Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc cimetidine của màng bacterial cellulose lên men từ nước dừa già định hướng sử dụng qua đường uống

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH-KTNN --- PHẠM THỊ THÚY HẰNG NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI THUỐC CIMETIDINE CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE LÊN MEN TỪ NƯỚC DỪA GIÀ ĐỊNH HƯ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH-KTNN -

PHẠM THỊ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI THUỐC CIMETIDINE

CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE

LÊN MEN TỪ NƯỚC DỪA GIÀ ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG QUA ĐƯỜNG UỐNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 2016

LỜI CẢM ƠN

Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Xuân Thành, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt

quá trình thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô trong khoa Sinh – KTNN cùng các thầy cô tại Trung tâm Nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân, bạn bè đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ và khích lệ tôi hoàn thành khóa luận này

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách hoàn chỉnh nhất Tuy nhiên do buổi đầu mới làm quen với công việc nghiên cứu khoa học cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót nhất định mà bản thân chưa thấy được Tôi rất mong được sự góp ý của quý thầy cô để khóa luận được hoàn chỉnh hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Phạm Thị Thúy Hằng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin khẳng định kết quả khóa luận “Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc Cimetidine của màng Bacterial cellulose lên men từ nước dừa già định hướng sử dụng qua đường uống” là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi

dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS Nguyễn Xuân Thành, giảng viên khoa

Sinh – KTNN trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 Đề tài này chưa từng công bố

ở đâu và hoàn toàn không trùng với công trình nghiên cứu của các tác giả khác

Hà Nội, tháng 5 năm 2016 Sinh viên

Phạm Thị Thúy Hằng

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Thành phần của nước dừa già 7Bảng 2.1 Môi trường lên men tạo màng BC 16Bảng 2.2 Nồng độ CM và giá trị OD tương ứng (n = 3) 18Bảng 3.1 Giá trị OD (y) trung bình của thuốc CM sau khi hấp thụ thuốc ở

các khoảng thời gian khác nhau (n = 3) 27Bảng 3.2 Khối lượng và tỉ lệ thuốc CM hấp thụ vào màng BC (n = 3) 28Bảng 3.3 Giá trị OD (y) tương ứng với nồng độ CM ở các độ dày màng,

môi trường pH và thời điểm khác nhau khi giải phóng từ màng BC – CM (n = 3) 30Bảng 3.4 Tỉ lệ giải phóng thuốc CM từ màng BC – CM trong các độ dày,

thời gian và môi trường pH khác nhau (n = 3) 32Bảng 3.5 Hệ số tương quan R2, tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ

giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau (n = 3) 34

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 2.1 Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn CM 19

Hình 3.1 Màng BC được nuôi trong môi trường ở ngày thứ 4 24

Hình 3.2 Thu màng BC thô ở các khoảng thời gian khác nhau 25

Hình 3.3 Màng BC đã được tinh chế 26

Hình 3.4 Màng BC được cho vào 100 ml dung dịch CM 5% 27

Hình 3.5 Khả năng giải phóng thuốc CM của màng BC – CM trong các độ dày, thời gian và môi trường pH khác nhau 31

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình thu nhận màng BC 17

Sơ đồ 3.1 Quy trình tinh chế màng BC 26

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG, HÌNH, SƠ ĐỒ

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

6 Phương pháp nghiên cứu 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tổng quan về đối tượng và lĩnh vực nghiên cứu 5

1.1.1 Tổng quan về màng BC 5

1.1.2 Tổng quan về thuốc CM 8

1.2 Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế

giới 11

1.2.1 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới về màng BC 11

1.2.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới về CM 12

1.2.3 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới về hướng

nghiên cứu 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu nghiên cứu 15

2.1.1 Giống vi khuẩn 15

2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất 15

2.2 Thiết bị và dụng cụ 15

2.2.1 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 15

2.2.2 Dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp tạo màng BC 16

2.3.2 Phương pháp dựng đường chuẩn của CM 18

2.3.3 Phương pháp xác định lượng thuốc CM hấp thụ vào màng BC 19

2.3.4 Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng CM từ màng

BC – CM 20

2.3.5 Phương pháp phân tích dược động học giải phóng của CM 22

2.3.6 Phương pháp xử lý thống kê 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Tạo màng BC của A xylinum trong môi trường nước dừa già 24

