2011) công bố endochitinase và exochitinase trong dịch enzym

thô từ Aeromonas sp PTCC 1691 [57]; Sashiwa và cs (2002) cũng khẳng định endochitinase và exochitinase trong dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 đều

hỗ trợ nhau trong thủy phân cơ chất chitin thành NAG [129]

Để enzym thủy phân chitin thành NAG đạt hiệu suất thu nhận cao, thì chế phẩm enzym phải chứa endochitinase với hoạt tính thấp và β-N-acetylhexosaminidase hoạt tính cao [9, 19, 148]

1.4 SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ VI SINH VẬT

Trong các nguồn thu nhận chitinase thì chitinase từ vi sinh vật là quan trọng và chiếm số lượng nhiều hơn cả Nhiều nghiên cứu thu hồi dịch chitinase thô từ vi sinh vật

như: thu hồi dịch chitinase thô từ Bacillus licheniformis SK-1, Aeromonas hydrophila H2330 [129], Aeromonas sp GJ-18 [74] Aspergillus niger, Carcica papaya L và Acremonium cellulolyticus [128], Trichoderma viride [7], từ một số chủng nấm mốc như Penicillium monoverticillium CFR 2, Aspergillus flavus CFR 10 và Fusarium oxysporum

CFR 8 [146],

1.4.1 Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase

Vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau trong đất, phế thải giáp xác, khu vực bón phân, và dòng suối nóng [182] Hầu hết chitinase được tạo ra từ vi sinh vật - phân lập từ mẫu đất biển Chitinase được tạo ra nhằm phân giải chitin trong môi trường cung cấp nguồn cacbon cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Nguồn vi sinh vật đáng kể có khả năng sinh tổng hợp chitinase là vi khuẩn Chitinase

vi khuẩn tạo ra phần lớn từ họ Alteromonas [157], Bacillus (B megaterium, B licheniformis, B circulans, ) [99], Escherchia [166], Pseudomonas (P aeruginosa , P maltophilia) [164], Serratia (S marcescens, S liquefaciens), Arthrobacter, Beneckea, Enterobacter Chromobacterium, Klebriella, Clostridium (C perfringens, C puraputrificum, ), Vibrio (V fluvialis, V harveyi, V vulnificus)

Nguồn xạ khuẩn: Chitinase xạ khuẩn đại đa số được tạo ra từ họ Streptomycetes (S viridificans, S aureofaciens, S coelicolor, S glaucescens, S kanamycitis, S lividans, S parvies và S venezuelae) [44]

Nguồn nấm sợi: Chitinase từ nấm mốc phần lớn do họ Trichoderma và Aspergillus (A nidulans,…) sinh tổng hợp tạo ra, tiếp đó là Penicillium (P citrinum [4], P janthinellum [36], P aculeatum NRRL 2129 [20], P chrysogenum [107], Pencillium sp

LYG 0704 [80], Aspergillus sp [132], Aeromonas sp PTCC 1691 [57], A hydrophila

H-2330 đều có khả năng sinh tổng hợp cả endochitinase và exochitinase [129], đặc biệt P oxalicum có khả năng sinh tổng hợp endochitinase [118] và NAHase [116] Penicillium monoverticillium CFR 2, Aspergillus flavus CFR 10 và Fusarium oxysporum CFR 8 đều

sinh tổng hợp cả endochitinase và NAHase, tỷ lệ hoạt độ endochitinase so với NAHase là thấp [146]

Penicillium aculeatum NRRL 2129 có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao, nhưng Trichoderma harzianum TUBF 927 lại sinh tổng hợp chitobiosidase hoạt tính cao [19]

Hiện nay, Penicillium có khả năng sinh tổng hợp hàng loạt các enzym ngoại bào [109]

1.4.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp chitinase

Cacbon chiếm tỉ lệ trên 50% trọng lượng khô tế bào, nó tồn tại trong tế bào chất, ở tất cả các phân tử của enzym, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất Ngoài nhiệm vụ

là nguồn cung cấp năng lượng, tạo thành những tiền chất, hợp chất cacbon còn tạo ra các quá trình oxy hóa khử để biến đổi những tiền chất này thành những sản phẩm trung gian hoặc những sản phẩm cuối cùng dùng xây dựng tế bào, đồng thời tích tụ trong môi trường một vài sản phẩm sinh tổng hợp

Nguồn cacbon là nhân tố chính ảnh hưởng tới sinh tổng hợp chitinase từ các loài vi sinh vật [48, 139]

Khi bổ sung glucose, tinh bột, lamanarin, β-glucan và glycerol vào môi trường lên men thì sinh tổng hợp chitinase từ vi khuẩn bị ức chế Nhưng đối với nấm mốc, sinh tổng hợp chitinase lại tăng do thêm pectin, tinh bột, lamanarin, β-glucan Sinh tổng hợp

chitinase ngoại bào từ Fusarium chlamydosporum với hoạt độ lớn nhất khi sử dụng saccarose 10 mM [91] Streptomyces viridificans sinh tổng hợp chitinase gấp 2 khi môi

trường chứa arabinose (trong số các loại đường pentose và hexose), nhưng chứa glucose lại

gây kìm chế sự tạo enzym này [44] Sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ Vibrio alginolyticus ở 2 g/l glucose [104], từ Alcaligenes xylosoxydans sinh tổng hợp chitinase ở 2

g/l tinh bột [162]

Nếu môi trường chỉ chứa nguồn cacbon dễ hấp thụ như glucose, tinh bột tan thì vi sinh vật phát triển về mặt sinh khối, nghĩa là lượng sinh khối thu được nhiều nhưng lượng chitinase mà vi sinh vật tiết ra môi trường là rất ít Muốn thu được enzym thì cần phải có chất cảm ứng Chất cảm ứng cho sinh tổng hợp chitinase là chitin

Dạng chất cảm ứng để sinh tổng hợp chitinase từ vi sinh vật - phân lập ở đất biển có thể là gel chitin, vỏ cua và vỏ tôm đã xử lý [34]

Nguồn cacbon trong môi trường lên men cạn kiệt thì P oxalicum sinh tổng hợp cả

chitinase and β-N-acetylglucosaminidase Môi trường lên men chứa cả glucose và 6 g/l gel

chitin thì β-N-acetylglucosaminidase có hoạt tính cao nhất Chitinase được sinh tổng hợp cao nhất khi môi trường lên men chứa glucose cùng NAG hoặc 2 g/l gel chitin [117] Kim và Ji (2001) khẳng định bột chitin kích thước từ 180 - 250 µm giúp

Streptomyces griseus HUT 6037 sinh tổng hợp chitinase tốt hơn so với gel chitin [68]

Ngoài ra, Setthakaset và cs (2008) cho rằng trong số các dạng chitin cảm ứng như bột chitin, β-chitin kích thước khoảng 50 μm – 100 μm, gel chitin thì dạng chất cảm ứng ảnh

α-hưởng tới sinh tổng hợp chitinase từ Aspergillus sp lớn nhất là dạng bột β-chitin, kém nhất

là bột α-chitin [132]

Gel chitin là dạng chất cảm ứng tốt nhất để Streptomyce cinereoruber lên men sinh

tổng hợp chitinase hoạt độ 20,7 U/ml Ngoài ra, gel chitin cũng là chất cảm ứng tốt cho

