Sử dụng các dòng vi khuẩn phòng trừ vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cà chua

Đây là một trong những phương pháp phòng chống có hiệu quả nhất hiện nay ở khả năng phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum, giúp cây cà chua sinh trưởng và phát triển tốt hơn, làm ch

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Cà chua là một trong số những cây rau màu quan trọng, được phân bố rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới Tuy nhiên việc gieo trồng cà chua vẫn gặp nhiều khó khăn, trở ngại Một trong những nguyên nhân làm hạn chế sự phát triển sản xuất và làm giảm năng xuất cà chua đó là sâu và bệnh hại Trong đó đáng chú ý

hơn cả là bệnh héo rũ do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra Đây là loại vi

khuẩn có khả năng gây hại trên 200 loài cây cỏ, đặc biệt gây hại nặng trên cây họ cà như cà chua, cà tím, khoai tây, thuốc lá và các cây khác họ như đậu phụng, gừng, chuối, chúng có khả năng sống rất lâu trong đất và lây lan rất nhanh, di chuyển từ nơi nay sang nơi khác Cây chết hàng loạt khi lá vẫn còn xanh giống như

bị cắt ngang gốc Ước tính thiệt hại cho sản xuất cây trồng hàng năm do vi khuẩn

Ralstonia solanacearum gây ra là 15-95%(Emil Q.Javier, 1994)

Để khắc phục tình trạng này, các biện pháp phòng trừ tác nhân gây bệnh bằng phương pháp sinh học được nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu Đây là một trong những phương pháp phòng chống có hiệu quả nhất hiện nay ở khả năng

phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum, giúp cây cà chua sinh trưởng và phát

triển tốt hơn, làm cho tác nhân gây bệnh không kháng thuốc, an toàn với môi trường sinh thái cho kết quả nhanh và chính xác rất phù hợp với xu hướng nông nghiệp an toàn hiện nay và đang được rất nhiều nước trên thế giới áp dụng

Việc nghiên cứu các loại vi khuẩn đối kháng như : Pseudomonas fluorescens,

Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, để chống lại vi khuẩn Ralstonia solanacearum là một vấn đề hết sức cần thiết hiện nay Vì vậy, nghiên cứu về tính

đa dạng của các cá thể trong quần thể vi khuẩn gây bệnh và sự lưu hành của chúng

ở các vùng sản xuất là rất cần thiết, nó làm cơ sở khoa học cho các giải pháp phòng chống và chọn tạo giống kháng bệnh sau này

Xuất phát từ thực tiễn trên và để đánh giá khả năng phòng trừ của các dòng

vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Chúng tôi thực hiện đề tài:

“Sử dụng các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà chua”

1.2 Mục đích – yêu cầu

Đánh giá khả năng phòng trừ của các dòng vi khuẩn Pseudomonas

fluorescens với các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên

cây cà chua

1.3 Giới hạn đề tài

Đề tài được thực hiện trong tháng có nhiều mưa, đất trồng bị nhiễm nhiều loại bệnh Cây cà chua là loại cây dễ mẫn cảm với nhiều loại bệnh

1.4 Đối tượng nghiên cứu

Các dòng vi khuẩn đối kháng thuộc nhóm Pseudomonas fluorescens Dòng vi khuẩn gây bệnh Ralstonia solanacearum

Cây trồng: cà chua

1.5 Nội dung nghiên cứu

Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn Pseudomonas

fluorescens với các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên đĩa petri trong

phòng thí nghiệm

Đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà chua trong điều kiện nhà

lưới

Đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà chua ngoài đồng ruộng

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là vi khuẩn gây bệnh mạch dẫn gây hại

trên 200 loài cây cỏ Halted đã nghiên cứu bệnh này vào năm 1892, năm 1896

E.F.Smith nghiên cứu, mô tả, định tên Pseudomonas solanacearum Những năm sau

đó, bệnh héo rũ được nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu, nghiên cứu một cách toàn diện như Kelman 1953, Hayward 1964, Cook and Baker 1983, Yabuuchi 1992, 1995(Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998)

Bệnh héo rũ do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua có tên là:

Southern wilt (theo cách gọi của người Hoa Kỳ), Bacterial wilt (theo cách gọi của người Anh), ở Việt Nam gọi là bệnh héo xanh, héo rũ

