Sử dụng kỹ thuật FISH để kiểm tra sự hội nhập của gen IL-6 phân lập từ người trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen

Những nghiên cứu về gà chuyển gen gần đây tập trung chủ yếu vào phương pháp thông qua các tế bào gốc phôi, với ưu điểm là lựa chọn được ngay từ đầu những tế bào mang gen chuyển mong muốn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Tiến Lung

SỬ DỤNG KỸ THUẬT FISH ĐỂ KIỂM TRA

SỰ HỘI NHẬP CỦA GEN IL–6 PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI

TRONG TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

BÌA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Tiến Lung

SỬ DỤNG KỸ THUẬT FISH ĐỂ KIỂM TRA

SỰ HỘI NHẬP CỦA GEN IL–6 PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI

TRONG TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Tiến Lung

SỬ DỤNG KỸ THUẬT FISH ĐỂ KIỂM TRA

SỰ HỘI NHẬP CỦA GEN IL–6 PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI

TRONG TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 60.42.0114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Lai Thành

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cố GS.TS Nguyễn Mộng Hùng, nguyên Trưởng phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, người đã sáng lập nên phòng thí nghiệm nơi tôi học tập và làm việc hơn năm năm qua Trong những ngày tháng ít ỏi được làm việc cùng thầy, tôi đã học hỏi được rất nhiều điều, không chỉ kiến thức, thao tác thực hiện thí nghiệm mà cả sự kiên trì, tìm tòi, chịu khó Thầy đã truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu về công nghệ tế bào động vật, đặc biệt là trong lĩnh vực công nghệ tế bào gốc

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Lai Thành, người thầy đã hướng dẫn tôi thực hiện cả khóa luận tốt nghiệp Đại học và luận văn cao học Thầy đã rất tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm làm việc giúp tôi hoàn thành những nghiên cứu này Trong quá trình làm việc, tôi luôn nhận được những lời nhận xét, góp ý quý báu từ thầy để có thể thực hiện tốt nghiên cứu của mình Không những vậy, trong cuộc sống, tôi cũng luôn nhận được sự giúp đỡ của thầy

Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, học viên và sinh viên phòng Công nghệ Tế bào Động vật, đặc biệt là CN Đinh Duy Thành đã chỉ dẫn, giúp đỡ trong thời gian tôi thực hiện nghiên cứu này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô công tác tại bộ môn Sinh học Tế bào cũng như các thầy cô trong Khoa Sinh học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức cơ sở để tôi có thể thực hiện được luận văn cũng như vận dụng trong công việc sau này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein – trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu Gia cầm Thụy Phương – Viện Chăn nuôi Quốc gia đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân đã quan tâm, động viên tinh thần trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng, nghiên cứu của tôi được thực hiện dựa trên kinh phí hỗ trợ từ đề tài thuộc Trung tâm Nghiên cứu Châu Á, Đại học Quốc gia Hà Nội “Sử dụng kỹ thuật FISH để kiểm tra sự hội nhập của gen IL–6 phân lập từ người trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen” do TS Nguyễn Lai Thành làm Chủ nhiệm đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm cũng như Chủ nhiệm đề tài

Hà Nội, tháng 12 năm 2013

Nguyễn Tiến Lung

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN 3

1.1.CHUYỂN GEN Ở GÀ 3

1.1.1.Các phương thức chuyển gen vào tế bào 3

1.1.2.Các phương pháp tạo gà chuyển gen 5

1.1.3.Những ứng dụng của gà chuyển gen 10

1.2.KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH) 12

1.2.1.Nguyên lý 12

1.2.2.Đầu dò cho phản ứng lai 13

1.2.3.Ưu điểm của kỹ thuật FISH 18

1.2.4.Ứng dụng của kỹ thuật FISH 19

1.3.INTERLEUKIN 6 Ở NGƯỜI 22

1.3.1.Giới thiệu 22

1.3.2.Chức năng 23

1.3.3.Những ứng dụng lâm sàng 24

1.3.4.Gen mã hóa IL–6 ở người 25

Chương 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1.ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 26

2.1.1.Đối tượng – vật liệu nghiên cứu 26

2.1.2.Dụng cụ và vật tư tiêu hao 29

2.1.3.Thiết bị nghiên cứu 29

2.1.4.Hoá chất sử dụng 30

2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.2.1.Tổng hợp đầu dò gắn huỳnh quang cho phản ứng lai FISH 32

2.2.2.Thu nhận tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người 34

2.2.3.Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) 38

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1.TỔNG HỢP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP

PCR 40

3.1.1.Thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen IL – 6 40

3.1.2.Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR 46

3.1.3.Kết quả tổng hợp đầu dò bằng phản ứng PCR 49

3.2.THU NHẬN TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN IL–6 NGƯỜI 50

3.2.1.Phân lập và nhân nuôi tế bào gốc phôi gà 50

3.2.2.Thu nhận và duy trì tế bào gốc phôi gà chuyển gen 52

3.2.3.Kiểm tra sự có mặt gen chuyển trong tế bào bằng phản ứng PCR 54

3.3.KẾT QUẢ LAI FISH PHÁT HIỆN GEN IL–6 TRONG cESCs 55

3.4.THẢO LUẬN 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC A

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA

Hình 1 Chu trình tái bản của retrovirus và cách thức sản xuất vector retrovirus 4