3.2 Thu màng BC thô trong môi trường nước dừa già 24

3.3 Tinh chế màng BC 25

3.4 Lượng thuốc hấp thụ vào màng BC 27

3.5 Lượng thuốc CM giải phóng khỏi màng BC – CM 29

3.6 Phân tích động dược học giải phóng của CM 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

1.1.Kết luận 37

1.2.Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

& F đã nhận thấy vai trò kích thích tiết acid dạ dày của histamin trong cơ thể từ năm 1964, nhưng ở thời điểm đó các kháng histamin cổ điển không có tác dụng

để ức chế hoạt động này Và kể từ khi họ chứng minh được sự hiện diện của receptor histamin H2 ở tế bào thành dạ dày, mục đích duy nhất của nhóm nghiên cứu là tìm ra một chất có khả năng ức chế cạnh tranh với histamin, gắn vào receptor histamin H2 nhưng lại ức chế tiết acid Chất đó chính là chất kháng histamin H2 [9, 22] Vào tháng 11 năm 1976, CM sau khi trải qua hàng loạt các thử nghiệm với kết quả thành công mỹ mãn, đã được ra mắt trên thị trường với tên Tagamet Vào ngày 01 tháng 01 năm 1979, CM chính thức được Cục quản lí dược và mỹ phẩm Hoa Kỳ kê đơn [9]

Tuy nhiên, khả năng hòa tan trong nước của CM thấp làm giảm hiệu quả điều trị, sinh khả dụng thực tế của CM ở người đau dạ dày khoảng 56 – 68%, nửa đời thải trừ của CM là 2 giờ [33] Do đó cần thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc CM để giúp thuốc giải phóng một cách kéo dài

Uống là một trong những đường ưa thích nhất và truyền thống để phân phối thuốc So với đường tiêm, lợi thế chính của nó chính là an toàn, đơn giản,

sản phẩm của một loài vi khuẩn, đặc biệt là chủng A xylinum BC có cấu trúc

và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật nhưng có một số tính chất hóa lí đặc biệt như: độ bền cơ học và khả năng thấm hút cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, có thể bị phân hủy bởi enzyme, … Vì vậy

BC đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ như: thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ pin, trong lĩnh vực y học BC được dùng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da [2, 6]

Ngoài ra, BC còn là một hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản

sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động của UV, ổn định về kích thước và hướng, vì thế màng BC còn có ý nghĩa giữ thuốc và kéo dài thời gian giải phóng thuốc [8, 12] Bên cạnh đó, các sợi cellulose có cấu trúc mạng

sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc,

nó có thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trường acid

Các nghiên cứu cho thấy màng BC được tạo ra từ các nguyên liệu rẻ tiền,

dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp Môi trường nuôi cấy vi

khuẩn A xylinum rất đa dạng như nước dừa già, rỉ đường, nước mía, … Trong

đó nước dừa già được coi là môi trường kinh điển trong nuôi cấy A xylinum với

hàm lượng chất dinh dưỡng cao, rẻ tiền, phổ biến, phù hợp với sự phát triển của loại vi khuẩn này [2]

Với mục đích khảo sát khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc CM qua

màng BC định hướng sử dụng qua đường uống, tôi đã chọn đề tài nghiên cứu:

3 Nội dung nghiên cứu

Tạo màng BC lên men từ môi trường nước dừa già

Thiết kế hệ thống vận tải và phân phối thuốc CM dựa trên màng BC

Khảo sát, đánh giá khả năng vận tải và phân phối thuốc thông qua hệ

thống được thiết kế

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Sự vận tải và phân phối thuốc CM dựa trên màng

