Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)

Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

MAI THỊ HUYỀN TRANG

PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA

FLAVONOL SYNTHASE TỪ CÂY CHÈ BẢN ĐỊA

Ở THÁI NGUYÊN (Camellia sinensis)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

MAI THỊ HUYỀN TRANG

PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA

FLAVONOL SYNTHASE TỪ CÂY CHÈ BẢN ĐỊA

Ở THÁI NGUYÊN (Camellia sinensis)

Chuyên nghành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Thị Thu Yến

THÁI NGUYÊN - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Mai Thị Huyền Trang

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thị Thu Yến

- Giảng viên, phó trưởng khoa - Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Khoa học Sự sống, cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và các cán bộ công tác tại Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn tôi trong quá trình làm đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Cử nhân Phạm Thị Hằng, TS Huỳnh Thị Thu Huệ, Phòng đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Dương Trung Dũng – Khoa Nông học – Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tác giả

Mai Thị Huyền Trang

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ CÂY CHÈ 3

1.1 Giới thiệu chung về cây chè 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây chè 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây chè 4

1.1.3 Thành phần hóa học của lá chè 6

1.1.4 Giá trị của cây chè 7

1.2 Tình hình sản xuất chè trên thế giới và Việt Nam 9

1.2.1 Tình hình sản xuất chè trên thế giới 9

1.2.2 Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam 11

1.3 Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới và ở Việt Nam 12

1.3.1 Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới 12

1.3.2 Tình hình nghiên cứu chè ở Việt Nam 13

1.4 Flavonol synthase và con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè 14

1.4.1 Polyphenol ở chè 14

1.4.2 Con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè 16

1.4.3 Flavonol synthase ở chè 17

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu nghiên cứu 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.2 Hóa chất 18

2.1.3 Thiết bị 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 19

2.2.2 Điện di RNA tổng số 20

2.2.3 Tổng hợp cDNA 20

2.2.4 Nhân gen FLS bằng kỹ thuật PCR 21

2.2.5 Tinh sạch sản phẩm PCR 23

2.2.6 Tách dòng gen FLS 24

2.2.7 Xác định trình tự gen 27

2.2.8 Xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng 28

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Tách RNA tổng số từ các mẫu chè nghiên cứu 29

3.2 Nhân gen mã hóa Flavonol synthase từ các mẫu chè nghiên cứu 31

3.3 Tạo dòng gen FLS 32

3.4 Xác định và phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

KẾT LUẬN 41

KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh

DNA Axit Deoxiribonucleic Deoxyribonucleic Acid

EST Đoạn trình tự biểu hiện Expressed Sequence Tag

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction

RNA Axit Ribonucleic Ribonucleic Acid

Rnase Enzyme phân hủy RNA Ribonuclease

Taq Vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High Performance Liquid Chromatography

FLS Flavonol synthase Flavonol synthase

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng chè trên thế giới giai đoạn

2001- 2010 9

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất, sản lượng một số nước trồng chè trên thế giới năm 2010 10

Bảng 1.3 Tình hình diện tích, năng suất, sản lượng chè ở Việt Nam trong những năm gần đây 12

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 21

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA 21

Bảng 2.3 Trình tự các đoạn oligonucleotide sử dụng nhân gen FLS 21

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR nhân gen FLS 22

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nối đoạn gen FLS với vector pJET 1.2 24

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng ghép nối giữa đoạn gen và vector 25

Bảng 2.7 Phản ứng cắt được tiến hành với thành phần 27

Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra nồng độ RNA tổng số từ các mẫu chè Trung Du 30

Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự nucleotide gen FLS của chè Trung du xanh và chè Trung du tím với trình tự đã công bố trên Genbank 38

Bảng 3.3 Sự sai khác trình tự amino acid của FLS với trình tự FLS chè Trung du xanh và Trung du tím 38

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Một số giống chè trồng tại Thái Nguyên 9

Hình 1.2 Sơ đồ con đường sinh tổng hợp các hợp chất polyphenol ở chè [26] 16

Hình 2.1 Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng nhân gen FLS 22

Hình 2.2 Sơ đồ vector tách dòng pJET 1.2 24

Hình 3.1 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số 30

Hình 3.2 Kết quả PCR nhân gen FLS từ cDNA của hai mẫu chè Trung du xanh (chè xanh) và chè Trung du tím (chè tím) 31

Hình 3.3 Hình ảnh điện di tách plasmid của mẫu chè Trung du tím 32

Hình 3.4 Hình ảnh điện di tách plasmid của mẫu chè xanh 33

Hình 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra 4 dòng plasmid 34

Hình 3.6 Kết quả phân tích trình tự gen FLS phân lập từ mẫu chè xanh và chè tím 37

Hình 3.7 So sánh trình tự amino acid suy diễn của FLS đã công bố (DQ198089.1) với FLS chè Trung du xanh (FLS CX) và chè Trung du tím (FLS CT) 40

