Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc curcumin của màng bacterial cellulose lên men từ nước dừa già định hướng sử dụng qua da

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ===o0o=== DIÊM THỊ THÙY DUNG NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI THUỐC CURCUMIN CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE LÊN MEN TỪ NƯỚC DỪA GIÀ Đ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

===o0o===

DIÊM THỊ THÙY DUNG

NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI THUỐC CURCUMIN CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE

LÊN MEN TỪ NƯỚC DỪA GIÀ ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG QUA DA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

dẫn khoa học:

TS Nguyễn Xuân Thành

HÀ NỘI - 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

===o0o===

DIÊM THỊ THÙY DUNG

NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI THUỐC CURCUMIN CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE

LÊN MEN TỪ NƯỚC DỪA GIÀ ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG QUA DA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học THS LÊ THỊ TUYẾT hướng

dẫn khoa học:

TS Nguyễn Xuân Thành

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu với đề tài

“Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc Curcumin của màng Bacterial Cellulose lên men từ nước dừa già định hướng sử dụng qua da”, em đã

nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và các bạn tại Trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:

ThS Lê Thị Tuyết – Người đã hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này

Em cảm ơn chân thành tới các thầy cô làm việc tại Trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ - trường Đại học Sư phạm

Hà Nội 2, các thầy cô và các bạn sinh viên đang học tập và làm việc tại Bộ môn Sinh lý người và động vật, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình hoàn thành đề tài nghiên cứu

Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, những người thân, bạn bè đã quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Diêm Thị Thùy Dung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật Đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã công bố Trong tài liệu này tôi có sử dụng một số tài liệu của một số tác giả, tôi xin phép tác giả để bổ sung cho luận văn của mình Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, ngày 03 tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Diêm Thị Thùy Dung

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

4 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 3

5 Ý nghĩa 3

6 Phương pháp nghiên cứu 4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1 TỔNG QUAN VỀ BC 5

1.1 Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum 5

1.2 Đặc điểm của A xylinum 5

1.3 Cấu trúc đặc tính của màng BC tạo bởi A xylinum 6

1.4 Tính chất độc đáo của BC 6

1.5 Sinh tổng hợp BC 7

1.6 Môi trường nuôi cấy A xylinum 7

1.7 Các phương pháp sản xuất BC từ A xylinum 8

1.8 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC trong lĩnh vực vận tải và phân phối thuốc qua da 9

2 TỔNG QUAN VỀ TINH CHẤT CUR 11

2.1 Sơ lược về thuốc CUR 11

2.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc CUR 14

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Độ dày màng BC trong các điều kiện nuôi cấy 24

3.2 Tinh chế màng BC 25

3.3 Màng BC nạp CUR 26

3.4 Khả năng hấp thụ CUR của màng BC 27

3.5 Khả năng giải phóng thuốc CUR 28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

4.1 Kết luận 34

4.2 Kiến nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

PHỤ LỤC 39

DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1: Cấu trúc CUR 1,7-bis (4-hydroxy-3-metoxyphenyl) -1,6-heptadien-

3,5-dione 11

Hình 2.1: Phổ UV của CUR với dung môi là etanol 19

Hình 2.2: Phương trình đường chuẩn của CUR 20

Hình 3.1: Màng BC thô thu được sau 6 ngày 25

Hình 3.2: Màng BC sau khi tinh chế 26

Hình 3.3: Màng BC sau khi loát thuốc 26

Hình 3.4: Màng BC – CUR 0,3 cm sau khi sấy 27

Hình 3.5: Phương trình hồi quy của mẫu CUR 29

Biểu đồ 3.1: Mật độ quang của màng BC – CUR ở độ dày khác nhau 30

Biểu đồ 3.2: Tỉ lệ giải phóng thuốc từ màng BC – CUR theo giờ 32

Sơ đồ 2.1: Quy trình tinh chế màng BC 18

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần của nước dừa già 8

Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy A xylinum tạo màng BC 18

Bảng 2.2: Mật độ quang của dung dịch CUR ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau (n = 3) 20