BC lên men từ nước dừa già định hướng sử dụng qua đường uống

Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu in vitro

Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ trường ĐHSP Hà Nội 2

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

* Ý nghĩa khoa học:

Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng BC Mở ra những hướng nghiên cứu mới về khả năng vận chuyển và phân phối thuốc của màng BC trên nhiều các loại thuốc khác nhau nhằm tăng sinh khả dụng và kéo dài thời gian giải phóng của các loại thuốc đó

* Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

Xây dựng được quy trình tạo màng BC từ chủng A xylinum

Từ màng BC đã được tạo ra được dùng làm hệ thống vận tải phân phối

4

thuốc CM nhằm xác định lượng CM hấp thụ và giải phóng qua màng BC

6 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp tạo màng BC từ chủng A xylinum trong môi trường nước

dừa già

Phương pháp dựng đường chuẩn của thuốc CM

Phương pháp xác định lượng thuốc CM hấp thụ được vào trong màng

BC

Phương pháp xác định lượng thuốc CM giải phóng từ màng BC – CM Phương pháp phân tích động dược học giải phóng của thuốc CM

Phương pháp xử lý thống kê

5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về đối tượng và lĩnh vực nghiên cứu

1.1.1 Tổng quan về màng BC

1.1.1.1 Vi khuẩn sản sinh BC

BC là sản phẩm của một số loài vi khuẩn như: Acetobacter,

Achromobacter, Agrobecterium Trong đó Acetobacter xylinum sinh tổng họp

BC hiệu quả nhất và được nghiên cứu nhiều nhất vì năng suất BC cao, cấu trúc

BC phù hợp cho nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau [2]

A xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter

Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào [2]

Theo khóa phân loại của Bergey, A xylinum thuộc:

 Lớp: Schizomycetes

 Bộ: Pseudomonadales

 Bộ phụ: Pseudomonadieae

 Họ: Pseudomonadaceae

A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang

khoảng 0,6 – 0,8 µm, dài khoảng 2-3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram

âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [2]

1.1.1.2 Cấu trúc của màng BC tạo bởi A xilynum

Cellulose vi khuẩn cấu tạo bởi những chuỗi polymer β - 1,4 glucopyranose không phân nhánh Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của

BC giống cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể

6

Theo AJ Brown (1886), BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5 nm, kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng khoảng 3 – 8 nm [2]

1.1.1.3 Đặc tính của màng BC tạo bởi A xylinum

Trong nuôi cấy tĩnh, BC tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01 – 0,5 nm Sản phẩm này có những tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh và

độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản khuẩn [2] Với các tính chất này BC được ứng dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học

1.1.1.4 Chức năng sinh lý của BC tạo bởi A xylinum

A xylinum là vi khuẩn tổng hợp polysaccharid ngoại bào, những tế bào vi

khuẩn này nằm trong mạng lưới polymer giúp tế bào bám chặt vào bề mặt môi trường và thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với tế bào vi khuẩn không nằm trong mạng lưới polymer

Cellulose có các đặc tính như độ bền cơ học cao, tính thấm và tính hút cao,

trạng thái kết tinh giúp A xylinum kháng lại sự thay đổi của môi trường như

việc thay đổi xuống 1 hay 2 đơn vị pH trong thời gian nuôi cấy hay do lượng nước bị giảm đi, các chất chuyển hóa được sinh ra [2]

