Nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử SSRs liên kết với locus kiểm soát chất lượng xơ ở cây bông

Chính vì những thực tế nêu trên, việc nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử SSR để xác định các QTL kiểm soát các tính trạng chất lượng xơ ở cây bông phục vụ công tác chọn tạo giống bông ch

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSRs LIÊN KẾT VỚI LOCUS KIỂM SOÁT

CHẤT LƯỢNG XƠ Ở CÂY BÔNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSRs LIÊN KẾT VỚI LOCUS KIỂM SOÁT

CHẤT LƯỢNG XƠ Ở CÂY BÔNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án

là do tôi thực hiện Các số liệu và kết quả nghiên cứu đã nêu trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ một công trình nghiên cứu của tác giả nào khác

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ đã đƣợc cám ơn, các tài liệu trích dẫn nêu trong luận án đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 10 năm 2016

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Minh Nguyệt

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, Nghiên cứu sinh xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS

TS Trịnh Đình Đạt, TS Nguyễn Thị Thanh Thủy, những thầy cô đã tận tình dẫn dắt, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho NCS trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận án

Nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của những Thầy Cô giáo trong Bộ môn Di truyền học, các Thầy Cô trong Khoa Sinh học cũng như các Thầy Cô công tác tại Phòng Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội trong suốt quá trình học tập tại đây

Nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn TS Trịnh Minh Hợp, các cán bộ nghiên cứu trong Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Ban Lãnh Đạo Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố đã chia sẻ kinh nghiệm, nguồn vật liệu, tạo mọi điều kiện giúp đỡ, động viên NCS trong suốt quá trình thực hiện luận án

Trong quá trình thực hiện luận án, Nghiên cứu sinh luôn nhận được sự chia sẻ, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi của các cán bộ, bạn bè đồng nghiệp công tác tại Bộ môn Sinh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp và Ban Lãnh Đạo Viện, Nghiên cứu sinh xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến sự quan tâm tận tình đó

Công trình nghiên cứu của Nghiên cứu sinh nằm trong Đề tài “Nghiên cứu áp dụng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống bông có chất lượng xơ tốt” thuộc Chương trình Công nghệ Sinh học Nông nghiệp cấp Nhà nước giai đoạn 2010- 2015 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới Gia đình và bạn bè, những người luôn đồng hành và dành mọi quan tâm, khích lệ Nghiên cứu sinh trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án

Hà Nội, tháng 10 năm 2016 Tác giả luận án

Nguyễn Thị Minh Nguyệt

1

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC BẢNG 7

DANH MỤC HÌNH 9

MỞ ĐẦU 11

1 Tính cấp thiết của đề tài luận án 11

2 Mục tiêu nghiên cứu 12

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 12

4 Những đóng góp mới của luận án 13

5 Phạm vi giới hạn của luận án 13

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14

1.1 PHÂN LOẠI HỌC VÀ QUÁ TRÌNH TIẾN HÓA CỦA CHI BÔNG GOSSYPIUM 14

1.1.1 Phân loại học cây bông 14

1.1.2 Quá trình tiến hóa chất xơ và những đặc tính chất lượng xơ chính của cây bông 15

1.2 ĐÁNH GIÁ NGUỒN TÀI NGUYÊN DI TRUYỀN VÀ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN TRONG CHI BÔNG 18

1.2.1 Sự đa dạng các chỉ tiêu hình thái và nông học của cây bông 18

1.2.2 Đa dạng di truyền phân tử trong nguồn gen bông trồng trọt 19

1.2.2.1 Nguồn gen bông lưỡng bội 19

1.2.2.2 Nguồn gen bông tứ bội 20

1.3 MỘT SỐ KỸ THUẬT CHỈ THỊ PHÂN TỬ VÀ NHỮNG ỨNG DỤNG TRÊN CÂY BÔNG 22

1.3.1 Một số kỹ thuật chỉ thị phân tử chính trên cây bông 22

1.3.2 Sự phát triển của chỉ thị SSR và các cơ sở dữ liệu về chỉ thị phân tử của cây bông 24

1.4 NGHIÊN CỨU LẬP BẢN ĐỒ LIÊN KẾT DI TRUYỀN VÀ BẢN ĐỒ CÁC LOCUS QUY ĐỊNH CHẤT LƯỢNG XƠ Ở CÂY BÔNG 27

1.4.1 Những nghiên cứu lập bản đồ liên kết di truyền ở cây bông trên thế giới 27

2

1.4.2 QTL và những nghiên cứu lập bản đồ QTL chất lượng xơ ở cây

bông trên thế giới 31

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ CHỌN TẠO GIỐNG BÔNG TẠI VIỆT NAM 40

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 45

2.1.1 Các giống bông nghiên cứu 45

2.1.2 Chỉ thị phân tử SSR 46

2.1.3 Hóa chất và thiết bị thí nghiệm 47

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 48

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49

2.3.1 Các phương pháp theo dõi, đánh giá các thí nghiệm đồng ruộng 49

2.3.1.1 Phương pháp lựa chọn vật liệu 49

2.3.1.2 Phương pháp gieo trồng, chăm sóc, đánh giá nguồn vật liệu 50

2.3.2 Phương pháp phân tích di truyền bằng chỉ thị SSR 54

2.3.3 Phương pháp lập bản đồ liên kết di truyền cây bông 56

2.3.4 Phương pháp xác định chỉ thị phân tử SSR liên kết với locus kiểm soát chất lượng xơ ở cây bông 57

2.3.5 Các phương pháp xử lý số liệu 57

2.3.5.1 Phương pháp xử lý thống kê 57

2.3.5.2 Phương pháp phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử 57

2.3.5.3 Phương pháp lập bản đồ liên kết di truyền và bản đồ QTL chất lượng xơ 59

2.3.5.4 Phương pháp vẽ bản đồ liên kết di truyền 60

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 61

3.1 ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN BÔNG LÀM VẬT LIỆU PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU 61

3.1.1 Xác định đa dạng các nguồn gen bông bằng các chỉ tiêu hình thái 61 3.1.2 Xác định đa dạng di truyền của các nguồn gen bông bằng chỉ thị

3

SSR 68 3.1.3 Nhận định về tiềm năng đa dạng di truyền của các nguồn gen bông trong nghiên cứu 75