2.2 Mức độ phổ biến và gây hại của Ralstonia solanacearum

Ngày nay, Ralstonia solanacearum được ghi nhận là vi khuẩn gây hại ở hầu

hết các châu lục, phổ biến là ở các nước như Angola, Trung quốc, Bangladesh, Aán Độ, Indonesia, Srilanka, Đông Aán Ethiopia, Lybia, Kenya, Malaysia, Nigieria, Philippin, Nam Phi, Đài Loan, Thái Lan, Uganda, Hoa Kỳ, Việt Nam, Zambia (Subrhmagam, 1994)

Ở Việt Nam, bệnh héo xanh cà chua do vi khuẩn Ralstonia solanacearum

gây ra là một trong những bệnh gây hại rất phổ biến làm chết héo hàng loạt cây cà chua trên đồng ruộng, gây tổn thất lớn ở các vùng trồng cà chua trong nước, nhất là

ở vùng đồng bằng sông Hồng Bệnh được ghi nhận trên cà chua, khoai tây, cà tím, thuốc lá, đậu phụng, gừng, ớt Qua một số kết quả nghiên cứu công bố gần đây cho

thấy ở nước ta vi khuẩn gây bệnh héo xanh thuộc division Châu Á (Lê Lương Tề, 2002), race1, biovar 3 và 4 (Nguyễn Thị Yến, 2002)

Ở Hoa Kỳ, vi khuẩn Ralstonia solanacearum được phát hiện trên khoai tây,

thuốc lá ở Florida được xác định bằng phương pháp PCR là biovar 1 (Prakash, 2002)

Ở Indonesia, bệnh được phát hiện đầu tiên trên đậu phụng vào năm 1905, ở vung Cirebon Về sau bệnh được ghi nhận trên nhiều loại cây trồng khác như cà chua, khoai tây, thuốc lá, ớt, chuối Kết quả nghiên cứu bệnh héo xanh trên đậu phụng giữa AARD và ACIAR vào năm 1985 cho rằng đây là bệnh chính trên đậu phụng ở Indonesia, sự thiệt hại do bệnh gây ra có thể từ 15-90% năng suất (Wright, 1991)

Ở Đài Loan bệnh được gây hại trên cà chua, khoai tây, thuốc lá, ớt, cà tím, đậu phụng, dâu tây, tía tô, thầu dầu, mè, củ cải, rau dền và một số cây trồng khác Trên nhiều loại cây trồng sự thiệt hại do bệnh gây ra có thể từ 5-100% năng suất

Các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum chủ yếu thuộc race1 (Yung-An Lee,

2001)

Ở Ai Cập, bệnh héo xanh vi khuẩn do Ralstonia solanacearum được ghi nhận

là gây hại nặng nhất trên cà chua và a ti sô trong những năm gần đây, sự thiệt hại gây ra trên a ti sô từ 5-20% năng suất (Aly, 2000)

2.3 Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum có dạng hình gậy, hai đầu hơi tròn, có một lông roi ở một đầu, kích thướt 0,5-1,5µ, nhuộm gram âm là loài vi sinh vật tồn tại ở

trong đất thường xuyên gây ra các bệnh chết héo (héo rũ, héo xanh) trên nhiều loại cây trồng như lạc, khoai tây, cà chua, ớt, thuốc lá phổ biến rộng ở hầu hết khắp các vùng, gây tác hại lớn cho sản xuất Chúng lan truyền theo nước tưới, xâm nhập vào

cây qua các vết thương và di chuyển vào trong bó mạch Bệnh thường xảy ra vào lúc cây đang tăng trưởng

Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ tương đối cao, đất ẩm, xâm nhập qua vết thương, sinh sản ở các bó mạch, kí chủ và di chuyển ở các bó mạch từ thân đến lá, sinh độc tố làm cây héo, chết

Phá bó mạch làm tắt ngẽn sự vận chuyển nước và các chất dinh dưỡng, bệnh hại nhiều trên đất cát pha, đất thịt bệnh nhẹ hơn Trên những ruộng trồng luân canh với cây lúa nước bệnh nhẹ

