Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)

MA THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI

CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN

TỪ AXIT FERULIC

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên - 2016

MA THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI

CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN

TỪ AXIT FERULIC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Dương Văn Cường

Thái Nguyên - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS Dương Văn Cường tại bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ gen, Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào Mọi thông tin trích dẫn trong luận văn này được ghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, ngày 14 tháng 5 năm 2016

Tác giả luận văn

Ma Thị Trang

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Dương

Văn Cường đã hướng dẫn và chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học sự sống, các thầy cô tại bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ gen đã tạo điều kiện giúp

đỡ tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo khoa Khoa học sự sống, trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong thời gian tôi học tập và hoàn thành khóa học này

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ khó khan cùng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thiện luận văn này

Thái nguyên, ngày 14 tháng 10 năm 2016

Tác giả luận văn

Ma Thị Trang

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

4.1 Ý nghĩa khoa học 3

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về vanillin 4

1.1.1 Nguồn gốc 4

1.1.2 Cấu trúc, đặc điểm lí hóa 5

1.1.3 Đặc tính sinh học 6

1.1.4 Vai trò vanillin trong công nghiệp và đời sống 8

1.2 Các con đường sinh tổng hợp vanillin 10

1.2.1 Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật 10

1.2.2 Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic trong vi sinh vật 10

1.3 Các phương pháp sản xuất vanillin 15

1.3.1 Phương pháp tách chiết vanillin từ thực vật 15

1.3.2 Sản xuất vanillin bằng tổng hợp hoá học 16

1.3.3 Sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ sinh học 18

1.4 Tiềm năng ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp trong sản xuất vanillin 21

1.4.1 Các gene mã hóa các enzyme sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic 21

1.4.2.Vi khuẩn E coli và khả năng sử dụng làm vật chủ sản xuất vanillin.

23

1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp trong nước và ngoài nước 26

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 26

1.5.2 Các nghiên cứu trong nước 29

Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Vật liệu nghiên cứu 30

2.1.1 Các chủng vi sinh vật 30

2.1.2 Các vector tách dòng và biểu hiện nền tảng 30

2.1.3 Mồi khuếch đại các gene gltA, fcs và ech 35

2.1.4 Hóa chất 36

2.1.5 Thiết bị 37

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37

2.3 Nội dung nghiên cứu 38

2.4 Phương pháp nghiên cứu 38

2.4.1 Quy trình tách dòng gene và thiết kế vector biểu hiện 38

2.4.2 Nhân gene đích bằng PCR 41

2.4.3 Điện di trên gel agarose 42

2.4.4 Tách chiết ADN plasmid 43

2.4.5 Lập bản đồ giới hạn 44

2.4.6 Thu nhận ADN từ gel agarose 45

2.4.7 Nối ADN bằng ADN ligase 46

2.4.8 Chuẩn bị tế bào khả biến 46

2.4.9 Biến nạp ADN vào E coli khả biến 47

2.4.10 Xác định trình tự nucleotide 47

2.4.11 Phân tích trình tự gene đã tách dòng 48

2.4.12 Nuôi E coli sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic 48

2.4.13 Lên men sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit ferulic 49

2.4.14.Phân tích vanillin và axit ferulic bằng HPLC 50

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 Tách dòng và giải trình tự các gene mã hóa các enzyme xúc tác con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic 51

3.1.1 Tách dòng và giải trình tự gene gltA từ E coli DH5α 51

3.1.2 Tách dòng và giải trình tự gene ech từ Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 55

3.1.3 Tách dòng và giải trình tự gene fcs từ từ Amycolatopsis sp HR104 60 3.2 Thiết kế vector biểu hiện chứa 3 gene gltA, ech, fcs trên nền tảng vector pET22b+ 65

3.2.1 Chuyển gene gltA từ pTZ-gltA sang pET22b+ tạo vector tái tổ hợp pET22-G 65

3.2.2 Chuyển gene ech từ pTZ-ech sang pET22-G tạo vector tái tổ hợp pET22-GE 68

3.2.3 Chuyển gene fcs từ pTZ-fcs sang pET22-GE tạo vector tái tổ hợp pET22-GEF 71

3.3.1 Chuyển gene fcs từ pTZ-fcs sang vector pRSET tạo vector pRSET-F 72

3.3.2 Chuyển cụm hai gene gltA và ech từ pET22-GE sang pRSET-F tạo vector tái tổ hợp pRSET-GEF 73

3.4 Sinh tổng hợp vanillin từ axit fefulic sử dụng E coli tái tổ hợp làm tế bào chủ 75

3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ axit ferulic đến sinh trưởng của E coli 75

3.4.2 Xác định axit ferulic tồn dư và vanillin được tổng hợp bởi hệ thống pET22 76

3.5 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên năng suất sinh tổng hợp vanillin 77

3.5.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 77

3.5.2 So sánh các môi trường LB, M9 và 2YT 78

3.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG 79

3.6 So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin giữa hai hệ vector pET22 và pRSET 80

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82

4.1 Kết luận 82

4.2 Kiến nghị 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83

CoA : Coenzyme Acetoacetyl

ĐHQGHN : Đại học quốc gia Hà Nội

ADN : Deoxyribonucleic acid

ADN-PK : ADN protein kinase

ADN-PK : ADN protein kinase

dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate

E coli : Escherichia coli

EDTA : Etilenduamin tetraacetic acid

HCLC : 4-hydroxycinnamate CoA-hydratase/lyase IPTG : Isopropy Thyogalactoside

Kb : Kilo base

LB : Lauria Broth

NCBI : NationCenter for Biotechnology Information PCR : Polymerase Chain Reaction

SDS : Sodium doecyl sulfat

TAE : Tris acetate EDTA

TCA : Tricarboxylic acid

VAO : Vanillyl alcohol oxidase

X-gal : 5-bromo-4chloro-3indoly-β-D-galactoside

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các đặc tính hóa lí của vanillin 5

Bảng 2.2: Mức độ sử dụng vanillin trong các hạng mục thực phẩm 8

Bảng 2.3: Hàm lượng vanillin có trong các mặt hàng thực phẩm và mỹ phẩm 9

Bảng 2.4: Các chủng vi sinh vật với khả năng sản xuất vanillin trên 20

Bảng 3.1: Các thành phần của vector pTZ57R/T 32

Bảng 3.2: Các thành phần của vector pRSET – A 33

Bảng 3.3: Các thành phần của vector pET22b (+) 34

Bảng 3.4: Trình tự mồi khuếch đại gene 35

Bảng 3.5: Danh mục các thiết bị 37

Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR 41

Bảng 3.7: Thành phần phản ứng cắt enzyme 45

Bảng 3.8: Thành phần phản ứng nối 46

Bảng 3.9: Chương trình chạy HPLC phân tích axit ferulic và vanillin 50

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Sơ đồ phân bố vanilla trên thế giới 4

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của vanillin và vanillin dạng bột 5

Hình 1.3: Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA dependent) 11

Hình 1.4: Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent) 12

Hình 1.5: Con đường Non-oxidation decarboxylataion 13

Hình 1.6: Con đường CoA-Independent Deacetylation 14

Hình 1.7: Con đường Side-Chain Reductive 15

Hình 1.8: Thứ tự các phản ứng tổng hợp vanillin từ guaiacol (Kirk & Othmer, 1983) 17

Hình 1.9: Con đường phân hủy axit ferulic trong Pseudomonas fluorescens BF13 (Calisti et al., 2008) 23

Hình 1.10: Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic(Yoon et al., 2005) 24