3.2 LỰA CHỌN BỐ MẸ VÀ LAI TẠO, ĐÁNH GIÁ, CHỌN LỌC TỔ HỢP LAI F1 THÍCH HỢP CHO NGHIÊN CỨU 77

3.2.1 Chọn lọc nguồn vật liệu bố mẹ cho lai tạo 77 3.2.2 Đánh giá khả năng kết hợp và ƣu thế lai của các con lai khác loài

giữa bông Luồi G hirsutum và bông Hải đảo G barbadense 79

3.2.2.1 Đánh giá khả năng kết hợp chung và riêng của các giống bông bố mẹ Luồi G hirsutum và bông Hải đảo G barbadense 79 3.2.2.2 Mức độ ưu thế lai của các tổ hợp lai về năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất và chất lượng xơ bông 81

3.3 XÂY DỰNG BẢN ĐỒ LIÊN KẾT DI TRUYỀN TRÊN HỆ GEN CÂY BÔNG TỨ BỘI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ 83

3.3.1 Các đặc điểm nông sinh học, các yếu tố cấu thành năng suất và chất lƣợng xơ chính của cặp giống bố mẹ 83 3.3.2 Xác định các cặp mồi SSR cho đa hình giữa hai giống bông bố mẹ L591 và HD138 84 3.3.3 Lai tạo quần thể con lai F 2 (L591 x HD 138) và gieo trồng, theo dõi trên đồng ruộng 88 3.3.4 Phân tích phân ly di truyền của quần thể con lai F 2 với chỉ thị SSR 89 3.3.5 Xây dựng bản đồ liên kết di truyền ở cây bông tứ bội sử dụng chỉ thị phân tử SSR 91

3.3.6 So sánh bản đồ liên kết di truyền hệ gen cây bông tứ bội G

hirsutum x G barbadense sử dụng chỉ thị phân tử SSR 95

3.4 XÁC ĐỊNH CÁC QTL CHẤT LƢỢNG XƠ VÀ CÁC CHỈ THỊ SSR LIÊN KẾT GẦN VỚI CÁC QTL 98

3.4.1 Theo dõi, đánh giá một số chỉ tiêu cấu thành năng suất và chất lƣợng xơ bông của quần thể con lai F 2 (L591 x HD138) 98 3.4.2 Xây dựng bản đồ QTL chất lƣợng xơ của quần thể con lai F 2 (L591

4

x HD138) 102

3.4.3 Xác định các chỉ thị phân tử SSR liên kết gần với các QTL chất lƣợng xơ 113

3.4.4 Đánh giá tiềm năng ứng dụng các QTL kiểm soát chất lƣợng xơ và các chỉ thị SSR liên kết QTL trong chọn tạo giống 115

3.4.5 Chọn lọc những nguồn gen triển vọng phục vụ công tác chọn tạo giống bông năng suất cao, chất lƣợng xơ tốt tại Việt Nam 120

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 124

KẾT LUẬN 124

ĐỀ NGHỊ 125

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 126

TÀI LIỆU THAM KHẢO 127

PHỤ LỤC 142

5

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragment Length

Polymorphism

Đa hình chiều dài phân đoạn đƣợc khuếch đại

CAPS Cleaved Amplified Polymorphic

bông

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide

trình tự ISSR Inter-Simple Sequence Repeat Trình tự xen giữa các SSR

LOD Log of the odds ratio

MAS Marker Assisted Selection Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử MABC Marker Assisted Backcrossing Chọn lọc dựa vào chỉ thị

phân tử và lai trở lại

6

PIC Polymorphism Information Content Hệ số thông tin đa hình

QTL Quantitative Trait Locus Locus tính trạng số lượng

R2 Relative importance of a QTL Tầm quan trọng tương đối

của một QTL RAPD Randomly Amplified Polymorphic

Đa hình khuếch đại các vi

vệ tinh- yếu tố nhảy ngược

RFLP Restriction Fragment Length

Polymorphism

Đa hình chiều dài phân đoạn giới hạn

SRAP Sequence-Related Amplified

Polymorphism

Đa hình khuếch đại các trình

tự liên quan

SNP Single Nucleotide Polymorphism Đa hình nucleotid đơn

TRAP Target RegionAmplification

Polymorphism

Đa hình khuếch đại các

v ng đích UPGMA Unweighted Pair- Group Method

with Arithmetical averages

Phương pháp phân nhóm với trung bình số học

7

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất bông vải tại Việt Nam qua các năm và so với thế

giới 41 Bảng 2.1 Danh sách các mẫu giống bông sử dụng trong nghiên cứu 45 Bảng 2.2 Danh sách nhóm mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu 47 Bảng 2.3 Tiêu chuẩn phân cấp xơ bông theo các chỉ tiêu chất lượng xơ chính

54 Bảng 2.4 Thành phần đệm chiết 55 Bảng 2.5 Thành phần đệm rửa 55 Bảng 3.1 Các đặc điểm nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất và chất

lượng xơ của các giống bông nghiên cứu 62 Bảng 3.2 Thống kê mô tả các tính trạng nông sinh học, yếu tố cấu thành năng

suất và năng suất của 32 giống bông trong nghiên cứu 64 Bảng 3.3 Thống kê mô tả các tính trạng chất lượng xơ của 32 giống bông

trong nghiên cứu 66 Bảng 3.4 Các chỉ tiêu về alen và hệ số thông tin đa hình PIC của các locus

SSR nhận biết trong 32 giống bông nghiên cứu 69 Bảng 3.5 Ma trận tương đồng di truyền của các giống thuộc hai nhóm bông

Luồi G hirsutum và bông Hải đảo G barbadense khi sử dụng chỉ thị

phân tử SSR 74 Bảng 3.6 Kết quả phân tích đa dạng di truyền 32 giống bông nghiên cứu bằng

chỉ tiêu hình thái và chỉ thị phân tử 75 Bảng 3.7 Một số kết quả nghiên cứu về đa dạng di truyền trên nguồn gen cây

bông sử dụng chỉ thị ADN 76 Bảng 3.8 Danh sách các tổ hợp lai F1 78 Bảng 3.9 Khả năng kết hợp chung trên một số tính trạng của các giống bông

bố mẹ 80 Bảng 3.10 Khả năng kết hợp riêng của các tổ hợp lai 81 Bảng 3.11 Ưu thế lai của các tổ hợp lai về năng suất và các yếu tố cấu thành