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Chè (Camellia sinensis (L) O Kuntze) là loại cây công nghiệp lâu năm,

có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới Cây chè sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nóng ẩm, tập trung chủ yếu ở Châu Á và Châu Phi Chè là thứ nước uống tự nhiên lâu đời nhất, được tiêu thụ rộng rãi với chi phí thấp Sản phẩm từ cây chè đang được sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới dưới nhiều công dụng khác nhau nhưng phổ biến nhất vẫn là đồ uống Uống chè chống được lạnh, khắc phục được sự mệt mỏi của cơ bắp và hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh mẫn sảng khoái, hưng phấn trong những thời gian lao động căng thẳng cả về trí óc và chân tay Lá chè có khả năng chữa được một số bệnh đường ruột như kiết lị, tiêu chảy (do chứa tamin), lợi tiểu (do chứa theofilin, theobromin), chống lão hóa Hơn nữa, còn kích thích tiêu hoá mỡ, chống béo phì, chống sâu răng, hôi miệng, phòng ngừa ung thư (do chứa catesin), phòng ngừa bệnh tăng huyết

áp, tiểu đường và ngăn ngừa cholesteron tăng cao… Trong chè còn chứa nhiều loại vitamin như C, B2, PP, K, E, F… và những amino acid cần thiết cho cơ thể Ngoài ra, chè còn có khả năng bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím, chè cũng được cho là ức chế sự xâm nhiễm và sinh sản của HIV Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức khỏe được liệt kê ở trên đã được chứng minh là do các hợp chất polyphenol có trong chè

Thành phần hóa học chính trong chất rắn chiết xuất từ chè xanh là polyphenol, thành phần các chất hóa học trong chè đen giống với chè xanh Tuy nhiên, hàm lượng của một số hợp chất polyphenol được thay đổi do quá trình oxi hóa Hàm lượng polyphenol quyết định đến màu sắc, độ chát của nước chè và góp phần tạo hương vị của chè Có rất nhiều các hợp chất polyphenol được tìm thấy ở chè Tuy nhiên, tùy vào loại sản phẩm chè mà

thành phần hóa học của polyphenol khác nhau, các polyphenol phức tạp được tạo ra trong quá trình sản xuất từ sự trùng hợp của các polyphenol đơn giản Bằng kỹ thuật HPLC đã xác định nhanh chóng một số polyphenol quan trọng

ở chè bao gồm catechin, f1avonols, glycosides flavonol và theaflavins…

Ở Việt Nam, cây chè còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội như: giải quyết công ăn việc làm, đem lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân, thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa và hiện đại hóa nông thôn Hiện nay, hoạt tính sinh học và cơ chế tổng hợp polyphenol ở mức độ phân tử được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu, đặc biệt là các gen thực hiện chức năng tổng hợp polyphenol Trong đó, Flavonol synthase là enzyme quan trọng trong cơ chế tổng hợp polyphenol Ở chè Việt Nam, gen mã hóa Flavonol synthase vẫn chưa được phân lập Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến

hành thực hiện đề tài: “Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tạo dòng, xác định và phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase

từ cây chè bản địa Thái Nguyên

3 Nội dung nghiên cứu

+ Tách chiết RNA tổng số từ lá chè của 1 số mẫu nghiên cứu

+ Nhân gen mã hóa Flavonol synthase bằng kỹ thuật PCR và tạo dòng gen + Xác định và phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CHÈ

1.1 Giới thiệu chung về cây chè

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây chè

Nguồn gốc cây chè là vấn đề phức tạp, cho đến nay có nhiều quan điểm khác nhau về nguồn gốc cây chè, dựa trên những cơ sơ về lịch sử, khảo cổ học và thực vật học Một số quan điểm được nhiều nhà khoa học công nhận nhất là:

+ Cây chè có nguồn gốc ở Vân Nam Trung Quốc:

Nhiều công trình nghiên cứu, khảo sát trước đây cho rằng nguồn gốc của cây chè là ở Vân Nam – Trung Quốc, nơi có khí hậu ẩm ướt và ấm Theo các tài liệu Trung Quốc thì cách đây trên 4000 năm, người Trung Quốc đã biết dùng chè làm dược liệu và sau đó là để uống [35]

Theo Daraselia Gruzia (1989) thì các nhà khoa học Trung Quốc như: Schenpen, Jaiding, …đã giải thích cây chè mẹ ở Trung Quốc: Tỉnh Vân Nam

là nơi bắt đầu hàng loạt các con sông lớn đổ về các con sông ở Việt Nam, Lào, Campuchia, Mianma Đầu tiên cây chè mọc ở Vân Nam, sau đó hạt chè

di chuyển theo đường nước đến các nước nói trên và sau đó lan dần ra các nơi khác, dọc theo cao nguyên Tây Tạng [7], [11]

+ Cây chè có nguồn gốc ở vùng Atxam (Ấn Độ):

Năm 1823, Bruce đã phát hiện được cây chè dại lá to ở vùng Atxam (Ấn Độ), từ đó các học giả người Anh cho rằng: Nguyên sản của cây chè là ở vùng Atxam chứ không phải ở Vân Nam – Trung Quốc [7]