Bảng 2.3: Môi trường đệm PBS với pH 7,4 21

Bảng 3.1: Kết quả thu màng BC tươi (n = 3) 24

Bảng 3.2: Tỉ lệ hấp thụ thuốc của CUR vào màng BC (n = 3) 27

Bảng 3.3: Khối lượng hấp thụ CUR vào màng BC ở các độ dày khác nhau (n=3) 28

Bảng 3.4: Độ hấp thụ quang của Curcumin tại các nồng độ (µg/ml) khác nhau (n = 3) 28

Bảng 3.5: Mật độ quang của dung dịch CUR tại các độ dày màng khác nhau theo giờ (n = 3) 29

Bảng 3.6: Tỉ lệ giải phóng dược chất của màng BC – CUR ở độ dày khác nhau trong môi trường đệm pH 7,4 theo thời gian (n = 3) 31

Bảng 3.7: Hệ số tương quan R2, tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ giải phóng (n) trong môi trường pH 7,4 ở độ dày màng khác nhau (n = 3) 32

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong những năm gần đây đã có sự chú ý đặc biệt về việc sử dụng các vật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái tạo, tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng Một trong những vật liệu sinh học có những đặc tính trên được chú ý là cellulose Vật liệu này vượt trội so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác [15] Trong đó, Bacterial Cellulose hay màng sinh học (BC) là đối tượng của nhiều nghiên cứu ứng dụng của các nhà khoa học trong nước cũng như nước ngoài Đây là một loại nguyên liệu mới, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học,

mỹ phẩm, Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng BC được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp Về mặt tính chất, BC có độ tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác,

có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn Ngoài ra, BC còn có

độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước và hướng BC còn là một mạng polyme sinh học có khả năng giữ nước rất lớn,

có tính xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề mặt (lực bền cơ học cao) [5]

Ngoài ra, màng BC còn là hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và sự tác động của UV, có tiềm năng cao cho các ứng dụng trong các hệ thống vận chuyển thuốc, cho cả thẩm thấu qua da, qua đường miệng và mô - kỹ thuật, và một số ứng dụng y sinh học khác [5, 6, 9, 28],…

Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm

hệ thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da với một số loại thuốc có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường Lợi thế lớn nhất từ việc sử dụng màng BC nạp thuốc là khả năng chữa lành vết

thương, đặc tính bảo vệ, khả năng hấp thu dịch tiết với việc giải phóng các loại thuốc trị liệu có liên quan Hầu hết các chế phẩm đắp qua da được sản xuất bởi các vật liệu khác nhau Do đó, một hệ thống nạp thuốc có khả năng giải phóng thuốc kéo dài có ít lớp, hoặc thậm chí một lớp duy nhất có thể đơn giản hóa quy trình sản xuất và giảm chi phí [5, 26]

Curcumin (CUR) có nguồn gốc từ các gia vị nghệ - thực phẩm phổ biến được sử dụng trong nhiều thế kỷ như một phương thuốc cho nhiều bệnh Nghiên cứu khoa học rộng lớn trong thập kỷ qua đã thể hiện khả năng của hợp chất này để điều chỉnh nhiều mục tiêu của tế bào và do đó có giá trị phòng ngừa và điều trị chống lại một loạt các bệnh

Trong những năm gần đây, các tác dụng dược lý tiềm năng của CUR trong các bệnh viêm, bệnh tim mạch, ung thư, bệnh Alzheimer và các chứng rối loạn thần kinh đã được chứng minh Tuy nhiên, các ứng dụng lâm sàng của CUR hạn chế do nhược điểm chính của nó như sự bất ổn, độ hòa tan thấp, khả dụng sinh học kém và quá trình chuyển hóa nhanh chóng [27]