Aspergillus niger sinh tổng hợp chitinase hoạt độ 16,4 U/ml [149] Mahadevan và Crawford cho rằng chủng Streptomyces sinh tổng hợp chitinase cao nhất khi nồng độ gel chitin khoảng 0,8 - 1,4 g/l [89] Saima và cs (2013) khẳng định Aeromonas hydrophila HS4

và A punctata HS6 sinh tổng hợp chitinase ngoại bào cao nhất lần lượt đạt 64,41 U/ml và

59,41 U/ml khi nồng độ gel chitin 0,3% [124]

Bacillius aminolquefaciens, B megatrium và B subtilis sinh tổng hợp chitinase ở

hoạt độ lần lượt 1,9 mU/l; 3,9 mU/l, 3,6 mU/l và 1,7 mU/l khi sử dụng chất cảm ứng 1% chitin từ phế phẩm vỏ tôm; ngoài ra các chủng này sinh tổng hợp chitinase với hoạt độ cao lần lượt là 2,7 mU/l; 3,4 mU/l; 2,2 mU/l và 4,3 mU/l ở chất cảm ứng 1% chitin thương mại[122]

Sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ Fusarium chlamydosporum ở nồng độ 0,5% gel chitin [91], từ Aeromonas sp no 16 ở nồng độ 1,5% gel chitin [55], từ Aeromonas sp GJ-

18 ở 1% gel chitin [73], từ Streptomyces viridificans ở 1,5% gel chitin [44], từ Serratia

marcescens XJ-01 ở nồng độ 0,75% gel chitin [171], từ Streptomyces cinereoruber ở nồng

độ 5 g/l thành tế bào Aspergillus niger, từ A carneus ở 10 g/l chitin, từ Cellulosimicrobium cellulans 191 ở 15 g/l chitin [88], từ Vibrio alginolyticus ở 3 g/lchitin mai mực [104], từ

Pseudomonas aerogunisa K-187 ở 3% phế thải vỏ tôm và cua và 0,1% carboxymethy

chitin [126]

Môi trường lên men chứa chất cảm ứng chitin 10% giúp nấm sợi P oxalicum sinh

tổng hợp chitinase hoạt tính cao nhất [3]

1.4.3 Ảnh hưởng của nguồn và nồng độ nitơ tới sinh tổng hợp chitinase

Thành phần quan trọng của tế bào đều chứa Nitơ (Protein, axit nucleic, enzym, ) Nitơ chiếm 10 - 15% trọng lượng khô Nitơ tham gia cấu tạo protein như: axit amin, glycoprotein, lipitprotein, peptidoglucan Protein chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần chất khô (phổ biến từ 60 - 85%) Protein giữ chức năng tham gia cấu trúc mọi bào quan của

tế bào, đặc biệt enzym giữ vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất ở nấm sợi, trong

đó cả enzym deacetyl hóa chitin thành chitosan trên thành tế bào [42]

Nguồn nitơ là cần thiết để đạt hiệu suất cao và có lợi về mặt kinh tế trong lên men sinh tổng hợp enzym Các loại hợp chất nitơ mà nấm sợi có thể đồng hóa được thường là cao nấm men (CNM), cao malt, cao ngô, và các nguồn nitơ vô cơ như NH4NO3, (NH4)2SO4, NaNO3, urea…Trong đó nguồn cao nấm men, pepton là thành phần mà các loài nấm tiếp hợp và ưa sử dụng nhất [138]

Nguồn nitơ là nhân tố chính ảnh hưởng tới sinh tổng hợp chitinase từ các loài vi sinh vật [48, 139]

Trong sinh tổng hợp chitinase, nhu cầu nitơ về nồng độ và nguồn khác nhau đối với

từng chủng vi sinh vật Sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ Myrothecium verucaria trên

môi trường (g/l): cao nấm men, 0,5; pepton, 0,5 Đặc biệt bổ sung 0,03% urea thì tổng hợp

chitinase tăng gấp 4 [163] Fusarium chlamydosporum sinh tổng hợp chitinase lớn nhất khi

môi trường chứa NaNO3 15 mM [91] Aspergillus carneus sinh tổng hợp chitinase lớn nhất

ở môi trường chứa cao nấm men 3 g/l [134] Aeromonas sp GJ-18 sinh tổng hợp chitinase

ngoại bào cao nhất trong môi trường lên men chứa 1% tryptone [73]

Peptone 3% là nguồn nitơ tốt nhất để Pseudomonas stulzeri YPL-1 tạo chitinase [53] Môi trường lên men sinh tổng hợp chitinase cao nhất đối với Vibrio alginolyticus

chứa (g/l): pepton, 7,5 và cao nấm men, 2 [104] 0,5% (NH4)2SO4 được xem là nguồn nitơ

tốt nhất cho Serratia marcescens XJ-01 sinh tổng hợp chitinase [171]

Môi trường lên men chứa hỗn hợp 4,0 g/l CNM và 2,0 g/l tryptone sinh tổng hợp

chitinase cao nhất đạt 6,9 U/ml từ Cellulosimicrobium cellulans 191 [88] Alcaligenes xylosoxydans sinh tổng hợp chitinase lớn nhất khi môi trường lên men 4 g/l CNM [162] Khả năng sinh tổng hợp chitinase từ các loài Streptomyces tăng khi bổ sung

(NH4)2SO4 nhưng giảm khi bổ sung CNM vào môi trường lên men [102] Ngược lại

Bacillus licheniformis TH-1 sinh tổng hợp chitinase tăng khi bổ sung CNM vào môi trường lên men [8] và B pumilus [115, 154]

1.4.4 Ảnh hưởng của nguyên tố khoáng tới sinh tổng hợp chitinase

Ngoài nguồn cacbon, nitơ thì các nguyên tố khoáng cũng có tác dụng nhất định đối với quá trình phát triển của vi sinh vật, chúng cần thiết cho sự duy trì cân bằng sinh lý tế bào Các nguyên tố khoáng bao gồm các nguyên tố vi lượng như Mn, Cu, Fe, Zn…được bổ sung dạng muối vô cơ như KH2PO4, MgSO4… Mỗi nguyên tố khoáng có chức năng riêng đối với vi sinh vật như photpho tham gia thành phần cấu tạo của axit nucleic, phophoprotein, photpholipit và nhiều coenzym quan trọng như ATP, NADP, ADP…Các kim loại này đóng vai trò quan trọng để sinh tổng hợp chitinase từ một số vi sinh vật [72, 102]

Môi trường lên men sinh tổng hợp chitinase lớn nhất từ Streptomyces cinereoruber,

từ Aspergillus niger đều cần lượng nhỏ các thành phần như: 0,2% K2HPO4, 0,1% MgSO4, 0,01% FeSO4 7H2O [149] Sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ Cellulosimicrobium

cellulans 191 cần 4,0 g/l MgSO4.7H2O; 1,2 g/l KH2PO4; 2,8 g/l K2HPO4 [88], từ

Alcaligenes xylosoxydans cần K2HPO4 0,2%, MgSO4.7H2O 0,1% và FeSO4.7H2O 0,01%

[162], từ Vibrio alginolyticus cần K2HPO4, 2 g/l và nước biển, 75% (v/v) [104], từ

Aeromonas sp GJ-18 cần 1% NaCl [73],

Các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc và cấu hình của

enzym Ảnh hưởng của các ion kim loại lên sinh tổng hợp chitinase từ Aeromonas hydrophia HS4 và A punctata HS6 đã được công bố bởi Saima và cs (2013) Khi bổ sung

một số ion kim loại vào môi trường thấy: Co2+ và Mn2+ giúp Aeromonas hydrophia HS4 và

