Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)

Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô (LV thạc sĩ)

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh

THÁI NGUYÊN - 2015

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự giúp đỡ của các cán bộ Khoa Khoa học sự sống – Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này

Thái Nguyên, ngày 04 tháng 11 năm 2015

Tác giả luận văn

NGUYỄN THỊ HƯỜNG

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn chỉnh luận văn của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Khoa học sự sống – Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Sơn và các cán bộ, kỹ thuật viên phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tốt nhất để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Thái Nguyên, ngày 04 tháng 11 năm 2015

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hường

Trang 5

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đ t vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY NGÔ 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây ngô 3

1.1.2 Đ c điểm sinh học của cây ngô 3

1.1.3 Đ c điểm hóa sinh hạt ngô 6

1.1.4 Giá trị kinh tế 7

1.1.5 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới 7

1.1.6 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam 10

1.2 MỌT NGÔ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA MỌT NGÔ ĐẾN QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN NÔNG SẢN 11

1.2.1 Đ c điểm của mọt hại ngô (Sitophilus zeamais Motschulsky) 11

1.2.2.Côn trùng hại ngô trong quá trình bảo quản nông sản 14

1.3 CYSTEINE PROTEINASE VÀ CYSTATIN 16

1.3.1 Cysteine proteinase 16

1.3.2 Cystatin - chất ức chế Cysteine proteinase 18

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

Trang 6

2.1 VẬT LIỆU 21

2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 21

2.2.1 Hóa chất 21

2.2.2 Thiết bị 21

2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 22

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.3.1 Phương pháp sinh lí 22

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử 22

2.3.3 Phương pháp xác định trình tự nucleotide 30

2.3.4 Phương pháp xử lí trình tự gen 30

2.3.5 Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ BẰNG NHIỄM MỌT NHÂN TẠO 31

3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10 33

3.2.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số 33

3.2.2 Kết quả tổng hợp cDNA và nhân gen 33

3.2.3 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 34

3.2.4 Kết quả tách dòng gen 35

3.2.5 Kết quả tách plasmid tái tổ hợp 36

3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN 37

3.3.1 Kết quả so sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG và HG 38

3.3.2 Kết quả so sánh hai trình tự nghiên cứu (BG, HG) với hai trình tự đã được công bố (CB2, MX4) và BN000514 trên GenBank 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

Trang 7

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DEPC diethyl pyrocarbonate

DNA Deoxyribose nucleic acid

dNTP deoxynucleoside triphosphate

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

E coli Escherichia coli

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

mRNA messenger ribonucleic acid

NCBI National Center for Biotechnology Information

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RT- PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng chuỗi phiên mã ngƣợc)

X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside

Trang 8

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng 1.1 Tỉ lệ các bộ phận hạt ngô và thành phần hóa học của chúng ….….6

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới trong 10 năm gần đây 8

Bảng 1.3 Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới năm 20149 Bảng 1.4 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 2006 - 2013 10

Bảng 2.1 Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA 24

Bảng 2.2 C p mồi nhân gen Cystatin 10 25

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PT-PCR nhân gen Cystatin 10 25

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen Cystatin 10 vào vector PBT 27

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng colony – PCR 28

Bảng 2.6 Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony – PCR 28

Bảng 3.1 Lượng ngô hao hụt theo thời gian của 6 giống ngô nghiên cứu 31

Bảng 3.2 Giá trị tỉ lệ phổ hấp thụ A260/A280 và hàm lượng RNA của giống ngô nghiên cứu 33

Bảng 3.3 Sự sai khác giữ các trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG, HG38 Bảng 3.4 Hệ số tương đồng giữa các trình tự gen của hai mẫu ngô BG, HG 39

Bảng 3.5 Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin10 ở hai giống ngô BG, HG 40

Bảng 3.6 Hệ số tương đồng giữa các trình tự amino acid của 2 mẫu nghiên cứu 41

Bảng 3.7 Sự khác nhau giữa trình tự gen Cystatin 10 của BG, HG với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank 44

Bảng 3.8 Hệ số tương đồng giữa các trình tự gen của 2 mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank 45

Bảng 3.9 Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin10 ở hai mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank 47

Bảng 3.10 Hệ số tương đồng giữa các trình tự amino acid của 2 mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank 48

Trang 9

DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

Hình 1.1 Mọt ngô Sitophilus zeamais 11

Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn lƣợng thức ăn hao hụt theo thời gian ở các mẫu ngô nghiên cứu 32

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm RT - PCR nhân gen Cystatin 10 ở 2

giống ngô nghiên cứu 34

Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch gen Cystatin 10 ở 2 mẫu ngô

nghiên cứu 35

Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen Cystatin 10 ở 2 mẫu

ngô nghiên cứu 36Hình 3.5 Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp 37

Hình 3.6 So sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG, HG 38

Hình 3.7 Trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin 10 ở hai mẫu nghiên cứu 40

Hình 3.8 So sánh trình tự gen Cystatin 10 của BG, HG với CB2, MX4 và

BN000514 trên GenBank 42Hình 3.9 Trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin 10 ở hai mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank 46

Trang 10

MỞ ĐẦU

1 Đ t vấn ề

Cây ngô (Zea mays L.) là một trong năm loại cây lương thực chính của

thế giới Hạt ngô chứa khá đầy đủ các chất dinh dưỡng cho người và gia súc

Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa gạo Trong những năm gần đây, sản xuất ngô ở Việt Nam tăng nhanh nhờ sự thúc đẩy của ngành chăn nuôi và công nghiệp chế biến Ngô là cây thức ăn chăn nuôi quan trọng nhất hiện nay, 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp của gia súc là từ ngô Gần đây, cây ngô còn là cây thực phẩm; người ta dùng bắp ngô bao tử làm rau cao cấp vì nó sạch và có hàm lượng dinh dưỡng cao; ngô nếp, ngô đường (ngô ngọt) được dùng làm quà ăn tươi (luộc, nướng) ho c đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu Ngô còn là nguyên liệu của ngành công nghiệp lương thực, thực phẩm và công nghiệp nhẹ để sản xuất rượu, cồn, tinh bột, dầu, glucôzơ, bánh kẹo Trong y dược, ngô được dùng để trị áp huyết, râu ngô được dùng để làm thuốc [46]