Hình 1.11: Sơ đồ con đường tái sử dụng CoA từ acety-CoA(Lee et al., 2009) 25

Hình 2.1: Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T 30

Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc vector pRSET-A 32

Hình 2.3: Cấu trúc vector biểu hiện pET22b(+) 33

Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tách dòng các gene gltA, ech, fcs từ E.coli DH5 , 39

Hình 2.5: Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu hiện chứa các gene 40

Hình 2.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene ech 41

Hình 2.7: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene fcs 42

Hình 3.1: Sản phẩm PCR gene gltA (A), sản phẩm PCR sau khi tinh sạch (B) và ADN plasmid các dòng khuẩn lạc màu trắng 51

Hình 3.2: Plasmid tái tổ hợp có khả năng mang gene gltA được cắt bằng enzyme NcoI 53

Hình 3.3: Kết quả xác định trình tự gene gltA 54

Hình 3.4: Kết quả PCR khuếch đại gene ech 55

Hình 3.5: Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-ech 56

Hình 3.6: (A) Thiết kế in silico vector pTZ-ech; (B) Kết quả cắt kiểm tra vector tái tổ hợp đồng thời bằng SacI và EcoRI 57

Hình 3.7: Kết quả xác định trình tự gene ech 59Hình 3.8: Kết quả tách ADN tổng số từ Amycolatopsis sp HR104

(DSM 9991) 60Hình 3.9: Sản phẩm PCR gene fcs (A), plasmid các dòng có khả

năng mang gene fcs (B), cắt plasmid tái tổ hợp bằng

EcoRI và BamHI (C) 61Hình 3.10: Kết quả xác định và phân tích trình tự gene fcs 64Hình 3.11: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET22-G 66Hình 3.12: Cắt plasmid dòng 1,7 bằng đồng thời 2 enzyme HindIII

và SacI 66Hình 3.13: Minh hoạ cơ sở kiểm tra chiều gắn gene gltA trong

pET22-G 67Hình 3.14: Kết quả cắt pET22-G dòng 1,7 bằng enzyme NcoI 68Hình 3.15: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET22-GE 68Hình 3.16: Kết quả cắt các dòng plasmid đồng thời bằng SacI và

EcoRI 69Hình 3.17: Minh họa cơ sở kiểm tra chiều gắn gene ech trong

pET22-GE 70Hình 3.18: Kết quả cắt các dòng plasmid đồng thời bằng EcoRI và

BamHI 71Hình 3.19: Thiết kế vector tái tổ hợp pET22 mang 3 gene gltA, ech

và fcs 71Hình 3.20: ADN plasmid của các khuẩn lạc trắng có khả năng mang

pRSET-F (A) và cắt plasmid bằng enzyme SacI và

BamHI (B) 72Hình 3.21: Cấu trúc theo lý thuyết của vector pRSET-GEF (A), cắt

plasmid bằng các tổ hợp enzyme khác nhau (B) và

Marker 1kb được dùng làm thang chuẩn để xác định kích

thước các băng của sản phẩm cắt (C) 74Hình 3.22: Ảnh hưởng của nồng độ axit ferulic ban đầu với sinh

trưởng của E coli tái tổ hợp mang vector pET22-GEF 75Hình 3.23: Phân tích HPLC động học sự chuyển hóa axit ferulic

thành vanillin ở chủng E coli BL21(DE3) tái tổ hợp

mang vector pET22-GEF 76

Hình 3.24: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh

trưởng và sinh tổng hợp vanillin của chủng E coli tái tổ

hợp 77Hình 3.25: So sánh khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp vanillin

của E coli tái tổ hợp trên các môi trường LB, M9 và

2YT 78Hình 3.26: Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến sinh tổng hợp

vanillin 79Hình 3.27: So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit

ferulic sử dụng các chủng E coli tái tổ hợp mang

vector pET22-GEF và pRSET-GEF 80

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) là một chất thơm quan trọng được sử dụng phổ biến trên thế giới trong công nghiệp thực phẩm, đồ uống, nước hoa, dược phẩm, dinh dưỡng [66] Mức độ tiêu thụ hàng năm trên thế giới vào khoảng hơn 12000 tấn [44] Vanillin còn thể hiện các đặc tính chống khuẩn và chống oxy hóa [71], đồng thời đã có nghiên cứu chứng minh vanillin có tác dụng chống đột biến và ung thư [71]

Vanillin được sản xuất chủ yếu từ nguồn tách chiết vỏ quả của loài lan

Vanilla planifolia và tổng hợp nhân tạo từ eugeneol, lignin…Trong đó,

vanillin được tách chiết từ thực vật chỉ đáp ứng 1% nhu cầu thị trường, còn lại

là tổng hợp hóa học Giá trị kinh tế của vanillin tự nhiên từ Vanilla planifolia có giá lên tới 4000 đôla một kilogam, trái lại vanillin nhân tạo

chỉ vào khoảng 15 đôla trên một kilogram [84] Tuy nhiên, vanillin nhân tạo không được đánh giá tương đương như vanillin tự nhiên theo quy định của Mỹ và Châu Âu do thiếu hẳn các hương vị thuần khiết của vanillin tự nhiên và quá trình tổng hợp gây ảnh hưởng xấu tới môi trường [51]

Sự khác biệt lớn giữa giá trị của vanillin tự nhiên với vanillin tổng hợp

đã kích thích mối quan tâm của ngành công nghiệp hương liệu để sản xuất ra vanillin tự nhiên, bảo vệ môi trường và hiệu quả kinh tế bằng các con đường sinh tổng hợp thông qua các chuyển hóa sinh học nhờ vi sinh vật từ các nguồn

cơ chất như axit ferulic, eugeneol, isogeneol, lignin,…

Trong các nguồn cơ chất trên, axit ferulic được nghiên nhiều về các con đường chuyển hóa để tạo ra vanillin có thể được ghi nhãn tự nhiên Axit ferulic có nhiều trong thành tế bào của thực vật hai lá mầm nên có thể thu từ các phế phụ phẩm nông nghiệp Một số vi sinh vật có khả năng phân hủy axit

ferulic để tạo ra vanillin như Amycolatopsis sp strain HR167 [6], Delftia acidovorans [63], Pseudomonas putida [62], Streptomyces setonii [73],

Pseudomonas fluorescens [53],…Vanillin mặc dù được tổng hợp từ các vi sinh vật trên song nó bị phân hủy thành các hợp chất khác, do vậy làm giảm nồng độ vanillin tạo ra Đồng thời quá trình lên men một số xạ khuẩn thường gặp khó khăn bởi dịch nuôi cấy có độ nhớt cao do sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và bào tử

Với những khó khăn trên, hướng nghiên cứu tiếp theo là tổng hợp vanillin trong các vi khuẩn không mang gene sinh tổng hợp cũng như không

có con đường phân hủy vanillin bằng kĩ thuật ADN tái tổ hợp Trong số đó, E coli được xem là một vật chủ tiềm năng bởi các lý do sau:

- Vanillin tạo ra bằng con đường này được chấp nhận là vanillin tự nhiên

- Axit ferulic chiếm tỉ lệ cao trong mô thực vật, do đó là nguồn cơ chất phổ biến, rẻ tiền tận dụng từ phụ phẩm nông nghiệp

- Ở các loại vật chủ khác, vanillin sau khi tạo thành nhanh chóng bị chuyển hóa thành các sản phẩm khác, hoặc là bị chính vật chủ tái sử dụng như

một nguồn cacbon E coli là vật chủ không mang các con đường chuyển hóa này, do đó sản xuất vanillin nhờ E coli không bị yếu điểm này

- E coli là loài vi khuẩn lành tính, đặc điểm di truyền cũng như quy trình

lên men đã được nghiên cứu kĩ

Từ các luận điểm trên, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này với

mục tiêu sử dụng kĩ thuật di truyền để tạo ra chủng vi khuẩn E coli tái tổ hợp chứa các gene của con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic Chủng E coli này sẽ có khả năng sản xuất ra vanillin tự nhiên từ axit ferulic