+ Cây chè có nguồn gốc ở Việt Nam:

Những công trình nghiên cứu của Djemukhatze (1961 – 1976) về phức catechin của lá chè từ các nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần các chất

catechin giữa các loại chè được trồng và chè mọc hoang dại đã nêu lên luận điểm về sự tiến hóa sinh hóa của cây chè, trên cơ sở đó xác minh nguồn gốc của cây chè Djemukhatze đã kết luận rằng những cây chè mọc hoang dại từ cổ xưa, tổng hợp chủ yếu là (-) - epicatechin galat, ở chúng có khả năng tổng hợp (-) - epigalocatechin và các galat của nó để tạo (+) galocatechin chậm hơn Nghiên cứu các cây chè dại ở Việt Nam cho thấy chủ yếu là tổng hợp (-) – epicatechin và (-) – epicatechin galat (chiếm 70 % tổng các loại catechin) Khi

di thực các cây chè dại này lên phía Bắc với các điều kiện khí hậu khắc nghiệt hơn, chúng sẽ thích hợp dần với các điều kiện sinh thái bằng cách có thành phần catechin phức tạp hơn, cùng với tạo thành (-) epigalocatechin và các galat của nó Điều đó có nghĩa là trao đổi chất ở đây hướng về phía tăng cường quá trình hidroxil hóa và galil hóa Từ những biến đổi hóa sinh này của các cây chè dại và cây chè được trồng trọt, chăm sóc cho phép đi tới một kết luận mới là

“Nguồn gốc cây chè chính là ở Việt Nam” Từ đó có sơ đồ tiến hóa cây chè trên

thế giới: Camellia → Chè Việt Nam → Chè Vân Nam lá to → Chè Trung Quốc → Chè Assam (Ấn Độ) [7], [11] Tuy có sự khác nhau nhưng quan điểm nêu trên đều có sự thống nhất rằng: Cây chè có nguồn gốc từ Châu Á, nơi có điều kiện khí hậu nóng, ẩm

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây chè

Đặc điểm hình thái

Thân: Thẳng và tròn, phân nhánh liên tục thành một hệ thống cành và

chồi Trên thân có mấu chia thành nhiều lóng

Cành: Do mầm dinh dưỡng biến đổi thành Trên cành chia ra làm nhiều

đốt, chiều dài đốt cành biến đổi từ 1 - 10 cm tùy theo giống và điều kiện sinh trưởng Tùy theo lứa tuổi mà màu sắc cành chè biến đổi từ màu xanh thẫm, xanh nhạt, màu đỏ, màu nâu và khi cành già có màu xám

Chồi: Mọc ra từ nách lá, chia theo sự biệt hóa của chồi có chồi dinh

dưỡng mọc ra lá và chồi sinh thực mọc ra nụ, hoa, quả Chia theo vị trí trên cành có: Chồi ngọn (đỉnh), chồi nách, chồi ngủ (trong cành)

Lá: Lá chè là loại lá hình đơn nguyên, có hệ gân lá rất rõ, rìa lá có răng

cưa, chiều dài từ 4 - 15 cm, rộng từ 2 - 5 cm Mặt phiến lá có thể nhẵn, lồi lõm, láng bóng Hệ gân lá hình mạng lông chim Lá chè có thể có hình thuôn, mũi mác, ô van, trứng gà, gần tròn Gốc lá nhọn, tròn đến tù; chóp lá nhọn tù

Lá chè thường thay đổi về hình dạng, màu sắc và kích thước tùy theo giống, điều kiện tự nhiên và điều kiện canh tác Các độ tuổi khác nhau của lá chè tạo

ra các các sản phẩm chè có chất lượng khác nhau do thành phần hóa học trong các lá này khác nhau

Hoa: Hoa chè là loại hoa lưỡng tính, trong hoa có 5 - 8 cánh màu trắng,

có khi lại hơi phớt hồng Tràng có 5 - 9 cánh màu trắng hay phớt hồng, bộ nhị đực trung bình có 200 - 300 cái; bao phấn có hai nửa bao, chia 4 túi phấn, hạt phấn hình tam giác màu vàng nhạt (khi chín màu hoàng kim) Bầu nhị cái có

3 - 4 ô, chứa 3 - 4 noãn, ngoài phủ lớp lông tơ, núm nhị cái chẻ ba Ở gốc bầu nhụy có tuyến mật làm thành một vòng tròn gọi là đĩa

Quả: Quả chè là một loại quả nang có từ 1- 4 hạt Quả chè có dạng hình

tròn, tam giác, vuông tùy theo số hạt Khi còn non quả chè có màu xanh, khi chín chuyển sang màu xanh thẫm hoặc nâu Khi quả chín vỏ nứt ra giải phóng các hạt chè Kích thước của hạt phụ thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác Hạt chè có khối lượng từ 0,6 - 2g thường từ 1- 1,6g