Hiện nay, diện tích ngô ngày càng được mở rộng và có sự phát triển tiến bộ trong công tác chọn tạo giống cây trồng nhằm tạo ra những giống ngô

có năng suất cao, có khả năng kháng sâu bệnh hại, chống chịu hạn tốt Tùy theo mục đích sử dụng mà sản phẩm ngô phải được bảo quản trong điều kiện khác nhau và thời gian bảo quản khác nhau Trong quá trình bảo quản sản phẩm ngô theo thời gian có rất nhiều loại côn trùng phá hoại làm giảm phẩm chất, chất dinh dưỡng nông sản,… Thành phần sâu mọt hại ngô tương đối đa dạng xuất hiện trong kho bảo quản ngô như mọt gạo, mọt răng cưa, mọt đục thân, mọt thóc,… Vì vậy, việc nghiên cứu chọn tạo ra giống ngô có năng suất cao và khả năng kháng mọt tốt là yêu cầu thực tiễn đ t ra cho ngành trồng trọt nói chung và ngành chọn giống ngô nói riêng

Trang 11

Cystatin là một dạng protein ức chế hoạt động của cysteine proteinase (Cysteine proteinase inhibitor- CPI) Chúng có m t trong vi sinh vật, động vật

và thực vật Các nghiên cứu gần đây bàn luận nhiều về mối liên quan giữa cystatin tới tính chống chịu yếu tố bất lợi của ngoại cảnh như: hạn, lạnh, muối, sự già và bảo vệ thực vật chống lại côn trùng, vi sinh vật gây bệnh và

đ c biệt là khả năng kháng mọt Ở động vật không xương sống, cysteine proteinase là enzyme tiêu hóa, nếu cysteine proteinase bị ức chế thì hoạt động tiêu hóa của mọt s bị cản trở Chính vì vậy, nghiên cứu theo hướng tăng cường khả năng ức chế cysteine proteinase ở mọt bằng kỹ thuật chuyển gen được quan tâm nghiên cứu

Để tạo cơ sở cho việc thiết kế vector chuyển gen có khả năng kháng mọt phục vụ việc tạo giống ngô kháng mọt tốt, chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Phân lập gen Cystatin 10 liên quan ến khả năng kháng mọt của một số

giống ngô”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và xác định được trình tự gen Cystatin 10 của hai giống ngô

(kháng mọt tốt và kháng mọt kém)

3 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập và đánh giá khả năng kháng mọt của một số giống ngô

- Nhân gen, tách dòng và xác định trình tự gen Cystatin 10 của hai giống ngô

Trang 12

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY NGÔ

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây ngô

Cây ngô có tên khoa học là Zea may L., thuộc chi Maydeae, họ hòa thảo

(Gramineae), bộ hòa thảo (Graminales) [13] Có nhiều giả thuyết khác nhau về nguồn gốc cây ngô dựa trên những kết quả nghiên cứu về khảo cổ học, di truyền học, thực vật học và địa lý học cho rằng quá trình thuần hóa ngô ban đầu diễn ra ở Mexico, sau đó việc gieo trồng lan rộng ra khu vực Bắc Mỹ Ngô được đưa tới châu Âu (Tây Ban Nha) lần đầu tiên vào năm 1494, là kết quả của chuyến thám hiểm lần thứ hai của Columbus Đầu thế kỷ XVI, bằng đường thủy với các tàu của Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Ý đã đưa cây ngô đến hầu hết các nơi trên thế giới Ở Việt Nam, cây ngô có nguồn gốc từ Trung Quốc, được trồng vào khoảng thế kỷ XVII (theo “Vân Đài loại ngữ” của Lê Quý Đôn) Tuy nhiên, do là một nước có truyền thống sản xuất lúa nước nên trong thời gian đầu ngô ít được chú ý mà chỉ phát triển trong những năm gần đây

Ngô có nhiều cách phân loại khác nhau, có thể phân loại theo đ c điểm thực vật học, sinh thái học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm Phân loại theo đ c điểm thực vật học thì dựa vào hạt có mày hay không có mày, hình thái bên ngoài và cấu trúc nội nhũ của hạt, ngô được phân thành các loài phụ: ngô bọc, ngô đá, ngô răng ngựa, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nếp, ngô đường bột, ngô bán răng ngựa Từ các loài phụ căn cứ vào màu sắc hạt và màu sắc lõi ngô để phân thành các thứ [3]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây ngô

Ngô là thực vật một lá mầm có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau nhưng thích hợp nhất là đất có thành phần cơ giới nhẹ độ màu mỡ cao, dễ

thoát nước, tầng canh tác dày, pH 6-7 [13] Cây ngô gồm các bộ phận: rễ,

thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) và hạt

Trang 13

Ngô có hệ rễ chùm tiêu biểu trong bộ rễ các cây họ Hòa thảo Tùy theo

vị trí, chức năng, nhiệm vụ và thời gian sinh trưởng mà rễ hoàn chỉnh của cây được chia làm 3 loại: Rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng Rễ mầm (rễ tạm thời,

rễ hạt) mọc từ trụ lá mầm, chức năng chính của rễ này là hút nước, thức ăn khi cây còn non Rễ đốt (rễ phụ cố định) phát triển từ các đốt thấp của thân, mọc vòng quanh các đốt dưới m t đất bắt đầu lúc ngô được 3 - 4 lá Đây là loại rễ quyết định quá trình sinh trưởng phát triển của cây ngô, nó giúp cây hút nước và các chất dinh dưỡng suốt đời sống của cây Rễ chân kiềng (rễ neo, rễ chống) mọc quanh các đốt thấp sát m t đất Rễ này giúp cây chống đỡ

và bám ch t vào đất, ngoài ra còn tham gia hút nước và dinh dưỡng [6]

Thân ngô đ c, đường kính từ 2 - 4 cm, cao từ 1,8 - 2 m Thân ngô trưởng thành bao gồm nhiều lóng nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ Thân ngô ngoài nhiệm vụ giúp cây đứng vững, là bộ phận dự trữ và vận chuyển chất hữu cơ, ngoài ra còn có khả năng quang hợp để tổng hợp chất hữu cơ [6]

Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen k nhau Căn cứ vào

vị trí và hình thái lá trên cây, lá ngô được chia thành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá ngọn, lá bi Lá ngô điển hình được cấu tạo bao gồm các bộ phận: bẹ

lá, phiến lá (bản lá), thìa lá (lưỡi lá, tai lá) Lá ngô là cơ quan làm nhiệm vụ quang hợp, đồng thời làm nhiệm vụ trao đổi khí, hô hấp, dự trữ dinh dưỡng…

Số lượng lá, chiều dài, chiều rộng, độ dày, lông tơ, màu lá, góc lá và gân lá thay đổi tùy theo từng giống khác nhau Số lá là đ c điểm khá ổn định ở ngô,

có quan hệ ch t với số đốt và thời gian sinh trưởng Những giống ngô ngắn ngày thường có 15 - 16 lá, giống ngô trung bình có 18 - 20 lá, giống ngô dài ngày thường có trên 20 lá [6] Lá ngô là cơ quan làm nhiệm vụ quang hợp, đồng thời làm nhiệm vụ trao đổi khí, hô hấp, dự trữ dinh dưỡng…

Trang 14

Ngô là loại cây có hoa khác tính cùng gốc Cơ quan sinh sản đực và cái tuy cùng nằm trên một cây song ở những vị trí khác nhau Hoa đực nằm ở đỉnh cây, xếp theo chùm gồm một trục chính và nhiều nhánh, hoa cái mọc ở các nách lá ở giữa thân cây ngô, số mầm nách nhiều nhưng chỉ có 1-3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp, số bắp trên cây phụ thuộc vào giống, điều kiện tự nhiên và mật độ gieo trồng, chế độ chăm sóc

Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơrôn, phôi, nội nhũ và chân hạt Vỏ hạt là một màng nhẵn bao xung quanh hạt Lớp alơrôn nằm dưới vỏ hạt bao lấy nội nhũ và phôi Nội nhũ là phần chính của hạt chứa các tế bào dự trữ dinh dưỡng Nội nhũ gồm hai phần nội nhũ bột và nội nhũ sừng Tỷ lệ giữa nội nhũ bột và nội nhũ sừng tùy vào chủng ngô, giông ngô Phôi ngô chiếm 1/3 thể tích hạt ngô, gồm có: ngù (phần ngăn cách giữa nội nhũ và phôi), lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm Trong bốn phần này thì lá mầm thường phát triển rõ rệt nhất Màu sắc hạt phụ thuộc

đ c tính di truyền của giống và chủng loại, vì vậy hạt ngô có nhiều màu sắc khác nhau như: trắng, vàng, tím, da cam, đỏ…Mỗi bắp ngô có từ 200 - 1000 hạt phụ thuộc vào giống, điều kiện ngoại cảnh, sinh thái, trung bình mỗi bắp có

từ 500 - 600 hạt [2]

Quá trình sinh trưởng, phát triển của cây ngô được chia thành hai giai đoạn: Giai đoạn sinh dưỡng là từ khi gieo đến khi xuất hiện nhị cái và giai đoạn sinh trưởng thực bắt đầu từ khi hoa cái thụ tinh cho đến khi hạt chín hoàn toàn Căn cứ đ c điểm sinh lý và thời gian sinh trưởng có thể chia ra các thời kì sinh trưởng phát triển quan trọng sau: Thời kì hạt nảy mầm và mọc, thời kì từ 3 lá đến

6 lá, thời kì từ 8 đến 10 lá, thời kì xoáy nõn, thời kì nở hoa và thời kì chín [5]

Trong từng giai đoạn cây ngô yêu cầu các điều kiện khác nhau và mỗi giai đoạn đều có ảnh hưởng khác nhau đến các yếu tố tạo thành năng suất và chất lượng hạt ngô

Trang 15

1.1.3 Đặc điểm hóa sinh hạt ngô

Hạt ngô có giá trị dinh dưỡng cao, chứa tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho con người và gia súc Bột ngô chiếm 65 - 83% khối lượng hạt, là nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp chế biến bột Thành phần chủ yếu của hạt ngô gồm tinh bột và protein, ngoài ra còn có một số chất như đường, cellulose, chất khoáng, sinh tố

Bảng 1.1 Tỉ lệ các bộ phận hạt ngô và thành phần hóa học của chúng [11] Các bộ

phận của

hạt ngô

Tỉ lệ (%) Thành phần hóa học (tính theo % chất khô)

Vitamin của ngô tập trung ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm Ngô cũng có nhiều vitamin C, vitamin B (B1, B2, B6 ) Vitamin PP hơi thấp cộng với thiếu tryptophan một amino acid có thể tạo vitamin PP Riêng ngô vàng chứa nhiều carotene (tiền vitamin A) [16]

Tỷ lệ chất béo trong hạt ngô tương đối cao (3 - 6%), chủ yếu tập trung trong mầm ngô Trong chất béo của ngô có 50% là acid linoleic, 31% là axít oleic, 13% là axít panmitic và 3% là stearic Hàm lượng lipid là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt [9]

Trang 16

1.1.4 Giá trị kinh tế

Ngô là một trong những cây lương thực quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu, 1/3 dân số trên thế giới dùng ngô làm lương thực chủ yếu Toàn thế giới sử dụng khoảng 21% sản lượng ngô làm lương thực cho con người, các nước ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng ngô làm lương thực chính, các nước Đông Nam Phi sử dụng 85% sản lượng lương thực cho người [13]

Ngô được sử dụng nhiều trong công nghiệp như chế biến thực phẩm, công nghiệp nhẹ Các loại ngô nếp, ngô đường được đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu Bột ngô được dùng để nấu cồn sản xuất đường glucose, làm môi trường nuôi cấy nấm penicillin, sản xuất acid acetic Lõi ngô được chế biến làm chất cách điện, nhựa hóa học Phôi ngô dùng để ép dầu, phục vụ trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm Ví dụ, nước Mỹ hàng năm sử dụng 18% tổng sản lượng ngô để sản xuất tinh bột, 37% sản xuất cồn và 5,8% sản xuất bánh kẹo [18]