CUR - một hợp chất polyphenolic sở hữu tác dụng dược lý khác nhau bao gồm chống viêm, chống oxy hóa, chống tiền tăng sinh và các hoạt động chống tạo mạch Mặc dù hiệu quả và độ an toàn của nó đã được chứng minh, hạn chế sinh khả dụng CUR tiếp tục được nhấn mạnh như là một mối quan tâm chính Nồng độ CUR trong huyết thanh và mô thấp, không phân biệt đường dùng, quá trình chuyển hóa nhanh chóng và loại trừ những yếu tố quan trọng làm giảm bớt khả năng sinh khả dụng của CUR [8]

Thử nghiệm lâm sàng đã chỉ ra rằng chất CUR là an toàn ngay cả ở liều cao (12 g/ngày) ở người nhưng biểu hiện sinh khả dụng kém Lý do chính hấp thu vào mức độ huyết tương và mô thấp của CUR là do kém hấp thu, chuyển hóa nhanh chóng, và loại bỏ hệ thống nhanh chóng Để cải thiện sinh khả dụng của CUR, nhiều phương pháp đã được thực hiện [8]

Từ các nghiên cứu về màng BC và một số hạn chế của CUR trong quá trình điều trị, xét thấy đây là hướng nghiên cứu mới và triển vọng Đó là lí do

chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc

Curcumin của Bacterial Cellulose lên men từ nước dừa già định hướng sử dụng qua da”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu tiềm năng của màng BC trong việc hấp thu và giải phóng thuốc kéo dài định hướng sử dụng qua da nhằm khắc phục hạn chế của thuốc

- Kết quả nghiên cứu thu được có thể khắc phục các nhược điểm của CUR và tăng hiệu quả sinh khả dụng của thuốc thông qua việc sử dụng màng

BC làm hệ thống vận tải và phân phối thuốc qua da

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Tạo màng và xử lí màng BC

- Thiết kế, chế tạo màng BC nạp CUR

- Khảo sát khả năng vận tải và phân phối thuốc của BC – CUR in vitro

4 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu: Màng BC làm từ môi trường nước dừa già; thuốc CUR tinh khiết 95%

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu khả năng vận tải và phân phối thuốc

CUR dựa trên màng BC định hướng qua da in vitro

5 Ý nghĩa

* Ý nghĩa khoa học

Tiếp tục nghiên cứu tiềm năng của màng BC trong việc vận tải và phân phối thuốc định hướng qua da Việc nghiên cứu ứng dụng màng BC nhằm nâng cao hiệu quả của thuốc CUR

* Ý nghĩa thực tiễn

Sử dụng màng BC làm hệ thống vận tải và phân phối thuốc nhằm tạo hệ

thống vận tải và phân phối thuốc kéo dài có thể khắc phục những hạn chế của thuốc CUR

6 Phương pháp nghiên cứu

- Chuẩn bị màng BC;

- Phương pháp dựng đường chuẩn;

- Chuẩn bị bộ đệm;

- Chế tạo màng BC nạp CUR;

- Xác định lượng CUR nạp vào màng BC;

- Xác định lượng thuốc giải phóng của màng BC đã nạp thuốc CUR;

- Phương pháp xử lý thống kê

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 TỔNG QUAN VỀ BC

1.1 Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum

Acetobacter xylinum (A xylinum) thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi

Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, là loại hiếu khí bắt buộc, có nhu mao và

sản xuất cellulose ngoại bào [5]

Theo khóa phân loại của Bergey [20], A xylinum thuộc:

A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang

khoảng 0,6 – 0,8 µm, dài khoảng 2 – 3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram

âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biển đổi: tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [5]

* Đặc điểm sinh lí và sinh hóa của A xylinum:

Vi khuẩn có khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, phản ứng catalase dương tính, không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, không tạo sắc

tố nâu, có khả năng tổng hợp cellulose, chuyển hóa glucose thành acid, chuyển hóa glycerol thành dihydroaceton

A xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc

vào chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất

Nhiệt độ tối ưu để A xylinum phát triển là từ 25 - 30°C; vi khuẩn tăng

trưởng trong khoảng pH từ 3 – 8, pH tối ưu để sản xuất cellulose là 5,5 [5, 20]

1.3 Cấu trúc đặc tính của màng BC tạo bởi A xylinum

- Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer β-1,4-glucopyranose không phân nhánh Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của BC giống cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [13, 28]

- Theo AJ Brown (1886), BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5 nm, kết hợp với nhau Các sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 – 8 nm

- Đặc tính cấu trúc của BC phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy: + Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh (S - BC: Static-Bacterial

Cellulose), A xylinum tạo ra cellulose nhiều hơn và tạo thành màng dày trên bề

mặt môi trường Màng BC thu được dẻo dai, dày, có màu trắng trong hơi ngả màu vàng

+ Khi nuôi cấy động (A - BC: Agitated-Bacterial Cellulose), một lượng nhỏ cellulose được hình thành dưới dạng hyền phù phân tán trong đó chuỗi β-1,4-glucan xếp một cách ngẫu nhiên BC được tạo ra bằng phương pháp nuôi cấy động dưới dạng các hạt nhỏ, các sợi rối rắm, cong và không trật tự do sự dao động của môi trường nuôi cấy

+ Lượng BC được sinh ra giữa hai phương pháp nuôi cấy động và tĩnh cũng khác nhau: khối lượng màng khô của phương pháp nuôi cấy động nhỏ hơn so với nuôi cấy tĩnh [5, 24]

1.4 Tính chất độc đáo của BC

- Độ tinh khiết cao: BC là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp

không có chứa lignin hay hemicellulose Do đó BC có thể bị vi khuẩn phân hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh [30]

- Độ bền dai cơ học lớn: cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao, trọng lượng nhẹ, độ bền đáng kể [6, 30]

- Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: khả năng giữ nước đáng kể, lực ẩm cao Màng BC có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút khoảng 200 lần trọng lượng của nó (Patel & Suresh 2008; Wippermann et al 2009) [33]

1.5 Sinh tổng hợp BC

Các vị trí tổng hợp cellulose của A xylinum là những lỗ nằm trên bề mặt

tế bào, có đường kính 3,5 nm sắp xếp song song trên đường thẳng trục dọc của vi khuẩn Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10 nm chứa các enzym có chức năng trong sự polyme hóa để tổng hợp cellulose và các protein hỗ trợ liên quan đến các chức năng khác [5]

A xylinum hấp thu đường glucose vào trong tế bào, kết hợp với một

acid béo tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào, sau đó tiền chất này được tiết

ra ngoài tế bào cùng với enzym để thực hiện quá trình polyme hóa tạo cellulose Các sợi siêu nhỏ 1,5 nm tạo nên các dãy glucan tạo thành các sợi, sau đó kết hợp với nhau thành bó sợi nhỏ Các bó sợi này sẽ được phun vào môi trường nuôi cấy [5]

1.6 Môi trường nuôi cấy A xylinum

Môi trường nuôi cấy A xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn

dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [5]

A xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn

cacbonhydrat Nguồn cacbonhydrat mà A xylinum sử dụng là glucose,

fructose, maninol, sorbitol nếu sử dụng glycerol, galactose, lactose, sucrose cho hiệu suất thập hơn, không nên sử dụng mannose, cellobiose, erythriol, acetate Việc sử dụng các loại đường cũng như nồng độ các loại đường trong

môi trường còn phụ thuộc vào những chủng A xylinum khác nhau [5]

Nhu cầu sử dụng đương ở A xylinum rất lớn và giữ vai trò quan trọng

trong quá trình tổng hợp BC nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng

các sản phẩm: rỉ đường, chất thải trong công nghiệp sản xuất khoai tây và pho

mát, nước dừa già và nước mía để làm nguyên liêu nuôi cấy A xylinum Trong đó nước dừa già được xem là môi trường kinh điển trong nuôi cấy A

xylinum [5]