Hạt: Hình cầu, bán cầu, tam giác tùy giống chè; vỏ sành thường màu

nâu, cứng, bên trong là lớp vỏ mỏng

Hệ rễ: Gồm rễ cọc (trụ), rễ dẫn (hay rễ nhánh, rễ bên) màu nâu hay nâu

đỏ và rễ hút hay rễ hấp thụ màu vàng ngà

Đặc tính sinh lý, sinh thái của cây chè

Nhiệt độ không khí thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của chè là

22 - 28oC, độ ẩm không khí tương đối thích hợp là 80 - 85 % Hàm lượng nước cần thiết cho cây chè biến động tùy từng giống chè Loại đất thích hợp cho trồng chè dày 60 - 100 cm; mực nước ngầm dưới 100 cm; độ chua pH: 4,5 - 5,5; tỷ lệ mùn 3 - 4 %

Sinh trưởng và phát triển của cây chè

Sự phát triển của cây chè chia làm hai chu kỳ: Chu kì phát triển lớn gồm suốt đời sống cây chè từ khi hạt nảy mầm đến khi cây chết và chu kì phát triển nhỏ bao gồm các giai đoạn sinh trưởng, phát triển lặp lại nhiều lần trong một năm

1.1.3 Thành phần hóa học của lá chè

Cây chè được trồng chủ yếu để lấy búp và lá, do đó thành phần hóa học của lá chè có liên quan chặt chẽ với quy trình sản xuất và chế biến chè thành phẩm, gồm chủ yếu là nước, các hợp chất vô cơ và hữu cơ

Nước là thành phần quan trọng và chủ yếu trong búp chè, chiếm 75 - 80

% khối lượng lá chè, hàm lượng phụ thuộc vào giống chè, thời vụ và độ non già của lá chè Nước trong nguyên liệu chè tham gia trực tiếp vào nhiều phản ứng thủy phân, oxi hóa khử, liên quan trực tiếp đến các quá trình hóa sinh trong búp chè và có ảnh hưởng đến sự hoạt động của các enzyme.Trong chế biến chè, nước có vai trò quan trọng trong các quá trình biến đổi, tạo nên mùi

vị và ngoại hình của búp chè, nó có liên quan trực tiếp đến chất lượng chè nguyên liệu và chất lượng chè thành phẩm

Chất khô chiếm 18 - 25 % khối lượng lá chè, gồm có các polyphenol,

pectin, chất xơ (xenlulo), protein, amino acid, các alcoloit (cafein, theofilin, theobromin), các enzyme (enzyme oxi hóa và enzyme thủy phân) và chất tro

Các hợp chất polyphenol chiếm 28 - 37 % chất khô, nó quyết định tính chất, chất lượng chè tươi và sản phẩm Polyphenol tạo màu, mùi, vị cho chè,

có vị chát đắng dưới tác dụng của enzyme thủy phân có trong nước bọt Hợp chất polyphenol trong chè là thành phần quan trọng được xúc tác bởi enzyme polyphenol oxidase có trong lá chè, nó có tính chất quyết định đến màu sắc nước pha, hương thơm và vị chát của chè (các polyphenol chứa 70% là các dạng catechin) [33]

Hợp chất alkaloid: trong chè có nhiều loại nhưng nhiều nhất vẫn là loại

cafein Hàm lượng cafein trong chè chiếm từ 3 - 5% chất khô Hàm lượng cafein trong chè thay đổi phụ thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác, mùa vụ thu hái và thay đổi theo bộ phận của cây

Protein và amino acid: là hợp chất phức tạp có chứa N, phân bố không

đều ở phần búp chè và thay đổi tùy theo giống và thời vụ, điều kiện canh tác

và các yếu tố khác Protein có thể kết hợp trực tiếp với tanin, polyphenol tạo nên những phẩm chất chè Thái Nguyên đen Do đặc điểm của của việc chế biến chè xanh là dệt men ngay từ đầu, nên hàm hượng tanin bị thay đổi và còn quá cao làm cho chè có vị đắng Protein kết hợp với một phần tanin làm cho

có vị chát và đắng giảm đi Vì thế trong một trừng mực nào đó, protein có lợi cho phẩm chất chè xanh

Ngoài ra, trong chè còn có các amino acid, gluxit và pectin, dầu thơm, các loại vitamin trong chè, các enzyme, chất tro…

1.1.4 Giá trị của cây chè

Cây chè là loại cây công nghiệp lâu năm, mau cho sản phẩm, cho hiệu quả kinh tế cao, có đời sống kinh tế lâu dài Chè trồng một lần, có thể thu hoạch 30 - 40 năm hoặc lâu hơn nữa Chè được dùng làm nước uống từ thời

xa xưa, đến nay đã trở thành một thức uống lý tưởng được nhân dân trên thế giới ưa dùng Có giá trị về nhiều mặt như: Thực phẩm, dược liệu, kinh tế xã hội, văn hóa…