Vi khuẩn thích hợp ở nhiệt độ 30-370C, nhiệt độ tối thiểu là 100C, tối đa

410C, nhiệt độ gây chết là 520C, mẫn cảm được môi trường khô

2.4 Sự phân chia vi khuẩn Ralstonia solanacearum theo đặc tính gây hại

2.4.1 Race

Dựa trên phạm vi ký chủ được chia làm 4 race (Martin và French, 1997) + Race 1: Tấn công trên nhiều vùng địa lý, loại cây trồng khác nhau Đặc biệt trên các cây như khoai tây, cà chua, cà tím, ớt, thuốc lá, đậu phụng Vi khuẩn

Ralstonia solanacearum thuộc race 1 thường gây hại ở những vùng có nhiệt độ ấm

áp và gây hại nặng ở vùng nhiệt đới

+ Race 2: Chủ yếu tấn công trên các cây thuộc họ chuối như chuối tam bội, chuối lá, chuối sợi

+ Race 3: Chủ yếu tấn công trên khoai tây Khác với race 1, race 3 thường gây hại ở những vùng có nhiệt độ thấp hơn và những vùng có vĩ độ cao

+ Race 4: Được ghi nhận tấn công trên cây dâu tằm (mulberry) ở Trung Quốc

Sự phân chia các race thường rất phức tạp do phụ thuộc vào thầnh phần cây ký chủ và phạm vi phân bố của chúng Theo Martin và French (1997), race 1 lưu

tồn nhiều năm trong đất, ngược lại race 3 thường có xu hướng giảm sau vài năm nếu không có khoai tây dại làm ký chủ

2.4.2 Biovar

Dựa vào đặc tính sinh lý, sinh hoá khác nhau của các mẫu phân lập, 5 biovar có thể nhận dạng dựa vào khả năng sử dụng và oxi hoá 3 disaccharides (cellobiose, lactose, maltose) và 3 rượu 6 cacbon (dulcitol, mannitol, sorbitol) Biovar 2 thường bao gồm race 3, biovar 5 gồm race 4 và biovar 1, 3, 5 gồm race 1

2.5 Triệu chứng gây hại của vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Triệu chứng thường biểu hiện ngay sau khi bệnh xâm nhập vào cây Ở cây

bị bệnh ban ngày lá mất màu nhẵn bóng, tái xanh, héo cụp xuống, ở giai đoạn cây con thường biểu hiện trên toàn cây còn ở giai đoạn cây trưởng thành triệu chứng thường biểu hiện ở lá ngọn trước Ở 1-2 ngày đầu cây có thể phục hồi lại được vào lúc trời mát hoặc về đêm, nhưng sau 2-3 ngày lá héo không thể hồi phục lại được nữa và toàn cây bị héo rũ rồi chết Cắt ngang đoạn thân cây gần mặt đất ta thấy bó mạch bị hoá nâu, trong điều kiện ẩm độ cao thân cây bị bệnh dần dần thối mềm, ấn mạnh gần miệng cắt có thể thấy dịch nhờn vi khuẩn tiết ra màu trắng sữa Rễ có màu nâu đen và thối

2.6 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh

Thời gian vi khuẩn lưu tồn trong đất phụ thuộc nhiều yếu tố như ẩm độ, nhiệt độ, hoá lý đất Bên cạnh đó còn phụ thuộc vào race gây bệnh, race 1 thường lưu tồn lâu trong đất trái lại race 3 thường giảm sau vài năm do khả năng thích ứng thấp hơn Vi khuẩn có thể lưu tồn trong đất từ 5-6 năm, trong cơ thể ký chủ thực vật hoặc trong hạt giống có thể sống tới 7 tháng, còn nếu bám dính trên bề mặt hạt chỉ tồn tại 2-7 ngày (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998)

Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua rễ, vết thương cơ giới, thân non, lỗ hở tự nhiên, do côn trùng, khi vào bên trong chúng sinh sản rất nhanh làm bít các lỗ mạch đồng thời tiết ra độc tố làm các bó mạch bị hoá nâu, đen và gây ra hiện tượng héo

do cây bị thiếu nước Dưới những điều kiện thuận lợi vi khuẩn có thể di chuyển xuyên qua lớp vỏ và đi ra bên ngoài môi trường đất, đó cũng là sự tương tác giữa đất và rễ, rễ bị nhiễm vi khuẩn từ đất và ngược lại vi khuẩn từ trong cây đi ra môi trường đất (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)