Hình 2 Mô hình chuyển gen thông qua trung gian tế bào ở gà 8

Hình 3 Quy trình của kỹ thuật FISH 12

Hình 4 Cấu trúc một số chất đánh dấu huỳnh quang thường được sử dụng 14

Hình 5 Vị trí của các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào ở kỳ trung gian 19

Hình 6 Kiểu nhân phổ của nhiễm sắc thể tủy xương bệnh nhân đa u tủy 21

Hình 7 Một số ảnh hưởng của IL–6 trong cơ thể 23

Hình 8 Cấu trúc vector pLenti6/V5–DEST Gateway (ViraPower) của Invitrogen 27

Hình 9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 32

Hình 10 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi với cADN của gen IL–6 42

Hình 11 Kết quả xác định vị trí tương đồng giữa cADN và mARN gen IL–6 43

Hình 12 Kết quả kiểm tra vị trí chèn của gen IL–6 trên vector 44

Hình 13 Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của đầu dò trên vector 45

Hình 14 Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp giữa đầu dò với hệ gen gà bằng BLASTn 46

Hình 15 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi và nồng độ ion Mg2+ tới hiệu suất phản ứng PCR 47

Hình 16 Kết quả giải trình tự nucleotide các sản phẩm PCR và so sánh với trình tự đầu dò theo lý thuyết 48

Hình 17 Kết quả điện di sản phẩm PCR tổng hợp đầu dò 49

Hình 18 cESCs 24 giờ nuôi cấy in vitro sau khi phân lập 51

Hình 19 cESCs nuôi cấy trên lớp tế bào nuôi 52

Hình 20 Đánh giá ảnh hưởng của lentivirus tới sự sinh trưởng của cESCs 53

Hình 21 Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào chuyển gen 54

Hình 22 Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào qua các lần cấy chuyển 55

Hình 23 Kết quả lai FISH trên tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người 56

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Một số chất đánh dấu huỳnh quang và thuốc nhuộm sử dụng trong

FISH 15Bảng 2 Vai trò của một số yếu tố chính của vector pLenti6/V5–DEST Gateway 28Bảng 3 Dụng cụ và vật tư tiêu hao được sử dụng trong đề tài 29Bảng 4 Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài 29Bảng 5 Các hóa chất được sử dụng trong đề tài 30Bảng 6 Thành phần phản ứng PCR tối ưu hóa điều kiện tổng hợp của mồi IL–6 33Bảng 7 Thành phần môi trường nuôi cấy cESCs 35Bảng 8 Thành phẩn phản ứng PCR phát hiện gen chuyển trong tế bào 37Bảng 9 Kết quả thiết kế cặp mồi sử dụng chương trình Primer3 41

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Viết đầy đủ

ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BLAST Basic Local Alignment Search Tool BSA Bovine serum albumin

cESCs Chicken Embryonic Stem Cells cADN Complementary ADN

CMV Cytomegalovirus DAPI 4',6–diamidino–2–phenylindole DIG Digoxigenin

DNase Deoxyribonuclease EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FBS Fetal Bovine Serum

FISH Fluorescence in situ hybridization

HIV Human Immunodeficiency Virus IL–6 Interleukin – 6

LTR Long Terminal Repeats NCBI National Center for Biotechnology Information PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction PGCs Primordial germ cells RNase Ribonuclease

SDS Sodium dodecyl sulfate SSC Saline – sodium citrate buffer SSCs Spermatogonial Stem Cells

Ta Annealing template

Tm Melting temperature

MỞ ĐẦU

Sử dụng động vật chuyển gen để sản xuất các loại protein dược phẩm là hướng đi đã được quan tâm từ lâu Trong lĩnh vực này, gia cầm chuyển gen đang được chú ý đến với một số lợi thế vượt trội so với động vật có vú như thời gian tạo dòng ngắn, trứng có môi trường vô trùng tự nhiên, thành phần protein lòng trắng trứng đơn giản nên dễ tách sản phẩm chuyển gen,… Tính đến nay, nhiều protein dược phẩm tái tổ hợp ở người đã được nghiên cứu tạo ra từ gà chuyển gen, trong đó một số sản phẩm đã bước vào giai đoạn thử nghiệm như kháng thể đơn dòng miR24 điều trị khối u ác tính, interferon β–1a chữa trị đa xơ cứng và interferon α–2a có trong thuốc Roferon A chữa viêm gan C, ung thư máu Những nghiên cứu về gà chuyển gen gần đây tập trung chủ yếu vào phương pháp thông qua các tế bào gốc phôi, với ưu điểm là lựa chọn được ngay từ đầu những tế bào mang gen chuyển mong muốn trước khi tiêm chúng vào phôi nhận, do đó tiết kiệm được thời gian cũng như chi phí cho quá trình sàng lọc cơ thể chuyển gen từ bố mẹ khảm

Để tạo động vật chuyển gen hiệu quả thì cần phải có các hệ thống vector đủ mạnh để chuyển được gen mong muốn với hiệu suất cao, duy trì ổn định trong cơ thể vật chủ Hệ thống được sử dụng thường xuyên nhất dựa vào retrovirus (virus ARN) trong đó sử dụng các enzyme của bản thân và bộ máy phiên mã trong tế bào chủ để sao chép hệ gen của chúng, sau đó tích hợp nó vào nhiễm sắc thể vật chủ trong quá trình phân bào Gần đây, một nhóm nhỏ của retrovirus là lentivirus đã được coi như một công cụ hứa hẹn trong chuyển gen Chúng mang đầy đủ các ưu điểm của retrovirus, hơn nữa còn có khả năng chèn gen vào tế bào không phân chia, loại vector này đặc biệt hiệu quả đối với tế bào gốc phôi do loại tế bào này rất khó chuyển gen bằng các phương pháp khác