Ở nước ta, ngô là cây lương thực chính đứng hàng thứ hai sau lúa nước, giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân nói chung và nền sản xuất nông nghiệp nói riêng, đ c biệt với đồng bào vùng cao miền núi thì cây ngô còn góp phần xóa đói giảm nghèo [6] Hàng năm, nước ta phải nhập khẩu một lượng lớn ngô từ các nước như: Braxin, Achentina, Ấn Độ, Thái Lan, Camphuchia, Lào Theo báo cáo thống kê tháng 9 năm 2015 của Trung tâm Tin học và Thống kê - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, lượng ngô nước ta nhập khẩu từ tháng 9/2014 đến tháng 8/2015 là 4.263.903 tấn tương đương 963.184.000 USD [49]

1.1.5 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới

Ngô là một loại ngũ cốc quan trọng trên thế giới đứng thứ 3 sau lúa mì

và lúa gạo, có địa bàn phân bố rộng, được gieo trồng rộng khắp trên thế giới với sản lượng hàng năm cao hơn bất kỳ cây lương thực nào Do điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng, tập quán canh tác dẫn đến diện tích, sản lượng và năng suất ngô ở các khu vực có sự khác nhau Sự chênh lệch này được thể hiện ở bảng 1.2

Trang 17

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới trong 10 năm gần đây

Năm Diện tích

(triệu ha)

Sản lượng (triệu tấn)

Năng suất (tạ/ha)

2004 diện tích trồng là 147,45 triệu ha nhƣng đến năm 2013 đã đƣợc mở rộng lên 184,19 triệu ha Năm 2009 diện tích trồng bị giảm xuống còn 158,85 triệu

ha tuy nhiên năng suất vẫn tăng

Do có nhiều giá trị sử dụng và giá trị kinh tế, ngô đã trở thành một loại ngũ cốc quan trọng thứ 3 của thế giới Hiện nay do điều kiện tự nhiên cũng nhƣ sự phát triển về khoa học kỹ thuật mà tình hình sản xuất ngô giữa các

Trang 18

quốc gia trên thế giới có sự khác biệt cả về diện tích, năng suất lẫn sản lượng,

sự khác biệt đó được thể hiện qua bảng 1.3

Bảng 1.3 Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới năm 2014

Nước Diện tích

(triệu ha)

Sau Mỹ đó là Trung Quốc, một cường quốc đang phát triển và lớn mạnh Với diện tích lãnh thổ lớn nhất thế giới nền sản xuất ngô của nước này lớn thứ

2 với diện tích 35,26 triệu ha có sản lượng 217,73 triệu tấn Sản lượng ngô trên thế giới tăng nhanh trong những năm gần đây, chủ yếu là tăng năng suất nhờ giống mới và kỹ thuật canh tác tưới tiêu Trong giai đoạn hiện nay, ngô cùng với lúa nước, lúa mỳ vẫn là những cây lương thực chiếm vị trí quan trọng nhất, nuôi sống toàn nhân loại Vì vậy, việc lựa chọn các giống ngô có đ c tính tốt, năng suất cao và biện pháp kỹ thuật canh tác tiên tiến là một trong những giải pháp quan trọng để chống lại khủng hoảng lương thực toàn cầu

Trang 19

1.1.6 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam

Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa và là cây màu quan trọng nhất được trồng ở nhiều vùng sinh thái khác, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác Trước đây sản xuất ngô ở nước ta còn nhỏ lẻ, phân tán, m t khác do kỹ thuật canh tác kém và chất lượng giống kém dẫn đến năng suất rất thấp Trong những năm gần đây sản xuất ngô ở nước ta có sự thay đổi đáng kể, được thể hiện qua bảng 1.4

Bảng 1.4 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 2006 - 2013

Năm Diện tích

(triệu ha)

Trang 20

1.2 MỌT NGÔ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA MỌT NGÔ ĐẾN QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN NÔNG SẢN

1.2.1 Đặc điểm của mọt hại ngô (Sitophilus zeamais Motschulsky)

1.2.1.1 Sơ lược về mọt hại ngô

Mọt hại ngô (gọi tắt là mọt ngô) có tên khoa học là Sitophyllus zeamais

Motsch, thuộc bộ Coleoptera, họ Curculionidae Mọt ngô là loại đa thực, chúng có thể ăn được hầu hết các loại ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu và nhiều sản phẩm thực vật khác Thức ăn thích hợp nhất với nó là ngô hạt Mọt này có phổ biến ở hầu hết các nước trên thế giới, nhất là ở châu Á, vùng Địa Trung Hải (Châu Âu) và Bắc Mỹ Ở nước ta trong các kho lương thực, nhất là kho bảo quản ngô, gạo thường g p loài mọt này Mọt có thể đẻ trứng ở ngoài đồng và cả trong kho Nó thuộc loại phá hoại nghiêm trọng [35]

Con đ c Con cái

Hình 1.1 Mọt ngô Sitophilus zeamais

Mọt gây hại trên bắp và hạt ngô ngay giai đoạn ngô chín sáp ngoài đồng, chúng theo ngô vào kho và gây hại liên tục trong suốt quá trình bảo quản Trong kho mọt hoạt động nhanh nhẹn, hay bay bò và có tính giả chết, chúng thích bò lên các vị trí cao trong đống hạt Khi g p điều kiện độ nhiệt cao, mọt thường tập trung vào k kho, mép bao… để ẩn nấp

Trang 21

1.2.1.2 Đặc điểm hình thái của mọt ngô

Giai đoạn trưởng thành mọt ngô rất giống mọt gạo, vì thế trong phân loại trước đây, có nhiều ý kiến khác nhau Có người cho rằng mọt ngô và mọt gạo là cùng loài nhưng khác tên, nhiều người khác cho rằng mọt ngô và mọt gạo là 2 loài độc lập với nhau [33] Cho đến nay, mọt ngô được xem như một loài riêng biệt, rất gần với mọt gạo Về hình dạng ngoài, mọt ngô rất giống mọt gạo, nhưng kích thước cơ thể lớn hơn (3,5- 5mm) Cánh trước trơn bóng và các điểm màu đỏ tròn cánh khá rõ Các lỗ chấm trên tấm lưng ngực trước thô và dày ở phía trước Do đó việc phân biệt chủ yếu dựa vào dạng cơ quan sinh dục đực (penis) ở mọt gạo có hình bán nguyệt, còn ở mọt ngô là hình 3 góc Bề m t phía trên của penis ở mọt gạo đơn giản, không có lông dài, còn ở mọt ngô thì có 2 lông dài Đầu máng đẻ trứng của con cái mọt gạo có hình chữ Y, còn của mọt ngô là hình móc nhọn