8

năng suất 82 Bảng 3.12 Ưu thế lai của các tổ hợp lai ở một số tính trạng chất lượng xơ 82 Bảng 3.13 Các đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng xơ và đa dạng

di truyền của hai giống bông bố mẹ 84 Bảng 3.14 Kết quả phân tích đa hình hai giống bông bố mẹ với các chỉ thị

SSR 87 Bảng 3.15 Phân bố số lượng locus SSR đa hình giữa hai giống bông L591 và

HD138 trên các nhiễm sắc thể của hệ gen cây bông 88 Bảng 3.16 Đặc điểm các nhóm liên kết trong bản đồ liên kết di truyền của

quần thể con lai F2 (L591 x HD138) 93 Bảng 3.17 Số lượng chỉ thị SSR tương đồng trên hai bản đồ liên kết di truyền

xây dựng từ các quần thể F2 (G hirsutum x G barbadense) 97

Bảng 3.18 Kết quả phân tích một số đặc điểm nông sinh học, yếu tố cấu

thành năng suất và chất lượng xơ của các cá thể F2 (L591 xHD138) có

xơ bông siêu dài (*)

99 Bảng 3.19 Các QTL liên quan đến chất lượng xơ được phát hiện bằng phần

mềm WinQTLCart 2.5 109 Bảng 3.20 Các chỉ thị phân tử SSR liên kết và khoảng cách tới QTL chất

lượng xơ trong nghiên cứu 114 Bảng 3.21 Kết quả đánh giá và chọn lọc các dòng bông mang QTL độ bền xơ

qFS-3 122

Bảng 3.22 Kết quả đánh giá và chọn lọc một số dòng bông xơ rất dài và năng

suất cao 123

Hình 1.3 Sự đa dạng giữa chất lượng xơ của các loài Gossypium trong quá

trình chọn lọc tự nhiên và nhân tạo 17 Hình 1.4 Đa dạng các chỉ tiêu hình thái trong chi bông Gossypium spp 19 Hình 2.1 Sơ đồ các bước triển khai thực hiện luận án 49 Hình 2.2 Sơ đồ các bước lập bản đồ liên kết di truyền ở cây bông tứ bội bằng

chỉ thị phân tử SSR 56 Hình 2.3 Sơ đồ các bước xác định vị trí QTL chất lượng xơ và các chỉ thị

SSR liên kết gần với các QTL quan tâm 57 Hình 3.1 Ruộng gieo trồng, đánh giá các tính trạng nông sinh học của các

giống bông nghiên cứu 61 Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR của các giống bông nghiên cứu với

chỉ thị BNL119 (a), BNL3992 (b) và NAU1201 (c) trên gel agarose SFR 3,5% 68 Hình 3.3 Sự biến động về kích thước alen của các locus SSR nghiên cứu 71 Hình 3.4 Sự phân bố của hệ số thông tin đa hình PIC với 38 chỉ thị SSR 71 Hình 3.5 Sự phân bố của hệ số tương đồng di truyền Dice giữa 32 giống

bông nghiên cứu 72 Hình 3.6 Ruộng gieo trồng đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học và chất lượng

xơ của các con lai F1 (G hirsutum x G barbadense) 79

Hình 3.7 Ảnh điện di sản phẩm PCRcủa hai giống bông bố mẹ với các chỉ thị

SSR trên gel agarose SFR 3,5% 86 Hình 3.8 Ruộng gieo trồng đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học và chất lượng

xơ của thế hệ con lai F2 89 Hình 3.9 Kết quả phân tích sản phẩm PCR các cá thể con lai F2 (L591 x

HD138) với một số chỉ thị SSR trên gel agarose SFR 3,5% 90 Hình 3.10a Bản đồ liên kết di truyền cây bông tứ bội xây dựng từ quần thể

liên kết di truyền cây bông tứ bội (F2: G hirsutum x G barbadense) 96

Hình 3.12 Biểu đồ phân tích năng suất và các chỉ tiêu xơ bông chính của

quần thể con lai F2 (L591 x HD138) 101 Hình 3.13 Các QTL liên quan đến chiều dài xơ đƣợc phát hiện bằng phần

mềm WinQTLCart 2.5_011 104 Hình 3.14 Các QTL liên quan đến độ bền xơ đƣợc phát hiện bằng phần mềm

WinQTLCart 2.5_011 105 Hình 3.15 Các QTL liên quan đến độ đều xơ đƣợc phát hiện bằng phần mềm

WinQTLCart 2.5_011 106 Hình 3.16 Các QTL liên quan đến độ giãn xơ đƣợc phát hiện bằng phần mềm

WinQTLCart 2.5_011 107 Hình 3.17 Các QTL liên quan đến tỷ lệ xơ và chỉ số xơ ngắn đƣợc phát hiện

bằng phần mềm WinQTLCart 2.5_011 108 Hình 3.18a Vị trí các QTL liên quan đến chất lƣợng xơ trên bản đồ liên kết di

truyền của quần thể con lai F2 (L591 x HD138) 111 Hình 3.18b Vị trí các QTL liên quan đến chất lƣợng xơ trên bản đồ liên kết di

truyền của quần thể con lai F2 (L591 x HD138) 112 Hình 3.19 Vị trí QTL kiểm soát độ giãn xơ trên NST số 1 của hai bản đồ

QTL chất lƣợng xơ ở cây bông tứ bội (G hirsutum x G barbadense)

118 Hình 3.20 Vị trí QTL kiểm soát độ bền xơ trên NST số 3 của hai bản đồ QTL

chất lƣợng xơ ở cây bông tứ bội (G hirsutum x G barbadense) 119

Hình 3.21 Vị trí QTL kiểm soát độ đều xơ trên NST số 5 của hai bản đồ QTL

chất lƣợng xơ ở cây bông tứ bội (G hirsutum x G barbadense) 119

Hình 3.22 Ruộng gieo trồng đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học và chất

lƣợng xơ của các thế hệ con lai BC4F2 121 Hình 3.23 Kết quả phân tích sản phẩm PCR của các dòng BC4F2 với chỉ thị