1.1.1.5 Môi trường nuôi cấy A xylinum nhằm thu màng BC

Môi trường nuôi cấy A xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn

dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các yếu

tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng

Nhu cầu sử dụng đường ở A xylinum rất lớn và giữ vai trò quan trọng

trong quá trình tổng hợp BC nên có rất nhiều nghiên cứu đề nghị sử dụng các

7

sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác nhau như: rỉ đường, chất thải trong công nghệ sản xuất khoai tây và phomat, chất thải của nhà máy sản

xuất bột ngọt, nước dừa già, nước mía, … để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A

xylinum Trong đó, nước dừa già được xem là môi trường kinh điển trong nuôi

cấy A xylinum [2] Thành phần của nước dừa già [2] được trình bày như ở

1,3 – diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol, … Vì vậy A

xylinum rất thích hợp phát triển trong môi trường này [2]

Nước dừa sau khi thu hoạch được sử dụng không quá 3 ngày, tránh để lâu làm cho đường và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất kém [2]

Công thức cấu tạo:

Nồng độ của CM trong huyết tương đảm bảo làm giảm đến 50% lượng acid tối đa là 0,5-1,0 mcg/ml [13]

Phân phối

Thể tích phân phối của CM ở mức xấp xỉ 0,8 – 1,39 L/kg Tuổi bệnh nhân càng tăng thì thể tích phân phối càng giảm CM phân bố rộng khắp phần lớn trong dịch cơ thể, các cơ quan và mô người, không có trong mô mỡ [11]

Tỉ lệ phân phối trung bình của CM giữa dịch não tủy và huyết thanh thay đổi từ 0,03 – 0,18 Tỷ lệ này là 0,2 – 0,5 ở người bệnh gan hay thận Tỉ lệ gắn protein huyết tương của CM là 18 – 26,3% ở mức nồng độ giữa 0,05 – 50 mcg/ml Ở những bệnh nhân loét dạ dày tá tràng thì tỉ lệ này đạt khoảng 13 - 25% (trung bình 19%) [11]

Chuyển hóa và thải trừ

CM và chất chuyển hóa của nó được đào thải qua thận Khoảng 50 - 80% tổng lượng CM dùng đường tiêm tĩnh mạch tồn tại dưới dạng không đổi trong nước tiểu Tỉ lệ này là 40% nếu dùng thuốc đường uống Sự chuyển hóa CM chỉ chiếm khoảng 25 - 40% tổng lượng thải trừ của CM và quá trình này phụ thuộc vào độ tuổi [11] Nửa đời thải trừ của CM khoảng 2 giờ, tăng lên khi suy thận Sulphoxide cimetidine được chứng minh là chất chuyển hóa chính của

CM [31]

Độ tuổi đóng một vai trò quan trọng trong dược động học của CM Tuổi càng trẻ thì độ thanh thải càng lớn, trừ trẻ sơ sinh, độ thanh thải này giảm một nửa từ độ tuổi 30 - 65 [11] Một lượng nhỏ liều thuốc tiêm tĩnh mạch được đào

10

thải qua mật (Spence và cs, 1977) và phân (Griffiths và cs, 1977; Taylor và cs 1978) CM có thể qua hàng rào nhau thai, được bài tiết qua sữa mẹ và ở những người mẹ cho con bú, thuốc vào được cơ thể trẻ nhiều mg/ngày [11]

1.1.2.5 Dược lực học của CM

Các thử nghiệm trong ống nghiệm cho thấy CM là một chất đối kháng cạnh tranh chọn lọc với thụ thể histamin H2 mà không có tương tác có ý nghĩa nào với catecholamin, thụ thể β, thụ thể histamin H1, thụ thể muscarinic và không có tác dụng kháng cholinergic CM làm giảm bài tiết và giảm nồng độ acid dạ dày cả ở điều kiện cơ bản (khi đói) và khi được kích thích bởi thức ăn, histamin, pentagastrin, insulin và cafein [33] Vì quá trình tiết acid cơ bản dài nhất xảy ra vào ban đêm nên việc dùng thuốc sau ăn tối hoặc trước khi ngủ sẽ đạt hiệu quả tối ưu CM cũng ức chế enzym cytochrome P - 450, cytochrome P