Vi khuẩn lan truyền chủ yếu bằng nguồn nước, đất như bám dính vào giầy dép, dụng cụ canh tác (Martin và French, 1997)

Bệnh héo xanh vi khuẩn phát sinh phát triển phụ thuộc vào đièu kiện đất đai như trên các chân đất cao bệnh thường nặng hơn các chân đất thấp, đất được luân canh với lúa nước làm giảm tỉ lệ bệnh đáng kể (Đỗ Tấn Dũng, 2001)

Thời vụ trồng cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển bệnh, thời vụ trồng có mưa nhiều, ẩm độ cao làm gia tăng sự phát sinh phát triển bệnh

Mật độ trồng cao tỉ lệ bệnh thường cao do chúng tạo một vùng khí hậu thuận lợi cho sự phát sinh phát triển bệnh

Vì nước là nguồn lây lan chủ yếu của bệnh, do đó phương pháp tưới là một trong những yếu tố gia tăng tỉ lệ gây hại của bệnh

2.7 Biện pháp phòng trừ 2.7.1 Biện pháp hoá học

Hiện nay, vẫn chưa có loại thuốc nào đặc hiệu để phòng trừ bệnh héo xanh trên cây cà chua, tuy nhiên biện pháp hoá học vẫn được xem là cần thiết hiện nay, nhưng xét về lâu dài biện pháp hoá học ngày càng thể hiện các mặt trái của nó như làm cho tác nhân gây bệnh trở nên kháng thuốc, đặc biệt là gây ô nhiễm môi

trường và sức khỏe con người một cách nghiêm trọng Dùng formol, Mocap 10G, Furadan 3H, vôi, CuSO4 xử lý đất Dùng thuốc: Kasuran, Rovral, Dithan

2.7.2 Biện pháp sinh học

Khi sử dụng thuốc hoá học để bảo vệ thực vật thì thuốc sẽ tạo thành một lớp mỏng trên bề mặt lá, quả, thân cây, mặt đất, mặt nước và một lớp chất lắng gọi là

dư lượng ban đầu của thuốc vì vậy biện pháp sinh học trong công tác bảo vệ thực vật ngày càng chú ý khai thác và vị trí của biện pháp nay ngày càng được nâng cao Việc bảo vệ môi trường sống, môi trường sản xuất cũng như tiến hành nông nghiệp sạch thì biện pháp này càng có ý nghĩa hơn

Sử dụng một số vi khuẩn đối kháng như Bacillus sudtilis, Pseudomonas

fluorescens để xử lí hạt trước khi gieo, nhúng rể cây con trước khi trồng hoặc đưa vi

sinh vật đối kháng vào vùng rễ sau trồng nhằm ức chế, cạnh tranh và tiêu diệt vi

khuẩn Ralstonia solanacearum (Đỗ Tấn Dũng, 2001)

Sử dụng chế phẩm V58 có chứa vi sinh vật đối kháng trên ruộng trồng cà chua ở Tiền Phong - Mê Linh - Vĩnh Phúc, kết quả thu được có công thức sử dùng

V58 tỉ lệ chết giảm còn 25% so với đối chứng 80% (Lê Như Kiểu, 2001)

Ngoài ra, chúng ta cần phải làm đất vườn ươm sạch bệnh, cày bừa kỹ, bón đạm vừa phải, phân chuồng phải ủ hoai, luân canh với cây lúa nước và dùng thuốc một cách hợp lý

2.8 Phòng trừ sinh học bệnh cây 2.8.1 Khái niệm phòng trừ sinh học bệnh cây

Theo Cook và Baker (1983), phòng trừ sinh học bệnh cây (PTSHBC) là thông qua việc sử dụng một hoặc nhiều sinh vật (ngoại trừ con người) để khống chế mầm bệnh hay làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một tác nhân gây hại nào đó Đến năm 1988, Cook đã đưa ra một khái niệm rộng hơn về phòng trừ sinh

học Theo ông PTSHBC là việc sử dụng sinh vật, gen và các sản phẩm của gen để điều khiển tác nhân gây bệnh Các cách điều khiển tác nhân gây bệnh có thể là: (i) duy trì mật số nguồn bệnh ở mức thấp dưới ngưỡng kinh tế, (ii) làm chậm hoặc loại trừ tiến trình xâm nhiễm của bệnh, (iii) kích hoạt và tạo điều kiện phát huy hệ thống tự vệ của cây