2 Mục tiêu của đề tài

Tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp mang các gen mã hóa cho

enzyme sinh tổng hợp axit ferulic thành vanillin

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Tách dòng gene gltA, ech và fcs

Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện mang các gen gltA, ech, fcs

Nội dung 3: Đưa vector biểu hiện vào tế bào chủ, cảm ứng biểu hiện các gen đích

Nội dung 4: Phân tích sản phẩm vanillin được tạo thành

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo được chủng E.coli có khả năng sản xuất ra vanillin từ axit ferulic là nền tảng để thực hiện nhiều nghiên cứu ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp để tạo ra sản phẩm thực tiễn Giúp bổ sung thêm dữ liệu cho việc nghiên cứu các đối tượng tiếp theo Là nguồn tài liệu tham khảo hữu ích cho các nghiên cứu tiếp theo về công nghệ ADN tái tổ hợp

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài là tiền đề để sản xuất vanillin từ vi sinh vật giúp cung cấp cho thị trường lượng vanillin tự nhiên với giá cả phù hợp với túi tiền người tiêu dùng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về vanillin

1.1.1 Nguồn gốc

Vanillin là hỗn hợp chất thơm tự nhiên phổ biến trên thế giới được tách chiết

từ vỏ quả loài lan Vanilla planifolia Trong số hơn 250 thành phần chất hóa học

khác nhau được tách chiết từ vỏ quả, vanillin chiếm thành phần chủ yếu.

Lịch sử về nguồn gốc vanillin bắt đầu từ sự khám phá ra loài lan Vanilla planifolia ở Mesoamerica suốt những năm 1930 Người Aztecs (Mexico) được coi

là cái nôi đầu tiên trong việc sử dụng vanilla cho đồ uống của họ Sau đó, người Tây Ban Nha xâm chiếm và mang nó về Châu Âu, song mọi cố gắng để có thể

trồng được cây Vanilla planifolia đều thất bại do không có sự thụ phấn tự nhiên

Cho đến khi nhà thực vật học Charles Morren phát hiện ra bí mật của sự miễn cưỡng sinh sản ở những vùng đất ngoài Mexico, điều này đã dẫn tới khám phá ra

sự thụ phấn nhân tạo cho hoa cuả vanilla [71]

Ngày nay, vanilla được trồng phổ biến ở một số quốc gia như Indonesia, Trung Quốc, Madagascar, Mexico,…

Hình 1.1: Sơ đồ phân bố vanilla trên thế giới

1.1.2 Cấu trúc, đặc điểm lí hóa

Vanillin có dạng bột kết tinh màu trắng với mùi thơm mạnh, dễ chịu Về mặt hóa học, vanillin là một phenolic aldehyde (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde),

có công thức phân tử là C8H8O3, bao gồm các nhóm aldehyte, ete, phenol [18]

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của vanillin và vanillin dạng bột

(Converti et al., 2010) Các đặc tính lí hóa của vanillin được thể hiện dưới bảng sau:

Bảng 1.1: Các đặc tính hóa lí của vanillin

(Ravendra, Sharma, & Prem Shanker, 2012)

1.1.3 Đặc tính sinh học

Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra những đặc tính của vanillin như chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, chống bệnh hồng cầu lưỡi liềm,… [71]

1.1.3.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật

Vanillin và dẫn xuất thể hiện mức độ khác nhau về hoạt tính kháng nấm bao gồm các loại nấm men, nấm mốc gây hư hại thực phẩm [23] Vanillin còn ức chế sự sinh trưởng của nấm men và nấm mốc trong nước hoa quả ép, thạch hoa quả [45] và trong bảo quản xoài chế biến tươi và chống lại

một số nấm men gây bệnh quan trong trong y học như Candida albicans, Cryptococcus neoformans [16], [56]

Vanillin đóng vai trò như một tác nhân kháng khuẩn chống lại

Escherichia coli, Lactobacillusp lantarum, Listeria innocua Schiff bases

(thuốc nhuộm fuchsin) có nguồn gốc từ vanillin được đánh giá là một chất kháng khuẩn chống lại một số chủng Gram dương và gram âm như

Pseudomonas pseudoalcaligenes, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, Enterobacter aero-genes, Staphylococcus subfava, Bacillus megaterium

[76] Tuy nhiên cần có hướng nghiên cứu xác định nồng độ nhỏ nhất mà ở

đó vanillin hoạt động như một chất kháng vi sinh vật cũng như chất bảo quản tự nhiên

1.1.3.2 Hoạt tính kháng oxy hóa

Vanillin đã được công nhận với khả năng chống oxy hóa cũng như hoạt tính phân hủy các gốc tự do Vanillin có khả năng chống lại các tổn thương ở não dưới sự cảm ứng của carbon tetrachloride (CCl4) tác nhân gây oxy hóa ở chuột [47], bảo vệ lớp màng ty thể gan khỏi quá trình oxy hóa được cảm ứng bởi sự nhạy cảm ánh sáng trên ty thể gan chuột [35] Sự

có mặt của vanillin với lượng nhỏ trong thực phẩm cũng giúp chống lại oxy hóa, ức chế sự tự oxy hóa ở sữa béo

1.1.3.3 Hoạt tính chống ung thư và đột biến

Vanillin đã được nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư và đột biến

Vanillin ức chế đột biến ở locus CD59 trên NST 11 ở người được cảm ứng bởi hydrogene peroxide, N-methyl-N-nitrosoguanidine và mitomycin

C [27] Vanillin ức chế con đường Non-homologous ADN end- joining (NHEJ) gây ra sự đứt gãy trên mạch kép ADN bởi ức chế hoạt tính của ADN-PK (ADN protein kinase), làm giảm số lượng khối u ruột cảm ứng bởi nhiều tác nhân trong mô hình chuột [7]

1.1.3.4 Hoạt tính hạ lipid trong máu

Vanillin được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển tình trạng bệnh lí như siêu mỡ trong máu Hoạt tính dược lí của vanillin như một tác nhân

hạ lipid trong máu khi nồng độ vượt quá phạm vi cho phép trong điều trị bệnh tiểu đường (type 2), rối loạn tim mạch, béo phì Trước đó đã có nghiên cứu vanillin làm giảm lượng triglycerin trong huyết tương, triglycerin liên kết với lipoprotein và triglycerin trong gan trên đối tượng chuột [72]

1.1.3.5 Hoạt tính chống tạo hồng cầu lưỡi liềm

Vanillin trong các thí nghiệm in vitro đã chứng minh khả năng

chống tạo hồng cầu lưỡi liềm bởi tác động của nhóm aldehyde với hemoglobin trong tế bào hồng cầu [5] Tuy nhiên vanillin được hấp thụ theo đường uống không có tác động trị liệu bởi vì nó có sự phân hủy nhanh chóng trong dịch tiêu hóa Để khắc phục vấn đề này, chế phẩm vanillin MX- 1520 đã được tổng hợp Lợi ích sinh học của loại thuốc này chống tạo thành hồng cầu lưỡi liềm mạnh gấp 5 lần so với vanillin

tự nhiên [89]

1.1.3.6 Các hoạt tính khác

Các loại dầu dễ bay hơi tách chiết từ nghệ, cỏ xả, húng quế kết hợp với 5% vanillin có tác dụng hiệu quả chống lại các loài muỗi [74]

1.1.4 Vai trò vanillin trong công nghiệp và đời sống

Vanillin được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất nước hoa, mỹ phẩm và dược phẩm [71]

