Phương Pháp Chẩn Đoán Bệnh Ký Sinh Trùng Ở Gia Súc, Gia Cầm

Trong phạm vi của giáo trình này, chúng tôi đề cập chủ yếu đến các phương pháp chẩn đoán bệnh giun sán và bệnh đơn bào ký sinh ở gia súc, gia cầm vì sự phổ biến và vai trò gây bệnh quan

PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH KÝ SINH TRÙNG

Ở GIA SÚC, GIA CẦM

Như chúng ta đã biết, bệnh ký sinh trùng ở gia súc, gia cầm chia làm 3 nhóm lớn: nhóm bệnh giun sán, nhóm bệnh do động vật tiết túc ký sinh và nhóm bệnh do động vật đơn bào ký sinh Trong phạm vi của giáo trình này, chúng tôi đề cập chủ yếu đến các phương pháp chẩn đoán bệnh giun sán và bệnh đơn bào ký sinh ở gia súc, gia cầm

vì sự phổ biến và vai trò gây bệnh quan trọng của giun sán và động vật đơn bào ký sinh

1 PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH GIUN, SÁN

Có hai cách chẩn đoán bệnh giun, sán: chẩn đoán trên con vật sống và chẩn đoán trên con vật đã chết

1.1 Phương pháp chẩn đoán trên con vật sống

Chẩn đoán bệnh giun sán trên con vật sống bao gồm các phương pháp: chẩn đoán lâm sàng, chẩn đoán trong phòng thí nghiệm và chẩn đoán miễn dịch

1.1.1 Chẩn đoán lâm sàng

Một số bệnh giun, sán có những biểu hiện lâm sàng rất đặc trưng và dễ nhận biết như: rối loạn hoạt động thần kinh (đi vòng quanh, co giật trong bệnh ấu sán ở não dê, cừu ); ỉa phân trắng trong bệnh giun đũa bê, nghé Tuy nhiên, đa số các bệnh giun

sán thường không có những biểu hiện đặc trưng và khó phân biệt như: rối loạn tiêu hoá, ăn uống kém, thể trạng gầy, da khô, lông xù Vì vậy, không thể chỉ dựa vào

triệu chứng lâm sàng để chẩn đoán chính xác mà cần phải có những phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm

1.1.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Mục đích của phương pháp này là tìm giun, sán trưởng thành, trứng hoặc ấu trùng giun, sán ở trong phân bằng các nghiên cứu định tính và định lượng

* Kỹ thuật lấy phân để xét nghiệm:

Trong đất hoặc trên nền chuồng có chứa số lượng lớn trứng và ấu trùng giun tròn sông tự do Khi gia súc, gia cầm thải phân, trứng và ấu trùng giun tròn sống tự do có thể dính vào phân, gây khó khăn cho việc xét nghiệm chẩn đoán Vì vậy, cần lấy phân trực tiếp qua hậu môn con vật Phân của mỗi con vật để riêng vào túi ngon sạch, mỗi mẫu khoảng 20 - 30 gam, có nhãn ghi số thứ tự mẫu, tuổi, tính biệt, khối lượng con vật, địa điểm thu thập mẫu Mẫu phân phải đưa về phòng thí nghiệm hoặc cơ sở nghiên cứu để xét nghiệm ngay (vì trứng nhiều loài giun tròn ở nhiệt độ 20 - 300C hoặc cao hơn, chỉ sau 16 - 18 giờ sẽ nở ra ấu trùng nên việc xét nghiệm chẩn đoán khó khăn

hơn Mặt khác, trong thời gian này, ấu trùng giun phổi Dictyocaulus cũng lột xác lần thứ nhất và trở nên ít hoạt động hơn, nên sẽ gặp khó khăn khi phân ly ấu trùng bằng phương pháp Baerman)

Nếu mẫu phân chưa xét nghiệm được ngay thì cần bảo quản ở nhiệt độ dưới

100C, thời gian bảo quản không quá 3 ngày

1.1.2.1 Nghiên cứu định tính

Là phương pháp xác định có hoặc không có các loài giun sán ký sinh ở gia súc, gia cầm, tức là tìm giun sán trưởng thành hoặc đất sán dây, trứng hoặc ấu trùng giun sán trong phân