A punctata HS6 sinh tổng hợp chitinase tăng; nhưng Ca2+ và Mg2+ gây ức chế Aeromonas hydrophia HS4 sinh tổng hợp chitinase; Fe2+, Mg2+, và Hg2+ ức chế A punctata HS6 sinh

tổng hợp chitinase [124]

Tương tự MnSO4 and FeSO4 đều đóng vai trò quan trọng để sinh tổng hợp chitinase

từ Aspergillus terreus [41], cũng như từ B pumilus [154]

Trong môi trường lên men, ở nổng độ Mg2+

và PO43- thấp, Streptomyces sinh tổng

hợp chitinase tăng nhưng ở nổng độ Mg2+ và PO43- cao thì ngược lại [102] PO43- đóng vai

trò quan trọng sinh tổng hợp chitinase từ Paenibacillus sp D1 [139],

1.4.5 Ảnh hưởng của pH tới sinh tổng hợp chitinase

pH môi trường lên men ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật bởi lẽ ion H+ và OH- tác động trực tiếp lên màng nguyên sinh chất, làm thay đổi sự vận chuyển chất cảm ứng vào tế bào và vận chuyển enzym ra ngoài môi trường Nên những biến đổi dù nhỏ nhất nồng độ của chúng trong môi trường cũng gây những biến đổi rõ rệt về khả năng sinh trưởng và phát triển sinh vật

Mặt khác ion H+ và OH– cũng ảnh hưởng đến hệ enzym trong vi sinh vật, tham gia hoạt động sống của vi sinh vật pH thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase từ vi sính vật thường trong vùng axit yếu (từ 4,0 - 6,5), vùng trung tính (pH 7,0), một số ở vùng kiềm yếu (từ 7,5 - 9,0) Tùy vào chủng vi sinh vật mà pH tối thích của nó khác nhau

Môi trường bán rắn sinh tổng hợp chitinase hoạt tính cao nhất từ nấm sợi ở khoảng

pH 4 - 6 như từ P oxalicum ở pH 4,1 [3], từ P chrysogenum ở pH 4 [107], từ Trichoderna spp ở pH 5 [5], từ Aspergillus protuberus ở pH 5,5 [48]

Ở môi trường lỏng, lên men sinh tổng hợp chitinase hoạt tính lớn nhất đối với chủng

vi sinh vật ưa axit nhẹ pH từ 3,5 - 6 như từ Aspergillus sp ở pH 3,5 [132]; từ Trichoderma

harzianum ở pH 4,9 [35] hoặc ở pH 5,6 [63]; từ Talaromyces emersonii CBS81470 [93], từ

Myrothecium verucaria [163], từ Nocardia orientalis đều ở pH 5 [161], từ Talaromyces emersonii đều ở pH 5 [93], từ Alcaligenes xylosoxydans ở pH 6 [162],

Một số chủng sinh tổng hợp chitinase lớn nhất ở môi trường trung tính như từ

Streptomyces cinereoruber, từ Aspergillus niger [149] và từ Pseudomonas stulzeri YPL-1

đều ở pH 6,8 [53]; từ Bacillus lichiniformis [152], từ Cellulosimicrobium cellulans 191, từ Aeromonas punctata HS6 đều ở pH 7 [124],

Ngoài ra chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase tối ưu trong môi trường kiềm nhẹ

pH khoảng 7,5 - 9,0 như từ Vibrio alginolyticus ở pH 7,5 [104]; từ Serratia marcescens [181], từ Aeromonas hydrophila HS4 đều ở pH 8,0 [124], từ Microbispora sp.V2 ở pH 8,5 [103], từ Pseudomonas aerogunisa K-187 ở pH 9,0 [126],

1.4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp chitinase

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật Nhiệt độ từ 28 - 32ºC là tối ưu cho sự sinh trưởng của hầu hết vi sinh vật [34], nhiệt độ tối đa là dưới 50ºC Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp có thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậm chí làm vô hoạt sợi nấm nên quá trình tổng hợp enzym sẽ bị ức chế

Sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở khoảng nhiệt độ 25ºC - 35ºC từ chủng vi sinh vật

như từ Cellulosimicrobium cellulans 191 ở 25ºC, từ Streptomyces cinereoruber [149] cũng như Myrothecium verucaria ở 28ºC [163], từ Fusarium chlamydosporum ở 28ºC [91], từ Trichoderma harzianum ở 28ºC [63] và ở 30ºC [35], từ Streptomyces lividans [89] cũng như S viridificans [44] ở 30ºC, từ Aspergillus protuberus ở 30ºC [48], từ Aeromonas sp GJ-18 ở 30ºC [73], từ Paenibacillus sp CHE-N1 ở 34,3ºC [62], từ Microbispora sp V2 cũng như từ Alcaligenes xylosoxydans ở 35ºC [103],

Khoảng nhiệt độ 37ºC - 40ºC là tối ưu cho sinh tổng hợp enzym đối với các chủng vi

sinh vật như Aspergillus sp ở 40ºC [134], Vibrio alginolyticus ở 37ºC [104]; đối với các loài thuộc chi Aeromonas ở 37ºC [72]

Saima và cs (2013) công bố nhiệt độ 37ºC là nhiệt độ tối ưu cho loài Aeromonas [72] (như Aeromonas hydrophila HS4, A punctata HS6, ) lên men sinh tổng hợp chitinase; khả năng sinh tổng hợp chitinase từ A punctata HS6 giảm ở nhiệt độ trên 40ºC và từ A hydrophila HS4 khi nhiệt độ trên 50ºC [124]

Ngoài ra một số chủng chịu nhiệt có khả năng sinh tổng hợp chitinase ở nhiệt độ cao

như từ Pseudomonas aerogunisa K-187 ở 45ºC [126], từ Pseudomonas aerogunisa K-187

ở nhiệt độ 45ºC [126], từ Bacillus lichiniformis ở 50ºC [152]

1.4.7 Ảnh hưởng của thời gian tới sinh tổng hợp chitinase

Khi thực hiện lên men, hầu hết vi khuẩn tổng hợp ra chitinase lớn nhất tại giờ thứ 72, nhưng nấm mốc và xạ khuẩn tổng hợp chitinase lớn nhất ở khoảng giờ thứ 144 [34]

Lên men trong môi trường lỏng ở điều kiện tối ưu, các vi khuẩn như: Talaromyces emersonii CBS81470 sinh tổng hợp lần lượt chitinase 1,5 mU/l trong bình tam giác nuôi lắc 96 h và 2,3 mU/l ở bồn lên men 48 h [93] Pseudomonas stulzeri YPL-1 sinh tổng hợp chitinase lớn nhất đạt được sau 84 h lên men [53] Serratia marcescens lên men theo mẻ

cũng như liên tục để sinh tổng hợp chitinase cao nhất đạt 0,027 mU/ml sau thời gian 100 h

[181] Aeromonas sp PTCC1691 sinh tổng hợp chitinase cao nhất đạt 9,2 U/ml tại 48 h lên

men, sau đó khả năng sinh tổng hợp chitinase giảm khi thời gian lên men kéo dài hơn 48 h

[57] Aeromonas hydrophila HS4 sinh tổng hợp chitinase cao nhất sau thời gian lên men 24

h và duy trì không đổi đến tận 48 h lên men đạt 80,9 U/ml, trong khi A punctata HS6 sinh

tổng hợp chitinase cao nhất đạt 82,36 U/ml tại 48 h lên men, sau thời gian 48 h lên men, cả

hai chủng này đều sinh tổng hợp chitinase giảm dần [124] Aeromonas sp GJ-18 sinh tổng

hợp chitinase ngoại bào cao nhất tại 120 h lên men đạt 1,44 U/ml, sau thời gian 120 h lên men khả năng sinh tổng hợp chitinase giảm [73]