Các lỗ chấm ở ngực trước khá trơn và không có vùng lỗ chấm lộn xộn ở giữa Chấm lõm trên đầu rất rõ ràng Đoạn trước trán rất bằng dẹt, phần gốc vòi

có 3 chiếc máng, dọc theo viền mép ngực trước còn có một dảy chấm lõm Chấm lõm trên mảnh lưng ngực trước hình tròn, ở khu giữa chấm lõm rất dày, chấm lõm ở 2 cạnh gần như hỗn hợp lại Cánh cứng có 2 vệt chấm màu trắng

đỏ, một ở bên vai, một ở gần đoạn cuối Chấm lõm ở m t bụng thân mình dày hơn Cánh sau phát triển và có thể bay được Cánh màu nâu đen bóng Các điểm vá màu vàng đỏ hình bán nguyệt rất rõ Trên m t ngoài của gai giao cấu (Aedeagus) con đực có các rãnh chạy dọc; các con cái đầu nhánh r hình chữ Y hóa cứng mạnh nên nhọn

Giai đoạn trứng có đ c điểm: dài 0,5-0,7mm, rộng 0,25- 0,3mm, hình bầu dục hơi dài màu trắng sữa Giai đoạn sâu non: Khi đã lớn dài 3-3,2 mm, rất mập, lưng cong lại như hình bán nguyệt, m t bụng tương đối bằng Toàn thân màu sữa đến màu nâu nhạt Giai đoạn nhộng: dài 3-4 mm, hình bầu dục, cân đối 2 đầu, lúc đầu màu vàng sữa sau chuyển sang màu vàng nâu

Cũng như mọt gạo, mọt ngô có thể bay được, nó còn bay mạnh hơn mọt gạo cho nên mọt ngô đã gây hại ngay từ ngoài đồng Trên các ruộng ngô ở Tây Nguyên, mọt ngô thường xuất hiện và phát triển vào thời kỳ chuẩn bị thu hoạch [8], [29]

Trang 22

S granarius khoảng 7 ngày trong điều kiện tương tự Hầu hết trứng được lắng

đọng trong nội nhũ Tốc độ sinh sản tối đa của mỗi con cái đạt 6,7/quả trứng/ngày, thời gian phát triển và số lượng các thế hệ con cháu sản xuất là tối

ưu ở 30 C và độ ẩm 75% [51]

Khi đẻ trứng, mọt dùng vòi khoét một lỗ sâu vào hạt, rồi đẻ trứng vào những lỗ này, sau đó tiết ra một thứ dịch nhầy để bít kín lỗ đó lại Sâu non nở

ra ăn hại ngay trong hạt và lớn lên Khi ăn hạt, nó thường ăn phôi trước, sau

đó mới đến nội nhũ và các bộ phận khác làm hạt chỉ còn lại một lớp vỏ mỏng, nhìn bề ngoài dễ lẫn với hạt còn nguyên vẹn Khi đẫy sức, sâu non đục những

lỗ nhỏ lộ rõ trên m t hạt để vũ hoá bay ra ngoài Tùy theo điều kiện mà mọt

đẻ ít hay nhiều, nhiều nhất mỗi con cái có thể đẻ được 384 trứng [47]

Thức ăn có ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của mọt, trong cùng một điều kiện độ nhiệt và độ ẩm như nhau, nuôi mọt ngô bằng thức ăn khác nhau

đã thu được kết quả như sau: Khi nuôi bằng ngô hạt, thời gian vòng đời của mọt là 34 ngày; khi thay bằng loại thức ăn khác là gạo, thời gian vòng đời s

là 47 ngày; thóc là 53 ngày

Ở nhiệt độ 0 C, mọt có thể sống được 37 ngày, ở -5 C mọt chết sau 23 ngày, còn ở -10 C tất cả các giai đoạn phát triển của mọt chết sau 13 ngày Ở

55 C, mọt chết sau 6 giờ, ở 60 C chết sau 2 giờ Trong điều kiện độ nhiệt

25 C mọt có thể sống không có thức ăn 18 - 26 ngày [31], [47]

Trang 23

1.2.2 Côn trùng hại ngô trong quá trình bảo quản nông sản

Sau khi thu hoạch, ngô cần được bảo quản để sử dụng làm lương thực, thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nhiều mục đích khác nhau Do vậy, bảo quản đúng kỹ thuật s góp phần giảm tỷ lệ hao hụt, thối hỏng ở mức thấp nhất Đ c biệt, với đ c điểm khí hậu nước ta nóng ẩm quanh năm, nấm mốc, mối mọt, côn trùng động vật hại phát triển mạnh Có nhiều loại côn trùng hại ngô, chúng

có khả năng thích ứng rộng với điều kiện ngoại cảnh và có sức sinh sản nhanh

Ngô là loại cây trồng bị nhiều loại sâu bệnh gây hại Những người làm công tác bảo vệ thực vật đã thống kê được hơn 100 loài sâu hại và gần 100 loại bệnh hại ngô [4] Theo kết quả điều tra của Nguyễn Thị Giáng Vân và cs

đã ghi nhận được thành phần côn trùng trong kho của Việt Nam gồm 46 loài sâu mọt hại lương thực cất trữ trong 28 tỉnh thuộc 3 miền Bắc, Trung và Nam [21] Trong số này có 38 loài mọt thuộc bộ Cánh cứng với 19 họ khác nhau, 8 loài mọt thuộc bộ Cánh vảy với 5 họ khác nhau Trên ngô, sâu mọt chính gồm:

mọt ngô (Sitophilus zeamais), mọt gạo (Sitophilus oryzae), mọt đục hạt (Rhyzopertha dominica), mọt cà phê (Aracerus fasciculatus), mọt thò đuôi (Carpophilus pilosellus) Theo kết quả điều tra giai đoạn 1996 - 2000 của Cục