Trong công nghiệp thực phẩm, vanillin là một phụ gia rất thông dụng, đặc biệt trong sản xuất kem đá lạnh (ice cream) Ngoài sử dụng trong sản xuất kem, vanillin còn được dùng rất nhiều để làm tăng hương vị và tạo mùi thơm cho bánh, kẹo, cho các loại đồ uống

Hương thơm đặc trưng của vanillin được sử dụng trong lĩnh vực mỹ phẩm như tạo mùi cho nước hoa, kem, sữa dưỡng ẩm, nước hoa xịt phòng, xà phòng ,…

Bảng 1.3: Hàm lượng vanillin có trong các mặt hàng thực phẩm và mỹ phẩm

Sản phẩm Hàm lượng Trạng thái vật lí TLTK

Đồ uống không cồn 0.0063%

Hoà tan hoặc rắc lên

bề mặt

(Furia & Bellanca, 1975)

Chocolate sữa Lên tới 0.03%

Đường cô Lên tới 0.015%

Nước hoa Bình thường: 0.2%

Hòa tan Opdyke, 1977

Vanillin còn là một chất khử mùi hữu hiệu để che giấu mùi khó chịu của nhiều loại mặt hàng như đồ may mặc, sản phẩm cao su, giấy và chất dẻo,…Thông thường chỉ cần đến một lượng nhỏ, vì mùi của vanillin có thể cảm nhận được ngay

ở độ pha loãng khoảng 0,0000002 mg trong 1 m3 không khí [2] Ngoài ra, vanillin còn được sử dụng ngăn chặn tạo bọt trong sự bôi trơn nhiều loại dầu, làm sáng trong lớp phủ kẽm bồn tắm, hỗ trợ sự oxi hóa tinh dầu hạt lanh, hấp dẫn côn trùng, ngăn chặn xỉn màu răng gây ra bởi khói thuốc lá, hòa tan vitamin B1 và xúc tác phản ứng trùng hợp methyl methacrylate [39]

1.2 Các con đường sinh tổng hợp vanillin

1.2.1 Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật

Quả vanilla được thu hoạch khoảng từ 6 đến 8 tháng sau quá trình thụ phấn và ở giai đoạn này chúng chưa bộc lộ ra hương vanilla [79] Mùi hương chỉ được giải phóng ra trong quá trình lên men, được gọi là “curing” Khi glucoside, glucovanillin, các ß-glucoside liên quan

bị thủy phân bởi enzyme ß-D-glucosidase sẽ giải phóng ra vanillin tự

do và các chất liên quan [57]

Mặc dù vanillin là một trong số những chất hóa học được nghiên cứu nhiều song những con đường sinh tổng hợp chúng trong thực vật vẫn c̣n gây nhiều tranh luận, bởi v́ chưa có nghiên cứu chính xác nào xác định và nêu ra đặc trưng của tất cả các bước trong con đường được

đề xuất Có một giả thiết nói rằng vanillin là sản phẩm của con đường acid shikimic Ở con đường này, phenylalanine hoặc tyrosine trải qua khử amin hóa tới C6 – C3 phenylpropanoid, tiếp đó đóng vai trò như một cơ chất cho vanillin [30]

1.2.2 Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic trong vi sinh vật

Một số vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đã được nghiên cứu để xác định các gene mã hóa các enzyme xúc tác phản ứng tổng hợp vanillin từ các

cơ chất khác nhau như lignin, eugeneol, isoeugeneol, axit ferulic, glucose,…Trong

đó đáng chú ý nhiều là các chuyển hóa sinh học từ axit ferulic

Axit ferulic (acid 4-hydroxy-3-methoxycinnamic) là một thành phần phổ biến trong thực vật được tạo ra từ sự trao đổi chất phenylpropanoid, kết hợp với acid dihydroferulic tạo nên tính vững chắc của thành tế bào bằng liên kết chéo giữa lignin và polysacchatide [58]

Axit ferulic là thành phần phenolic chủ yếu được tìm thấy trong thành tế bào của thực vật hai lá mầm, nên nó có thể được thu từ các nguồn phế phẩm nông nghiệp như vỏ ngu, cám ngu, củ cải đường, thành tế bào nội nhũ gạo,

lúa mỳ, lúa mạch Axit ferulic còn là cơ chất ít độc tính nhất với vi sinh vật trong số các cơ chất được nghiên cứu Vì vậy, có thể coi đây là cơ chất thích hợp cho sản xuất vanillin sinh học [50]

Các nhà nghiên cứu đã đưa ra 5 con đường chuyển hóa axit ferulic thành vanillin, đó là con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent), β-oxidative deacetylation (CoA-dependent), Non-oxidative decarboxylation, CoA-Independent Deacetylation, Side-Chain Reductive

1.2.2.1 Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)

Các gene mã hóa enzyme cần cho con đường Non-β-oxidative deacetylation

đã được xác định và xác nhận hoạt tính của chúng [25]

Hình 1.3: Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)

(Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)

Con đường này có ba bước xúc tác với sự tham gia của hai enzyme: hydroxycinnamate-CoA ligase (4-CL) hay feruloyl-CoA synthetase, mã hóa bởi

4-gene fcsvà 4-hydroxycinnamate CoA-hydratase/lyase (HCHL) hay enoyl-CoA hydratase/aldolas được mã hóa bởi gene ech Đầu tiên, enzyme HCHL chuyển axit

ferulic thành feruloyl-ScoA, sau đó 4-CL xúc tác thủy phân feruloyl-ScoA thành một chất trung gian tạm thời 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-b-hydroxypropionyl-ScoA và tách chuỗi bên theo kiểu retro-aldol thành vanillin và acetyl-ScoA Một

gene khác liên kết với gene fcs và gene ech mã hóa enzyme vanillin-xidoreductase

gây oxi hóa vanillin thành sản phẩm khác [25]

Các gene và enzyme tham gia vào các phản ứng tương ứng đã được xác

định ở các chủng Pseudomonas fluorescens AN103 [25], Pseudomonas sp

HR199 [59], Streptomyces setonii [51], Amycolatopsis sp.HR167 [6], Delftia acidovorans [63], and Pseudomonas putida KT2440 [62] Sự nhận biết về đặc trưng của các gene mã hóa cho các enzyme đưa ra cơ hội mới cho điều hướng trao đổi chất và cấu trúc các chủng tái tổ hợp

1.2.2.2 Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)

Con đường β-oxidation deacetylation được đề xuất cho P Putida [88]

và Rhodotorula rubra [32].

Hình 1.4: Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)

(Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)

Bước đầu là sự hình thành feruloyl-ScoA từ axit ferulic được xúc tác bởi enzyme 4-CL Bước thứ hai enzyme HCHL xúc tác phản ứng cộng nước

để tạo thành 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-b-ketopropionyl-ScoA và trải qua quá trình lưu phân (thyolytic)thành vanillyl-ScoA và acetyl-ScoA Tiếp theo, vanillyl-ScoA cộng nước (hydrate) và loại CoASH hình thành vanillin, bước

này được xúc tác bởi enzyme b-ketoacyl-CoA-thiolase (aat)

1.2.2.3 Con đường non-oxidative decarboxylation

Đầu tiên là sự tham gia của enzyme decarboxylase xúc tác phản ứng đồng phân hóa axit ferulic thành một chất quinoid trung gian và sau đó loại gốc cacboxyl tạo thành 4-vinylguaiacol [33]

Hình 1.5: Con đường Non-oxidation decarboxylataion

(Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)

Các chất trung gian của các phản ứng xuôi dòng tiếp theo giữa 4 vinylguanicol và vanillin chưa được xác định Đặc trưng của mỗi loại enzyme decarboxylase phụ thuộc vào từng vi sinh vật [13] Trong số đó