2.8.2 Lựa chọn tác nhân phòng trừ sinh học

Chiến lược PTSHBC có thể chia thành hai loại (1) chiến lược dựa trên nguyên tắc cơ bản về sinh thái học hay còn gọi là phòng trừ sinh học cổ điển (Hokkaness và Lynch, 1995) hay phòng trừ sinh học chỉ xử lý một lần (Cook, 1993), (2) chiến lược sử dụng vi sinh vật như là một loại thuốc sinh học và việc xử lý có những điểm gần giống như xử lý thuốc hoá học nhằm mục đích kiểm soát bệnh trong một khoảng thời gian giới hạn Chiến lược này còn được gọi là phòng trừ sinh học tăng dần (Hokkaness và Lynch, 1995) Sự khác nhau về chiến lược phòng trừ ảnh hưởng đến sự lựa chọn và phương pháp sàng lọc tác nhân phòng trừ sinh học Đối với chiến lược PTSHBC tăng dần, người ta chú ý đến nguồn gốc của vi sinh vật đối kháng Tuy nhiên những hiểu biết về khía cạnh này là điều cần thiết cho việc đánh giá rủi ro và là một trong những yêu cầu cần thiết cho quá trình đăng ký thương mại hoá sản phẩm (Lumsden và Lewis, 1989)

Có một số phương pháp sàng lọc tác nhân phòng trừ sinh học dựa trên hoạt tính của men thủy phân của vi sinh vật đối kháng, tương tác giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật đối kháng, phương pháp có liên quan đến cây kí chủ

2.8.3 Vi khuẩn - một tác nhân phòng trừ sinh học:

Nhiều công trình nghiên cứu về các tác nhân phòng trừ sinh học đã công bố từ dầu thế kỷ 20 trong đó có vi khuẩn Đang là nhóm vi khuẩn hoại sinh mà phổ

biến nhất là Pseudomonas spp., kế đến là Bacillus spp và Streptomyces (Burr và

ctv, 1978, Weller và Cook, 1983)

Những nghiên cứu về vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn trên thân lá cây đã dẫn đến việc chia chúng thành ba loại: loại có hại cho cây, loại trung tính và loại có ích cho cây Aûnh hưởng có ích của nhóm vi khuẩn này là do chúng sản sinh ra chất kích thích tăng trưởng cây, các chất ức chế hoặc làm suy yếu tác nhân gây bệnh hoặc cả hai (Baker, 1988) Cơ chế ban đầu ức chế tác nhân gây bệnh là tiết ra các chất kháng sinh (Fravell, 1988) Tuy nhiên những yếu tố khác như việc tiết ra chất sidrophores, HCN, sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng có vai trò quan trọng trong việc ức chế tác nhân gây bệnh (Cook và Baker, 1983)

Trong số các loài Pseudomonas spp., Pseudomonas fluorescens được chú ý

và tăng cường nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại nấm bệnh lưu tồn trong đất, loài vi khuẩn này có khả năng kích thích sự phát triển cây trồng Bằng cách xử lý hạt có hay không có chất mang hoạt chủng vào đất cùng với giá thể làm thức ăn nền, đã làm giảm mức trầm trọng cũa bệnh, làm gia tăng sự phát triển và tăng năng suất cây trồng Với thuận lợi là có nhiều cơ chế tác dụng như: định cư, chiếm chỗ, loại trừ mầm bệnh ra khỏi vùng thích hợp, tiết chất kháng sinh (Pyrrolnitrin, pyoluteorin) ngoại ký sinh, cạnh tranh dinh dưỡng (hợp chất sắt),

gia tăng sức đề kháng cho cây, Pseudomonas rất có triển vọng sử dụng trên lãnh

vực thương mại

Biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh cây là điều khiển môi trường, cây trồng và sinh vật đối kháng một cách thích hợp, để tạo nên một thế cân bằng sinh học cần thiết, giúp giảm mật số của mầm bệnh xuống dưới ngưỡng gây hại Nhờ đó, bệnh của cây trồng chỉ xuất hiện ở mức độ nhẹ, không gây ảnh hưởng quan trọng về mặt kinh tế