- 448 trong gan đồng thời với các hệ thống chức năng oxidase, đối kháng dihydrotestosterone (hoạt động kháng androgen)

Ngoài ra, CM tăng cường sự bảo vệ niêm mạc dạ dày và có khả năng chữa khỏi các rối loạn liên quan đến acid, đặc biệt là loét và chảy máu dạ dày

do stress, bằng cách tăng sản xuất chất nhầy dạ dày, tăng tiết chất nhầy do bicarbonat, tăng lưu lượng máu ở niêm mạc dạ dày, tăng tổng hợp prostaglandin nội sinh và tăng tốc độ tái tạo tế bào biểu mô [33]

1.1.2.6 Tác dụng phụ của CM

- Đường tiêu hóa: Tiêu chảy (nhẹ), tần suất 1/100 bệnh nhân [18]

- Hệ thần kinh trung ương: Đau đầu (nhẹ đến nặng), chóng mặt và buồn ngủ (nhẹ) Các rối loạn tâm thần như kích động, trầm cảm, lo âu, ảo giác, mất phương hướng, mất đi sau 3 - 4 ngày ngừng thuốc [20]

- Nội tiết: Chứng vú to đã được báo cáo Theo báo cáo của L.A Garcia Rodriguez và Hershel Jick tác dụng phụ này gặp ở những người dùng CM > 1 g/ngày trong thời gian từ 7 - 12 tháng, hiện tượng này thường trở lại bình

11

thường khi ngừng điều trị [30, 31] Theo S.M Sabesin, nếu uống CM kéo dài với liều > 5 g/ngày mới có thể gây bất lực và chứng vú to ở nam giới [27]

- Quá mẫn: Sốc phản vệ và viêm mạch máu quá mẫn

- Thận: Tăng creatinin huyết thanh (tăng nhẹ) Có thể gặp viêm thận kẽ

và bí tiểu phải ngừng điều trị

- Tim mạch: Nhịp tim chậm, nhanh và block nhĩ thất đã được báo cáo với thuốc đối kháng thụ thể H2 S.Saltissi (1981) cho thấy không có sự thay đổi đáng kể nào lên hệ tim mạch của 24 bệnh nhân dùng 400 mg CM/ngày trong 4 tuần [28]

- Cơ xương khớp: Đau khớp và đau cơ tự hồi phục

- Da và phần phụ: Phát ban nhẹ, hội chứng Stevens - Johnson, hoại tử thựợng bì nhiễm độc, hồng ban đa dạng, đỏ da bong vảy toàn thân, rụng tóc

1.2 Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế

giới

1.2.1 Tình hình nghiên cứu về màng BC

1.2.1.1 Tình hình nghiên cứu về màng BC tại Việt Nam

Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ vi khuẩn A

xylinum ngày càng được quan tâm Nguyễn Văn Thanh và cs (2006) [2] đã tiến

hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng BC từ A xylium đạt hiệu cao Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng dụng

màng BC điều trị bỏng với 2 loại màng BC gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô

và hoạt chất kháng khuẩn Kết quả cho thấy màng BC có cho thêm hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u làm gia tăng hiệu quả trị bỏng là ưu điểm mà các loại màng khác trên thế giới không có

Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như

Quỳnh [5] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter

xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, kết quả

12

cho thấy màng BC tạo bởi A xylinum BNH2 tổng hợ có sợi cellulose nhỏ, dai,

độ bền kéo, độ thấu khí cao, độ hút nước tốt có triển vọng ứng dụng làm màng trị bỏng

1.2.1.2 Tình hình nghiên về màng BC trên thế giới

Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A xylinum và những ứng dụng của

nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới Tác giả Brown (1989), dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào Brown (1989), Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm [2]

BC được ứng dụng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm Các tác giả Hamlyn và cs (1997), Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cs (2006) sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí

bản quyền về làm màng BC từ A xylinum dùng trị bỏng Các tác giả Jonas và

Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [2]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới về CM