Đây là phương pháp thông dụng để đánh giá tình hình nhiễm giun sán ở các đàn gia súc, gia cầm

* Phương pháp tìm giun sán trưởng thành

Để tìm giun sán trưởng thành hoặc các đốt sán dây được thải ra theo phân (đặc biệt

là khi tẩy giun sán thăm dò), có thể dùng que bới phân và quan sát bằng mắt thường hoặc quan sát kỹ hậu môn của từng con vật (có thể phát hiện cả đoạn sán dây lủng lẳng ở hậu môn dê, chó, gà) Thường thu gom toàn bộ phân của mỗi con vật vào chậu rồi hoà tan trong nước, để lắng, gạn nhiều lần cho đến khi cặn lắng trong thì gạn nước đi để tìm giun sán trong cặn

* Phương pháp tìm trứng giun sán

Có nhiều phương pháp tìm trứng giun sán, nhưng đạt hiệu quả cao và đơn giản, dễ làm là: phương pháp phù nổi Fullebom (1927), phương pháp Darling, phương pháp Cherbovick và phương pháp gạn rửa sa lắng Benedek (1943)

- Phương pháp Fullebom: là một trong các phương pháp phù nổi dễ làm và rẻ tiền Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng dung dịch muối ăn (Nacl) bão hoà có tỷ trọng d = 1,18, lớn hơn tỷ trọng của trứng giun sán, làm cho trứng giun sán nổi lên bề mặt dung dịch Phương pháp Fullebom phát hiện khá tốt trứng giun tròn, trứng sán lá cơ quan sinh sản gia cầm và Oocyst cầu trùng

Dung dịch nước muối bão hoà pha bằng cách: cho tinh thể muối ăn (Nacl) vào chậu hoặc nồi nước sôi, vừa cho vào vừa khuấy cho đến khi muối không hoà tan được nữa (thường dùng 380 - 400 gam muối tinh thể không ngậm nước, hoặc 450 gam muối tinh thể ngậm nước) Để nguội, được dung dịch muối bão hoà dùng để xét nghiệm trứng giun sán

- Phương pháp Darling: là phương pháp phù nổi có độ chính xác rất cao, tuy dụng cụ và thao tác có phức tạp hơn so với phương pháp Fullebom Trong phương pháp Darling, dung dịch nước muối bão hoà (Nacl) vẫn được sử dụng làm dung dịch xét nghiệm chẩn đoán, song cần có máy ly tâm để thực hiện phương pháp này Sau hai lần ly tâm, trứng giun sán, Oocyst cầu trùng dễ dàng nổi lên bề mặt dung dịch nước

muối bão hoà Đồng thời, tiêu bản làm từ phương pháp Darling được loại bỏ cặn tốt hơn nên "sạch" hơn, dễ phát hiện trứng giun sán hơn, đặc biệt là dễ phát hiện Oocyst cầu trùng hơn so với tiêu bản làm từ phương pháp Fullebom

- Phương pháp Cherbovick: là phương pháp có độ chính xác cao trong xét nghiệm trứng giun sán Cách tiến hành phương pháp Cherbovick cũng gồm hai lần ly tâm như phương pháp Darling, song tuỳ mục đích chẩn đoán mà có thể dùng dung dịch bão hoà khác nhau (dung dịch ma giê sunfat bão hoà, dung dịch nam hyposunfit bão hoà) Phương pháp gạn rửa sa lắng (còn gọi là phương pháp lắng cặn trứng giun sán): nguyên tắc của phương pháp này là dùng nước lã sạch tách trứng giun sán ra khỏi phân Trứng giun sán có tỷ trọng lớn hơn tỷ trọng của nước lã sẽ chìm xuống, có thể thu nhận để quan sát chẩn đoán dưới kính hiển vi