Streptomyces viridificans sinh tổng hợp chitinase cao nhất tại thời điểm 144 h lên

men [44]; S cinereoruber sinh tổng hợp 0,85 mU/ml sau 96 h lên men [149]; chế phẩm

chitinase 6,9 U/mL được sinh tổng hợp từ Cellulosimicrobium cellulans 191 ở 72 h lên men [88] Chitinase từ Streptomyces griseus HUT 6037 được sinh tổng hợp bắt đầu ở giờ

thứ 36 và đạt hoạt độ 8,6 U/ml tại 120 h lên men [68]

Sinh tổng hợp chitinase từ nấm sợi ở điều kiện tối ưu như: Aspergillus sp sinh tổng hợp chitinase thô hoạt độ cao nhất 3,1 U/ml tại 120 h lên men [132], Aspergillus sinh tổng hợp chitinase cao nhất 0,0473 mU/ml tại thời điểm 168 h lên men [134]; Trichoderma harzianum [34] sinh tổng hợp chitinase lớn nhất 0,196 mU/ml tại thời điểm 120 h lên men; Myrothecium verucaria sinh tổng hợp chitinase cao nhất tại 168 h lên men [163]; Fusarium chlamydosporum sinh tổng hợp chitinase ngoại bào lớn nhất sau 192 h lên men [91]; Alcaligenes sinh tổng hợp chitinase tại 60 h lên men [162],

Tại 166 h lên men, Penicillium monoverticillium CFR 2, Aspergillus flavus CFR 10

và Fusarium oxysporum CFR 8 đều có khả năng sinh tổng hợp endochitinase và

β-N-acetylhexosaminidase hoạt tính cao nhất [147]

Pencillium sp LYG 0704 bắt đầu sinh tổng hợp chitinase tại 24 h lên men và tiếp tục

tăng dần cho đến khi đạt được hoạt tính cao nhất sau 72 h lên men [80]

1.4.8 Ảnh hưởng của tốc độ lắc và cường độ khuấy tới sinh tổng hợp chitinase

Lên men chìm, sự lắc (khuấy) đóng vai trò quan trọng trong chuyển khối Tốc độ khuấy càng cao thì tốc độ dịch chuyển của dịch càng lớn Cường độ khuấy tối ưu đóng vai trò quan trọng cho sự sống và tăng trưởng tế bào vi sinh vật trong suốt quá trình lên men Tốc độ khuấy cao gây sự dịch chuyển mạnh nên làm các enzym có thể mất chức năng do cấu trúc bị thay đổi [131]

Cường độ khuấy ảnh hưởng lên hình thái học nấm và sự chuyển khối của phản ứng sinh hóa [84] Trong nhiều quá trình lên men nấm, tốc độ khuấy cao là cần thiết đủ cho đảo trộn và chuyển khối, và đặc biệt tế bào nấm tăng trưởng ở dạng khuếch tán tự do Tuy nhiên, lực cơ học có thể gây ra hệ sợi nấm tổn thương Do vậy, tốc độ khuấy được giới hạn

trong khoảng nhất định nhằm tránh sức ép dịch chuyển căng thẳng lên hệ sợi nấm

Felse và Panda (2000) cho rằng: tốc độ khuấy 224 vòng/phút (v/p) phù hợp nhất

cho sự tăng trưởng tế bào và sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum [34], và

đã sinh tổng hợp chitinase lớn nhất 0,196 mU/ml ở tốc độ lắc 224 v/p [35] Bồn lên men

2L có khuấy tốc độ 200 v/p, sử dụng cơ chất gel chitin thì T virens UKM1 sinh tổng hợp chitinase với tốc độ từ 4,1 mU/(ml h) đến 5,97 mU/(ml h) Myrothecium verucaria sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở tốc độ lắc 200 v/p [163] Fusarium chlamydosporum sinh

tổng hợp chitinase lớn nhất ở chế độ lắc 75 v/p, với thể tích môi trường lên men 50 ml

trong bình tam giác 250 ml [91] Streptomyces viridificans [44] và Cellulosimicrobium cellulans [88] đều sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở tốc độ lắc 200 v/p S cinereoruber

sinh tổng hợp 0,85 mU/ml chitinase khi thông khí 1 L min-1 và tốc độ khuấy 500 v/p [149] Liu và cs (2003) công bố khi tăng tốc độ khuấy giúp sinh tổng hợp chitinase từ

Verticillium lecanii trong bình lên men 5 L và 30 L tăng trong thời gian ngắn [86]

Kao và cs (2007) cho rằng Paenibacillus sp CHE-N1 sinh tổng hợp chitinase lớn

nhất trong bình lên men 5 L ở tốc độ lắc 200 v/p [62]

1.5 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CHITINASE TỪ VI SINH VẬT

Chitinase sinh tổng hợp từ vi sinh vật được chia làm hai loại chính: chitinase nội bào

và chitinase ngoại bào

Đối với chitinase nội bào, giải phóng enzym ra khỏi vi sinh vật (cụ thể Garrido (1994) đã tách beta-galactosidase ra khỏi nấm men [40], Illanes (1995) tách lactase ra khỏi nấm men [56], hoặc enzym được tách ra khỏi tế bào vi khuẩn [18, 140]) nhờ phá vỡ tế bào bởi phương pháp nghiền [32, 135]; bởi phương pháp đồng hóa [31, 94]; bởi phương pháp sóng siêu âm, máy nén, sốc nhiệt [65]; bởi phương pháp hóa học dùng các loại dung môi, butylic, acetone, glycerol, ethylacetate,…

Đối với chitinase ngoại bào từ vi sinh vật do được tiết thẳng vào môi trường nuôi cấy

tế bào nên có thể thu dịch chiết enzym dễ dàng

Tuy nhiên dịch chitinase ngoại bào thường chứa rất nhiều protein và các hợp chất không mong muốn, nồng độ enzym thấp và khó bảo quản Do đó cần phải có các bước tách tạp chất rắn và sinh khối tế bào thu nhận dịch chiết enzym Thực hiện các bước này bằng ly tâm, lọc, vi lọc [39, 79], và cô đặc dịch enzym nhằm tăng nồng độ bằng phương pháp siêu lọc, hoặc kết tủa bằng các tác nhân dung môi hữu cơ (ethanol hay acetone, ) hoặc muối trung tính (hay dùng nhất là amonium sulfate))

1.5.1 Phân tách tạp chất rắn thu dịch chiết enzym

Tách tạp chất (phần sinh khối và tạp chất không tan) có ở dịch chitinase được thực hiện bằng phương pháp li tâm, lọc, vi lọc Phương pháp li tâm hay được sử dụng nhất do thời gian ngắn và có thể thực hiện ở qui mô phòng thí nghiệm lẫn công nghiệp Tốc độ li tâm phụ thuộc vào kích thước tế bào vi sinh vật và độ nhớt dịch sau lên men Dịch

chitinase được thu từ dịch sau sinh tổng hợp bởi Stenotrophomonas maltophilia bằng ly tâm tốc độ 7000 v/p trong thời gian 20 phút [47], từ Aeromonas sp DYU-Too7 bằng ly

tâm tốc độ 2280 v/p ở 4ºC trong thời gian 15 phút [85], từ Bacillus licheniformis Mb-2 bằng ly tâm tốc độ 10000 v/p ở 4ºC trong thời gian 20 phút [156], từ Stenatrophomonas maltophilia[58] bằng ly tâm tốc độ 10000 v/p trong thời gian 20 phút Kumar và cs (2012)

tách tạp chất thu nhận exochitinase từ Trichoderma asperellum UTP-16 bằng ly tâm tốc độ