-ở nấm men Brettanomyces anomalus, enzyme được sản xuất -ở mức độ

thấp và được cảm ứng nhờ sự bổ sung của cơ chất [22]

Rhodotorulaglutinis và Rhodotorularubra đã được báo cáo về cơ

chế trao đổi chất axit ferulic qua quá trình loại nhóm cacboxyl [32]

1.2.2.4 Con đường CoA-Independent Deacetylation

Trong suốt con đường này, liên kết đôi dạng trans của axit ferulic cộng nước tạo thành một chất trung gian tạm thời là acid 4-hydroxy-3-methoxy-b-hydroxypropionic

Hình 1.6: Con đường CoA-Independent Deacetylation

(Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)

Tiếp theo bước này enzyme aldolase phân tách acetate giải phóng trực tiếp vanillin Ngoài ra, chất trung gian tạm thời còn có thể mất đi một hydro thành acid 3(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)3-ketopropionic và sau đó loại nhóm acetyl (deacetylation) thành vanillin Một enzyme có khả năng

loại nhóm acetyl (fca) đã được xác nhận ở chủng Pseudomonas putida

1.2.2.5 Con đường Side-Chain Reductive

Đồng thời với phản ứng loại nhóm cacboxyl, axit ferulic bị đồng phân hóa thành một chất quinoid trung gian tạm thời mà chính nó bị khử thành acid dihydroferulic (4-hydroxy-3-methoxyphenylpropionic acid) [69]

Hình 1.7: Con đường Side-Chain Reductive

(Havkin-Frenkel & Belanger, 2010) Con đường này đã được đề xuất cho sự biểu hiện của S cerevisiae dưới

điều kiện yếm khí [33] hoặc Lactobacillus plantarum [13] Tuy nhiên, sự khử chuỗi bên này còn được báo cáo dưới điều kiện hiếu khí ở Phanerochaete chrysosporium [26] Phụ thuộc vào vi sinh vật mà acid dihydroferulic được trao đổi chất tiếp theo thành homovanillic hoặc acid vanillic Sau đó, acid vanillic có thể được hoàn nguyên thành vanillin

Axit ferulic ngoài là một cơ chất thích hợp cho sản xuất vanillin mà còn biểu hiện nhiều chức năng sinh lí bao gồm các hoạt tính chống oxi hóa, kháng khuẩn, chống viêm, chống nghẽn mạch, chống ung thư Axit ferulic chống lại các chứng động mạch vành, cholesterol thấp, tăng cường khả năng sống của tinh trùng và còn được đánh giá là chất có khả năng chống lại các gốc tự do làm giảm thiểu các tác động gây hại của quá trình oxi hóa [37].

1.3 Các phương pháp sản xuất vanillin

1.3.1 Phương pháp tách chiết vanillin từ thực vật

Vanillin tự nhiên được thu chủ yếu từ nguồn hạt và vỏ quả của loài

lan nhiệt đới Vanilla planifolia Thời gian thu hoạch thông thường từ sáu

đến tám tháng sau khi thụ phấn Quá trình chế biến vanilla để sản xuất vanillin bắt đầu bằng việc ủ vỏ quả đã thu hoạch còn tươi, mục đích là

để làm ngừng lại các quá trình dinh dưỡng tự nhiên bên trong vỏ quả và thúc đẩy nhanh chóng sự hình thành chất thơm

Mỗi vùng miền có phương pháp ủ (curing) khác nhau, điều này

có thể là tác động chính đến sự khác biệt về chất lượng vanillin trong

vỏ quả

Có một vài phương pháp chế biến vanilla song chủ yếu là chế biến theo kiểu Mexico (Sun method) và Madagascar (Bourbon method) đều bao gồm bốn giai đoạn chính [65]:

- Làm héo: Làm ngừng các quá trình tự nhiên trong vỏ quả sau thu hoạch, đồng thời thúc đẩy các phản ứng enzyme xúc tác sự hình thành hợp chất thơm Điều này được nhận biết bởi các đốm nâu trên vỏ quả

- Xông hơi: Ở bước này, nhiệt độ tăng lên nhằm thú đẩy các phản ứng enzyme và làm khô nhanh chóng ban đầu tránh quá trình lên men gây hại xảy ra

- Làm khô: Bước này thực hiện ở nhiệt độ thường cho đến khi khối lượng vỏ quả đạt một phần ba so với ban đầu

- Đóng gói: Vỏ quả được lưu trữ trong các hộp đóng khoảng ba tháng, vào thời điểm này vanillin sẽ được tạo ra

Để thu được vanillin, vỏ quả sẽ được ngâm trong hỗn hợp ethanolvà nước bằng các phương pháp tách chiết khác nhau như ngâm chiết, xử lí nhiệt,… sản phẩm có thể ở dạng lỏng hay bột tùy mục đích sử dụng

Sản xuất vanillin tự nhiên từ nguồn thực vật không chỉ mất nhiều công lao động mà còn bị giới hạn bởi sự dao động thất thường về năng suất cùng với điều kiện nông nghiệp và các vấn đề về kinh tế và chính trị Để tạo ra 1 kg vanillin tách chiết phải cần tới 500 kg vỏ quả tương đương với gần 40000 hoa được thụ phấn [65] Do vậy, số lượng vanillin tách chiết tự nhiên chỉ đáp ứng 1% nhu cầu thị trường [87]

1.3.2 Sản xuất vanillin bằng tổng hợp hoá học

Quá trình hóa học đầu tiên để thu vanillin được thực hiện bởi Tiemann vào năm 1876 Nguyên liệu là eugeneol có trong tinh dầu cây đinh hương và được sử dụng thương mại cho đến những năm 1920 Sau đó vanillin được tổng hợp bằng

dịch kiềm sunphit giàu lignin là sản phẩm phụ của ngành công nghiệp giấy Quá trình tổng hợp vanillin bao gồm xử lí dung dịch lỏng chứa lignin bằng các chất oxi hóa, pH kiềm, nhiệt độ và áp suất cao Các chất oxi hóa có thể là không khí, oxi, nitrobenzene hoặc không có sự hỗ trợ của các chất xúc tác Lignin bị phân hủy và oxi hóa, vanillin được tạo thành kèm theo các sản phẩm phụ khác [15]

Sự có mặt của các chất tạp nhiễm đòi hỏi phải sử dụng các quá trình tinh sạch cao Ngày nay sản xuất vanillin từ lignin không phổ biến nữa bởi vì tác động xấu tới môi trường Hơn nữa, dù là cơ chất có nguồn gốc từ tự nhiên song tổng hợp vanillin

từ lignin vẫn bị ghi nhãn là vanillin nhân tạo bởi vì có sự biến đổi hóa học để thu được sản phẩm cuối cùng [31]

Ngày nay hầu hết vanillin tổng hợp được sản xuất từ nguyên liệu hóa dầu guaiacol và acid glyoxylic [42] Đây là một quá trình gồm hai bước bắt đầu với phản ứng ngưng tụ trong môi trường kiềm giữa guanicol và acid glyoxylic tạo thành acid vanillylmandelic và tiếp đó được chuyển thành vanillin bởi quá trình loại nhóm

CO2 oxi hóa Thứ tự của các phản ứng được chỉ ra ở hình 2.8

Hình 1.8: Thứ tự các phản ứng tổng hợp vanillin từ guaiacol

(Kirk & Othmer, 1983)