1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam về CM

Ở Việt Nam, phần lớn CM được sử dụng là một loại thuốc để chữa trị bệnh viêm loét và trào ngược dạ dày, ngăn ngừa tái phát sau khi bị viêm loét dạ dày

Ngoài ra, CM còn được ứng dụng trong chữa các bệnh về da liễu, Hà Nguyễn Phương Anh của trường Đại học Y dược đã thành công với luận án: Nhiễm Human papillomavirus trên bệnh nhân bị nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục và tác dụng của CM trong phòng tái phát bệnh sùi mào gà [1]

13

1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về CM

Fukuda M và cs đã chứng minh hiệu quả của CM là một chất đối kháng thụ thể histamin H2 điều trị tổn thương dạ dày cấp tính, ung thư đại trực tràng [15]

Arisawa T và cs có công trình nghiên cứu sự kết hợp CM và Rabeprazole đơn trị liệu điều trị các tổn thương dạ dày cấp tính thông qua đường uống tái tạo mô liên kết [12]

Nghiên cứu của Franco I (2000) dùng CM với liều 30 – 40 mg/ngày, dùng trong 3 tháng liền để chữa mụn cóc trên bốn trẻ em Kết quả là bốn trẻ đều khỏi mụn cóc [14]

1.2.3 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới về hướng nghiên

cứu

Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng BC làm hệ thống vận tải và phấn phối thuốc được báo cáo [17], trong đó có 9 nghiên cứu với màng BC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng

BC và 7 nghiên cứu với các vật liệu nanocomposite Như vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp tục được tiến hành nghiên cứu

M C I Mohd Amin và cs đã nghiên cứu đánh giá tiềm năng của BC hydrogels như là một hệ thống phân phối thuốc qua đường uống Nghiên cứu được thử nghiệm trong dịch dạ dày mô phỏng và dịch ruột mô phỏng Kết quả cho thấy hidrogels phân phối chậm ở dịch dạ dày mô phỏng hơn so với dịch ruột mô phỏng Như vậy, BC hydrogels có thể thích hợp cho việc phân phối thuốc qua đường uống [21]

Amin và cs đã báo cáo việc sử dụng màng BC làm màng phân phối thuốc bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ Kết quả cho thấy màng BC có thể làm thành một màng phim dẻo, trong suốt để phân phối thuốc, giúp cho thuốc được giải phóng một cách kéo dài, làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc [10] Gần

14

đây hơn, Lin Huang và cs [19] nghiên cứu việc sử dụng màng BC cho việc kiểm

soát in vitro của Berberin Ngoài thẩm thấu qua da, thí nghiệm kiểm soát sự giải

phóng thuốc qua màng BC còn được thử nghiệm mô phỏng trong dạ dày, ruột Các kết quả thu được cho thấy thuốc đã được giải phóng với một tốc độ chậm

Jayswal BD, Yadav VT, Pater KN, Patel BA đã sử dụng Sodium alginate – một polymer tự nhiên, được sử dụng làm hệ thống phân phối thuốc CM qua đường uống Nghiên cứu đã xây dựng và đánh giá các Sodium alginate và

pectin dựa trên In situ gel của CM Kết quả nghiên cứu cho thấy các thí nghiệm

có chứa 1,2% natri alginate và 1,5% pectin có khả năng hấp thụ thuốc tốt hơn

và thời gian giải phóng thuốc dài hơn [16]

Nghiên cứu của A K Srivastava và cs liên quan đến việc đánh giá các vi cầu khuẩn nổi với CM như mô hình kéo dài thời gian cư trú thuốc tại dạ dày Các vi cầu được chuẩn bị bằng phương pháp bay hơi dung môi sử dụng polymer hydroxyporyl methyl celllulose và ethyl cellulose Hình dạng và bề mặt hình thái của vi cầu được quan sát bằng kinh hiển vi quang học và kính hiển vi điện

tử quét Kết quả cho thấy nồng độ polymer, kích thước vi cầu khuẩn, thành phần dung môi ảnh hưởng tới thời gian giải phóng thuốc Kích thước hạt vi cầu khuẩn tăng lên, nồng độ polymer cao hơn thì thời gian cư trú CM tại dạ dày tăng lên [7]