Biện pháp sinh học không có mục đích tiêu diệt toàn bộ mầm bệnh, và cũng không có khả năng này (Phạm Văn Kim, 1999)

2.8.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước:

2.8.4.1Nghiên cứu trong nước:

Lê Lương Tề, 2002 nghiên cứu “phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn cà chua có hiệu quả kinh tế cao bằng biện pháp sử dụng rộng rãi các giống cà chua kháng bệnh, có năng suất cao CLN-1462A và P.T4719A ở vùng đồng bằng sông Hồng” Đã đưa vào trồng đại trà ở các tỉnh thuộc đồng bằng sông Hồng và các tỉnh phía Bắc nước ta

Lê Như Kiểu, Nguyễn Ngọc Cường, Đào Thu Hằng, 2003 nghiên cứu “phát

hiện biovar 1 và 5 trong quần thể vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo

xanh cà chua” Điều này cho thấy quần thể gây bệnh héo xanh cà chua ở Việt Nam

là rất đa dạng (có 5 biovar)

Phạm Minh Sang, 2003 nghiên cứu “Hiệu lực của vi khuẩn đối kháng và kích

thích sinh trưởng trong phòng trừ bệnh khô vằn do nấm Rhizoctonia solani” bước

đầu đã khống chế được bệnh khô vằn cho lúa và kích thích cây tăng trưởng mạnh bằng VKĐK

Nguyễn Trung Thành, 2004 cũng đã thành công trong việc nghiên cứu “Bước đầu chọn lọc và đánh giá dòng VKĐK, phân lập từ đất để khống chế nấm

Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, và vi khuẩn Ralsronia solanacearum gây

bệnh trên cây cà chua” Các dòng VKĐK có khả năng kháng với cả ba tác nhân gây bệnh trong điều kiện In vitro và trong nhà lưới VKĐK đã khống chế được bệnh

do nấm Sclerotium rolfsii gây ra

Phạm Mỹ Liên, 2004 nghiên cứu về vấn đề “Chọn lọc và đánh giá dòng vi

khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng với nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh trên

cây cà chua” cũng đã thành công trong quá trình nghiên cứu

2.8.4.2 Nghiên cứu ngoài nước

Tại Đài Loan, bằng phương pháp PCR với cặp primer PS-IS đặc hiệu với vi

khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc race 1, kết quả phân tích cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum thu thập trên cà chua, khoai tây, ớt, đậu phộng,

cà tím, thuốc lá, dâu tây, chuối và nhiều loại cây trồng khác đều thuộc race 1 (Yang

An Lee, 2001)

Phân tích trên 120 dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập trên cà

chua, khoai tây, cà tím, ớt, chuối, gừng và nhiều loại cây trồng khác từ Châu Aù,

Mỹ, Aâu, Phi và Châu Đại Dương cho thấy vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc

division Châu Aù thường bao gồm biovar 3 và 4, division Châu Mỹ thường bao gồm biovar 1 và 2

Theo Rindran và Vidhiaekaran (1996) cho rằng những loại vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens được phân lập từ vùng rễ, có sắc tố phát huỳnh quang

vàng xanh cũng kìm hãm sự phát triển của nấm Rhizoctonia solani Một trong

những dòng có hiệu quả nhất là PFAIR2, phân lập trên than bùn được dùng để xử lý hạt, xử lý rể, rải vào đất và phun trên lá Từng nghiệm thức riêng lẻ đã kiểm soát bệnh có hiệu quả Tuy nhiên, sự kết hợp của bốn cách dẫn đến hiệu quả phòng trừ tốt nhất trong nhà lưới Trên đồng ruộng, sử dụng PFAIR2 phòng trừ bệnh có hiệu quả, gia tăng năng suất và có thể so sánh với các loại thuốc trừ nấm thông dụng như carbendazim