Trong quá trình tạo động vật chuyển gen, các bước sàng lọc tế bào hay cơ thể mang gen mong muốn đóng vai trò rất quan trọng Gen chuyển cần được cài vào ADN trong nhân tế bào để đảm bảo di truyền cho thế hệ sau qua con đường sinh sản hữu tính, đồng thời phải được duy trì bền vững qua nhiều thế hệ động vật Ngoài ra,

gen chuyển phải nằm ở vị trí thích hợp: trong vùng ADN hoạt động, không chèn vào giữa gen cấu trúc hay các vùng ADN giữ chức năng điều hòa, Vì vậy, các kỹ thuật nhằm xác định vị trí gen trong bộ nhiễm sắc thể đã được phát triển, trong số

đó ít tốn kém và dễ thực hiện nhất là kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescence

in situ hybridization – FISH) Cơ sở của kỹ thuật FISH dựa trên sự bắt cặp chính

xác giữa giữa ADN đích và đầu dò đánh dấu huỳnh quang có trình tự tương đồng Đây là một trong những kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử và chẩn đoán nhằm phát hiện những bất thường trên nhiễm sắc thể, nghiên cứu cấu trúc và chức năng tế bào, lập bản đồ kiểu nhân, xây dựng hệ thống phát sinh loài,

Có thể nói FISH là cầu nối giữa lĩnh vực di truyền học cổ điển với di truyền học hiện đại, kết hợp sự chính xác của các kỹ thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực quan từ kính hiển vi

Ở Việt Nam, một số bệnh viện lớn như Bệnh viện K, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, Bệnh viên Nhi Trung ương, đã sử dụng kỹ thuật này để chẩn đoán một số bệnh di truyền ở người Tuy nhiên trong nghiên cứu cơ bản, việc ứng dụng

nó còn rất hạn chế Đến nay, chưa có báo cáo nào về việc sử dụng để đánh giá sự chèn gen ngoại lai vào hệ gen của tế bào động vật Mặt khác, trong những nghiên cứu trên, đầu dò sử dụng đều là các sản phẩm thương mại, hoặc được tự thiết kế nhưng đặt tổng hợp tại các hãng nổi tiếng, chưa tự tổng hợp tại phòng thí nghiệm sử dụng chúng

Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá về tiềm năng ứng dụng vector chuyển gen lentivirus đối với tế bào gốc phôi gà, sử dụng kỹ thuật FISH để phát hiện vị trí gen chuyển IL–6 trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen, từ

đó tạo tiền đề cho việc tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc Nghiên cứu này cũng góp phần phát triển kỹ thuật FISH trong nghiên cứu cơ bản ở Việt Nam

Chương 1 – TỔNG QUAN

1.1 CHUYỂN GEN Ở GÀ 1.1.1 Các phương thức chuyển gen vào tế bào

1.1.1.1 Chuyển gen sử dụng vector virus

Các hệ thống chuyển gen hiệu quả nhất hiện nay khai thác tiềm năng của virus động vật đã tiến hóa hàng triệu năm qua Những vector virus được tạo ra bằng cách thay thế một hoặc một số gen của chúng bằng gen mong muốn Ưu điểm của

hệ thống chuyển gen sử dụng virus là hiệu suất chuyển gen khá cao và ổn định Tuy nhiên, chúng có nhược điểm về độ an toàn, cũng như phản ứng miễn dịch của vật chủ loại bỏ tác nhân virus Những nhược điểm này đang dần được khắc phục trong những vector tái bản thiếu thế hệ mới [58]

Đối với gia cầm, chuyển gen bằng retrovirus và lentivirus thu được nhiều thành công nhất trừ trước đến nay Retrovirus có vật chất di truyền là ARN, mang

ba gen chính là gag (mã hóa kháng nguyên kết hợp nhóm), env (mã hóa protein vỏ)

và pol (mã hóa enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase và enzyme hội nhập

intergrase) Sau khi thâm nhiễm vào tế bào chủ (đang trong giai đoạn phân chia), ARN phiên mã ngược thành ADN, từ đó hợp nhất với ADN tế bào chủ, trở thành một bộ phận ổn định và hoạt động như các gen khác trong tế bào, có thể di truyền lại cho các thế hệ sau Nhờ tín hiệu đóng gói tương thích (), ARN phiên mã từ hệ gen virus kết hợp trở lại với các protein virus (đều được tạo ra nhờ bộ máy tổng hợp của tế bào chủ), tạo nên các hạt virus mới (Hình 1A) Khi thiết kế vector, người ta chỉ sử dụng tín hiệu  và hai trình tự dài lặp lại ở hai đầu (long terminal repeat – LTR), gen chuyển được chèn vào giữa hai LTR này Vector cần có một dòng tế bào đóng gói chứa retorvirus cải biến, có khả năng tạo ra các protein virus nhưng không

có tín hiệu  (Hình 1B) Nhờ vậy, các hạt virus mới được sinh ra chỉ chứa vector chuyển gen quan tâm, không có khả năng tạo nên các virus khác [5, 72, 74] Gần đây, một nhóm nhỏ của retrovirus là lentivirus cũng được sử dụng rộng rãi trong

chuyển gen Chúng mang đầy đủ các ưu điểm của retrovirus, hơn nữa còn có khả năng thâm nhiễm vào tế bào không phân chia [58, 74]