Hiện chưa có đề tài nào nghiên cứu việc sử dụng màng BC làm hệ thống vận tải và phân phối thuốc CM qua đường uống

15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Giống vi khuẩn

Giống vi khuẩn A xylinum thuần chủng được cung cấp bởi phòng thí

nghiệm vi sinh trường ĐHSP Hà Nội 2

2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất

 Nguyên liệu: Nước dừa già

 Hóa chất: Sử dụng các hóa chất đặc biệt và các hóa chất thông thường

có nguồn gốc từ Trung Quốc và Việt Nam:

 Bể rung siêu âm S60/H

 Buồng cấy vô trùng (Haraeus)

 Cân kĩ thuật TE412

 Cân phân tích (Sartorius – Thụy sỹ)

 Khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức)

 Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản)

Bảng 2.1 Môi trường lên men tạo màng BC

Môi trường được hấp khử trùng ở 113o

C trong 15 phút Tiếp tục khử trùng bằng tia UV trong 30 phút

Để nguội môi trường sau đó bổ sung 10% dịch giống và 2% acid axetic Sau đó nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 26o

C trong 6 – 14 ngày [2]

Sau khi nuôi cấy tĩnh 6 – 14 ngày ở 26oC, màng BC được nhúng vào nước cất Sau đó màng BC được tinh chế nhiều lần theo quy trình được trình bày trên sơ đồ 1 [2]

17

Sơ đồ 2.1 Quy trình thu nhận màng BC

- Tách BC: Trong môi trường nuôi cấy tĩnh BC tạo thành màng dày ở mặt môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường

- Ngâm NaOH: Trong màng chưa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm màng trong NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn

- Ngâm HCl: Màng BC sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước rồi ép màng Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH

- Ngâm nước: Màng sau khi ngâm với nước rửa rồi ép màng Ngâm nước đến trung hòa hết acid, thời gian khoảng 48 giờ ta thu được BC tinh chế

- BC sau khi được tinh chế sấy 90oC trong 4 giờ để loại bỏ nước

Ngâm trong NaOH 3%

18

2.3.2 Phương pháp dựng đường chuẩn của CM

Nguyên lí: Sử dụng máy UV 2450 đo quang phổ hấp thụ của CM ở các

nồng độ khác nhau với bước sóng 265 nm [24]

Thực hiện: Chuẩn bị các mẫu chuẩn CM với các nồng độ lần lượt là:

0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% mg/ml trong dung môi 0,1N HCl

Mẫu trắng là dung môi hòa tan CM (0,1N HCl)

Dựng đồ thị đường chuẩn và lập phương trình chuẩn CM bằng phần mềm Excel 2010 [3]

Để kết quả đo có độ chính xác cao tiến hành pha dung dịch chuẩn 3 lần

và đo quang phổ 3 lần lấy giá trị trung bình để dựng đường chuẩn

Kết quả quang phổ trung bình của CM ở bước sóng 265 nm được trình bày trong bảng 2.2

19

Hình 2.1 Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn CM

Phương trình đường chuẩn:

y = 0,008x – 0,0013 (R2 = 0,9891) (2.1) Trong đó:

x: Nồng độ CM (mg/ml) y: Giá trị OD tương ứng với nồng độ x

R2: Độ lệch chuẩn

2.3.3 Phương pháp xác định lượng thuốc CM hấp thụ vào màng BC

Lượng thuốc CM hấp thụ vào màng BC được tiến hành thử nghiệm trên 2 mẫu