Giá trị về mặt thực phẩm: Trong chè có các thành phần hóa học giàu

chất dinh dưỡng, có tác dụng tốt đối với cơ thể con người như hỗn hợp tanin chè có khả năng giải khát, chữa một số bệnh đường ruột (tả lỵ, thương hàn), các loại protein, vitamin, muối khoáng… Cafein và một số alkanoit khác là chất có thể kích thích hệ thần kinh trung ương, vỏ cầu đại não, giúp tăng

cường sự hoạt động của cơ thể, giảm mệt nhọc [34]

Giá trị y học: Nước chè tươi còn giảm được các quá trình viêm như

viêm khớp, viêm gan mãn tính, tăng cường tính đàn hồi của thành mạch máu Uống chè giảm nguy cơ tim mạch, chống lão hóa, chống nhiễm độc Mới đây nhất, các nhà khoa học còn phát hiện ra chè còn có tác dụng chống khả năng gây ung thư của các chất phóng xạ Người ta đã trích ly các chất trong chè để điều chế các thuốc trợ tim, cầm máu, lợi tiểu… Những giá trị tiềm ẩn của cây

chè vẫn còn đang được quan tâm nghiên cứu [34]

Giá trị về mặt kinh tế xã hội: Cây chè giữ vai trò quan trọng trong cơ

cấu cây trồng nông nghiệp, sản phẩm chè là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của ngành nông nghiệp Việt Nam Sản xuất chè đã góp phần tạo công ăn việc làm, xóa đói giảm nghèo, tạo nguồn thu nhập ổn định cho người dân và thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa, hiện đại hóa nông thôn, nhất là vùng Trung du

và miền núi [34]

Ngoài ra, trồng chè còn giúp phủ xanh đất trống đồi trọc, chống sói mòn đất, bảo vệ môi trường…

Giá trị về mặt văn hóa: Lá chè được sử dụng không chỉ để chế biến

thức uống phục vụ nhu cầu của con người, mà từ lâu chè thành phẩm đã trở

thành nét văn hóa đặc trưng của nhiều quốc gia Uống chè là nét văn hóa lâu

đời của người Việt Nam, mang một giá trị thiêng liêng, cao quý trong đời

sống tinh thần của con người Thưởng thức chè là một thú vui tao nhã, tạo

được cảm hứng trong văn thơ, hội họa… Ở Việt Nam chè không thể thiếu

trong lễ nghi giao tiếp, giáo dục, cưới xin, ma chay, hội hè

Hình 1.1 Một số giống chè trồng tại Thái Nguyên

1.2 Tình hình sản xuất chè trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình sản xuất chè trên thế giới

Cây chè sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện nóng ẩm, tập trung chủ yếu ở Châu Á và Châu Phi, tuy nhiên ngày nay chè được trồng phổ biến ở

58 quốc gia với quy mô khác nhau, phân bố rộng khắp 5 Châu Nhu cầu về mặt hàng chè thành phẩm cao cấp ngày càng tăng vì vậy sản xuất chè trên thế giới tăng nhanh cả về diện tích, năng suất và sản lượng

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng chè trên thế giới giai đoạn 2001- 2010 Năm Diện tích (ha) Năng suất (Tạ khô/ ha) Sản lượng (Tấn khô)

Từ bảng 1.1 trên ta thấy: diện tích, năng suất, sản lượng chè trên thế giới đạt 10 năm qua tăng đều, đến năm 2010 diện tích chè trên thế giới đã đạt 3.123.561 ha, năng suất đạt 14,464 tạ khô/ha, sản lượng đạt 4.242.280 tấn chè búp khô

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất, sản lượng một số nước trồng chè

trên thế giới năm 2010

(ha)

Năng suất (tạ khô/ha)

Sản lượng (tấn khô)

Xuất khẩu năm 2009 (tấn)

Độ, Srilanca, Kênia và Việt Nam, trong đó:

Trung quốc là quốc gia đứng đầu thế giới về diện tích đạt 1.419.530 ha, chiếm 45,45% diện tích chè thế giới, tuy năng suất chè của Trung Quốc không cao, chỉ đạt 10.338 tạ khô/ha, nhưng do diện tích cao nên sản lượng chè của Trung Quốc vẫn đứng đầu thế giới đạt 1.467.467 tấn, chiếm 32,48 % sản lượng chè thế giới

Ấn Độ đứng thứ 2 về diện tích chè, đạt 583.000 ha, chiếm 17,22 % diện tích thế giới, năng suất đạt 17.001 tạ/ha, sản lượng đứng thứ 2 sau Trung Quốc, đạt 991.180 tấn, chiếm 21,94 % sản lượng chè thế giới

Srilanca đứng thứ 3 trên thế giới về diện tích 218.300 ha, sản lượng đạt 282.300 tấn

Kênia là nước đứng thứ 4 về diện tích chè đạt 171.900 tấn, nhưng lại là nước có năng suất chè cao nhất, chiếm 8,83 % sản lượng chè toàn thế giới