Hình 1 Chu trình tái b ản của retrovirus v à cách th ức sản xuất vector retrovirus

Chu trình tái bản của retrovirus (hình trái): Virus xâm nhập vào tế bào chủ, sử dụng enzyme phiên mã ngược để tổng hợp ADN từ ARN của mình; ADN này hội nhập vào hệ gen tế bào, sử dụng bộ máy tổng hợp của tế bào để phiên mã thành ARN và dịch mã tạo các protein virus; các protein này đóng gói ARN lại tạo thành các hạt virus mới và giải phóng vào môi trường Khi sản xuất vector retrovirus (hình phải), vector đóng gói mang các gen mã hóa protein virus nhưng không có tín hiệu đóng gói (  –), nên vector tạo thành chỉ chứa cấu trúc gen chuyển trong vector retrovirus (chứa tín hiệu đóng gói  +) [72]

1.1.1.2 Chuyển gen không dùng virus

Việc chuyển gen không sử dụng virus trên tế bào động vật đã được thực hiện

từ cách đây hơn 40 năm, chúng có ưu điểm về độ an toàn, không gây miễn dịch và đơn giản, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn nhiều so với khi sử dụng virus Những phương pháp được sử dụng nhiều hiện nay bao gồm các phương pháp vật lý (vi

tiêm, xung điện, súng bắn gen, ) hoặc sử dụng hóa chất (calcium phosphate, DEAE–dextran, liposome, ) [77]

Phương pháp vật lý được sử dụng thường xuyên nhất là sử dụng xung điện (electroporation) Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên đặc điểm màng tế bào hoạt động như một tụ điện không cho dòng điện đi qua Người ta sử dụng hiệu điện thế cao gây sốc trong một thời gian ngắn làm tăng tạm thời điện thế màng tế bào lên xấp xỉ 1V Kết quả là xảy ra sự tái tổ chức các thành phần trên màng một cách đáng

kể, tạo ra những kênh vận chuyển nước hoặc các lỗ ADN thẩm thấu vào trong tế bào qua đó [34, 66] Phương pháp này có những ưu điểm như chuyển gen hiệu quả,

áp dụng được với đa số các loại tế bào, có thể tiến hành với mô còn nguyên vẹn [77] Tuy nhiên, xung điện ảnh hưởng lớn tới khả năng sống sót và sinh trưởng của

tế bào (sự chuyển nhiễm tối ưu có thể đạt được trong điều kiện gây chết tới 50% số lượng tế bào) [61, 77]

Các phương pháp hóa học đều có bản chất là sự liên kết giữa phần mang điện tích dương của hóa chất sử dụng với gốc phosphate âm của bộ khung acid nucleic, hình thành phức hệ đại phân tử (polyplex) Phức hệ này được đưa vào trong tế bào chủ yếu bằng con đường thực bào Vì vậy, phương thức này có ưu điểm là không ảnh hưởng lớn tới tế bào, tuy nhiên thao tác thực hiện tương đối phức tạp, đồng thời nhiều loại tế bào khó chuyển nhiễm bằng những hóa chất này Kết tủa calcium phosphate và DEAE–dextran được sử dụng sớm nhất và hiện nay vẫn còn phổ biến, ngoài ra còn nhiều loại hóa chất khác như các phân tử polycationic (dendrimers polyamidoamine), polypeptide (polylysine, polyornithine, các dạng kết hợp giữa chúng) và polyethylenimine [77]

1.1.2 Các phương pháp tạo gà chuyển gen

1.1.2.1 Vi tiêm trực tiếp ADN vào đĩa phôi giai đoạn sớm

Vi tiêm ADN ngoại lai vào nhân nguyên của trứng mới thụ tinh là phương pháp đầu tiên được sử dụng để tạo động vật có vú chuyển gen và hiện nay vẫn rất phổ biến Trên gà, phương pháp này cũng thu được thành công nhất định: Love và

cộng sự vi tiêm trực tiếp ADN vào hợp tử, thu được bảy cá thể gà chuyển gen sống sót đến khi trưởng thành, trong đó 3,4% gà con thế hệ tiếp theo nhận gen chuyển từ một cơ thể gà trống thu được [53] Tuy vậy, phương pháp này bộc lộ rất nhiều nhược điểm Trước hết, phương pháp này không thể thao tác với số lượng lớn, do mỗi ngày chỉ có một quả trứng rụng và việc kích thích siêu bài noãn ở gà khó hơn nhiều so với ở động vật có vú Thêm vào đó, để thu được mỗi trứng mới thụ tinh, người ta phải giết một con gà mái, đồng thời trứng sau vi tiêm phải được bao bọc trong lớp lòng trắng và vỏ đá vôi như tự nhiên để có thể phát triển [18, 51]