Phương pháp gạn rửa sa lắng có thể phát hiện khá tốt trứng sán lá gan, trứng sán lá dạ

cỏ, trứng sán lá ruột lợn, đốt sán dây Nếu để lắng cặn 30 - 60 phút có thể phát hiện trứng giun đũa và một số trứng giun tròn có kích thước lớn khác

Chú ý, khi xét nghiệm phân cần phân biệt trứng giun sán với cặn thức ăn, bào tử nang của nấm, trứng của các loài tiết túc có thể có trong phân, cũng như phải phân biệt đặc điểm hình thái của từng loại trứng (hình 36, 37, 38, 39, 40) Trứng giun sán thường có 2 hoặc 4 lớp vỏ, nhẵn hoặc lồi lõm, trong trứng có phôi bào hoặc ấu trùng

Hình 36 Những vật không phải trứng giun sán

1 Tế bào thực vật; 2 Lông thực vật

3 Xơ thực vật; 4 Tế bào xoắn thực vật

5 Bào tử nấm; 6 Hạt phấn hoa

7 Giọt mỡ

Hình 40 Trứng giun sán ký sinh ở gia cầm

* Phương pháp tìm ấu trùng giun sán

Một số loài giun tròn (ví dụ, các loài thuộc giống giun tròn Dictyocaulus), sản phẩm thải ra theo phân ký chủ không phải là trứng mà là ấu trùng Hoặc, các giun tròn thuộc họ Trychostrongylidae đẻ trứng có hình thái và kích thước tương đối giống nhau, nếu chỉ căn cứ vào trứng thì việc chẩn đoán phân biệt giống hoặc loài rất khó khăn Trứng của những giun tròn này lại có đặc điểm là nở thành ấu trùng khi tồn tại

và phát tán ở ngoại cảnh Lợi dụng đặc điểm này mà ta có thể nuôi để trứng nở thành

ấu trùng, rồi căn cứ vào hình thái của ấu trùng cảm nhiễm để chẩn đoán bệnh

Có những phương pháp phân ly ấu trùng sau:

- Phương pháp Baerman

Phương pháp Baerman chủ yếu dựa trên nguyên tắc là, ấu trùng di chuyển ra khỏi

phân vào trong nước và lắng xuống đáy

Dùng phễu có đường kính 5 - 10 cm, cuối phễu lắp một ống cao su dài 10 - 15 cm, cuối ống cao su lắp ống nghiệm Đặt lưới thép hoặc vải màn lên miệng phễu, cho đầy nước ấm 37 - 380C, trên lưới thép đặt 10 - 15 gam phân (nếu là phân viên của dê, cừu thì 8

- 12 viên) Để yên 30 phút - 1 giờ, rồi lấy cặn ở ống nghiệm quan sát dưới kính hiển vi

để tìm ấu trùng

Cần chú ý rằng, ở nhiệt độ 20 - 300C, Sau 18 - 24 giờ, trứng một số giun tròn thuộc bộ Strongylata (như Oesophagostomum) sẽ nở ra ấu trùng, khó phân biệt với ấu trùng Dictyocaulus Vì vậy, tốt nhất là xét nghiệm ngay, không để phân qua đêm

Hiện nay, ở Việt Nam có thể thay thế phương pháp Baemlan bằng phương pháp của Essen và Donalson có cải tiến - phương pháp Thanh - Châu, dựa theo nguyên tắc của phương pháp Baerman, nhưng phương pháp này đơn giản, nhanh hơn và có hiệu

quả cao (Nguyễn Vũ Thanh và Nguyễn Ngọc Châu, 1993)

- Phương pháp Vaida

Phương pháp Vaida đơn giản hơn so với phương pháp Baemlan, thường dùng để tìm ấu trùng trong phân gia súc có dạng viên như phân dê, cừu Đặt 4 - 5 viên phân vào đĩa petri và cho vào một ít nước ấm Sau 15 - 30 phút vớt các viên phân bỏ đi, còn nước ở hộp lồng đem quan sát dưới kính lúp hoặc kính hiển vi tìm ấu trùng Phương pháp này áp dụng dễ hơn đối với dê, cừu nhưng hiệu quả thấp hơn phương pháp Baerman