Việt Nam có diện tích trồng chè đứng thứ 5 trên thế giới nhưng về năng suất lại đứng thứ 2 (17.532 tạ khô/ha) chỉ sau Kênia Tuy nhiên về xuất khẩu, nước ta chỉ đạt 82.416 tấn (đứng thứ 8)

1.2.2 Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam

Tại Việt Nam, cây chè và sản phẩm chè đã được người dân sản xuất, chế biến và sử dụng từ rất lâu Theo Nguyễn Ngọc Kính, lịch sử của ngành sản xuất chè Việt Nam có thể chia làm 3 giai đoạn:

Giai đoạn từ 1890 đến 1945: giai đoạn nền móng, sơ khai của ngành sản xuất chè, những đồn điền đầu tiên được thiết lập Năm 1938 diện tích trồng chè là 13 nghìn ha, sản lượng đạt 6100 tấn chè khô

Giai đoạn 1945 đến 1954: do ảnh hưởng của chiến tranh, ngành sản xuất chè suy giảm rõ rệt, tổng sản lượng chè khô năm 1946 chỉ đạt 300 tấn

Giai đoạn từ năm 1954 đến nay: giai đoạn phát triển không ngừng của ngành chè, không chỉ đáp ứng nhu cầu nội địa mà còn hướng tới xuất khẩu Năm 2013 tổng sản lượng chè xuất khẩu của cả nước đạt 145 nghìn tấn

Hiện nay chè được trồng ở trên 35 tỉnh thành trong cả nước, tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc (cả về diện tích và sản lượng) Với lợi thế về giống, đất đai và nguồn lao động, chè được xác định là ngành kinh tế chủ đạo các tỉnh trung du và miền núi nước ta

Phát triển cây chè ở nước ta là một trong 10 chương trình trọng điểm về phát triển nông nghiệp nông thôn Đến nay, cây chè được xác định là cây có giá trị kinh tế cao, thực sự là cây trồng mũi nhọn, có tầm quan trọng trong chiến lược phát triển kinh tế, xã hội của vùng trung du và miền núi phía Bắc

và Tây Nguyên Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam trong những năm gần đây được thể hiện ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Tình hình diện tích, năng suất, sản lượng chè ở Việt

Nam trong những năm gần đây

Năm Diện tích

(1000 ha)

Năng suất (Tạ khô/ha)

Sản lượng (1000 tấn)

Xuất khẩu (1000 tấn)

34 tỉnh thành phố sản xuất chè với tổng diện tích là 120.000 ha, tổng sản phẩm chè chế biến hàng năm trên 120 nghìn tấn Nhìn chung, diện tích trồng chè, sản lượng và mức suất khẩu chè nước ta đều tăng đáng kể qua các năm Điều đó nói lên phần nào triển vọng lớn, mở ra nhiều cơ hội phát triển ngành chè Việt Nam

1.3 Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới

Trung Quốc là quốc gia sản xuất chè hàng đầu thế giới, các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu và sử dụng giống chè tốt trong sản xuất từ rất sớm Ngoài những giống chè nổi tiếng từ lâu đời, hiện nay Trung Quốc có nhiều giống chè cho năng suất cao, chất lượng tốt để chế biến cả chè xanh và

chè đen như: Phúc Vân Tiên, Hoa Nhật Kim, Hùng Đỉnh Bạch (Phúc Kiến), Phú Thọ 10

Ấn Độ là quốc gia đứng đầu thế giới về sản lượng chè do rất quan tâm nghiên cứu triển khai các giống tốt vào sản xuất

Công tác chọn dòng chè, kết hợp chọn dòng có sản lượng cao và có khả năng chống hạn, chống bệnh rất được chú ý ở Srilanca.Nhờ đó đã tạo được các giống nổi tiếng như TRI777, TRI2043 Trong những năm 1950, 1960 Srilanca đã chọn ra các dòng chè có triển vọng như: TRI14, DT, DN, DP và DV

Nhật Bản đặc biệt quan tâm chú ý đến nghiên cứu chọn dòng, nhiều giống chè mới và cho năng suất cao đã được đưa vào sản xuất Trong đó có giống Yabukita được trồng phổ biến nhất chiếm tới 70% diện tích chè ở Nhật Bản

Ngày nay, để có được các giống chè cho năng suất cao thì việc áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật vào quá trình sản xuất chè luôn được chú trọng đầu tư Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng bắt đầu tập trung nghiên cứu sâu hơn về cây chè ở mức độ phân tử Kích thước genome của chè lớn, khoảng 4

Gb Do thiếu sự hiểu biết về nuôi cấy mô cũng như quá trình dịch mã xảy ra ở chè nên rất ít các thông tin về trình tự genome được biết đến Đến năm 2010, chỉ có 819 trình tự nucleotide, 12.664 đoạn trình tự biểu hiện (Expressed Sequence Tags - EST), 1 giả thuyết về trình tự genome và 478 protein từ chè được công bố trên ngân hàng Genbank