BNL3989 trên gel agarose SFR3,5% 121

11

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài luận án

Cây bông (Gossypium spp.) là loài cây lấy sợi được trồng rộng rãi ở hơn 80 nước trên thế giới Với những đặc điểm nổi trội so với sợi nhân tạo là thoáng khí, có khả năng thấm/ hút nước cao, giữ ấm tốt, không gây kích ứng

da, sợi bông đã trở thành nguyên liệu quan trọng nhất cho ngành công nghiệp dệt hiện đại Hàng năm, tổng diện tích trồng bông trên thế giới vào khoảng 30- 35 triệu ha, tạo ra 120 triệu kiện bông xơ và đóng góp vào nền kinh tế thế giới khoảng 500 tỉ USD [23][110] Cải tiến năng suất và nâng cao chất lượng

xơ luôn là mục tiêu đầu tiên của các chương trình chọn giống bông Việc khắc phục khó khăn do cơ sở di truyền hẹp của nguồn gen bông trồng trọt và mối tương quan di truyền nghịch giữa chất lượng xơ và năng suất cũng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [39][73]

Mặc d cây bông được phát triển mạnh mẽ tại nhiều quốc gia trên thế giới, song ở Việt Nam, diện tích trồng bông lại giảm sút Một trong những nguyên nhân dẫn đến thực trạng này là do các giống bông tại Việt Nam có năng suất chưa cao, chất lượng xơ bông thấp, dẫn đến việc ngay tại những vùng sinh thái phù hợp nhất với cây bông như Ninh Thuận, người nông dân cũng thay thế diện tích trồng bông để canh tác những loại cây trồng khác mang lại giá trị kinh tế cao hơn như cây nho, các loại cây họ đậu [111] Chính vì vậy, mặc dù dệt may là một trong những ngành xuất khẩu dẫn đầu của nước ta, song nguồn nguyên liệu sợi bông cung cấp cho ngành dệt may hiện nay đang phụ thuộc hoàn toàn vào nhập khẩu, nguyên liệu nội địa chỉ đáp ứng được phần rất nhỏ (dưới 2%) nhu cầu

Trong thời gian gần đây, Nhà nước đã ra nhiều chính sách ưu tiên thúc đẩy nghiên cứu, ứng dụng công nghệ sinh học trong cải tiến giống cây trồng Tuy nhiên, so với những cây trồng chính khác, những nghiên cứu trên đối

12

tượng cây bông tại Việt Nam vẫn còn rất ít, điều này đã làm hạn chế việc ứng dụng rộng rãi những thành tựu khoa học tiên tiến trong cải tiến năng suất, chất lượng cây bông Chính vì những thực tế nêu trên, việc nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử SSR để xác định các QTL kiểm soát các tính trạng chất lượng xơ ở cây bông phục vụ công tác chọn tạo giống bông chất lượng xơ tốt trên nền các giống bông có năng suất cao sẽ mang lại hiệu quả ứng dụng tại Việt Nam

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu chung:

Xác định được các chỉ thị phân tử SSR liên kết gần với các QTL (Quantitative trait locus) chất lượng xơ và định hướng ứng dụng trong chọn giống bông chất lượng xơ tốt và năng suất cao ở Việt Nam

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Ý nghĩa khoa học:

Luận án đã xác định được 14 QTL liên quan đến các chỉ tiêu độ đều xơ,

độ bền xơ, chiều dài xơ, tỷ lệ xơ, độ giãn xơ và chỉ số xơ ngắn Các QTL và các chỉ thị SSR liên kết với các QTL có thể sử dụng cho công tác chọn giống bông chất lượng xơ tốt nhờ trợ giúp của chỉ thị phân tử Đây chính là nguồn tài liệu tham khảo bổ ích cho những nghiên cứu tương tự trên cây bông

Ý nghĩa thực tiễn:

13

- Những QTL chất lượng xơ và các chỉ thị phân tử liên kết là nguồn vật liệu cho ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống bông chất lượng xơ tốt tại Việt Nam

- Kết quả nghiên cứu của luận án đã đóng góp nguồn vật liệu cho việc phát triển các dòng/ giống bông thuần và bông lai phục vụ ngành bông trong nước

4 Những đóng góp mới của luận án

- Luận án đã xây dựng được bản đồ liên kết di truyền các locus SSR của cây bông tứ bội gồm 26 nhóm liên kết của cây bông tứ bội hệ gen AD

- Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam xác định được vị trí các QTL chất lượng xơ và các chỉ thị SSR liên kết nhằm ứng dụng trong chọn tạo giống bông chất lượng xơ tốt nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử

5 Phạm vi giới hạn của luận án

- Các thí nghiệm của luận án được tiến hành từ năm 2010 đến năm

2014 tại phòng thí nghiệm, hệ thống nhà lưới, nhà kính, ruộng thí nghiệm của Viện Di truyền Nông nghiệp, Hà Nội và Viện Nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố, Ninh Thuận

- Với điều kiện thời gian có giới hạn dành cho nghiên cứu sinh, bản đồ liên kết di truyền và bản đồ QTL qui định các tính trạng chất lượng xơ bông được xây dựng trên quần thể F2 và các chỉ thị SSR liên kết chặt với các QTL chất lượng xơ được sử dụng khảo sát thế hệ BC4F2 nhằm phát hiện những cá thể mang QTL chất lượng xơ tương ứng phục vụ chọn giống bông chất lượng

xơ tốt trên nền giống năng suất cao

14

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 PHÂN LOẠI HỌC VÀ QUÁ TRÌNH TIẾN HÓA CỦA CHI BÔNG GOSSYPIUM

1.1.1 Phân loại học cây bông

Chi bông (Gossypium) bao gồm khoảng 50 loài phân bố ở những khu vực khô cằn đến bán khô cằn thuộc vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Trong số

đó có 4 loài được thuần hóa để lấy sợi, hai loài từ lục địa Á- Phi và hai loài từ Châu Mỹ Các loài bông Gossypium có nhiều hình thái khác nhau và rất đa dạng trong cách thức sinh sản và các đặc điểm thực vật học

Nghiên cứu về hệ thống phân loại học của bông được Linnaeus (1953)

mô tả đầu tiên với tên Gossypium [45].