Trong đường tiêu hoá của gia súc nhai lại có nhiều loài giun tròn thuộc bộ Strongylida ký sinh, trứng của chúng có hình thái gần giống nhau, khi nở thành ấu trùng cũng khó phân biệt loài này với loài khác Tuy nhiên, các dạng ấu trùng cảm nhiễm thuộc bộ Strongylida khác nhau bởi số lượng và hình dạng tế bào ruột, kích thước của ấu trùng và phần mút đuôi của chúng

Ví dụ, có thể phân biệt một số ấu trùng cảm nhiễm thuộc bộ Strongylida như sau (hình 42)

Ấu trùng giun tròn Dictyocaulus: mút đuôi hình nón, ruột chứa đầy các hạt màusáng

Ấu trùng giun tròn Haemonchus: mút đuôi không có gai, thực quản dài khoảng 1/5 chiều dài cơ thể

Ấu trùng giun tròn Trichostrongylus: mút đuôi có gai, thực quản dài khoảng 1/4 chiều dài cơ thể

Ấu trùng giun tròn Oesophagostomum: có 20 - 32 tế bào ruột, mút đuôi vuốt dài

Ấu trùng giun tròn Bunostomum: ruột là một ống dài không phân chia thành những tế bào riêng biệt

Hình 42 Các dạng ấu trùng cảm nhiễm của bộ Strongylida

1 - Haemonchus contortus; 2 - Cooperia; 3 - Trichostrongylus; 4 - Ostertagia; 5 - Chabertia;

6 - Oesophagostomum columbianum; 7 - O venulosum;

8 - Bunostomum; 9 - Nematodirus (theo Poliakov, 1953)

1.1 2.2 Nghiên cứu định lượng

Để đếm số lượng trứng và ấu trùng giun sán trong phân, có thể dùng các phương pháp sau:

* Phương pháp đếm trứng Stoll

Cho 5 gam phân vào trong một ống có vạch đo, cho dung dịch NaOH 0,1N tới vạch

75 ml Khuấy đều bằng đũa thuỷ tinh cho tan phân rồi dừng lại đột ngột, dùng pipet lấy

ra 0,05 ml nước phân loãng cho lên phiến kính, đậy lá kính và quan sát dưới kính hiển vi

Số trứng đếm được nhân với 32 sẽ cho biết số trứng trong 1 gam phân Tốt nhất nên làm vài lần để lấy số trung bình

Có thể dùng phương pháp phù nổi và gạn rửa sa lắng để đánh giá hiệu quả của thuốc sau khi tẩy giun sán mà không nhất thiết phải dùng phương pháp Stoll Trong trường hợp này phải lấy số lượng phân như nhau, các dụng cụ phải cùng kích thước, dung dịch dùng xét nghiệm phải như nhau So sánh số trứng trong một giọt váng bề mặt hoặc trong thị trường kính hiển vi (Nguyễn Thị Lê và cs, 1996)

* Phương pháp đếm trứng Mc Master (hình 43)

Phương pháp này dùng để xác định số lượng trứng giun tròn, trứng sán dây và Oocyst cầu trùng trong 1 gam phân bằng buồng đếm Mc Master Cân 4 gam phân vào cốc thuỷ tinh, thêm 56 ml dung dịch nước muối bão hoà, khuấy đều cho tan phân Lọc qua lưới thép vào một cốc khác và khuấy đều Trong khi đang khuấy, lấy công tơ hút hút dung dịch phân nhỏ đầy cả hai buồng đếm Mc Master (mỗi buồng đếm có dung tích 0,5 ml) Để yên 5 phút rồi kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x l0)

Trong thực tế, để dễ phát hiện và dễ đếm trứng, có thể cải tiến như sau:

+ Bước l: cân 4 gam phân vào cốc thuỷ tinh, thêm nước lã sạch (khoảng 100

-150 ml), khuấy tan phân, lọc bỏ cặn bã thô Nước lọc để lắng trong 1 - 2 giờ, gạn bỏ nước, giữ lại cặn