Trong nước dừa chưa rất nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích tố

tăng trưởng như hexitol, cytolunin, sorbitol, … Vì vậy A xylinum rất thích

hợp phát triển trong môi trường này Nước dừa sau khi thu hoạch được sử dụng không quá 3 ngày, tránh để lâu làm cho đường và các chất dinh dưỡng khác giảm dẫn đến hiệu suất kém [5, 11] Thành phần dinh dưỡng của nước dừa được trình bày trong bảng 1.1 [5]

Bảng 1.1: Thành phần của nước dừa già

Nước (%) 94,99 Kẽm (mg/100g) 0,1 Protein (%) 0,72 Đồng (mg/100g) 0,04 Chất béo toàn phần (%) 0,72 Mangan (mg/100g) 0,142 Carbonhydrat (%) 3,17 Selenium (µg/100g) 1 Đường (%) 2,16 Vitamin C (µg/100g) 2,4 Calcium (mg/100g) 24 Thiamin (mg/100g) 0,03 Sắt (mg/100g) 0,29 Riboflavin (mg/100g) 0,057 Magie (mg/100g) 25 Niacin (mg/100g) 0,08 Phosphorus (mg/100g) 20 Acid Pathenic (mg/100g) 0,043 Kali (mg/100g) 250 Vitamin B6 (mg/100g) 0,032 Natri (mg/100g) 105 Folate (µg/100g) 3

1.7 Các phương pháp sản xuất BC từ A xylinum

1.7.1 Lên men tĩnh

Môi trường dinh dưỡng để lên men A xylinum được cho vào các khay lên

men có bề mặt thoáng rộng Trong quá trình lên men các khay được đậy bằng

giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men 28 - 30ᴼC Sợi cellulose mới được tổng hợp sẽ di chuyển lên bề mặt của môi trường nuôi cấy tạo thành lớp màng cellulose nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và không khí Cellulose tiếp tục được tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên Sau 7-10 ngày có thể thu BC [5, 24]

1.7.2 Lên men động

Vi khuẩn A xylinum thường được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy lắc

Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào môi trường nuôi cấy đã chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong các máy lắc ổn nhiệt ở 28-30ᴼC, 180-200 vòng/phút BC được tạo ra từ môi trường lắc có dạng hạt nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường Lượng O2 hòa tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và khả

năng tổng hợp BC của vi khuẩn A xylinum Do đó, quá trình lên men đạt hiệu

quả cao, các reactor có sục khí thường xuyên được sử dụng để lên men [5, 24]

1.8 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC trong lĩnh vực vận tải

và phân phối thuốc qua da

1.8.1 Trên thế giới

Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng BC trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo [6], trong đó có 9 nghiên cứu với màng BC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng BC và 7 nghiên cứu với các vật liệu nanocomposite Như vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp tục được tiến hành nghiên cứu

Một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm hệ thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da với một số loại thuốc đã cho thấy có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường Nghiên cứu của Wei B và cộng sự (2011) cho thấy màng khô BC thu

được sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng khuẩn; Merck KGaA, Darmstadt, Đức) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116 kg/cm2, và tác dụng của thuốc kéo

dài ít nhất 24h chống lại hoạt động của S aureus và B Subtilis [31] Nghiên

cứu khác cho thấy việc sử dụng nanocomposites bạc với BC đã cho hiệu quả kháng khuẩn cao [21]