Theo cơ sở dữ liệu ITIS [Integrated Taxonomic Information System], cây bông được phân loại như sau: Giới thực vật – Plantae; Ngành hạt kín – Magnoliophyta; Lớp hai lá mầm – Magnoliopsida; Bộ bông – Malvales; Họ bông – Malvaceae; Chi bông – Gossypium [114]

Trong số 50 loài được nhận dạng trong chi hai lá mầm Gossypium của

họ bông Malvaceae có khoảng 45 loài lưỡng bội, 5 loài còn lại là dạng dị tứ bội (hay còn gọi là đa bội khác loài- allopolyploid) [25] Các loài lưỡng bội với 2n= 26 NST thuộc 8 nhóm hệ gen ký hiệu từ A- G và K Các loài tứ bội với 2n= 4X= 52 NST thuộc nhóm hệ gen AD [93] Trong số những loài bông được thuần hóa có bốn loài bông trồng trọt phổ biến là: hai loài bông Cỏ

lưỡng bội G arboreum L và G herbaceum L hệ gen AA; hai loài bông dị tứ bội G hirsutum L (bông Luồi) và G barbadense L (bông Hải đảo) hệ gen

AADD

Các nghiên cứu về hệ thống phát sinh cho rằng dạng dị tứ bội AD sơ khai từ sự kiện đa bội hóa xảy ra ở thời điểm 1-2 triệu năm trước có liên quan đến 5 loài dị tứ bội hiện nay Mối liên quan về hệ gen trong phân loại ở chi Gossypium được mô tả ở Hình 1.1

lượng sợi Hiện nay, các giống bông G hirsutum chiếm hơn 90% bông trồng

trên toàn thế giới đã lan rộng từ ngôi nhà tổ tiên của mình ở Trung Mỹ tới hơn

80 quốc gia trên cả hai bán cầu

Quá trình phát triển chất xơ của hầu hết các loài bông hoang dại đều tương tự nhau, với độ giãn xơ chấm dứt vào khoảng 2 tuần sau khi nở quả Kéo dài thời kỳ giãn xơ chính là sự kiện tiến hóa quan trọng xảy ra ở tổ tiên

Tổ tiên dạng lưỡng bội (6-11 triệu năm trước)

AA

X

DD Cựu Thế giới

n=13

(các NST lớn)

Tân Thế giới n=13 (các NST nhỏ)

Đa bội hóa (1-2 triệu năm trước)

AADD Dạng tứ bội Tân Thế giới

n=26 (13 NST lớn + 13 NST nhỏ)

16

chung của hai nhóm bông lưỡng bội giúp hình thành bông có sợi dài Cây phát sinh chủng loại của hai loài bông thương phẩm cho thấy thời kỳ giãn xơ được kéo dài thêm trong quá trình thuần hóa ở bông đa bội khác loài (Hình 1.2) [92].

Sự thay đổi về hình thái hạt trichome (chất xơ) ở chi Gossypium thể hiện sự khác biệt khá rõ giữa 50 loài hoang dại và trồng trọt Hình 1.3 minh họa hình thái chất xơ ở giai đoạn trưởng thành của các loài hoang dại và trồng trọt ở cả dạng lưỡng bội và dạng đa bội khác loài Trong giai đoạn đầu, sợi tương tự nhau ở tất cả các loài, nhưng sự thay đổi diễn ra trong suốt quá trình

sơ cấp và thứ cấp đã dẫn đến hình thái sợi trưởng thành khác nhau [92].

Hình 1.2 Cây phát sinh chủng loại của hai loài bông thương phẩm G

hirsutum và G barbadense

[92]

17

Hình 1.3 Sự đa dạng giữa chất lượng xơ của các loài Gossypium trong

quá trình chọn lọc tự nhiên và nhân tạo

(Chú thích: Cult.: loài trồng trọt, Wild: loài hoang dại) [92]

Các tính trạng quan trọng làm nên chất lượng sợi bông bao gồm chiều dài xơ, độ bền xơ, độ mịn xơ, độ đều xơ và độ giãn xơ Di truyền của các tính trạng chất lượng xơ cây bông có thể được quy định bởi đơn gen với ảnh hưởng rõ rệt của một gen riêng biệt và đa gen với ảnh hưởng cộng gộp của các gen Nhiều nghiên cứu đã chứng minh di truyền các tính trạng xơ bông được quy định chủ yếu bởi đa gen và đều chịu ảnh hưởng bởi tương tác cộng gộp gen với một số gen chiếm ưu thế Các nghiên cứu cũng cho thấy mối liên quan giữa các tính trạng chất lượng xơ với nhau Chiều dài xơ là tính trạng xơ quan trọng nhất giúp sợi có thể chồng tiếp lên nhau dẫn đến độ bền sợi tốt hơn Độ mịn xơ cũng là tính trạng quan trọng ảnh hưởng đến độ bền xơ Độ mịn của bông tốt thì mặt cắt ngang có nhiều sợi hơn dẫn đến độ bền xơ cao hơn Tăng chiều dài xơ để cải thiện độ bền xơ cũng đã được chứng minh vì sợi dài sẽ tạo ra lực cản ma sát lớn hơn với lực từ bên ngoài giúp kiểm soát độ bền sợi [15].