+ Bước 2: cho 56 mi dung dịch nước muối bão hoà, khuấy đều cho tan cặn Trong khi đang khuấy, lấy công tơ hút hút 1 mi dung dịch phân nhỏ đầy 2 buồng đếm

Mc Master Để yên 5 phút rồi kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x l0)

Đếm toàn bộ số trứng trong những ô của hai buồng đếm, rồi tính theo công thức sau:

(Tổng số trứng ở hai buồng đếm là số trứng có trong lưu dung dịch phân)

Theo Jorgen Han sen và Buôn Peny (1994), mức độ nhiễm một số loài giun tròn căn

cứ vào số trứng/1 gam phân dê như sau:

1 1 3 Phương pháp chẩn đoán bệnh giun sán bằng miễn dịch

Các bệnh giun sán cũng thể hiện mức độ miễn dịch nhiều ít khác nhau giống như nguyên lý miễn dịch của các bệnh truyền nhiễm Vì vậy, có thể chẩn đoán bệnh giun sán bằng miễn dịch Hiện nay đã có nhiều phương pháp như: phương pháp miễn dịch huỳnh quang, phương pháp miễn dịch men ELISA Tuy nhiên, do khó khăn về phương tiện

và việc chế kháng nguyên chuẩn, nên các phương pháp này còn ít được sử dụng trong thú y

biết được chính xác thành phần loài giun sán ký sinh và mức độ nhiễm nặng hay nhẹ Tuỳ theo mục đích mổ khám mà có ba phương pháp: phương pháp mổ khám toàn diện, phương pháp mổ khám giun sán ở một cơ quan, phương pháp mổ khám không toàn diện của Skrjabin K I (1928)

Mổ khám toàn diện là phương pháp mổ khám giun sán ở tất cả các cơ quan, tổ chức của cơ thể gia súc, gia cầm (phát hiện giun, sán ở xoang mắt, xoang miệng, xoang mũi, xoang ngực, xoang bụng, mô não; toàn bộ hệ tiêu hoá, kể cả gan, tuỵ; hệ hô hấp; hệ bài tiết; hệ sinh dục; các tổ chức dưới da)

Mổ khám không toàn diện là phương pháp mổ khám một loài giun sán nào đó trong

cơ thể gia súc, gia cầm Ví dụ, để phát hiện sán lá dạ cỏ phải mổ khám các túi dạ dày của loài nhai lại, ruột non, ruột già, gan, mật, xoang bụng, thận (bởi vì sán lá dạ cỏ non có thể

có mặt ở nhiều nơi khác nhau trong cơ thể)

Mổ khám giun sán ở một cơ quan là phương pháp phát hiện tất cả các loài giun, sán ký sinh ở một cơ quan nào đó của cơ thể Ví dụ, mổ khám giun, sán ở cơ quan tiêu hoá

1.2.2 Phương pháp kiểm tra thịt và nội tạng để phát hiện giun sán

Trong thịt gia súc có thể có giun sán ký sinh, ví dụ: Cysticercus sp (ấu trùng sán dây Taenia sp.), ấu trùng giun bao (Trichinella spiralis)

* Kiểm tra tươi

Mục đích: tìm Cysticercus sp trong tổ chức cơ

Để tìm các dạng ký sinh trùng này, có thể dùng dao sắc cắt ngang các bắp thịt vai, mông, đùi, lưỡi, vừa cắt vừa quan sát bề mặt các nhát cắt

Ấu trùng Cysticercus sp của sán dây Taenia sp có dạng hạt gạo, dài khoảng 0,5 mm hoặc hơn, màu trắng đục

Các dạng ấu trùng nói trên đều phát hiện bằng mắt thường một cách dễ dàng khi xem tươi tổ chức cơ

* Kiểm tra tổ chức cơ bằng phương pháp ép cơ, tiêu cơ

Mục đích: tìm ấu trùng giun bao Trichinetla spiralis

Thường lấy cơ chân hoành cách mô để làm 2 phương pháp: ép cơ và tiêu cơ (vì cơ ở

vị trí này thường có nhiều ấu trùng giun bao) Thực hiện phương pháp ép cơ trên dụng cụ