2240 v/p ở 4ºC trong thời gian 10 phút [75]

1.5.2 Cô đặc dịch chiết enzym

Do enzym có bản chất protein dễ bị biến tính bởi nhiệt độ cao, dịch enzym sau khi loại bỏ tạp chất rắn được cô đặc bằng phương pháp cô đặc chân không ở nhiệt độ thấp hoặc

cô đặc bằng phương pháp siêu lọc qua màng Siêu lọc qua màng được xem là phương pháp tốt nhất hiện nay để cô đặc dịch chiết enzym Bởi vì phương pháp này được thực hiện ở nhiệt độ thấp nên có thể giữ hoạt tính enzym tốt nhất, ngoài ra còn dễ dàng thực hiện ở qui

mô lớn và cho hiệu suất thu hồi cao Kích thước màng siêu lọc sử dụng cô đặc enzym phụ thuộc vào kích thước enzym muốn cô đặc Enzym chitinase thu nhận từ các vi sinh vật có kích thước khác nhau nhưng lớn hơn 20 kDa, do vậy nhiều tác giả đã sử dụng phương pháp

siêu lọc với kích thước màng lọc 10 kDa thu hồi dịch chitinase như từ Stenotrophomonas maltophilia [47], từ Aeromonas sp DYU-Too7 [85], từ Bacillus licheniformis Mb-2 [156],

từ Stenatrophomonas maltophilia[58]

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH NAG TỪ DỊCH THỦY PHÂN CHITIN

1.6.1 Ly tâm, siêu lọc loại tạp chất

Dung dịch chứa NAG sau thủy phân chitin được ly tâm tốc độ 2000 v/p trong 20 phút để loại bỏ phần tạp chất; ly tâm ở 4ºC loại chitin dư bị kết tủa bởi cồn tuyệt đối (EtOH) và thu dịch nổi chứa NAG [10] Ly tâm loại bỏ phần chitin dư, sau đó loại enzym bởi màng siêu lọc và thu dịch NAG [7] Setthakaset và cs (2008) đã loại bỏ cặn rắn bằng cách lọc qua màng lọc, loại bỏ màu bằng than hoạt tính [132]

Ngoài ra phương pháp siêu lọc với các màng lọc kích thước khác nhau nhằm thu sản phẩm xylo-oligosaccharides và xyloglucan có khối lượng phân tử thấp [78]

Mục đích bảo quản: do sau cô đặc thì nồng độ chất khô tăng, nên hạn chế sự phát

triển của vi sinh vật và kéo dài thời gian bảo quản

Mục đích hoàn thiện: tăng nồng độ chất khô theo yêu cầu làm chất lượng tăng lên

và hoàn thiện hơn

Tiến hành cô đặc bằng các phương pháp:

Phương pháp nhiệt: sử dụng nhiệt để cô đặc đối với các sản phẩm sinh học thường

khó khăn vì các sản phẩm này rất nhạy cảm với nhiệt độ Quá trình cô đặc nhiệt là quá trình làm bốc hơi nước, làm cho lượng nước trong dung dịch giảm đi, hàm lượng hoạt chất sinh học trong dung dịch sẽ tăng lên, hoạt tính sinh học cũng tăng cao Tuy nhiên phải kiểm soát điều kiện nhiệt độ để khống chế nó trong một khoảng cho phép thì hoạt tính sinh học mới được bảo toàn

Phương pháp siêu lọc: là phương pháp sử dụng màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ Được

sử dụng rộng rãi để thu nhận các chất có khối lượng phân tử trong khoảng 1000 – 300.000

Da Người ta thường sử dụng cellulose acetate và các polymer hữu cơ như: poly sulfone, polyvinylidene và polypropylene làm nguyên liệu màng lọc

Phương pháp kết tủa:

Kết tủa bằng dung môi hữu cơ: dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng

hòa tan của hoạt chất sinh học, ảnh hưởng solvat hóa của phân tử nước xung quanh phân tử hoạt chất bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử hoạt chất sinh học sẽ tăng lên

Kết tủa hoạt chất sinh học ở điểm đẳng điện: hoạt chất sinh học nếu là chất lưỡng

cực Mức độ hòa tan của hoạt chất sinh học phụ thuộc vào pH Kết tủa hoạt chất sinh học ở điểm đẳng điện thường thực hiện ở quy mô nhỏ Thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính hoạt chất sinh học

Cô đặc dịch thủy phân chitin bởi chế phẩm chitinase được tiến hành ở áp suất chân không, nhiệt độ từ 40ºC đến 75ºC (tốt hơn chọn nhiệt độ từ 45ºC đến 55ºC) tới nồng độ chất khô (phần lớn là NAG) khoảng 30% đến 45% [96] Cô đặc dịch NAG sau lọc dòng ngang ở áp suất chân không, nhiệt độ 50ºC [7] Dịch nổi NAG được cô đặc còn 1/3 thể tích bằng hệ thống cô quay [10]

1.6.3 Kết tinh

Kết tinh là quá trình tách chất rắn hòa tan trong dung dịch dưới dạng tinh thể Tinh thể là những vật rắn đồng nhất có các hình dạng khác nhau, giới hạn bởi các mặt phẳng Tinh thể gồm cả các phân tử nước gọi là tinh thể ngậm nước (tinh thể hydrat) Tùy theo điều kiện thực hiện quá trình mà tinh thể có thể ngậm số phân tử nước khác nhau

Điều kiện cần thiết để có quá trình kết tinh là phải tạo cho được những dung dịch quá bão hòa, tức làm mất cân bằng pha của hệ Do đó cần sử dụng các phương pháp: kết tinh tách một phần dung môi, kết tinh với thay đổi nhiệt độ, kết tinh chân không Kết tinh thu phần tử rắn sạch gồm các giai đoạn:

Giai đoạn 1: Giai đoạn kết tinh bằng cách hạ nhiệt độ hay làm bay hơi một phần dung môi

Giai đoạn 2: Tách tinh thể ra khỏi dung dịch còn lại bằng cách lắng, lọc, ly tâm Giai đoạn 3: Kết tinh lại (trong điều kiện cần thiết)

Giai đoạn 4: Rửa và sấy khô tinh thể

Rohani (2010) đã công bố các ứng dụng quá trình kết tinh để bào chế (tinh sạch và thu nhận) các hoạt chất sinh học trong công nghệ dược [119]

Quá trình kết tinh được sử dụng trong tinh sạch và thu chế phẩm NAG từ dịch thủy phân chitin bởi chế phẩm chitinase [96, 132]

1.6.4 Tinh sạch NAG bằng dung môi

Những năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu giải pháp tách tạp chất trong dung dịch NAG đã cô đặc được công bố bởi các nhà khoa học:

Hòa dung dịch NAG cô đặc vào dung môi như ethanol, methanol, acetone, tetrahydrofuran, dioxane và acetonitrile, Do NAG không hòa tan trong dung dịch hỗn hợp nên dễ dàng loại được một phần tạp chất hòa tan vào dung môi này Sau khi loại bỏ tạp chất, hạ nhiệt độ của hỗn hợp dung môi chứa NAG xuống thấp sẽ làm kết tinh các tinh thể NAG Tiếp tục loại tạp chất bằng cách hòa tan tinh thể NAG nhận được với dung môi

và tiến hành tách tạp chất lần nữa thu tinh thể rắn NAG Sản phẩm NAG nhận được lần 2

có độ tinh sạch khoảng 70% đến 99% [96]

Aiba (2005) cho rằng lựa chọn tỷ lệ EtOH/ dịch NAG cô đặc 10/1 để rửa và kết tủa loại tạp chất thu NAG có độ tinh sạch trên 95% [7]

1.6.5 Qui trình tinh sạch để thu nhận NAG

Aiba (2005) thu nhận NAG theo qui trình: dịch thủy phân chứa NAG sau ly tâm loại chitin dư và tạp chất rắn, được thực hiện siêu lọc để loại enzym, rồi tiến hành cô đặc ở nhiệt độ 50o C ở áp suất chân không thu dịch NAG thô cô đặc; sau đó dịch NAG thô cô đặc được trộn với EtOH rồi để nhiệt độ 4o

C và thu phần kết tủa rắn Phần rắn kết tủa này được rửa bằng EtOH, rồi sấy khô thu sản phẩm NAG với độ tinh sạch trên 95% và hiệu suất thu hồi khoảng 43% [7]

Setthakaset và cs (2008) thực hiện thu nhận NAG: dịch thủy phân chứa NAG sau lọc loại tạp chất rắn, được loại màu bằng hoạt tính, rồi đưa cô đặc thu dịch NAG thô đã cô đặc; sau đó dịch thủy phân NAG thô này (màu vàng sáng) được khuấy với EtOH trong thời gian

30 phút ở nhiệt độ phòng, rồi lọc thu phần rắn màu trắng để sấy chân không thu sản phẩm NAG với độ tinh sạch trên 70% và hiệu suất thu hồi đạt 65% [132]

Ajavakom và cs (2012) phối trộn dung dịch EtOH vào dịch thủy phân chứa NAG đã

cô đặc còn 1/3 thể tích, đồng thời khuấy liên tục tạo các đám mây lơ lửng và để kết lắng

4ºC qua đêm loại kết tủa tạp chất (phần lớn chitin dư) thu phần dịch nổi Phần dịch nổi được loại màu bằng cách khuấy với than hoạt tính trong 45 phút, rồi được cô đặc bằng cô quay, sau đó sấy đông khô thu sản phẩm NAG với độ tinh sạch trên 95% và hiệu suất thu hồi đạt 65% [10]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

Chủng P oxalicum 20B nằm trong bộ sưu tập giống của bộ môn CNSH - Viện

CNSH và CNTP - Trường Đại học Bách khoa Hà nội, là kết quả của đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi sinh và enzym để chế biến phế liệu tôm thành các sản phẩm có giá

trị gia tăng” [1] Chủng Penicillium oxalicum 20B đã được định tên dựa vào khoá phân loại

K B Raper và C Thom (1968) Chủng Penicillium oxalicum 20B đã được lựa chọn để thu

nhận NAG trong đề tài “Xây dựng qui trình thu nhận N-axetyl-D-glucosamin từ chitin sử dụng endochitinase và hexosaminidase” [2]

Hình 2.1 Khuẩn lạc chủng 20B trên môi trường MS-chitosan (A), ảnh bào tử (B) và cuống sinh

bào tử trần (C)

Đặc điểm hình thái chủng Penicillium oxalicum 20B thể hiện Hình 2.1 như sau:

Khuẩn lạc trên môi trường Czapeck có đường kính d = 3,5 - 5 cm sau 10 ngày ở nhiệt độ phòng, thường bằng phẳng dạng nhung nhiều bào tử, có màu xanh lục lơ; mặt trái không màu đến màu vàng, màu cam Chổi hai tầng, không đối xứng Cuống sinh bào tử trần dài

100 - 200 µm x 3,5 - 4,5 µm, hiếm có chổi một tầng Chổi hai tầng có 2 - 3 metulae, nhánh kích thước từ 10 - 20µm x 3,5 - 4,5 µm; mesulae 2 - 3 cái kích thước từ 15 - 20 µm x 3,3 - 3,8 µm Thể bình 6 - 10 cái, kích thước 9 -15 µm x 3,0 - 3,5 µm đỉnh thon lại Bào tử trần elip, nhẵn có kích thước d = 4,5 - 6,5 µm x 3,0 - 4,0 µm

2.1.3 Hóa chất

NAG (N-acetyl glucosame), (NAG)2 (diacetyl-chitobiose), (NAG)3 chitotriose) từ Sigma, NaOH, dinitrosalicylic (DNS) từ Mecrk, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, CaCl2, NaNO3, FeSO4, NaCl, KCl, Tween 80 (India) Ngoài ra các hóa chất có nguồn gốc Việt Nam hoặc Trung quốc

(triacetyl-Môi trường giữ giống (PDA): MT1; MT1 để nuôi cấy bào tử chủng nấm ở 30ºC trong thời gian 6 ngày, giống được giữ 1 tháng ở 4ºC phải cấy chuyển giúp đặc tính ổn định Môi trường hoạt hóa giống (Czapeck): MT2; MT2 để hoạt hóa giống với mật độ 104

bào tử/ml ở 30ºC, tốc độ lắc 150 vòng/phút (v/p) trong 40 h nhằm chuẩn bị giống đã hoạt hóa cho quá trình lên men

Môi trường lỏng lên men: MT3; MT3 để nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp chitinase tối ưu

Môi trường MT1, MT2 và MT3 được hấp vô trùng ở nhiệt độ 121ºC trong thời gian

20 phút Thành phần các môi trường cho nghiên cứu được trình bày trong phụ lục 2

2.1.4 Thiết bị

Các thiết bị: Máy so màu quang phổ UV – VIS Ultrospec (Novaspec III Cambridge England), Máy ly tâm (Thermo scientific Sorvall legend X1R, Đức), Hệ thống lọc dòng ngang (Amersham Biosience, Anh), Máy cô đặc áp suất thấp (Thermo Fisher, Mỹ), Tủ sấy (Thermo scientific 2555 Kerper Boulevard, USA), Hệ thống HPLC (Agilent, Mỹ), Hệ thống

cô quay chân không (Buchi, Thụy sỹ), Máy cô đặc áp suất thấp (Thermo Fisher, USA)

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

2.2.1 Phương pháp xác định sinh khối nấm mốc

Cách tiến hành: Lấy 100 ml canh trường đã lên men để ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút loại dịch và thu sợi nấm Sợi nấm được rửa sạch và sấy nhiệt độ 105ºC đến khối lượng không đổi

Sinh khối nấm mốc được biểu diễn bằng số gam trọng lượng khô của sợi nấm trong mỗi lít canh trường

2.2.2 Phương pháp phân tích hóa lý

2.2.2.1 Phương pháp x ác định độ ẩm

* Độ ẩm của các mảnh chitin được xác định bằng phương pháp sấy ở 105o

C đến khối

lượng không đổi theo TCVN 3700:1990 đối với sản phẩm thủy sản khô

* Độ ẩm của chế phẩm bột NAG được xác định bằng phương pháp sấy hồng ngoại

2.2.2.2 Phương pháp định lượng (NAG) i

A) Phương pháp DNS

Theo phương pháp DNS [95] coi lượng đường khử tạo thành là NAG

- Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) trong môi trường kiềm Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS acid:

Acid dinitrosalicylic 3-amino, 5- dinitrosalicylic acid

(Màu vàng) (Màu đỏ da cam)

* Cách tiến hành: Dịch sau thủy phân được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong thời gian 15 phút Lấy 0,5 ml dịch nổi cùng với 1ml dung dịch DNS và lắc đều Hỗn hợp

đó được đun sôi trong 5 phút và sau đó được làm lạnh nhanh tới nhiệt độ phòng và đo độ hấp thụ quang phản ứng ở bước sóng 540 nm Dùng NAG làm chất chuẩn để xây dựng đường chuẩn NAG ở phụ lục 3

Công thức tính:

Trong đó: X: lượng NAG (mg/ml); A và A0: độ hấp thụ quang của mẫu thí nghiệm

và mẫu vô hoạt enzym ở cùng một thời điểm xác định; n: hệ số pha loãng mẫu; kNAG , b: lần lượt là hệ số góc và hệ số tự do của đường chuẩn NAG

B) Phương pháp HPLC

Lượng (NAG)i, với i từ 1 – 3 được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): thiết bị Agilent 1200 infinity, áp suất bơm Pmax = 100 bar, cột Aminex HPX-87H tách rửa ở nhiệt độ 40oC, pha động H2SO4 10 mM, vận tốc dòng v = 0,6 ml/ phút, thể tích tiêm mẫu 0,02 ml, phát hiện UV ở 210 nm Từ sắc ký đồ (NAG)i chuẩn, ta có lượng (NAG)i với i = 1-3

C) Phổ sản phẩm thủy phân được xác định bởi phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)

Cách tiến hành: Dịch sau thủy phân được chấm trên bản silica gel (Kieselgel 60 F245 Merck), sử dụng n-propanol 99%: amoniac 27% theo tỷ lệ 2:1 (v/v) làm dung môi phân tách Sản phẩm thủy phân được quan sát trên bản sắc ký sau khi phun bản sắc ký bằng dung dịch 5% H2SO4 pha trong EtOH tuyệt đối và sấy ở nhiệt độ 140ºC trong 30 phút

2.2.2.3 Phương pháp xác định Nitơ tổng số của mẫu chitin

Hàm lượng Nitơ tổng số của mẫu chitin được xác định bằng phương pháp Kjeldahl

2.2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein của mẫu chitin

Hàm lượng protein trong nguyên liệu chứa chitin được xác định bằng phương pháp Biuret:

Dựng đường chuẩn protein: Hòa tan dung dịch Albumin nguyên chất với nước cất sẽ được một dung dịch protein có nồng độ 10 mg/ml Đường chuẩn được xác định trong khoảng nồng độ 0 - 0,8 mg/ml được pha từ dung dịch mẹ vừa pha Lấy 1 ml dung dịch protein các nồng độ vừa pha vào ống nghiệm rồi bổ sung 4 ml thuốc thử Biuret, lắc đều và

để phản ứng 30 phút Sau đó giá trị màu dung dịch hấp thụ được đem so màu ở bước sóng

570 nm (Phụ lục 4)

Phương pháp chuẩn bị mẫu và đo mẫu: Cân 1 g nguyên liệu chứa chitin cho vào ống fancol Sau đó giữ ở bình ổn nhiệt 90ºC trong 1 h, tiếp tục làm nguội xuống nhiệt độ phòng rồi lọc thu dịch trong Protein nằm trong phần dịch này, dịch lọc đưa đi ly tâm 6000 vòng/phút trong 20 phút để đảm bảo loại bỏ hết phần cặn kết tủa Pha loãng dịch ly tâm tới nồng độ sao cho tiến hành phản ứng màu giá trị đo được nằm trong đường chuẩn Sau khi pha loãng lấy 1 ml dung dịch đã pha loãng cộng với 4 ml dung dịch màu Biuret, để phản ứng trong 30 phút Cuối cùng đo giá trị màu bằng máy đo quang ở bước sóng 570 nm

2.2.2.5 Cách tính hàm lượng chitin

Hàm lượng chitin trong nguyên liệu được xác định theo phương pháp Black M.M (1950) bằng cách nhân hệ số 14,5 với Nitơ chitin (giả thiết chitin tinh khiết chứa 6,9% nitơ) [21] nên có công thức tính:

Cchitin = (Cnitơ tổng – Cnitơ hữu cơ) x (14,5)

(2.2) Trong đó:

Cnitơ tổng: Hàm lượng nitơ tổng số được xác định theo phương pháp Kjeldahl (%);

Cnitơ hữu cơ (%) = PBiuret / 6,25; Cnitơ hữu cơ: hàm lượng nitơ hữu cơ (%); Pbiuret: hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Biuret (%); 6,25: hệ số chuyển đổi giữa nitơ và protein; 14,5: hệ số chuyển đổi % nitơ sang % chitin

2.2.3 Phương pháp x ác định hoạt độ enzym

2.2.3.1 Hoạt độ chitinase được xác định theo phương pháp Binod cải tiến

Cách tiến hành: Phương pháp Binod cải tiến [19] như sau: Dịch enzym trộn với dịch gel chitin 1% pH 5 theo tỉ lệ 1:1 (v/v) được ủ trong thời gian 20 phút ở nhiệt độ 35ºC Xác định lượng đường khử tạo thành bằng phương pháp DNS Một đơn vị hoạt độ chitinase được định nghĩa là lượng enzym cần thiết để thủy phân gel chitin tạo thành 1 µmol NAG trong 1 phút

2.2.3.2 Hoạt độ endochitinase được xác định theo phương pháp Yabuki cải tiến

Cách tiến hành: Phương pháp Yabuki cải tiến [179] như sau: Trộn 2 ml dịch enzym

với 320 µl gel chitin 20% và 1680 µl dung dịch đệm acetate natri 0,1 M, pH 5 và ủ trong thời gian 20 phút, ở 35ºC Đo độ hấp phụ quang của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 610

nm trước và sau khi ủ Nồng độ enzym cần được pha loãng ở ngưỡng sao cho sự giảm độ hấp phụ quang không quá 20% Một đơn vị hoạt độ enzym được định nghĩa là lượng enzym cần thiết để làm giảm 1% độ hấp phụ quang ở bước sóng 610 nm trong 1 phút Công thức tính hoạt độ endochitinase:

axetyl-β-D glucosaminidase (pNP-NAG) giải phóng p – nitrophenol hấp phụ màu ở bước sóng 400 nm [92]

Cách tiến hành: Ủ 20 µL dịch enzym cùng 230 µL dịch 10 mM pNP-NAG pha với đệm citrate phosphate 50 mM pH 6 trong thời gian 10 phút, ở 35ºC Kết thúc phản ứng bằng cách thêm 750 µL Na2CO3 0,4M Đo độ hấp phụ quang của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 400 nm Một đơn vị hoạt độ enzym được định nghĩa là lượng enzym cần thiết

để giải phóng 1µmol p-nitrophenol trong 1 phút ở điều kiện trên [11]

Công thức tính hoạt độ NAHase:

0 pNP-NAG

n U ml k

(2.5)

Trong đó:

A, A0: độ hấp thụ quang của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng;

kpNP: hệ số góc của đường chuẩn pNP – NAG được xây dựng ở phụ lục 5;

n: hệ số pha loãng enzym;