Bảo vệ thực vật trên phạm vi toàn quốc và trên các loại lương thực khác nhau đã thu thập được 115 loài sâu mọt hại thuộc 44 họ trong 8 bộ và 1 lớp nhện [19]

Sự phá hại của côn trùng rất đa dạng Trước hết phải kể đến làm giảm phẩm chất ho c làm cho vật dữ trự bị giảm hay mất hoàn toàn giá trị sử dụng Thiệt hại do sâu bệnh hại gây ra cho các loại cây lương thực (trong đó có ngô) ước tính hàng năm từ 10 - 30% Ở nước ta, theo kết quả điều tra của Trần Văn Chương và cs về tổn thất ngô sau thu hoạch trung bình lên tới 15%, cá biệt ở miền núi lên tới 20-25% sau 6 tháng bảo quản [1] Số liệu điều tra của Nguyễn Văn Liêm và cs thì thiệt hại do các loại mọt gây ra trên ngô ở vùng Bắc Hà - Lào Cai sau 12 tháng bảo quản lên tới 38,95% Đối với ngô lai, tổn

Trang 24

thất sau thu hoạch còn có thể cao hơn do loại ngô này thường có hàm lượng protein cao, vỏ mỏng nên rất dễ bị mốc Thông thường giá ngô giảm 10 - 20% sau khoảng 3 - 6 tháng tồn trữ nếu bị nhiễm mọt và nấm mốc Ở Việt Nam,

mọt ngô Sitophilus zeamais được coi là đối tượng nguy hiểm hàng đầu trên

ngô giai đoạn sau thu hoạch [22]

Theo FAO (1999), hàng năm trên thế giới mức tổn thất về lương thực trong bảo quản trung bình từ 6-10 %, riêng ở Việt Nam thì tỷ lệ này là 8-15

% Đối với sản xuất ngô, tổn thất sau thu hoạch là rất lớn Riêng về số lượng dao động trong khoảng 18-19 %, thậm chí là 23-28 % tùy theo vùng và vụ mùa thu hoạch Đối với ngô lai bị thiệt hại nhiều hơn do vỏ mỏng và có hàm lượng protein cao [22]

Mọt ngô là một trong những loài gây hại trong quá trình bảo quản lương thực Gần đây, nguồn kháng mọt ngô là một yếu tố quan trọng đã đem lại sự thành công cho một chương trình nhân giống để giải quyết những thiệt hại về hạt sau khi thu hoạch Mục tiêu của của nghiên cứu này nhằm đánh giá sức đề kháng của các gen ở ngô đối với mọt ngô, và đó là một tiêu chuẩn để

họ sử dụng trong chương trình nhân giống Tổng cộng có 175 kiểu gen đã được thử nghiệm về tính kháng mọt ngô, khối lượng hạt ngô giảm, trọng lượng của hạt ngô bị hỏng và hạt không bị hư hỏng đều được đo Sự khác biệt đáng kể (P < 0,001) đã được quan sát giữa các kiểu gen của tất cả các đ c điểm đánh giá Sự phân bố của các kiểu gen giữa các loại khác nhau của tính kháng là một dấu hiệu của sự tồn tại biến dị di truyền Các kiểu gen kháng nhất

là ở giống ngô CKPH08003 và BRAZ2451, trong khi dễ bị mọt nhất là ở PH3254 và BRAZ4, trong số các giống lai và giống tương ứng Phần khối lượng hạt giảm, và trọng lượng bột được xác định là những đ c điểm quan trọng nhất

để phát hiện các kiểu gen có tính kháng côn trùng qua phân tích [36]

Trang 25

Như vậy, những thiệt hại do mọt ngô đem lại là rất lớn, không những làm giảm số lượng, chất lượng, và giá trị thương phẩm (làm giảm protein, lipid, vitamin, …), mà còn gây thiệt hại về kinh tế, đồng thời cũng làm giảm sức nảy mầm của hạt Do đó, trong những năm gần đây đã có rất nhiều nhà khoa học đã và đang nghiên cứu các gen, nhóm gen có liên quan đến khả năng chống lại sâu mọt, nhằm hạn chế những tổn thất do chúng gây ra trong quá trình bảo quản, và tạo ra những giống có khả năng kháng mọt và thích nghi với những điều kiện ngoại cảnh bất lợi, để đem lại hiệu quả cao nhất

1.3 CYSTEINE PROTEINASE VÀ CYSTATIN

Trong điều kiện hạn hán, cystatin protease giảm biểu hiện ở các giống

có khả năng chịu hạn và không thay đổi hay là tăng ở các giống có khả năng chịu hạn kém Cystatin đóng vai trò như là cơ chất để xâm nhập vào trung tâm hoạt động của cystatin protease, ức chế khả năng hoạt động của enzyme

Dựa vào gốc amino acid thiết yếu ở vị trí trung tâm hoạt động, sự thay đổi hoạt động ở pH tối ưu, sự tương đồng của trình tự amino acid và sự tương đồng

về các chất ức chế mà người ta phân proteinase thành 4 nhóm proteinase bao gồm: serine-, cysteine-, aspartic- và metallo- proteinase Trong bốn nhóm này, một lượng lớn chất ức chế của serine- và cysteine- proteinase đã được nghiên cứu nhiều trong khi các chất ức chế của aspartic- và metallo- proteinase vẫn còn nhiều bí ẩn [18]

Trang 26

Cysteine proteinase xúc tác phân cắt chuỗi peptide ở vị trí bên trong mạch polypeptide (endopeptidyl hydrolase) Trung tâm hoạt động của enzyme này có chứa nhóm sunfuhydryl (hay còn gọi là thiol, nhóm SH), đây là nhóm

có khả năng phản ứng cao Nhóm sunfuhydryl tham gia vào nhiều hoạt động biến đổi hóa học