18

Các chỉ số quan trọng của chất lượng xơ bông được đánh giá thông qua hiệu suất kéo sợi Trong các tính trạng chất lượng xơ thì chiều dài, độ bền và

độ mịn đóng góp nhiều nhất tới giá trị bông Chiều dài xơ là chỉ tiêu cơ bản

để đánh giá chất lượng bông trong thương mại và ngành công nghiệp dệt may cao cấp Độ bền xơ là yếu tố quan trọng thứ hai và quyết định độ bền sợi bông Sự phát triển nhanh chóng của công nghiệp sợi hiện đại đòi hỏi chất lượng xơ bông ngày càng tốt hơn Chính vì vậy, cải tiến năng suất và chất lượng sợi luôn là những mục tiêu đầu tiên của các chương trình chọn giống bông trên toàn thế giới Việc phát triển các giống bông xơ dài và độ bền cao là rất cần thiết để phù hợp với tiêu chuẩn máy kéo sợi hiện đại hiện nay Ngoài

ra, độ mịn xơ, độ đều xơ và độ giãn xơ cũng là những tính trạng được quan tâm trong nỗ lực cải tiến chất lượng xơ bông: độ mịn xơ là thước đo tương đối

về kích thước, đường kính, độ nhỏ của sợi vàđộ mịn của sợi; độ đều xơ biểu thị độ đồng nhất của xơ bông; độ giãn xơ là sự kéo dài của bó sợi [15]

1.2 ĐÁNH GIÁ NGUỒN TÀI NGUYÊN DI TRUYỀN VÀ PHÂN TÍCH

ĐA DẠNG DI TRUYỀN TRONG CHI BÔNG

1.2.1 Sự đa dạng các chỉ tiêu hình thái và nông học của cây bông

Cây bông (Gossypium spp) có đa dạng di truyền rất rộng về các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và nông học Đa dạng di truyền trong chi Gossypium rất phong phú với nhiều đặc tính quan trọng được áp dụng trong chọn giống như cấu trúc thực vật, lông tơ và màu sắc thân, dạng phiến lá, màu sắc hoa, màu phấn hoa, hình dạng hạt, chất lượng xơ, tiềm năng năng suất, tính chín sớm, ảnh hưởng quang chu kỳ và chống chịu với những điều kiện bất lợi của môi trường (Hình 1.4) Sự đa dạng kiểu hình rộng cho thấy tính mềm dẻo của cây bông và tiềm năng sử dụng rộng rãi như vật liệu khởi đầu trong các chương trình chọn giống [10]

19

Hình 1.4 Đa dạng các chỉ tiêu hình thái trong chi bông Gossypium spp

[10]

(A)- màu sắc phấn hoa, màu sắc cánh hoa, đốm hoa và dạng lá; (B)- quả chín ở các loài

lƣỡng bội và (C)- quả chín ở các loài tứ bội

1.2.2 Đa dạng di truyền phân tử trong nguồn gen bông trồng trọt

1.2.2.1 Nguồn gen bông lưỡng bội

Đa dạng di truyền nguồn gen bông lƣỡng bội hệ gen A đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử [33][42][43][57][67] Khoảng cách

di truyền giữa 39 giống bông G arboreum khi phân tích với các chỉ thị SSR

dao động từ 0,13- 0,42 cho thấy sự tồn tại đa dạng di truyền ở nguồn gen

bông lƣỡng bội A rộng hơn so với nguồn gen trồng trọt G hirsutum [57]

Kebede và cs (2007) đã công bố mức độ đa dạng khi nghiên cứu trên bông hệ

Rahman và cs (2008) khi nghiên cứu 32 mẫu giống G arboreum của

Pakistan với chỉ thị RAPD đã xác định đa dạng di truyền giữa các mẫu giống nghiên cứu là khoảng 53% và nhận biết đa dạng di truyền hẹp giữa các giống

G arboreum trồng trọt so với những giống hoang dại [67] Kết quả tương tự

cũng được ghi nhận trong công bố của Kantartzi và cs (2009) khi phân tích

96 mẫu giống G arboreum với các chỉ thị SSR và thu được khoảng cách di

truyền lên đến 51% giữa những mẫu giống có cách biệt địa lý [42]

1.2.2.2 Nguồn gen bông tứ bội

(1) Nguồn gen bông Luồi G hirsutum

Kết quả của những nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử hiện đại như isozyme, RAPDs, RFLPs, AFLPs và SSRs nhìn chung đều cho thấy mức độ

đa dạng di truyền thấp trong các giống bông Luồi Khoảng cách di truyền được báo cáo giữa các giống bông Luồi nằm trong khoảng 0,01- 0,28 [12]

Gần đây, một số lượng lớn các giống G hirsutum và những mẫu giống

ngoại lai từ bộ sưu tập nguồn gen bông Uzbek đã được phân tích với các chỉ thị SSR một lần nữa đã khẳng định cơ sở di truyền hẹp của bông Luồi (với khoảng cách di truyền (GD) khoảng 0,005-0,26) và cung cấp chứng cứ bổ sung cho sự xuất hiện của một “nút cổ chai” di truyền trong các sự kiện thuần hóa giống bông Luồi ở mức độ phân tử [12][13][39]

Tuy nhiên, một số nghiên cứu trên nguồn gen bản địa G hirsutum đã

thu được đa dạng di truyền khá cao khi phân tích bằng chỉ thị SSR và RAPD

21

[14][48][58][76] Điều này cho thấy vẫn tồn tại đa dạng di truyền có lợi trong các nguồn tài nguyên bông Luồi trồng trọt và ngoại lai Đánh giá mức độ đa dạng di truyền phân tử và khai thác hiệu quả trong chương trình chọn giống sẽ giải quyết mối quan tâm hiện nay về cơ sở di truyền hẹp của những giống bông Luồi đang được trồng rộng rãi [38]

(2) Nguồn gen bông Hải đảo G barbadense

Đa dạng di truyền phân tử trong các mẫu giống G barbadense cũng đã

được nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử như allozymes và AFLPs [9][91][94] Kết quả phân tích cũng cho thấy cơ sở di truyền hẹp trong các

mẫu giống G barbadense, với khoảng cách di truyền 7- 11%, gần với kết quả

nghiên cứu trong các nguồn tài nguyên bông Luồi [9][94] Tuy nhiên, nghiên

cứu của Boopathi và cs (2008) đã xác định được một cặp mẫu giống G barbadense rất đa dạng khi phân tích với chỉ thị SSR, đây là nguồn gen hữu

ích cho chọn giống bông Pima chất lượng cao [20] Gần đây, De Almeida và

cs (2009) đã nhận biết đa dạng di truyền khá cao giữa các quần thể G barbadense đang bảo tồn in situ ở hai bang của Braxin Điều này cho thấy đa dạng di truyền được bảo tồn in situ cần được tiếp tục duy trì ex situ để đảm

bảo lưu giữ lâu dài bộ sưu tập giống [26] Nhiều đa dạng di truyền hữu ích

trong các bộ sưu tập nguồn gen G barbadense hiện vẫn được bảo tồn ex situ

trên toàn thế giới (Uzbekistan, Nga, Trung Quốc, Hoa Kỳ và Ai Cập) [96]

Đa dạng di truyền của 61 giống bông màu (40 giống bông màu nâu và

21 giống bông màu xanh) đã được Sun và cs (2009) phân tích với các chỉ tiêu nông học và chỉ thị SSR Tổng số 244 alen từ 66 locus SSR đa hình đã được phát hiện giữa các giống bông nghiên cứu Số lượng các alen/ locus SSR thu được dao động từ 2- 12, với trung bình là 5,21 Chỉ số PIC là 0,36- 0,89, với trung bình là 0,72 Tác giả cũng nhận thấy nền di truyền hẹp trong những giống bông có màu ở những tính trạng tiềm năng [82].