Các nhà nghiên cứu đã thay đổi phương pháp này phù hợp với gia cầm bằng cách tiếp cận hai giai đoạn: đĩa phôi của trứng chưa ấp (giai đoạn X theo hệ thống phân chia của Eyal–Giladi, Kochav [41]) và phôi sau khoảng 55–72 giờ ấp (giai đoạn 17–20 theo hệ thống phân chia của Humberger và Hamilton [27]) Kwon và cộng sự tạo gà chuyển gen mã hóa protein phát huỳnh quang màu xanh lá cây tăng cường (Enhanced Green Fluorescence Protein – EGFP) bằng cách vi tiêm vector retrovirus vào đĩa phôi giai đoạn X, trong đó nhiều bộ phận như đầu, chi, mắt và một số nội tạng đều biểu hiện EGFP [43] Nhóm nghiên cứu của Kamihira đã chứng minh gen chuyển có khả năng biểu hiện cao khi được tiêm vào phôi 55–60 giờ ấp

Họ tiêm vector retrovirus chứa các gen mã hóa chuỗi đơn Fv và Fc của globulin miễn dịch G1 của người vào phôi gà, tạo được gà chuyển gen biểu hiện protein này trong huyết thanh và lòng trắng trứng (khoảng 5,6 mg/ml) [36] Ở Việt Nam, năm

2010, Nguyễn Thị Hồng Hạnh và cộng sự cũng đã báo cáo về việc tạo gà chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm vector vào đĩa phôi giai đoạn X, trong đó gen chuyển được phát hiện trong máu gà con sinh ra bằng phương pháp PCR [2]

1.1.2.2 Chuyển gen qua tinh trùng

Đây là phương pháp dựa trên khả năng của tinh trùng có thể lưu giữ ADN ngoại sinh và chuyển nó vào trứng trong quá trình thụ tinh Tinh trùng được ủ trực tiếp với ADN trần, ngoài ra người ta có thể tăng cường hiệu quả quá trình này bằng cách sử dụng xung điện hay các chất hóa học như liposome, calcium phosphate,

DEAE–dextran Tinh trùng mang ADN được thụ tinh nhân tạo, thụ tinh trong ống nghiệm hay có thể được tiêm trực tiếp vào trứng Lợi thế lớn nhất của phương pháp này là hiệu quả chuyển gen cao, giá thành thấp, dễ thực hiện [39, 47].

Sử dụng phương pháp này, năm 2000, Harel-Markowitz và cộng sự đã tạo được gà chuyển gen mã hóa EGFP và hormone kích thích nang trứng (follicle stimulating hormone – FSH) của người, trong đó tinh trùng được ủ với plasmid và một loại liposome là Lipofectamine® ADN ngoại lai đã được phát hiện trong mẫu

mô gan, da, tim và bạch huyết bằng kỹ thuật PCR, cũng như được chứng minh biểu hiện bằng RT–PCR và miễn dịch phóng xạ [28] Mới nhất, năm 2013, nhóm nghiên cứu của Samoylov đã tạo gà chuyển gen mã hóa nhân tố kích tích tạo quần lạc bạch cầu hạt (Granulocyte Colony–Stimulating Factor – gcsf) của người, sử dụng Lipofectamin® 2000 để tăng hiệu quả hấp thu ADN của tinh trùng Kết quả có 33,3% gà con sinh ra mang gen chuyển mong muốn, với hàm lượng protein gcsf trong huyết thanh đạt khoảng 50–220 pg Sử dụng những gà trống này thụ tinh nhân tạo với gà mái bình thường đã thu được 37,5% gà con thế hệ tiếp theo mang gen chuyển [73] Ở Việt Nam, Lê Thị Tuyết và cộng sự đã công bố nghiên cứu chuyển gen qua tinh trùng ở gà năm 2010, trong đó phát hiện được gen chuyển ở nhiều mô,

cơ quan khác nhau của gà con thế hệ tiếp theo [10]

1.1.2.3 Chuyển gen thông qua trung gian tế bào

Các phương pháp trên đều có nhược điểm là gen chuyển được tích hợp ngẫu nhiên vào nhiễm sắc thể của phôi, do đó không đánh giá sớm được ảnh hưởng của

vị trí chèn gen đến sức sống của gà con sinh ra Gần đây, người ta sử dụng các tế

bào nuôi cấy in vitro làm trung gian cho quá trình tạo gà chuyển gen, nhờ đó sàng

lọc ngay từ đầu những tế bào mang gen chuyển ở vị trí mong muốn, giảm thời gian cũng như chi phí đánh giá và chọn lọc kiểu hình cơ thể biến đổi di truyền [6, 88] Những loại tế bào được quan tâm gồm: tế bào gốc phôi, tế bào sinh dục nguyên thủy và tế bào gốc tinh nguyên bào (Hình 2)

Hình 2 Mô hình chuyển gen thông qua trung gian tế bào ở gà

Các tế bào gốc phôi (ESCs) hoặc tế bào sinh dục nguyên thủy (PGCs) thu nhận từ phôi được chuyển nhiễm với vector mang gen mong muốn, những tế bào mang gen chuyển được sàng lọc và vi tiêm trở lại phôi nhận, từ đó thu được gà khảm Phương pháp tương tự cũng được tiến hành với tế bào gốc tinh nguyên bào (SSCs) thu nhận từ tinh hoàn gà trống, những tế bào mang gen chuyển được tiêm trở lại vào tinh hoàn gà trống đã triệt sản [51]

Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem Cell – ESCs) là những tế bào đa tiềm năng chưa biệt hoá, trong điều kiện thích hợp có khả năng biệt hóa thành tất cả các loại tế bào có nguồn gốc từ ba lá phôi Bên cạnh đó, ESCs có khả năng tự duy trì và nhân lên trong thời gian dài Vì vậy chúng trở thành công cụ hữu hiệu trong việc tạo động vật chuyển gen [4, 46] Năm 1990, Petitte đã lần đầu tiên tạo được gà khảm bằng phương pháp vi tiêm các tế bào đĩa phôi vào phôi giai đoạn X [68] Đến năm

2006, Wang đã chuyển gen thành công vào ESCs bằng liposome và vector virus Sử dụng các tế bào này tiêm vào phôi nhận, nhóm nghiên cứu đã thu được gà con mang gen chuyển ở hầu hết các mô cơ thể với một bản sao duy nhất Tuy nhiên, sự đóng góp của các tế bào biến đổi di truyền vào dòng tinh là không thể hoặc hiệu suất rất thấp [92] Đến nay, chưa có báo cáo nào về việc ESCs sau khi nuôi cấy quá một

tuần có thể đóng góp vào dòng sinh dục của gà khảm, có thể việc nuôi cấy in vitro

đã làm ESCs mất dần khả năng này [51] Ở Việt Nam, năm 2012, Nguyễn Lai Thành và cộng sự cũng đã chuyển gen vào ESCs sử dụng vector lentivirus, sau khi tiêm chúng vào phôi nhận đã thu được gà con mang gen ở mô ruột Tuy vậy các phôi được vi tiêm thường chết ở giai đoạn sớm của quá trình phát triển, chỉ có 10% trong số đó nở thành gà con, có thể do gen chuyển chèn vào những vị trí gen hoạt động, ảnh hưởng tới sức sống của phôi [6]

Một cách tiếp cận khác là hướng đến các tế bào sinh dục nguyên thủy (Primordial Germ Cells – PGCs) Đây là những tế bào đầu dòng của trứng và tinh trùng, có thể tìm thấy trong liềm mầm phôi giai đoạn 7–10 (sau 23–38 giờ ấp), sau

đó chúng lưu thông trong mạch máu phôi, đến các vị trí sau này hình thành tuyến sinh dục trưởng thành [62] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng PGCs sau khi

nuôi cấy in vitro vẫn có thể hội nhập được vào phôi nhận, đóng góp vào quá trình

tạo trứng và tinh trùng Van de Lavoir và cộng sự đã phân lập PGCs từ mạch máu phôi, chuyển gen và nuôi cấy trong thời gian dài (lên tới 209 ngày) vẫn có thể đóng góp vào sự hình thành các tế bào sinh dục khi được tiêm vào phôi giai đoạn X [87] Tuy nhiên, việc thu nhận PGCs từ máu của phôi gà gặp nhiều khó khăn do chúng chiếm tỷ lệ rất thấp (0,05% tổng số tế bào máu) [65] Một số nhóm nghiên cứu khác

đã tìm cách phân lập loại tế bào này từ các tuyến sinh dục phôi Shiue và cộng sự đã thu nhận PGCs từ phôi 5,5 ngày ấp (giai đoạn 28) Những tế bào này trải qua 281 ngày nuôi cấy vẫn duy trì các đặc điểm đặc trưng, và khi được tiêm vào động mạch chủ lưng của phôi 2,5 ngày ấp (giai đoạn 17) vẫn có khả năng tạo thành gà khảm dòng sinh dục [81] Motono và cộng sự cũng đã hoàn thiện phương pháp tạo gà chuyển gen bằng PGCs thu nhận từ phôi 2,5 và 5,5 ngày ấp, trong đó chứng minh rằng khả năng truyền lại gen chuyển của gà mái khảm tốt hơn so với gà trống [60]

Ngoài ra, một số phòng thí nghiệm đã hướng đến sử dụng tế bào gốc tinh nguyên bào (Spermatogonial Stem Cells – SSCs) làm trung gian cho quá trình chuyển gen SSCs mang những đặc điểm đặc trưng của tế bào gốc đa tiềm năng, chiếm khoảng 0,33–0,44% số lượng tế bào trong tinh hoàn gà con 4 tuần tuổi, 0,029–0,072% ở gà trưởng thành 24 tuần tuổi [35] Sử dụng những tế bào này tiêm vào ống sinh tinh của gà nhận, người ta đã thu được gà trống khảm trong tinh hoàn với hiệu suất lên tới 50% [67] Sự phát triển của phương pháp này giúp giảm thiểu đáng kể thời gian tạo gà chuyển gen, minh chứng là thời gian từ khi chuyển nhiễm vector vào tế bào cho đến khi gà khảm thế hệ tiếp theo được nở ra chỉ khoảng 38–

45 ngày (tiêm vào gà trưởng thành) cho đến 137–188 ngày (tiêm vào gà con) [49]