Cystatin được phân bố ở cả động vật, thực vật và vi sinh vật Quá trình phân giải protein thực vật diễn ra phức tạp với sự tham gia của nhiều enzyme, bằng nhiều con đường khác nhau trong các thành phần khác nhau của tế bào Cysteine proteinase chiếm tới 30% tổng hoạt động phân giải protein và liên quan đến quá trình tiêu hóa, hoạt hóa tiền enzyme, giải phóng các peptide hoạt động sinh lí, hoạt hóa bổ sung và các quá trình viêm…

Cysteine proteinase hoạt động bằng cách loại bỏ đoạn amino tận trong chuỗi polypeptide để tạo ra các enzyme hoạt động Vùng amino tận (hay còn gọi là proregion) không những giữ vai trò trong việc ức chế hoạt động của enzyme mà còn giúp protein mới được tổng hợp cuộn xoắn chính xác và bảo

vệ enzyme chống lại tác động bất lợi của ngoại cảnh

Trong động vật có xương sống, các proteinases cysteine được tham gia vào hệ thống phân hủy protein lysosome Trong động vật không có xương sống như giun tròn, proteinases cysteine là một trong các enzym tiêu hóa [39] Trong động vật chân đốt như tôm hùm, chúng đóng vai trò tiêu hóa, nhưng cũng có liên quan trong hệ thống thần kinh [25] Trong côn trùng, chúng được sử dụng trong quá trình tiêu hóa nhưng được tìm thấy trong nhiều mô khác [39] Các nghiên cứu về sự phụ thuộc độ pH của hoạt động proteinase cysteine trong chiết xuất dầu thô của ấu trùng côn trùng đã chỉ ra rằng, chúng hoạt động chủ yếu trong phạm vi pH kiềm, đó là độ pH tối ưu cho các hoạt động của proteinases cysteine [24], [26], [42]

Trang 27

Ở thực vật, cysteine proteinase được tìm thấy chủ yếu trong không bào

và có thể tham ra biến đổi protein dự trữ trong suốt quá trình nảy mầm của hạt, điều đó cung cấp nguồn dinh dưỡng nitơ hỗ trợ cho sự phát triển của cây non, ngoài ra cystatin proteinase còn được tìm thấy ở môi trường ngoại bào cây sung và cây đu đủ [14]

1.3.2 Cystatin - chất ức chế Cysteine proteinase

Cystatin (CYS) là chất ức chế có bản chất là protein Chúng có m t trong vi sinh vật, động vật và thực vật Trong những năm gần đây bàn luận nhiều về mối liên quan giữa cystatin tới tính chống chịu yếu tố bất lợi của ngoại cảnh như : hạn, lạnh, muối, sự già và bảo vệ thực vật chống lại côn trùng, vi sinh vật gây bệnh và

đ c biệt là tính kháng mọt Protein này có mối quan hệ về m t cấu trúc và chức năng với chất ức chế của cysteine proteinase, nó được mô tả lần đầu tiên ở lòng trắng trứng gà và sau đó được gọi là cystatin lòng trắng trứng gà [20], [24]

Lượng cystatin có sự thay đổi theo bậc thang tiến hóa, thể hiện vai trò quan trọng trong sự thích nghi của thực vật, điều này được chứng minh qua việc nghiên cứu nguồn gốc và sự tiến hóa của các cystatin, papain và cystatin proteinase ở thực vật [22], [38]

Các cystatin kìm hãm hoạt động của cysteine protenase có liên hệ với nhau về m t tiến hóa, hình thành nên siêu họ cystatin Các thành viên của siêu

họ này được phân chia thành ba nhóm có mối liên hệ ch t ch với nhau, sự phân loại đó dựa trên sự tương đồng của trình tự bậc một, khối lượng phân tử,

số lượng liên kết disulfide và sự định vị của chúng trong tế bào

Cystatin họ 1, được biết là họ stefin, không chứa liên kết disulfide ho c

các nhóm carbohydrate, nó có trọng lượng phân tử khoảng 11 kDa, gồm 100 gốc amino acid

Trang 28

Cystatin họ 2, là protein có 2 liên kết disulfide trong chuỗi ở gần đầu

carbon cuối cùng và được glycosyl hóa, có trọng lượng phân tử khoảng 13 -

24 kDa với 115 amino acid

Cystatin họ 3, có tên là Kininogen, bao gồm các Kininogen huyết

tương, nó lớn hơn các thành viên khác của hai họ kia và hầu hết các phức hợp

phân tử cystatin có trọng lượng phân tử cao (60 - 120 kDa) với khoảng 355

gốc amino acid có chứa các liên kết disulfide Các kininogen giữ vai trò quan trọng trong quá trình đông máu

Ngoài ba họ trên, dựa vào sự khác nhau giữa cystatin phân lập từ động vật và thực vật, người ta còn bổ sung thêm họ phytocystatin [21], gồm hầu hết

các chất ức chế cysteine proteinase của thực vật, chúng có tính chất chung với

hầu hết các cystatin họ I và II Trong họ phytocystatin thì oryzacystatin từ hạt

gạo là chất ức chế nguồn gốc thực vật đầu tiên được nghiên cứu Nó có mối

liên hệ về m t cấu trúc và chức năng với cystatin lòng trắng trứng gà Oryzacystatin cũng được xếp vào cystatin nhóm I do sự vắng m t của liên kết

disulfide, chuỗi pentapeptide cũng được tạo thành bởi Gln-Val-Val-Ala-Gly (gốc thứ 57 - 61) và khối lượng phân tử xấp xỉ 11,5 kDal với 102 gốc amino

acid Trình tự amino acid của oryzacystatin giống 30% với cystatin họ II, nó

có vùng trình tự Phe-Ala-Val (gốc thứ 29 - 31) và Phe - Try (gốc thứ 83 - 84),

điều đó chứng tỏ oryzacysstatin cũng có thể xếp vào nhóm cystatin họ II

Gen cystatin được phân lập đầu tiên từ mRNA của cây lúa, ký hiệu là OC1 có đoạn mã hóa dài 309 nucleotide, mã hóa phân tử protein dài 102 amino acid [18] Ở cây đậu xanh, gen cystatin được Kang và cs phân lập, đọc

trình tự từ mRNA và công bố tại ngân hàng gen Quốc tế có mã số D38130 với kích thước 304 nucleotide, đoạn mã hóa gồm 267 nucleotide mã hóa 88

amino acid [50] Cũng thuộc nhóm cây đậu đỗ, gen cystatin ở cây đậu tương

khá lớn, có kích thước 5863 bp trên đó có 4 exon và 3 intron được Misaka phân lập năm 2000 [48] Ở cây lạc, Vũ Thị Thu Thủy cũng đã phân lập được