Vanillin thu được từ guaiacol bằng kĩ thuật này gần như không có các sản phẩm phụ, do vậy vai trò của quy trình tinh sạch sản phẩm sẽ được đơn giản hóa Mặc dù quá trình này làm giảm tác động mạnh tới môi trường khi so sánh với sản xuất từ lignin, song guaiacol là một sản phẩm hóa dầu cũng như vanillin khi

tổng hợp từ lignin đều có sự thay đổi hóa học mạnh tạo ra sản phẩm cuối cùng nên chúng vẫn bị ghi nhãn Ộnhân tạoỢ [81]

1.3.3 Sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ sinh học

1.3.3.1 Sử dụng enzyme

Những hiểu biết về con đường sinh tổng hợp vanillin và các enzyme

tham gia tạo cơ sở cho việc thiết lập một hệ thống enzyme in vitro để sản xuất

vanillin

Dignum và cộng sự đã mô tả việc sử dụng chế phẩm enzyme chứa glucosidase xúc tác phản ứng thủy phân vanillin từ glucovanillin để thu được vanillin giải phóng từ vỏ quả vanilla như một sự thay thế quá trình ủ truyền thống, rút ngắn thời gian [20]

ư-Ngoài enzyme trên còn có một số enzyme khác được sử dụng để tạo ra vanillin từ các nguyên liệu thực vật khác bằng các biến đổi sinh học Năm

1989, Kamoda và cộng sự đã sử dụng enzyme lignostilbene αβ-dioxygenease

được thu nhận từ Pseudomonas sp TMY1009 xúc tác sự oxi hóa giải phóng

vanillin từ Xtinben tìm thấy phổ biến trong vỏ gỗ [36]

Các enzyme được tạo ra bởi tách dòng gene mã hóa enzyme lipoxygenease từ đậu týõng đã đýợc biểu hiện trong một số vi sinh vật biến đổi gene để thãm dò khả năng tổng hợp vanillin từ este của coniferyl alcohol [48] Vanillin còn được giải phóng từ creosol (một thành phần chắnh của creosote được thu từ xử lắ nhiệt gỗ hoặc than đá) và vanillylamine (được thu bởi quá trình thủy phân capsaicin là phần cay chủ yếu của hồ tiêu) Năm

2001, Van den Huevel và cộng sự sử dụng enzyme vanillyl alcohol oxidase

(VAO), một flavoenzyme đặc trưng của Penicillium biến đổi cả creosol và

vanillylamine thành vanillin với hiệu suất cao Sự chuyển đổi trung gian VAO của creosol trải qua một quá trình gồm hai bước trong đó ban đầu là

sự hình thành vanillyl alcohol sau đó bị oxi hóa thành vanillin Tuy nhiên creosol không thể được xem như một cơ chất tự nhiên bởi vì có sự biến đổi hóa học mạnh của gỗ hoặc than đá [77]

1.3.3.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật

Có một số nghiên cứu khám phá ra khả năng trao đổi chất ở thực vật để sản xuất chất thơm trong đó có vanillin trong nuôi cấy mô tế bào như lá và

cuống lá cuả Vanilla planifolia Chiến lược nuôi cấy mô tế bào bao gồm dinh

dưỡng của cơ chất, sử dụng hoormon ức chế các con đường cạnh tranh, cố định tế bào, điều chỉnh điều kiện môi trường và sử dụng chất hấp phụ như than hoạt tính, nhựa để thu hồi vanillin được tạo ra [79]

Năm 1991, Knuth và Sahai đã phát hiện rằng bản chất và nồng độ của các

cơ chất được thêm vào môi trường là một yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi

cấy V.fragrans Phenyladenine và axit ferulic cho kết quả ít tăng cường tạo

vanillin, trong khi đó thêm vanillyl alcohol lại cho kết quả tăng hàm lượng vanillin [40]

Năm 1993, Westcott và cộng sự đã cải tiến một quy trình sản xuất vanillin tự nhiên từ các rễ khí sinh sử dụng axit ferulic như một chất xúc tác sinh học Than hoạt tính cũng được sử dụng đóng vai trò như một chất hấp phụ vanillin tạo ra, do vậy có thể giảm thiểu được sự ức chế quá trình xảy ra Các mô rễ khí sinh có thể được dùng lại một vài lần nhưng hoạt tính sẽ giảm qua mỗi lần sử dụng Nồng độ của vanillin tạo ra cao hơn khoảng 35 lần so với lượng vanillin ban đầu có trong mô rễ khí sinh và chiếm khoảng 40% vanillin có trong quả vanilla trưởng thành Sử dụng rễ khí sinh bổ sung axit ferulic, vanillin tạo ra nhanh hơn tổng hợp bình thường trong quả từ 5 đến 10 lần Mặc dù đã có nghiên cứu mô tả thành công sự tích lũy vanillin từ nuôi cấy mô tế bào, song năng suất thực tế không đủ để sản xuất thương mại [80]

Ngoài ra, trong quá trình nuôi cấy mô tế bào còn gặp phải một số vấn

đề như tính không ổn định của tế bào, tỉ lệ sinh trưởng thấp, đòi hỏi điều kiện

vô trùng Do vậy, đó không phải là lý tưởng cho sản xuất vanillin thương mại

Hơn thế nữa, ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trong tạo Vanilla còn là một vấn

đề mơ hồ bởi vì còn thiếu những hiểu biết về con đường sinh tổng hợp vanillin và các enzyme tham gia [79]

1.3.3.3 Lên men vi sinh vật

Vi sinh vật với khả năng sinh trưởng nhanh chóng và tuân theo di truyền học phân tử

là những mục tiêu lý tưởng cho công nghệ sinh học và có thể được tuyển chọn cho sản xuất vanillin bởi khả năng sinh trưởng trên các cơ chất như một nguồn cacbon và năng lượng

Trên thế giới đã có các nghiên cứu về quá trình lên men vi sinh vật sản xuất vanillin

từ các cơ chất khác nhau, dưới đây là bảng tóm tắt một số kết quả của các tác giả

Bảng 1.4: Các chủng vi sinh vật với khả năng sản xuất vanillin trên

các cơ chất

Eugeneol

Pseudomonas resinovorans

SPR1 0.24

(M Ashengroph, Nahvi, Zarkesh-Esfahani, &

Zarkesh-Esfahani, & Momenbeik, 2011a) [8]

(Morahem Ashengroph, Nahvi, Zarkesh-Esfahani, & Momenbeik, 2012) [11]

Axit

ferulic

Amycolatopsis sp

(DSM9991 or DSM9992) 11.5 (Rabenhorst & Hopp, 1997) [64]

Streptomyces setonii ATCC

Mặc dù các vi sinh vật trên có khả năng tạo ra vanillin từ các cơ chất khác nhau song chúng có nhược điểm là đều có con đường phân hủy vanillin thành các sản phẩm phụ như acid vanillic, vanillyl alcohol, Đối với một số

xạ khuẩn do sinh trưởng của hệ sợi nấm làm môi trường trở lên nhớt, khó kiểm soát sự vỡ ra từng mảnh và phân giải của sợi nấm nên gây khó khăn cho quá trình lên men

Do vậy, yêu cầu đặt ra là phải tìm được vật chủ thích hợp để tạo chủng tái tổ hợp biểu hiện các gene tổng hợp vanillin từ các cơ chất có sẵn, có quá

tŕnh lên men đơn giản, không có con đường phân hủy vanillin

1.4 Tiềm năng ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp trong sản xuất vanillin

Công nghệ ADN tái tổ hợp là tập hợp các kĩ thuật tạo nên các ADN tái tổ hợp để đưa các gene mong muốn vào các tế bào và cơ thể sống

ADN tái tổ hợp là phân tử ADN được tạo thành từ hai hay nhiều trình tự ADN của các loài sinh vật khác nhau Trong kỹ thuật di truyền, ADN tái tổ hợp thường được tạo thành từ việc gắn những đoạn ADN có nguồn gốc khác nhau vào trong vector tách dòng hay vector biểu hiện Những vector biểu hiện mang gene có thể tạo thành các protein tái tổ hợp trong các sinh vật