Tiềm năng vận tải và phân phối thuốc của màng BC qua da đã được nghiên cứu bằng cách tải tetracycline trong chùm electron mẫu chiếu xạ và không được chiếu xạ BC không chiếu xạ cho phép giải phóng thuốc nhanh hơn so với ảnh hưởng của BC chiếu xạ Kết quả nghiên cứu này cho thấy màng BC không chỉ có khả năng vận tải mà còn đề xuất một mô hình cho giải phóng thuốc qua màng [6] Việc sử dụng màng BC cho việc thẩm thấu qua da của nhiều thuốc, cụ thể là ibuprophen [33], caffeine [24], diclofenac [25] và sulfadiazine bạc [16] cho kết quả tích cực Các kết quả nghiên cứu cho thấy việc bổ sung glycerol vào màng BC giúp màng linh động hơn và tạo điều kiện

giữ ẩm cho bề mặt da Tất cả các loại thuốc trên đã được thử nghiệm in vitro

cho thẩm thấu qua da [17] và so sánh với cách thức thông thường Kết quả cho thấy ibuprofen là chất ưu mỡ thấm qua màng BC cao hơn gần ba lần những quan sát trong gel hoặc các giải pháp PEG400; lidocaine hydrochloride thẩm thấu qua màng chậm hơn ibuprofen, do màng BC có cấu trúc mạng không gian ba chiều phức tạp đã làm cho sự khuếch tán của thuốc được kéo dài và làm giảm tỉ lệ giải phóng thuốc khi so sánh với các cách thức thông thường, đây là một lợi thế cho việc điều trị dài hạn của thuốc mà không gây tình trạng quá mẫn [33] Luan J et al (2012) [16], đã nghiên cứu màng BC cho băng vết thương nạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phổ biến được sử dụng trong điều trị vết thương nhiễm khuẩn do bỏng Nó đã được chứng minh rằng sau khi sử dụng màng BC ngâm tẩm bạc sulfadiazine, hoạt động kháng

khuẩn đối với P aeruginosa, E coli và S aureus đạt hiệu quả tốt hơn dạng

kem bôi thông thường

1.8.2 Tại Việt Nam

Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [5] đã tiến hành nuôi cấy, tinh

chế và thu màng BC từ A xylium đạt hiệu cao Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng dụng màng BC điều trị

bỏng với 2 loại màng BC gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn Kết quả cho thấy tác dụng của màng có thêm hoạt chất tái sinh

mô tốt hơn hẳn

2 TỔNG QUAN VỀ TINH CHẤT CUR

2.1 Sơ lược về thuốc CUR

2.1.1 Công thức

+ Tên IUPAC: (1E, 6E) -1,7-bis (4-hydroxy-3-metoxyphenyl) heptadien- 3,5-dione (Anand et al 2007) [2]

-1,6-Cấu trúc CUR được trình bày trong hình 1.1

Công thức phân tử: C21H20O6 (CUR I)

+ Phân tử khối: 368,38 g/mol

Hình 1.1: Cấu trúc CUR 1,7-bis (4-hydroxy-3-metoxyphenyl)

-1,6-heptadien- 3,5-dione

+ Hiện tại người ta tìm thấy CUR tồn tại ở 4 dạng hợp chất:

- CUR chính thức ( còn gọi là CUR I) chiếm 60% tổng lượng CUR

- Demethoxycurcumin ( CUR II ) chiếm 24% tổng lượng CUR

- Bis-demethoxycurcumin ( CUR III ) chiếm 14% tổng lượng CUR

- Và một hợp chất mới xuất hiện là cyclocurcumin chiếm khoảng 1% [1, 2, 3, 8]

2.1.2 Nguồn gốc và tính chất

* Nguồn gốc:

CUR là hoạt chất được chiết xuất từ cây Nghệ vàng Curcuma longa L., họ

gừng Zingiberaceae, chiếm 0,3% khối lượng khô của cây Nghệ vàng [3, 7, 18] Thành phần hóa học của nghệ gồm: nhóm chất màu curcuminoid, tinh dầu và các hợp chất khác [3]

không hoạt động hoặc giải phóng nhanh chóng ra khỏi cơ thể Các nghiên cứu cho đến nay đã gợi ý một hoạt động nội tại mạnh mẽ và, do đó, hiệu quả của chất CUR như một đại lý trị liệu cho các bệnh khác nhau [22]