He và cs (2010) đã sử dụng 132 chỉ thị SSR trải đều trên hệ gen bôngđể phân tích kiểu gen quần thể tự nhiên bao gồm 92 mẫu bông đã ghi

22

nhận được 494 băng ADN đa hình, trung bình 3,69 băng/chỉ thị SSR Chỉ số PIC dao động từ 0,01- 0,87 với giá trị trung bình 0,55 Hệ số tương đồng di truyền Jaccard được tính toán đã dao động 0,41- 0,96, với giá trị trung bình 0,73 cho thấy đa dạng di truyền cao trong quần thể tự nhiên [36]

1.3 MỘT SỐ KỸ THUẬT CHỈ THỊ PHÂN TỬ VÀ NHỮNG ỨNG DỤNG TRÊN CÂY BÔNG

1.3.1 Một số kỹ thuật chỉ thị phân tử chính trên cây bông

Sự ra đời của kỹ thuật chỉ thị phân tử đã làm thay đổi cơ bản tốc độ và

độ chính xác của phân tích di truyền Chỉ thị phân tử đã trở thành công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng, trong đó một số loại chỉ thị ở thế hệ đầu tiên đã được ứng dụng khá phổ biến trên cây bông bao gồm RFLP, RAPD, AFLP và SSR Những kỹ thuật chỉ thị phân tử này được ứng dụng trong phân tích tiến hóa hệ gen, nghiên cứu hệ thống phát sinh, đánh giá đa hình ADN, phân tích phân tử các tính trạng phức tạp Ngoài ra, những chỉ thị này cũng được ứng dụng thành công trong lập bản đồ liên kết di truyền trên cây bông và xác định những QTL kiểm soát các tính trạng qui định hình dạng

lá, quang chu kỳ, khả năng kháng bệnh, năng suất và chất lượng xơ dựa trên

cả hai loại quần thể lai cùng loài và lai khác loài (G hirsutum x G barbadense)

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): ra đời từ năm

1986, RFLP kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axit nucleic RFLP được

sử dụng đầu tiên trong cải tiến giống cây trồng thông qua phân tích khác biệt chiều dài các đoạn ADN là sản phẩm của enzym cắt giới hạn đặc hiệu Ưu điểm của RFLP là chỉ thị trội, giúp phân biệt chính xác sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau, do đó được sử dụng khá phổ biến trong lập bản đồ liên kết di truyền, chọn lọc sớm tính trạng đơn gen, phân tích đa hình di truyền Tuy nhiên, hạn chế chính của kỹ thuật này là tốn nhiều thời gian, công sức, kỹ

23

thuật phức tạp, độc hại do sử dụng chất phóng xạ và đòi hỏi ADN khối lượng lớn, chất lượng cao Thêm vào đó, với mỗi tổ hợp mẫu dò và enzym giới hạn chỉ có thể nhận dạng và sàng lọc được 1 hoặc một vài locus Chỉ thị RFLP được sử dụng khá phổ biến ở thập kỷ 90 trong nghiên cứu lập bản đồ liên kết

di truyền ở cây trồng, trong đó có cây bông và hiện nay đang dần được thay thế bằng chỉ thị SSR, SNP [70][78]

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): là kỹ thuật chỉ thị phân

tử dựa trên PCR thế hệ đầu tiên do Williams và cs phát hiện năm 1990 [95] RAPD sử dụng những mồi PCR ngẫu nhiên, dài từ 9 - 12 nucleotide để nhân bội những trình tự ngẫu nhiên trên hệ gen Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm hơn RFLP ở chỗ nhanh, giá thành cho mỗi mẫu phân tích thấp, không cần biết những thông tin về trình tự, dễ dàng phân tích số lượng mẫu lớn Tuy nhiên, nhược điểm của RAPD là chỉ thị trội, do đó không có khả năng phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử Kỹ thuật RAPD thiếu khả năng lặp lại do kết quả phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm như kỹ năng phòng thí nghiệm, chu kỳ chạy PCR, chất lượng và nồng độ mồi Kỹ thuật RAPD trước đây được sử dụng khá phổ biến trong phân tích đa hình của hệ gen thực vật, chọn lọc dựa vào chỉ thị phân tử trong những quần thể lai khác loài RAPD cũng được sử dụng kết hợp với các loại chỉ thị khác trong nghiên cứu lập bản đồ liên kết ở cây bông [99]. Tuy nhiên, gần đây chỉ thị RAPD chỉ còn được sử dụng chủ yếu ở những đối tượng cây trồng còn thiếu thông tin về hệ gen

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): được phát triển

bởi Vos và cs (1995) cũng là một kỹ thuật chỉ thị phân tử dựa trên PCR Ưu điểm của AFLP là kỹ thuật có độ nhạy cao dễ phát hiện đa hình trong toàn bộ

hệ gen [85] AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định, số liệu đáng tin cậy, có khả năng ứng dụng trong lập bản đồ hệ gen và chọn giống Trước đây, kỹ

24

thuật AFLP được sử dụng khá phổ biến để đánh giá đa dạng di truyền ở cây bông, phát triển lập bản đồ liên kết cùng với các chỉ thị khác Nhược điểm của AFLP là chỉ thị di truyền trội do đó không có khả năng phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử, phương pháp phức tạp, giá thành nghiên cứu tương đối cao, do vậy chỉ thị AFLP hiện nay cũng không còn được sử dụng rộng rãi trên đối tượng cây trồng nói chung và cây bông nói riêng