Đã có những nghiên cứu về sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp để tổng hợp các hợp chất sinh học quan trọng phục vụ cho con người như: insulin [38], hoocmon sinh trưởng ở người [68], vacxin viêm gan B [14], interlerkin [54],… Như vậy để tổng hợp vanillin theo con đường tái tổ hợp cần tách dòng các gene mã hóa enzyme có khả năng chuyển hóa các cơ chất thành vanillin

từ vi sinh vật đã biết, sau đó đưa các gene đó vào vector biểu hiện, biến nạp vào tế bào vật chủ thích hợp cho phép sự biểu hiện

1.4.1 Các gene mã hóa các enzyme sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic

Các gene mã hóa enzyme sinh tổng hợp vanillin được xác định là gene

fcs mã hóa enzyme feruloyl-coA synthetase và gene ech mã hóa enzyme

enoyl-CoA hydratase/aldolase Hai gene trên có thể được tách dòng từ một số

vi sinh vật như: Pseudomonas fluorescens [53], Pseudomonas sp Strain

HR199 [59], Amycolaptosis sp strainHR167 [6], Delftia acidovorans [84],

Rhodococcussp I24 [61]…

Để lựa chọn chủng vi sinh vật phù hợp cho tách dòng gene fcs và ech,

cần căn cứ vào một số cơ sở như:

- Chủng vi sinh vật đó có hiệu suất tổng hợp vanillin cao (mức độ biểu

hiện của 2 gene fcs, ech mạnh)

- Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic đã được xác định

- Hai gene fcs, ech trong các chủng đã được giải trình tự và công bố trên

Genebank, đây là cơ sở để thiết kế mồi cho tách dòng gene

- Các chủng được lưu giữ trong bảo tàng vi sinh vật, giảm bớt thời gian, chi phí phân lập

Trong số những chủng vi vật được đề xuất, Pseudomonas fluorescens có thể được xem là đối tượng nghiên cứu thích hợp Đây là một loài vi khuẩn gram âm, hình que thuộc chi Pseudomonas, dựa vào phân tích vùng trình tự 16S rRNA nó được đặt vào nhóm Pseudomonas fluorescens của chi, mà nó cho mượn tên Các nghiên cứu thực hiện trên Pseudomonas fluorescens đã

cho thấy tiềm năng của loại vi khuẩn có lợi trong xử lý sinh học chống lại các tác nhân gây bệnh của nhiều giống cây trồng

Năm 2010, Di Gioia và cộng sự đã đề xuất sử dụng chủng của P fluorescensBF13 để sản xuất vanillin từ axit ferulic Chủng này tạo ra 8.41 mM vanillin, cao nhất trong số các chủng của Pseudomonas [19]

Dữ liệu phân tử và sinh hóa chỉ ra rằng ở chủng Pseudomonas fluorescens BF13 (một thành viên của chi Pseudomonas), axit ferulic bị

phân hủy qua con đường non-oxidative CoA-dependent dẫn đến sự hình thành vanillin [17]

Hình 1.9: Con đường phân hủy axit ferulic trong Pseudomonas fluorescens

1.4.2.Vi khuẩn E coli và khả năng sử dụng làm vật chủ sản xuất vanillin

Hiện nay, trong số các hệ biểu hiện protein ngoại lai thì vi khuẩn Gram

âm E coli vẫn là một trong những hệ biểu hiện thu hút nhiều quan tâm nhất

vì chúng có tốc độ sinh trưởng nhanh với mật độ tế bào cao trên môi trường

cơ chất không đắt tiền cũng như các đặc điểm di truyền đã được nghiên cứu đầy đủ Trên thị trường hiện nay thương mại nhiều loại vector tách dòng, vector biểu hiệu và chủng đột biến đối với hệ biểu hiện này Đồng thời, trong

E coli kiểu dại không có sự tổng hợp vanillin tự nhiên nhưng chúng có thể

tiếp nhận các gene ngoại lai để tạo ra vanillin mà không có con đường phân

hủy vanillin Đây là cơ sở để lựa chọn E coli làm đối tượng nghiên cứu

Các tế bào E coli mang vector tái tổ hợp chứa 2 gene fcs và ech trong

điều kiện môi trường có chứa axit ferulic và các chất cần thiết cho sự sinh

trưởng của tế bào diễn ra quá trình tổng hợp vanillin theo sơ đồ ở hình 2.10

Hình 1.10: Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic

(Yoon et al., 2005)

Axit ferulic bị chuyển hóa thành CoA dưới sự xúc tác của enzyme CoA (mã hóa bởi gene fcs) sử dụng ATP và CoA, sau đó feruloyl-CoA cộng nước tạo thành 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-hydroxypropionyl-CoA và phân tách tạo ra vanillin và acetyl-CoA dưới sự xúc tác xủa enzyme enoyl-CoA hydratase/aldolase

feruloyl-mã hóa bởi gene ech

Sự tích lũy acety-CoA trong tế bào gây ra hai vấn đề chính: Một là làm giảm nồng độ vanillin tạo ra; hai là gây thiếu CoA cho phản ứng chuyển hóa axit ferulic thành feruloyl-CoA, dẫn đến dư thừa cơ chất có thể gây ức chế phản ứng Do vậy, cần có quá trình tái sử dụng tối đa lượng acety-CoA dư thừa tạo thành CoA để khắc phục hai vấn đề trên cũng như giảm bới tiêu hao năng lượng, tăng cường chuyển hóa axit ferulic thành vanillin Quá trình đó

đã được Lee và cộng sự (2009) báo cáo liên quan tới một chuỗi các phản ứng trong chu trình TCA và con đường vòng Glyoxylate với sự tham gia của gene

gltA (citrate synthase) [43]

Hình 1.11: Sơ đồ con đường tái sử dụng CoA từ acety-CoA

(Lee et al., 2009)

fcs: feruloyl-CoA synthetase; ech: enoyl-CoA hydratase/aldolase; gltA: citrate synthase; icdA: isocitrate dehydrogenease; iclR: transcription repressor; aceA: isocitrate lyase; aceB: malate synthase

Gene gltA mã hóa enzyme citrate synthase xúc tác phản ứng đầu tiên của

chu trình TCA nơi có sự tiêu thụ acetyl-CoA giải phóng ra CoA Sự khuếch đại

gene gltA làm tăng cường tiêu thụ acetyl-CoA để tạo ra nhiều CoA từ đó sẽ

chuyển hóa tối đa lượng axit ferulic Ngoài con đường trên thì còn có một con đường nữa để chuyển acetyl-CoA thành CoA đó là con đường vòng glycoxylate nõi mà isocitrate chuyển thành glycoxylate và malate mà không thông qua α-ketoglutarate Như vậy, con đường vòng glucoxylate ngắn hơn chu trình TCA vì thế có thể sẽ giảm bớt tiêu hao năng lượng [43]

Để thực hiện con đường này cần có sự tham gia của hai enzyme

isocitrate lyase và malate synthase mã hóa bởi gene aceA, aceB Tuy nhiên,

sự phiên mã của operon aceAB bị ức chế bởi gene điều hòa iclR Do vậy để

sử dụng tập trung acetyl-CoA theo con đường này cần giải ức chế hai gene

aceA và aceB bằng cách xóa bỏ gene iclR, đồng thời xóa bỏ gene icdA bởi vì isocitrate có ái lực với enzyme isocitrate dehydrogenease (icdA) hơn enzyme isocitrate lyase (aceA)