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1 Thời gian

Đề tài được thực hiện từ ngày 5/6/2005 – 30/8/2005

- Nơi phân tích: Trung tâm phân tích thí nghiệm hoá sinh – Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng: 18, 73, 85, 123, 124, 187 và các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây

bệnh: RST004, RST005, RST006, RST01, RSBog3, RSBog4 Hạt cà chua với tỷ lệ nẩy mầm 90%

Môi trường phân lập và nuôi cấy:

- PDA (potato, dextrose, agar)

- LB (tryptone, yeast extract, sodium chloride)

- WA (water, agar) Vật liệu lây nhiễm: hạt giống cà chua (1628)

3.2.2 Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens với các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên đĩa

petri trong phòng thí nghiệm

Điều kiện tiến hành: thí nghiệm được tiến hành trong phòng thí nghiệm tại Phòng Thực tập Bệnh cây – Bộ môn Bảo vệ Thục vật – Trường Đại học Nông Lâm

Tp Hồ Chí Minh

Vật liệu nghiên cứu:

- Các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens:18, 73, 85, 123, 124

- Các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum: RST004, RST005, RST006,

RST01, RSBog3, RSBog4

Dụng cụ thí nghiệm:

Que trang vi khuẩn, pipet và đầu tiếp đã được vô trùng

Môi trường sử dụng: PDA (200g Potato, 15g Agar, 20g Dextrose và 1 lít nước cất)

Phương pháp tiến hành:

Lấy 100µl các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum tran đều trên môi trường PDA đã chuẩn bị sẵn Dùng pipet hút 20µl dịch vi khuẩn và tiến hành cấy dịch vi khuẩn thành 5 điểm tương ứng với các dòng vi khuẩn Pseudomonas

fluorescens đã chuẩn bị sẵn Cuối cùng đem ủ ở nhiệt độ phòng (27-300C), khoảng

24 giờ sau xem kết quả đối kháng của các dòng vi khuẩn

Chỉ tiêu theo dõi:

Khả năng đối kháng của 5 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

3.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens với dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà

chua trong nhà lưới

Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhà lưới tại công ty Hai Mũi Tên Đỏ

Vật liệu nghiên cứu:

- Nguồn vi khuẩn kháng mạnh nhất và gây độc mạnh nhất được chọn lọc trong phòng thí nghiệm

- Hạt cà chua với tỉ lệ nảy mầm 90%

- Đất

- Chậu nhựa 7x12cm (đường kính x chiều cao)

- Khay xốp (60 lổ)

- Trang thiết bị thí nghiệm tại phòng thực tập Bệnh cây – Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật và tại trung tâm phân tích thí nghiệm Hoá Sinh trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh

Môi trường sử dụng: LB lỏng (tryptone, yeast extract, sodium chloride) Phương pháp tiến hành: Lây nhiễm theo phương pháp của Phạm Đăng Minh (2003) có cải tiến

- Sau khi khảo sát tính độc của các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum

trong phòng thí nghiệm, ta chọn ra các dòng gây độc cho cây cà chua và chọn ra một dòng mạnh nhất Tương tự, ta cũng chọn ra một dòng VKĐK mạnh nhất

- Nguồn vi khuẩn: từ nguồn vi khuẩn trữ ở -800C, nuôi cấy trên môi trường

LB lỏng khoảng 16 giờ, ly tâm thu vi khuẩn ở 3000 vòng/phút, hoà vi khuẩn vào nước cất vô trùng

- Hạt giống cà chua được rửa bằng cồn 70% trong 1 phút, NaOCl 2% trong 5 phút, sau đó rửa lại nhiều lần với nước cất vô trùng, ủ hạt trên giấy thấm được làm ẩm bằng nước cất vô trùng đặt trong đĩa petri, giữ ở nhiệt độ 270C

- Lấy hạt cà chua đã nẩy mầm khoảng 0,5 – 2mm ngâm trong dịch huyền phù đã chuẩn bị ở trên, nồng độ 109 cfu/ml vi khuẩn đối kháng (khoảng 20 phút) đã chuẩn bị sẵn, sau đó làm khô hạt trên giấy thấm đem gieo khay xốp đã chuẩn bị sẵn đất (khay 60 lổ)

- Khi cây cà chua được 15 ngày tuổi đem trồng vào chậu đất đã có chủng sẵn dung dịch vi khuẩn gây độc, với mật số vi khuẩn: 103 cfu/g đất, các cây cà chua được chia thành 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 30 cây, với 3 lần lặp lại Tiến hành theo dõi trong vòng 20 ngày