1.1.3 Những ứng dụng của gà chuyển gen

1.1.3.1 Tạo mô hình nghiên cứu y – sinh học

Gà được coi là hệ thống thử nghiệm quan trọng trong các lĩnh vực sinh học phát triển, miễn dịch học, vi sinh vật học Nhiều khám phá có ý nghĩa sinh học mang tính lịch sử (ví dụ như virus có khả năng gây nên khối u, hay các tế bào B là một nhóm nhỏ của tế bào lympho) được phát hiện lần đầu tiên ở gà [16] Các dòng

gà chuyển gen có thể sử dụng để khám phá chức năng của nhiều gen trong quá trình phát triển phôi thai của động vật có vú nói chung Năm 2006, nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Sheffield (Anh) đã đánh giá khả năng bất hoạt gen của các ARN can thiệp (iARN) trên mô hình phôi gà Kết quả, các iARN có khả năng làm im lặng một số gen trong khu vực đặc hiệu của hệ thống thần kinh phôi, với hiệu suất đạt

trên 90% [20] Năm 2010, McGrew và cộng sự đã chứng minh một trong những yếu

tố kiểm soát biểu hiện gen ở chuột nằm trên locus chuỗi nhẹ myosin 1/3 (myosin light chain 1/3 – MLC1/3) có khả năng hoạt động ở phôi gà Yếu tố này có thể điều

khiển sự biểu hiện của gen lacZ trong sợi cơ xương tương tự như ở chuột Đây là

một minh chứng cho thấy các yếu tố kiểm soát biểu hiện của một số gen trong quá trình phát triển có thể tương đồng giữa các loài, chúng có thể hoạt động trong mô hình phát triển tương đương [56]

1.1.3.2 Sản xuất protein tái tổ hợp

Việc sử dụng động vật có vú (bò, cừu, dê,…) chuyển gen làm “lò phản ứng sinh học” đã sản xuất được nhiều protein dược liệu từ sữa, như –1 antitrypsin, calcitonin, interleukin–2, erithropoeietin,… Sản lượng sản phẩm thu được từ động vật có vú rất ấn tượng, đối với bò là khoảng 8.000 lít sữa, với lượng protein tái tổ hợp có thể lên tới 40 kilogam mỗi năm [33]

Gần đây, gà chuyển gen được quan tâm hơn với nhiều lợi thế Thứ nhất, chúng có thời gian tạo dòng ngắn, chi phí chăn nuôi cũng thấp hơn so với các động vật có vú khác Thứ hai, trứng gà rất giàu protein, trong đó hơn một nửa (54%) được tạo bởi sự biểu hiện của gen duy nhất ovalbumin, do đó dễ dàng sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp với độ tinh khiết cao Thứ ba, trứng gà chứa nhiều chất

ức chế protease tự nhiên và môi trường vô trùng tạo điều kiện lý tưởng cho việc ổn định hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp Ngoài ra, mô hình glycosyl hóa nhiều protein ở người giống với gà hơn động vật có vú, đồng thời một số protein gây độc cho động vật có vú có thể được tạo ra ở gà [18, 52]

Tính đến nay, nhiều protein dược phẩm tái tổ hợp ở người đã được nghiên cứu tạo ra từ mô hình này, như chuỗi đơn Fv và Fc của globulin miễn dịch G1 [36], hormone kích thích nang trứng (FSH) [28], nhân tố kích tích tạo quần lạc bạch cầu hạt (gcsf) [73], Một số sản phẩm đã bước vào giai đoạn thử nghiệm như kháng thể đơn dòng miR24 điều trị khối u ác tính, interferon β–1a chữa trị đa xơ cứng và interferon α–2a có trong thuốc Roferon A chữa viêm gan C, ung thư máu [52]

1.2 KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH) 1.2.1 Nguyên lý

Cũng như các kỹ thuật lai acid nucleic khác, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ

(Fluorescence In Situ Hybryzation – FISH) dựa trên đặc tính biến tính và hoàn

nguyên của acid nucleic [85] Trong phản ứng lai, sự tương đồng trình tự giữa đầu

dò và ADN đích cho phép chúng kết hợp chính xác với nhau tạo thành phức hệ lai Tín hiệu huỳnh quang gắn trên đầu dò được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang, cho phép phát hiện và xác định vị trí của gen đích trên mẫu nghiên cứu (Hình 3) [94]

Hình 3 Quy trình c ủa kỹ thuật FISH

Mẫu phân tích (máu ngoại vi, tế bào nuôi cấy, tiêu bản cố định mô, ) được biến tính ADN và ủ với đầu dò đánh dấu có trình tự đặc hiệu ADN cạnh tranh (thường sử dụng ADN tinh trùng cá hồi) và thêm vào hỗn hợp lai nhằm giảm liên kết không đặc hiệu giữa đầu dò và ADN đích Sau khi lai và rửa nguyên liệu thừa, mẫu được phát hiện trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua kháng thể thứ cấp đặc hiệu gắn huỳnh quang [15, 94]

1.2.2 Đầu dò cho phản ứng lai

1.2.2.1 Đầu dò đánh dấu trực tiếp và gián tiếp

Những nghiên cứu đầu tiên về kỹ thuật lai tại chỗ được công bố vào cuối những năm 1960, đều sử dụng đầu dò đánh dấu phóng xạ (32P, 35S, 3H), tuy nhiên các chất phóng xạ có nhiều nhược điểm về độ an toàn, thời gian và chi phí tiến hành Từ những năm 1980, sau thí nghiệm lai sử dụng đầu dò ADN gắn biotin và kháng thể đánh dấu huỳnh quang của Langer và Safer, các chất đánh dấu huỳnh quang đã dần thay thế các chất phóng xạ Đầu dò huỳnh quang thể hiện một số ưu điểm nổi bật hơn hẳn so với loại đầu dò phóng xạ: độ bền và độ an toàn cao, ít gây hại với môi trường và con người, kết quả lai thu được chính xác, đánh dấu được với nhiều loại thuốc nhuộm phát xạ tại những bước sóng khác nhau cho phép phát hiện nhiều trình tự đích chỉ với một lần lai Đặc biệt, sử dụng chất đánh dấu huỳnh quang thu được tín hiệu ở chính xác vị trí bắt cặp, trong khi các đầu dò phóng xạ có thể chỉ cho phép quan sát được tín hiệu trong ảnh chụp nhiễu xạ cách vị trí bắt cặp một khoảng nhất định Có hai loại đầu dò huỳnh quang theo phương pháp phát hiện vị trí lai: trực tiếp và gián tiếp [59]