2.2.3.4 Hoạt độ chitobiosidase

Hoạt độ 1,4- -chitobiosidase được xác định như phương pháp xác định hoạt độ NAHase, nhưng cơ chất pNP-(NAG)1 được thay thế bằng p-nitrophenyl N,N′-diacetyl-β-D-chitobioside (pNP-(NAG)2)

2.2.4 Phương pháp xác định cấu trúc bề mặt của chitin, NAG

Cấu trúc bề mặt chitin (hoặc NAG) được xác định bằng phân tích vi điện tử quét (SEM) trên máy HITACHI-S4800 tại Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương - 131 Lò Đúc - Hai Bà Trưng - Hà Nội

2.2.5 Phương pháp xác định đặc tính vật lý của chitin, NAG

Bằng phương pháp phân tích nhiệt vi sai (Differential scanning calorimetry (DSC)) [170] kiểm soát sự thay đổi đặc tính vật lý (nhiệt độ nóng chảy, điểm chuyển nhiệt độ) trong polymer sinh học (chitin) cũng như NAG

Thực hiện đo nhiệt lượng quét trong mô đun 910 – DSC cùng với bộ phân tích nhiệt

2100 – TGA (đều từ USA) trên thiết bị Labsys Evo của Viện vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Đường cong DSC được thực hiện trong điều kiện không khí bình thường Các mẫu sau khi cân trọng lượng chính xác (± 0,1 mg) được đặt trong hộp

nhôm cùng lỗ pin trung tâm Dùng thanh kim loại Indi (99,99%) để định cỡ mô đun DSC liên quan tới nhiệt độ và enthalpy Hộp nhôm không chứa mẫu được dùng để đối chứng và các dòng được thực hiện bằng gia nhiệt mẫu từ 20ºC lên đến 110ºC cùng đẳng nhiệt trong

15 phút Mẫu sau khi cân được gia nhiệt từ nhiệt độ 20ºC đến 850ºC

2.2.6 Phương pháp xác định cấu trúc của chitin, NAG

Cấu trúc chitin và cấu trúc NAG được xác định bằng phương pháp phân tích quang phổ hồng ngoại (FTIR) trong khoảng số sóng từ 400 - 4000 cm-1 [141] trên Perkin Elmer Spectrum100 FTIR spectrometer tại Viện Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.7 Phương pháp xác định sai số trung bình

Kết quả phân tích (Hoạt độ chitinase, hiệu suất thủy phân tương đối ra NAG, ) được xác định sai số trung bình theo độ lệch chuẩn, phần mềm excel 2007

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp chitinase

Chủng P oxalicum 20B sau khi hoạt hóa trên Czapek (Phụ lục 2) được chuyển vào

môi trường MT3 (Phụ lục 2) với tỉ lệ 5% theo thể tích Lên men sinh tổng hợp enzym ở 30ºC với sự thay đổi các yếu tố công nghệ làm cơ sở lựa chọn điều kiện thích hợp sử dụng trong những thí nghiệm sau Định kỳ thu dịch lên men tại thời điểm 72 h, 96 h, 120 h,

144 h lên men để xác định hoạt độ chitinase

* Nghiên cứu lựa chọn dạng và nồng độ chitin: chitin thô, chitin đã qua nghiền bi kích thước 600 µm – 2 mm và gel chitin ở nồng độ chitin 4 (g/l), pH 5, tốc độ lắc 150 vòng/phút (v/p) chọn dạng chitin thích hợp Sau đó nghiên cứu thay đổi nồng độ chitin từ 0 g/l – 6 g/l

* Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn và nồng độ nitơ: Khảo sát nguồn nitơ từ NaNO3, Urea, Cao nấm men (CNM), CNM+NaNO3, CNM + Urea Sau đó nghiên cứu thay đổi nồng độ chất chứa nitơ (g/l) từ 0; 5; 10; 15

* Nghiên cứu ảnh hưởng của pH: các giá trị pH môi trường lên men 3; 4; 5; 6; 7 được điều chỉnh bằng axit HCl hoặc NaOH

* Nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ lắc được khảo sát ở các tốc độ 100 v/p; 130 v/p; 150 v/p; 160 v/p; 180 v/p

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thu nhận chế phẩm chitinase kỹ thuật

Lên men sinh tổng hợp chitinase từ chủng P oxalicum 20B trên MT3 ở điều kiện đã

được lựa chọn, sau đó ly tâm tốc độ 6000 v/p, 4ºC, trong 15 phút thu dịch nổi enzym

Dịch nổi enzym được cô đặc lọc dòng ngang tuần hoàn qua màng lọc 10 kDa MWCO, diện tích bề mặt lọc 1400 cm2 ở điều kiện áp suất qua màng 0,758 bar, tốc độ bơm luân hồi khoảng 30 - 35 v/p ở 12ºC thu các dịch enzym trên màng và phần dịch lọt qua màng tương ứng với mức thể tích giảm 2; 3; 4 lần so với thể tích dịch enzym thô ban đầu Các chế phẩm enzym được xác định hoạt tính chitinase, NAHase, endochitinase và chitobiosidase

* Cách tính hiệu suất thu hồi (HSTH) enzym:

Trong đó:

H: Hiệu suất thu hồi enzym (%); Eo, E1: Hoạt độ enzym trước và sau cô đặc (U/ml) tương ứng với thể tích enzym Vo, V1 (ml)

2.3.3 Khảo sát đặc tính cơ bản của chế phẩm chitinase kỹ thuật

* Xác định nhiệt độ tối ƣu và độ bền nhiệt:

- Nhiệt độ tối ưu của chitinase, endochitinase và NAHase được xác định thông qua hoạt độ enzym ở dải nhiệt độ từ 30 - 50ºC, với cơ chất 1% gel chitin pH 5

- Xác định độ bền nhiệt của enzym bằng cách giữ chế phẩm enzym trong 5 ngày ở

pH 5 và nhiệt độ khác nhau từ 30 - 50ºC Hoạt độ chitinase, endochitinase và NAHase được xác định hàng ngày Độ bền hoạt lực enzym được đánh giá thông qua % hoạt độ chitinase, endochitinase và NAHase còn lại so với đối chứng (hoạt độ enzym ban đầu) Công thức tính:

- Độ bền pH của enzym được xác định bằng cách giữ chế phẩm trong 5 ngày ở 35 C

và pH khác nhau từ 3 - 7 Hoạt độ chitinase, endochitinase và NAHase được xác định hàng ngày Đánh giá độ bền enzym theo % hoạt độ chitinase, endochitinase và NAHase còn lại

so với đối chứng

(%) (2.8)

Trong đó: H: độ giảm hoạt độ tương đối (%); E: hoạt độ enzym ở pH và thời điểm phân tích (U/ml); Eo: hoạt độ enzym ban đầu (U/ml)

2.3.4 Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật

Bổ sung các chất phụ gia làm tăng tính ổn định của enzym, giúp kéo dài thời gian sử dụng được bố trí như Bảng 2.2

Bảng 2.2 Sử dụng chất phụ gia bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật ở 4 oC

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu thủy phân chitin

2.3.5.1 Phương pháp tiền xử lý chitin

* Phương pháp xử lý vật lý:

Xử lý nhiệt và áp suất:

Tất cả các mẫu nguyên liệu chứa chitin pha trong đệm natri acetate (0,1 M; pH 5) để

xử lý nhiệt và áp suất Mô tả phương pháp xử lý ở Bảng 2.3

Bảng 2.3 Xử lý nhiệt, áp suất lên nguyên liệu chitin