1.3.2 Tình hình nghiên cứu chè ở Việt Nam

Ở nước ta, cây chè đang được coi là cây trồng chủ lực góp phần xóa đói giảm nghèo cho vùng sâu, vùng xa, vùng núi cao Qua nhập nội, lai tạo, trong những năm gần đây nước đã tạo được nhiều giống chè mới đem lại hiệu quả kinh tế cao, trong đó có các giống chè Shan Ở Việt Nam, chè Shan được quan tâm nghiên cứu từ rất lâu, đã khẳng định được vai trò của sự phát triển của cây chè Shan đối với phát triển kinh tế xã hội vùng núi phía Bắc Việt Nam

Năm 1923 khi nghiên cứu tập đoàn giống chè nhập nội, Dupasquier cho rằng hai giống chè: Manipur và Assamica thích hợp và có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt ở Việt Nam Năm 1931, trạm nghiên cứu chè Bảo Lộc đã tiếp nhận một số giống chè Shan ở Phú Hộ và chọn được hai giống chè tốt là

TB11 và TB14

Qua nhiều năm nghiên cứu, Viện nghiên cứu chè đã ứng dụng thống kê sinh học qua phân tích tương quan dựa vào đặc trưng hình thái kết hợp với xem xét các đặc điểm phát triển bộ rễ, sinh trưởng sinh thực, màu sắc lá, sâu bệnh,khả năng giâm cành… để chọn nhanh các loại chè có triển vọng khi cây chè 2 - 3 tuổi Tại trung tâm nghiên cứu phát triển chè – Viện KHKT Nông lâm nghiệp miền núi phía Bắc, bằng phương pháp gây đột biến bằng bức xạ

đã chọn được một số cá thế chè sinh trưởng và phát triển tốt Ngoài ra, Viện còn sử dụng Consixin xử lý trên mầm chè giống PH1 trong thời gian 24 – 48h với nồng độ 0,2% cũng đã thu được kết quả bước đầu Ngoài ra, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nhân vô tính từ rất sớm như ghép, giâm cành và đã thu được những kết quả tốt [2]

Hiện nay, ở Việt Nam có rất nhiều công trình nghiên cứu về cây chè được

đề xuất, triển khai có hiệu quả, góp phần không nhỏ vào việc nâng cao sản lượng

và chất lượng chè thành phẩm Giúp cho ngành chế biến và sản xuất chè ở Việt Nam ngày càng có thương hiệu, đáp ứng được yêu cầu của thị trường

1.4 Flavonol synthase và con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè

1.4.1 Polyphenol ở chè

Theo thống kê của Harbowy (1997), thành phần hóa học chính trong chất rắn chiết xuất từ chè xanh là polyphenol, chiếm 30-40% trọng lượng, tiếp theo là các hợp chất chứa N có khoảng 15% bao gồm caffein (khoảng 2-5%), protein (6%) và các amino acid (5%) Điều đặc biệt là ngoài các amino acid phổ biến, theanine là amino acid chỉ có ở trong chè chiếm đến 3% trọng lượng Thành phần hydratcacbon ở chè có khoảng 11% bao gồm các polysaccharide, pectin và các gốc đường tự do Ở chè có khoảng 3-4% lipit,

tuy nhiên khả năng hòa tan của lipit vào dịch chiết xuất là thấp hơn Ngoài ra, trong chè còn có axit hữu cơ, các vitamin, muối khoáng, các sắc tố như chlorophyll, caroten… đặc biệt là tinh dầu và các hợp chất dễ bay hơi liên quan đến tạo hương vị trong chế biến chè chỉ chiếm một phần rất nhỏ Thành phần các chất hóa học trong chè đen giống với chè xanh Tuy nhiên, hàm lượng của một số hợp chất polyphenol được thay đổi do quá trình oxi hóa, thành phần chính của polyphenol trong lá chè bao gồm Flavan-3-ols (catechin); flavonol và glycosides; anthocyanins, leucoanthocyanidin

Hàm lượng polyphenol quyết định đến màu sắc, độ chát của nước chè

và góp phần tạo hương vị của chè Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức khỏe của chè đã được chứng minh là do các hợp chất polyphenol Vai trò của polyphenol là chất chống oxy hóa được biết đến và đang được nghiên cứu như các tác nhân có thể làm giảm yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh ung thư

và bệnh tim Có rất nhiều các hợp chất polyphenol được tìm thấy ở chè Tuy nhiên, tùy vào loại sản phẩm chè mà thành phần hóa học của polyphenol khác nhau, các polyphenol phức tạp được tạo ra trong quá trình sản xuất từ sự trùng hợp của các polyphenol đơn giản Ở chè xanh chứa cả polyphenol đơn giản và phức tạp, trong đó Flavonoid là thành phần polyphenol chủ yếu, được tổng hợp từ các polyphenol đơn giản và là đại diện cho các hợp chất chứa khoảng 15 nguyên tử C Hàm lượng catechin (30%) và flavonol (0,2-5%) là các hợp chất chính của flavonoid Các polyphenol ở chè đen cũng có các thành phần như chè xanh Ngoài ra, chè đen có polyphenol chứa khoảng 30 nguyên từ C, được tạo thành do sự trùng hợp của các polyphenol có trong chè xanh (theaflavin và thearubigin) Bằng kỹ thuật HPLC đã xác định nhanh chóng một số polyphenol quan trọng ở chè bao gồm catechin, f1avonols, glycosidesflavonol và theaflavins…[21]