đoạn gen cystatin có chiều dài 461 bp với 2 exon và 1 intron; Protein do gen

mã hóa có 98 amino acid [18] So với gen cystatin phân lập từ DNA hệ gen, gen cystatin phân lập từ mRNA chiếm số lượng lớn hơn

Trang 29

Kết quả nghiên cứu ở ngô cho thấy, có 10 gen cystatin của ngô, các gen

ký hiệu là CC gồm có CC1, CC2, CC3, CC4, CC5, CC6, CC7, CC8, CC9, và CC10 Trong 10 gen cystatin ở ngô, có 9 gen được phân lập từ mRNA, chỉ có gen CC1 phân lập từ DNA Kích thước gen CC1 chứa 2024bp, trong đó có 3

exon và 2 intron, 3 exon mã hóa phân tử protein dài 134 amino acid Sự biểu

hiện của gen cystatin là khác nhau ở các thời kỳ phát triển khác nhau của cây ngô Trong 10 gen cystatin ở ngô, CC1 ưu tiên biểu hiện trong cờ non, hai gen CC8, CC10 biểu hiện trong việc phát triển hạt, 7 gen CC còn lại biểu hiện

trong hai ho c nhiều mô khác nhau Riêng trong điều kiện chịu ảnh hưởng của

sự thiếu hụt nước có tới 5 gen cùng biểu hiện, đó là các gen CC2, CC3, CC4, CC5 và CC9 [34]

Gen cystatin đã được nghiên cứu và phân lập ở táo [40], lúa [27], cà rốt [37], đậu tương [28], khoai tây [44], đậu đũa [30] và ngô [17], [23]

Nghiên cứu về tác động của chất ức chế proteinase lên sinh lý tiêu hóa của côn trùng là một lĩnh vực quan trọng và đã thu được những kết quả đáng

kể trong công tác kiểm soát sinh học đối với côn trùng có hại Nhiều nghiên cứu về tương tác của chất ức chế proteinase lên chế độ ăn của côn trùng đã được phát triển trong một thời gian dài Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, khi có m t các chất ức chế này trong thức ăn của côn trùng có hại s làm tăng tỷ lệ tử vong Soyacystatin (scN) có khả năng ức chế sự sinh trưởng của

mọt đậu đũa (C maculatus) thế hệ I và II [32] Oryzacystatin – I dạng dại và

dạng đột biến (có tên là OC – Idelta D86 – bị loại bỏ gốc Asp86) đều biểu

hiện tác động xấu lên sự sinh trường và phát triển của Globodera pallida (một

loại giun tròn ký sinh thực vật)

Vì vậy, một hướng nghiên cứu mới với những ứng dụng thực tiễn trong việc tạo ra thực vật chuyển gen ức chế proteinase nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp để nâng cao khả năng kháng mọt của cây trồng [45]

Trang 30

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.2.1 Hóa chất

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và chuyên dụng có nguồn gốc từ các hãng nổi tiếng trên thế giới (hãng Invitrogen, Fermentas), bao gồm: Enzyme Taq-polymerase, buffer PCR, SDS, EDTA, Tris, agarose…

2.2.2 Thiết bị

Thiết bị sử dụng là các thiết bị hiện đại của các hãng nổi tiếng đƣợc trang bị tại các phòng thí nghiệm, đảm bảo độ chính xác cho kết quả của thí nghiệm

Các thiết bị sử dụng gồm có:

+ Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) + Máy PCR (Mỹ)

+ Bộ điện di (Mỹ) + Máy đo pH 151 Martini (Nhật) + Bể ổn nhiệt (Mỹ) + Máy ly tâm lạnh Hettich (Đức) + Máy lắc (Hàn Quốc) + Tủ lạnh sâu -80o

C, -20o C (Italy) + Máy đo quang phổ (Đức) + Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức) + Máy soi gel (Mỹ) + Nồi khử trùng (Đài Loan)

+ Cân kĩ thuật (Đức) + Máy vortex (Mỹ)

Ngoài các thiết bị trên còn cần một số đồ dụng thiết bị cần thiết khác phục vụ cho nghiên cứu

Trang 31

2.2.3 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng Công nghệ DNA và ứng dụng Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phòng thí nghiệm Sinh học Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp sinh lí

Để đánh giá nhanh khả năng kháng mọt của 06 giống ngô địa phương, chúng tôi đã thực hiện phương pháp đánh giá tổn thất thức ăn theo tác giả Hà Quang Hùng [9]

Tính lượng thức ăn hao hụt sau một thời gian theo dõi đối với loài mọt

ngô Sitophilus zeamais bằng cách bố trí 2 lô theo dõi: lô thí nghiệm (thả mọt)

nhắc lại 3 lần và lô đối chứng (không thả mọt) Cân 50 g ngô cho vào một lọ nhựa, mỗi lọ nhựa thả 15 c p mọt trưởng thành Ðộ hao hụt do mọt tiêu hao được theo dõi sau 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày, 50 ngày, 60 ngày

Trọng lượng thức ăn hao hụt được tính theo công thức:

P = 50 – Pt – P0 (g)

Trong đó:

P: trọng lượng thức ăn hao hụt ở công thức thí nghiệm

Pt: trọng lượng thức ăn cân được sau một thời gian bảo quản

P0: trọng lượng thức ăn hao hụt ở công thức đối chứng

50 g: trọng lượng thức ăn đưa vào thí nghiệm

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử

2.3.2.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số

Chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số bằng Trizol Reagent Kit Quy trình tách chiết RNA tổng số:

- Nghiền mẫu bằng nitơ lỏng (100 mg lá ngô non) Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 2 ml

Định dạng
Số trang	63
Dung lượng	1,05 MB