Chỉ tiêu theo dõi:

Chiều cao cây: đo từ hai lá mầm lên đến đầu ngọn lá, 5 ngày/lần Số lá: đếm toàn bộ số lá trên cây, 5 ngày/lần

Các nghiệm thức:

NT1 (T1): không xử lý vi khuẩn gây bệnh và đối kháng

NT2 (T2): chỉ xử lý vi khuẩn gây bệnh trong ly đất

NT3 (T3): xử lý vi khuẩn đối kháng ở giai đoạn hạt nứt nanh và vi khuẩn gây bệnh trong ly đất

NT4 (T4): xử lý vi khuẩn đối kháng ở giai đoạn hạt nứt nanh, trước khi trồng vào ly đất đã chủng sẵn vi khuẩn gây bệnh tiến hành nhúng cây cà chua vào dịch vi khuẩn đối kháng đã chuẩn bị sẵn với mật số 109 cfu/ml, (khoảng 20 phút)

3.2.4 Phương pháp đánh giá tính độc của vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên

cây cà chua trong điều kiện nhà lưới

Các phương pháp đánh giá giống như mục 3.2.3 nhưng chủng vi khuẩn gây

độc với mật số vi khuẩn: 1010 cfu/g đất, tiến hành theo dõi trong 12 ngày sau trồng Chỉ tiêu theo dõi:

Tỷ lệ chết của cây cà chua (%)

3.2.5 Phương pháp đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens với dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà

chua ngoài đồng ruộng

Thí nghiệm được tiến hành ngoài đồng ruộng tại công ty Hai Mũi Tên Đỏ Vật liệu nghiên cứu:

- Nguồn VKĐK mạnh nhất được chọn lọc trong phòng thí nghiệm

- Hạt cà chua với tỉ lệ nẩy mầm 90%

- Đất được lên luống, phủ bạt và đục lổ đã chuẩn bị trước

- Khay xốp (60 lổ)

Phương pháp tiến hành:

Khi cây được 15 ngày tuổi đem trồng ngoài đồng ruộng, các cây cà chua được chia thành 2 nghiệm thức, sau trồng 3 ngày tưới dịch VKĐK Tiến hành theo dõi trong

20 ngày sau trồng

Chỉ tiêu theo dõi:

Tỷ lệ chết của cây cà chua (%) Các nghiệm thức:

- NT1 (T1’): các cây cà chua, với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 20 cây Không chủng vi khuẩn đối kháng và gây bệnh

- NT2 (T2’): các cây cà chua, với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 80 cây Có chủng vi khuẩn đối kháng

Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

3.2.6 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm MSTATC

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Mức đối kháng của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên đĩa petri

Trên đĩa petri có chứa môi trường PDA dùng que tran vi khuẩn tran đều 6 dòng VKGB, sau đó tiến hành cấy thành 5 điểm đã đánh dấu trước tương ứng với 5 dòng VKĐK để xác định mức độ đối kháng của 5 dòng vi khuẩn Kết quả được tình bày ở bảng 4.1

Bảng 4.1 Mức độ đối kháng của 5 dòng vi khuẩn trên đĩa petri

DVKGB DVKĐK

DVKGB: dòng vi khuẩn gây bệnh DVKĐK: dòng vi khuẩn đối kháng Các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum: RST004, RST005, RST006, RST01, RSBog3, RSBog4

Các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens: 18, 73, 85, 123, 124

Trong các dòng VKĐK Pseudomonas fluorescen có 5 dòng đều có khả năng đối kháng với các dòng VKGB Ralstonia solanacearum, có 3 dòng đối kháng mạnh,

2 dòng còn lại có mức độ kháng từ trung bình đến yếu

Như vậy, trong 5 dòng VKĐK có 3 dòng kháng mạnh, tiếp tục nghiên cứu 3 dòng này và chọn ra một dòng mạnh nhất

Hình 4.1: Khả năng đối kháng của 5 dòng VKĐK đối với VKGB RSBog3

Hình 4.2: Khả năng đối kháng của 5 dòng VKĐK đối với VKGB RSBog4