1.4.2 Con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè

Việc nghiên cứu phân tích đặc tính phân tử của các gen liên quan đến các quá sinh học của chè luôn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu (Hình

1.2) Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào các gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp các hợp chất polyphenol ở chè [17], [19], [22], [25], [29], [30], [31], [32] Hàm lượng catechin (30%) và flavonol (0,2-5%) là các hợp chất chủ yếu của polyphenol Con đường sinh tổng hợp các chất này còn có tên

là con đường Flavonoid (Hình 1.3) đã được nghiên cứu ở Arabidopsis thaiana,

Petunia hybrida [21], [28] và ở chè Camellia sinenis [26]

Hình 1.2 Sơ đồ con đường sinh tổng hợp các hợp chất

polyphenol ở chè [26]

ANR (anthocyanidin reductase); ANS (anthocyanin synthase); 4CL coumarate : CoA ligase); C4H (cinnamate 4-hydroxylase); CHI (chalcone isomerase); CHS (chalcone synthase); DFR (dihydroflavonol reductase); F3H (flavanone 3β-hydroxylase); F3′H (flavonoid 3′-hydroxylase); F3′5′H (flavonoid 3′5′-hydroxylase); FLS (flavonol synthase); LAR (leuacoanthocyanidin reductase); PAL (phenylalanine ammonialyase); UFGT (UDP-glucoseflavonoid 3-O-glucosyl transferase)

(4-Nhiều gen mã hóa cho các enzyme tham gia vào con đường flavonoid

đã được nghiên cứu tạo dòng và xác định trình tự ở chè như FLS [24]);

CsPAL, CsC4H, CsF3H [30]; Cs4CL [27]; CsCHI, CsF3H, CsANS và CsANR [26] …Tuy nhiên, mối liên quan giữa sự biểu hiện của các gen này với hàm lượng các hợp chất polyphenol vẫn chưa được đề cập nhiều

1.4.3 Flavonol synthase ở chè

Các polyphenol ở chè đã được nghiên cứu rộng rãi và được chia thành nhiều lớp: flavonols, anthocyanidins, catechins, và flavones (Hình 1.2)

Flavonol có rất nhiều trong chè (Camellia sinensis), thành phần của flavonols,

quercetin và kaempferol trong chè cao hơn so với trong nước ép cà chua và rượu vang đỏ Flavanone 3-hydroxylase (F3H) là enzyme có nhiều trong lá chè, có chức năng xúc tác thủy phân flavanone hình thành dihydroflavonols Các dihydroflavonols như là trung gian cho sự sinh tổng hợp các flavonol, flavan-3 ols và anthocyanidins Flavonol synthase (FLS) là dioxygenase chuyển hóa dihyroflavonols thành flavonols, enzyme này lần đầu tiên được nghiên cứu ở mùi tây, hoạt tính đầy đủ của FLS cần có sự tương tác với 2-oxoglutarate và Fe (II) [24]

Gen mã hóa cho FLS tham gia tổng hợp flavonols ở chè đã được

nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện ở E.coli [24]; Tuy nhiên, mối liên quan

giữa sự biểu hiện của gen này với hàm lượng flavonol ở chè vẫn chưa được sáng tỏ

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Lá từ giống chè Trung du xanh và Trung du tím (chè xanh và chè tím)

có chất lượng tốt trồng tại Thái Nguyên được TS Dương Trung Dũng - Khoa Nông học - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên chọn lọc và cung cấp

2.1.2 Hóa chất

- Hóa chất tách chiết RNA tổng số: Các hóa chất dùng cho tách chiết

RNA tổng số như TRI Reagent, chloroform, isoamylalcohol, 2-propanol, DEPC (Diethylpyrocarbonat), ethanol, được đặt mua của các hãng Merck, Biobasic, Sigmar

- Hóa chất điện di RNA tổng số: 5X MOPS (MOPS pH 7.0 0.2M;

EDTA pH 8.0 0.005M; CH3COONa 0.05M); RNA loading dye (Glycerol

50%; EDTA 10mM; Bromophenol Blue: 0.4%)

- Hóa chất điện di DNA: agarose; TAE; DNA loading dye

- Kit tổng hợp cDNA: First-Strand cDNA Synthesis Kit for Real – Time

- Hóa chất sử dụng trong việc chọn dòng: Clone JET for cloning PCR

Kit; tế bào vi khuẩn E.coli chủng DH10b; LB; agar; dung dịch Sol I, Sol II, Sol III; Ampicillin; enzyme giới hạn BglII

- Các hóa chất chloroform, isoamyl alcohol, Tris, acetic acid, EDTA, cồn

tuyệt đối và các hóa chất chuyên dụng khác: Hãng Merck (CHLB Đức)