ép cơ chuyên dụng Còn phương pháp tiêu cơ được thực hiện với dung dịch tiêu cơ Kết quả là: trên tiêu bản ép cơ, nếu có thì thấy ấu trùng giun bao trong các kén có hình xoắn ốc Trong dung dịch tiêu cơ, khi cơ đã bị tiêu hết, sẽ chỉ còn các nang kén chứa ấu trùng giun bao

* Kiểm tra nội tạng

Chủ yếu là kiểm tra tươi để phát hiện ấu trùng Cysticercl/s tenllicollis ký sinh trên

bề mặt gan, lách, màng treo ruột, màng mỡ chài của gia súc

Ấu trùng Cysticercus tenuicollis có dạng bọc to nhỏ không đều, trong bọc có nhiều nước và một đầu sán dây dính ở màng trong của bọc Có thể phát hiện Cys tenuicollis dễ dàng khi xem tươi bằng mắt thường

2 PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐƠN BÀO KÝ SINH

Đơn bào (Protozoa) ký sinh gồm rất nhiều giống loài khác nhau, ký sinh ở những vị trí khác nhau trong cơ thể: amip, cầu trùng, trùng lông, trùng roi ký sinh ở đường ruột; nhục bào tử trùng ký sinh trong cơ; các đơn bào ký sinh trong máu

Có nhiều biện pháp chẩn đoán bệnh đơn bào ký sinh Các phương pháp thường dùng gồm:

2.1 Phương pháp xét nghiệm phân

Đối với động vật lớn như trâu, bò, ngựa thì trực tiếp dùng tay lấy phân từ trực tràng con vật Đối với dê, cừu, chó có thể dùng tay kích thích vào hậu môn hoặc dùng Syringne (không có kim) bơm vào hậu môn 2 - 3 mm glyxerin để kích thích thải phân Lấy khay hứng phân rồi cho vào lọ thuỷ tinh hoặc hộp nhựa có nắp đậy kín, đưa về phòng thí nghiệm để xét nghiệm ngay trong ngày

2.1.1 Phương pháp xét nghiệm cầu trùng ký sinh (Eimeria sp., Isospora sp )

Các loài cầu trùng giống Eimeria, Isospora, Criptosporidia ký sinh ở trong đường tiêu hoá trâu, bò, dê, cừu, lợn, gà Sản phẩm của quá trình sinh sản vô tính và hữu tính xen kẽ trong các tế bào biểu mô ruột được gia súc, gia cầm bài xuất ra ngoài theo phân, được gọi là nang trứng hay noãn nang (Oocyst) Số lượng Oocyst trong phân có thể lên tới hàng trăm nghìn/1 gam phân

Để chẩn đoán bệnh cầu trùng, cần dựa vào những triệu chứng lâm sàng của con vật bệnh và các đặc điểm dịch tễ học Nhưng nhất thiết phải tìm thấy căn bệnh mới có kết luận chính xác

Có thể tìm cầu trùng bằng phương pháp xem tươi (phương pháp trực tiếp) Phương pháp này dễ làm và dụng cụ rất đơn giản nhưng độ chính xác thấp, phải làm 8 - 10 tiêu bản/mẫu phân mới có thể thấy Oocyst cầu trùng

Oocyst cầu trùng có tỷ trọng nhỏ (d < 1 ) nên dễ nổi lên trên bề mặt các dung dịch có tỷ trọng lớn Trên cơ sở đó mà có thể dùng các phương pháp làm phong phú đơn bào danh bày ở mục sau) để phát hiện Oocyst cầu trùng Phương pháp thường dùng nhất là phương pháp Fullebom với dung dịch muối NaCl bão hoà Tuy nhiên, qua thực tế nghiên cứu về cầu trùng và bệnh cầu trùng ở gà và lợn, chúng tôi thấy phương pháp vừa lắng cặn, vừa làm nổi của Darling phát hiện cầu trùng tốt hơn so với phương pháp Fullebom (thời gian nhanh hơn, tiêu bản trong và sạch hơn, Oocyst nổi

dễ dàng hơn)