Các nghiên cứu trong ba thập kỷ qua liên quan đến sự hấp thu, phân bố, chuyển hóa và bài tiết chất CUR đã tiết lộ khả năng hấp thu kém và chuyển hóa nhanh chóng của chất CUR mà giảm bớt nghiêm trọng sinh khả dụng của

nó Trong phần này, các vấn đề khả dụng sinh học của CUR như độ thấp trong huyết thanh, phân phối mô hạn chế, quá trình chuyển hóa nhanh chóng

rõ ràng và ngắn nửa cuộc sống được mô tả chi tiết [32]

Rào cản lớn khiến thuốc nghệ CUR chưa được ứng dụng rộng rãi là do CUR không tan trong nước (độ tan 0,001%), sinh khả dụng thấp [23] Vì vậy, khi dùng theo đường uống, CUR hòa tan một phần rất nhỏ vào các dịch thể của ống tiêu hóa, chỉ 7 – 10% CUR được hấp thụ vào máu, lại bị chuyển hóa nhanh qua gan, làm cho sinh khả dụng thực tế của CUR chỉ đạt 2-3% [22] Các nghiên cứu dược động học ở động vật đã chứng minh rằng 40 - 85 phần trăm của liều uống CUR đi qua đường tiêu hóa không thay đổi, với hầu hết các phức flavonoid hấp thu chuyển hóa ở niêm mạc ruột và gan [23]

2.1.3.2 Tác dụng

CUR có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, kháng virus và kháng nấm Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chất CUR là không độc hại đối với con người CUR gây sức hoạt động chống viêm bằng cách ức chế một số phân tử khác nhau mà đóng một vai trò quan trọng trong viêm Củ nghệ có hiệu quả trong việc giảm viêm sau phẫu thuật Củ nghệ giúp ngăn ngừa xơ vữa động mạch bằng cách làm giảm sự hình thành của máu làm các khối [22]

CUR ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn Helicobacter pylori gây viêm

loét dạ dày và đã được liên kết với ung thư dạ dày CUR có thể gắn với các kim loại nặng như cadmium và chì, do đó làm giảm độc tính của các kim loại nặng Thuộc tính này của CUR giải thích hành động bảo vệ của nó đến não

CUR hoạt động như một chất ức chế cho cyclooxygenase, 5-lipoxygenase và glutathione S-transferase [14]

2.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc CUR

2.2.1 Trên thế giới

Các tài liệu khoa học trong 20 năm qua trên curcumin cho thấy chất curcumin có thể là một ứng cử viên mong muốn trong phòng ngừa và điều trị bệnh ung thư Số liệu hiện tại (theo cơ sở dữ liệu SciFinder, ngày 23 tháng 8 năm 2011) cho thấy tổng cộng có 12.903 lượt truy cập vào "curcumin" Trong

số đó, 60 tài liệu tham khảo là các thử nghiệm lâm sàng, 1094 tài liệu tham khảo trong một hình thức xem xét và tham khảo 1.515 trên các ứng dụng bằng sáng chế Có tổng cộng 56 thử nghiệm lâm sàng (giai đoạn I và giai đoạn II) trên CUR được liệt kê trên trang web của Viện y tế Quốc gia Hoa Kỳ Trong

số đó, 16 thử nghiệm đã được hoàn thành, ba thử nghiệm đã được chấm dứt, một người bị thu hồi và phần còn lại của các nghiên cứu đang được thực hiện [26]