SSR (Simple Sequence Repeats): còn gọi là các microsatellite, là những

đoạn ADN có trình tự đơn giản được lặp lại nhiều lần, mỗi đơn vị lặp dài từ 1- 6 bp, được mô tả đầu tiên bởi Litt và cs (1989) [59]

Các chỉ thị SSR có ưu điểm là khá phong phú, phân bố trên toàn hệ gen,

di truyền đồng trội, đa alen, nhân bản dễ dàng, độ phân giải cao và dễ dàng thao tác dựa trên kỹ thuật PCR Nhờ những lợi thế sẵn có đó, SSR đã được phát triển trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau Mặc dù còn những hạn chế trong sự hiểu biết về chức năng của các đơn vị lặp lại, SSR đã trở thành loại chỉ thị được sử dụng rộng rãi trong phân tích hệ gen thực vật Cho đến nay, chỉ thị SSR đã và đang được sử dụng thành công cho nhiều ứng dụng trong lĩnh vực di truyền và cải tiến giống cây trồng nói chung cũng như cây bông nói riêng như lập bản đồ gen hữu ích, xây dựng bản đồ liên kết di truyền, chọn lọc dựa vào sự trợ giúp của chỉ thị và lai trở lại (MAS, MABC), nhận biết giống cây trồng, xác minh phả hệ, phân tích đa dạng di truyền và nghiên cứu tiến hóa [40][47]

1.3.2 Sự phát triển của chỉ thị SSR và các cơ sở dữ liệu về chỉ thị phân tử của cây bông

Nhờ có những phương pháp mới và hiệu quả trong việc phân lập các trình tự lặp lại đã giúp giảm giá thành sản xuất các cặp mồi SSR và thúc đẩy

sự ứng dụng mạnh mẽ hệ thống chỉ thị này [65] Các chỉ thị SSR có thể được phát triển trực tiếp từ thư viện ADN hệ gen hoặc từ những thư viện được làm

với đơn vị lặp 2 và 3 nucleotide từ hệ gen bông Luồi G hirsutum L đã được

phân lập, trong đó 588 đoạn ADN được giải trình tự và 307 trình tự mồi đã

được thiết kế Kết quả thử nghiệm trên tập hợp các giống bông Luồi G hirsutum L và bông Hải đảo G barbadense L đã ghi nhận được khoảng 49%

mồi cho đa hình [69] Tác giả Nguyen và cs (2004) đã phát hiện và định vị được 392 trình tự microsatellite và thiết kế mồi để sàng lọc đa hình giữa hai

giống bông bố mẹ G hirsutum và G barbadense, kết quả đã ghi nhận được

56% tương ứng với 204 cặp mồi cho đa hình Nguồn chỉ thị này đã được sử dụng để xây dựng bản đồ liên kết di truyền trên cây bông tứ bội và xác định QTL kiểm soát các tính trạng quan tâm trên cây bông [64]

Những công bố rộng rãi về việc phát hiện các microsatellite ở các đoạn trình tự biểu hiện (EST) trên cây bông đã thúc đẩy những nghiên cứu phát triển chỉ thị EST- SSR Từ dữ liệu 13.505 EST trong hai thư viện cDNA sợi

và noãn bông Luồi, Han và cs (2006) đã phát triển được 489 cặp mồi SSR Những cặp mồi này đã được sử dụng để sàng lọc đa hình giữa bông Luồi và bông Hải đảo và thu nhận được 114 cặp mồi EST-SSR đa hình tương ứng với 130 locus EST-SSR Trong số đó, 123 locus được tích hợp trên bản

EST-đồ liên kết di truyền cây bông dị tứ bội [35] Ngoài ra, một công trình nghiên cứu khác năm 2009 cũng công bố một bộ mồi PCR cho 5.475 trình tự EST-

CM, 311 cặp mồi JESPR, 1.172 cặp mồi MUSS/MUCS, 150 cặp mồi STV,

và sẽ giúp tăng tốc độ nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng trong chọn giống phân tử và lập bản đồ liên kết di truyền trong chi Gossypium spp

Bản đồ liên kết di truyền dựa vào các chỉ thị phân tử đã trở thành công

cụ quan trọng trong phân tích hệ gen, phát hiện các QTL liên quan đến các tính trạng quan trọng, lập bản đồ vật lý, chọn dòng dựa vào bản đồ và chọn lọc dựa vào chỉ thị (MAS) trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau Sau khi bản đồ liên kết di truyền đầu tiên dựa vào chỉ thị RFLP trên đối tượng cây bông được Reinisch và cs công bố năm 1994, nhiều bản đồ dựa trên các chỉ thị RFLP, RAPD, SSR và AFLP cũng đã lần lượt được công bố và có những ứng dụng thực tiễn trong nghiên cứu và chọn tạo giống bông trên toàn thế giới

Các bản đồ liên kết di truyền được công bố sớm nhất là kết quả của những công trình nghiên cứu trên chỉ thị RFLP Bản đồ liên kết đầu tiên do Reinisch và cs công bố năm 1994 bao gồm 705 chỉ thị RFLP phân bố trên 41 nhóm liên kết, trải dài 4.675 cM, thu được khi phân tích quần thể con lai giữa

G hirsutum và G barbadense Bản đồ này đã đặt nền móng và tạo thêm cơ

hội cho các nghiên cứu tiến hóa NST và khai thác nguồn di truyền Gossypium trong tự nhiên [70] Năm 1998, Shappley và cs đã công bố một bản đồ liên kết với 120 locus RFLP phân bố trên 31 nhóm liên kết, trải dài 865 cM Mỗi nhóm liên kết bao gồm từ 2 đến 10 locus, chiều dài từ 0,5-107 cM [78] Năm

1999, Brubaker và cs công bố một bản đồ RFLP khác và so sánh kích thước

hệ gen giữa các loài dị tứ bội (hệ gen AD, n=26) và lưỡng bội (hệ gen A và D, n=13) Tác giả đã nhận định rằng sự đa bội hóa trong chi Gossypium có liên quan đến tái tổ hợp tăng cường vì chiều dài di truyền của hệ gen dị tứ bội lớn hơn 50% so với tổng các phần lưỡng bội hệ gen A và D [21]