Gene gltA được xác định nằm trong nhiễm sắc thể của E Coli [55] và đã

được tách dòng và giải trình tự, kết quả được công bố trên ngân hàng GeneBank số EG10402

Như vậy để tăng cường hiệu suất sản xuất vanillin trong E coli cần kết hợp ba gene fcs, ech, gltA trên cùng một hệ thống vector biểu hiện trong điều

kiện nuôi cấy được tối ưu hóa

1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp trong nước và ngoài nước

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu sản xuất vanillin từ các chủng E coli tái tổ hợp

Năm 2003, Converti và cộng sự đã tạo thành công chủng E coli tái tổ

hợp JM109 mang plasmid pBB1 bao gồm các gene trao đổi chất axit ferulic

từ Pseudomonas fluorescens BF13 Plasmid tái tổ hợp pBB1 được tạo ra bằng việc tạo dòng một đoạn 5098 bp chứa gene ech và fcs từ chủng Pseudomonas fluorescens BF13 đột biến gene vdh dưới sự điều khiển của promoter chủ Pfer

vào vector có số bản copy thấp pJB3Tc19 Các tế bào E coli chủng

JM109/pBB1 được sử dụng cho cho sự chuyển hóa sinh học axit ferulic tới vanillin với năng suất 0.851 mol/l [75]

Barghini và cộng sự đã báo cáo rằng sử dụng các plasmid có số bản sao

thấp sẽ khắc phục sự giảm nhanh chóng sản phẩm cuối trong chủng E coli tái

tổ hợp do tính không ổn định di truyền của đột biến sản xuất vanillin Các tế

bào E coli JM109/pBB1 với plasmid có số bản copy thấp dẫn đến nồng độ

cuối cùng của vanillin là 3.5 mM sau 6 giờ nuôi cấy với sự cảm ứng của axit ferulic 1.1 mM Các tác giả còn chỉ ra việc tái sử dụng thành công các tế bào

đó trong bốn chu kì chuyển hóa sinh học tiếp theo, điều đó cho phép tăng nồng độ sản phẩm cuối cùng lên 2.52 g vanillin trên mỗi lít dịch nuôi cấy Sự tái sử dụng sinh khối có thể là một chiến lược thích hợp vừa để củng cố năng

suất bằng hệ thống lên men liên tục vừa làm giảm chi phí thu hồi vanillin bằng sự cô đặc sản phẩm cuối trong môi trường [12]

Để khai thác một chủng tái tổ hợp ổn định hơn, E coli JM109 được thiết

kế bởi sự tách dòng gene ech và fcs từ Pseudomonas fluorescens BF13 vào

một vector (pFR12) với một đơn vị sao chép cảm nhiệt, được thiết kế cho sự

hợp nhất gene vào locus lacZ trên nhiễm sắc thể của E coli Chủng được tạo

ra mang tên FR13, đã được xác nhận là hiệu quả và ổn định hơn trong sản xuất vanillin so với những chủng biểu hiện cùng các gene đó từ một vector plasmid có sổ bản copy thấp [46]

Một chủng E coli tái tổ hợp XL1-Blue (pSKech/Hfcs) chứa một plasmid gắn gene fcs và ech từ Pseudomonas sp.HR199 dưới sự điều khiển của

promoter lacZ có thể chuyển axit ferulic thành vanillin ở mức độ mM [60] Tương tự như vậy, gene fcs và ech phân lập từ xạ khuẩn Amycolatopsis sp Strain HR167 được biểu hiện trong chủng E coli tái tổ hợp cũng có khả năng

chuyển đổi axit ferulic thành vanillin [6]

Hai plasmid tái tổ hợp mang tên pDAHEF và pDDAEF mang gene fcs và ech từ 2 chủng tương ứng Amycolatopsis sp Strain HR104 và Delftia acidovorans được biến nạp vào E coli Theo như báo cáo của tác giả, trong cùng

một điều điều kiện lên men thì chủng mang plasmid pDAHEF thu được 160 mg/l vanillin trong khi đó chủng còn lại chỉ thu được 10 mg/l Sự tối ưu hoá quá

trình lên men E coli mang pDAHEF đã được thực hiện bởi sự bổ sung arabinose

13.3 mM như một chất cảm ứng trao đổi chất và axit ferulic 0.2% trong 18 giờ nuôi cấy, kết quả thu được là 580 mg/l vanillin được tạo ra [84]

Cũng trong một nghiên cứu song song, Yoon và cộng sự báo cáo rằng

vanillin được thu với hiệu suất cao hơn từ chủng E coli tái tổ hợp thiết kế bởi tách dòng gene fcs và ech từ Amycolatopsis sp HR104 dưới sự điều khiển của promoter trc (được cảm ứng bởi IPTG) Nồng độ vanillin thu được là 1,1 g/L

trong điều kiện 48h nuôi cấy, môi trường 2YT với axit ferulic 0.2%, không IPTG và không bổ sung nguồn cacbon [86]

Để củng cố sự sản suất vanillin bằng cách giảm độc tính của nó đối với các

tế bào nuôi cấy, có hai chiến lược được đề xuất Đó là tạo ra một đột biến kháng vanillin mang tên NTG-VR1 bằng phát sinh đột biến nitrosoguanidine và loại bỏ vanillin ra khỏi môi trường bằng nhựa hấp phụ XAD-2 Sử dụng 5 g/L axit ferulic, vanillin thu được với đột biến NTG-VR1 tăng gấp 3 lần so với chủng hoang dại Kết hợp thêm 50% (w/v) nhựa XAD-2 vào môi trường nuôi cấy, từ 10g/L axit ferulic thu được 2.9 g/L vanillin Nồng độ sản phẩm cuối cùng cao hơn 2 lần so với không bổ sung nhựa hấp phụ [85]

Năm 2009, Lee và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất vanillin trên chủng

E.coli DH5α (pTAHEF-gltA) với sự khuếch đại gene gltA (mã hóa enzyme citrate synthase cần cho sự chuyển đổi của acetyl-CoA), gene ech và fcs được tách dòng từ Amycolaptosis sp Strain HR104 Từ 3 g/L axit ferulic tạo ra

1.98 g/L vanillin trong 48 giờ nuôi cấy Trong cùng nghiên cứu đó, các tác giả

chỉ ra sự xóa bỏ gene icdA mã hóa enzyme isocitrate dehydrogenease của chu

trình TCA làm tăng cường chuyển hóa acetyl-coA thành CoA khi so sánh với

toàn bộ chu trình TCA Sự sản xuất vanillin bởi chủng đột biến mới E coli BW25113 mang plasmid pTAHEF cùng với gene icdA bị xóa bỏ được tăng cường 2.6 lần Ảnh hưởng điều phối thực sự của việc khuếch đại gene gltA và

sự xóa bỏ gene icdA được quan sát với việc bổ sung nhựa XAD-2 làm giảm

tính độc của vanillin Kết quả là 5.14 g/L vanillin được thu hồi trong 24h nuôi cấy với hiệu suất chuyển đổi 86.6% [43]

Trong phạm vi điều hướng trao đổi chất của E coli cho sản xuất vanillin,

các gene chịu trách nhiệm cho sự phân hủy eugeneol và isoeugeneol đã được phân lập và tách dòng trong các vật chủ tái tổ hợp

Năm 2003, Overhage và cộng sự đề xuất một quá trình gồm hai bước cho sự

chuyển hóa sinh học từ eugeneol thành vanillin bằng hai chủng E coli điều hướng

trao đổi chất Trong bước thứ nhất, eugeneol được chuyển tới 8.6 g/L axit ferulic

trong 15 giờ bởi E.coli XL1-Blue (pSKvaomPcalAmcalB) Chủng này mang một