Nghiên cứu năm 2011 của Bambang Kuswandi và các cộng sự [10] về CUR / BC trong việc phát hiện sự hư hỏng của tôm Công trình này sử dụng thuốc nhuộm tự nhiên của chất CUR như chất cảm biến để phát hiện các biến động vô cơ và hữu cơ được sản xuất trong quá trình tăng trưởng của vi khuẩn trong mẫu tôm CUR được sử dụng như là thuốc thử cảm biến tự nhiên , là cố định trên BC sử dụng hấp thụ như một phương pháp đơn giản cho phép khối lượng sản xuất của bộ cảm biến chi phí thấp Như vậy, tất cả các vật liệu cảm biến có thể ăn được và phù hợp cho các ứng dụng thực phẩm Các chất CUR /

BC đã được sử dụng thành công như một cảm biến nhãn dán trên gói cho một phát hiện hình ảnh của tôm hư hỏng [10]

Nghiên cứu năm 2012 của Min Sun, Xun Su, Buyun Ding, Xiuli He, Xiuju Liu, Aihua Yu, Hongxiang Lou, Guangxi Zhai về những tiến bộ trong

hệ thống phân phối cho chất CUR dựa trên công nghệ nano [27] Bài viết này

đánh giá các hệ thống phân phối thuốc mới tiềm năng cho CUR bao gồm các

liposome, hạt nano polyme, hạt nano lipid rắn, mixen, nanosuspensions, dạng

nhũ tương nano, cụm, trong đó cung cấp các kết quả đầy hứa hẹn cho CUR để

cải thiện hoạt động sinh học của nó Tóm lại, hệ thống phân phối thuốc mới

làm sáng tỏ về sự phát triển của các công thức mới, trong khi đó, nghiên cứu

sâu rộng hơn nên được thực hiện trong tương lai để giải quyết các vấn đề

dược phẩm và ngộ độc [27]

2.2.2 Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến CUR

nhưng chủ yếu là các công trình nghiên cứu liên quan đến tách chiết và chế

tạo vật liệu Nano CUR Tại Hội thảo khoa học “Định hướng phát triển khoa

học và công nghệ vật liệu tiên tiến tại Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh”, TS

Dương Minh Tâm cho biết Trung tâm Nghiên cứu triển khai Khu Công nghệ

cao TP.HCM đã chế tạo thành công vật liệu nano CUR ở dạng hòa tan trong

dung dịch nước (nồng độ 8% khối lượng) nhằm hướng tới ứng dụng trong

thực phẩm chức năng [4]

Tuy nhiên chưa có công trình nào nghiên cứu sử dụng màng BC để vận

tải và phân phối thuốc CUR để làm tăng sinh khả dụng của thuốc

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Thuốc CUR (95%) có nguồn gốc từ Ấn Độ

- Etanol 96º có nguồn gốc Việt Nam

- Màng BC (99% hàm lượng nước) được sản xuất bằng cách sử dụng vi

khuẩn A xylinum (Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường ĐHSP Hà Nội 2) lên

men từ nước dừa già

- Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản); Cân phân tích (Sartorius – Thụy Sỹ); Nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA; Buồng cấy

vô trùng (Haraeus); Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức); Khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức); Máy rung siêu âm TCP 280; Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác

- Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng BC: Glucose, Pepton, KH2PO4, (NH4)2SO4, Nước dừa, Axit acetic, HCl, NaOH, … đạt tiêu chuẩn phân tích

2.2 Nội dung nghiên cứu

+ Nghiên cứu qui trình nuôi cấy A xylinum với các nguyên liệu có sẵn

+ Thu sản phẩm BC từ dịch nuôi cấy và quá trình xử lý

+ Chế tạo màng sinh học nạp thuốc CUR

+ Khảo sát khả năng hấp thụ của thuốc CUR vào màng BC

+ Khảo sát khả năng giải phóng thuốc từ màng BC - CUR trong môi trường đệm pH 7,4

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị màng BC

- A xylinum được nuôi cấy để tạo màng BC trong môi trường cải biên

từ môi trường chuẩn Hestrin – Schramm [19] được trình bày trong bảng 2.1