Trong phương pháp gián tiếp, các phân tử đánh dấu (như biotin, digoxigenin – DIG, dinitrophenol) được gắn vào đầu dò, sau đó mẫu lai được phát hiện bằng kháng thể thứ cấp đánh dấu huỳnh quang tương ứng Hệ thống phổ biến nhất hiện nay sử dụng biotin (Hình 4), được phát triển bởi David Ward và cộng sự từ năm

1981 [44] Đầu dò gắn biotin sau phản ứng lai được phát hiện bởi nhiều thuốc thử khác nhau, thường sử dụng nhất là streptavidin và avidin do chúng có khả năng liên

kết với biotin tốt nhất (trong đó streptavidin được ưa thích hơn do điểm đẳng điện gần như trung tính giúp giảm liên kết không đặc hiệu [59] Ngoài hệ thống sử dụng biotin, các đầu dò gắn DIG (Hình 4) cũng thường xuyên được sử dụng DIG là

steroid có nguồn gốc duy nhất từ hoa và lá của một số thực vật chi Digitalis (như D

purpureaand, D lanata), do đó kháng thể kháng DIG hầu như không gắn kết với

các vật liệu sinh học khác Trong lai FISH, các kháng thể kháng DIG có thể được kết hợp với alkaline phosphatase, peroxydase, Rhodamine,… [31] Phương pháp sử dụng đầu dò gián tiếp có ưu điểm là tạo ra các tín hiệu huỳnh quang cường độ cao, nhưng chúng gặp bất lợi khi cần thêm bước ủ để liên kết phức hệ lai và kháng thể thứ cấp gắn huỳnh quang [59]

Hình 4 Cấu trúc một số chất đánh dấu huỳnh quang thường được sử dụng

Đối với phương pháp trực tiếp, các phân tử báo cáo được gắn trực tiếp vào đầu dò và từ đó có thể quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ngay sau phản ứng lai mà không cần thêm bước ủ kháng thể thứ cấp Những chất huỳnh quang thường được sử dụng trong trường hợp này là các hợp chất thuộc các nhóm coumarin, fluorescein, rhodamine và cyanine (Bảng 1) Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản hơn phương pháp gián tiếp, hiện tượng nhiễu nền thấp Tuy nhiên, tín

hiệu thu được có cường độ yếu hơn Người ta có thể cái tiến bằng cách sử dụng thêm kháng thể thứ cấp gắn chất phát huỳnh quang mạnh, khi đó nó không khác phương pháp phát hiện gián tiếp như đã trình bày ở trên [59]

B ảng 1 M ột số ch ất đánh dấu huỳnh quang v à thu ốc nhuộm sử dụng trong FISH

Huỳnh quang Ex (nm) Em (nm)

Các chất đánh dấu 7–Amino–4–methylcoumarin–3–acetic acid, NHS (AMCA) 354 411 7–Diethylaminocoumarin–3–carboxylic acid, NHS 432 472

Fluorescein–5/6–isothiocyanate (FITC) 494 519 Tetramethylrhodamine–5/6–isothiocyanate (TRITC) 544 572 Oregon Green® 488 isothiocyanate 493 520 Rhodamine Green™ carboxylic acid, NHS 504 532

Ex: đỉnh hấp thụ; Em: đỉnh phát quang; NHS: N–Hydroxysuccinimidyl Ester

Gần đây, người ta có thể sử dụng kết hợp nhiều đầu dò gắn các chất huỳnh quang khác nhau, từ đó thu được nhiều tín hiệu khác nhau trên cùng một mẫu lai Phương pháp này được ứng dụng hiệu quả khi phân tích kiểu nhân sinh vật [59]

1.2.2.2 Các phương pháp đánh dấu đầu dò

Ba phương pháp thông dụng được sử dụng để đánh dấu đầu dò là dịch chuyển điểm đứt (nick translation), kéo dài mồi ngẫu nhiên (random primed) và PCR Cả ba phương pháp này đều sử dụng hoạt tính enzyme để gắn deoxyribo–nucleotide triphosphate đánh dấu lên phân tử đầu dò

Phương pháp dịch chuyển điểm đứt

Phương pháp dịch chuyển điểm đứt sử dụng đồng thời hoạt tính của hai loại enzyme là ADN polymerase và DNase Đầu tiên, DNase I tạo ra một điểm đứt trên phân tử ADN làm bộc lộ đầu 3’–OH Điểm đứt được dịch chuyển dần nhờ hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của enzyme ADN polymerase I Trong khi đó, enzyme ADN polymerase I bám vào đầu 3’–OH và tổng hợp kéo dài chuỗi nhờ hoạt tính 5’ – 3’ polymerase Klenow của nó Trong suốt quá trình tổng hợp, nucleotide đánh dấu được bổ sung vào hỗn hợp phản ứng sẽ thay thế một trong số các phân tử dNTP và được cài nhập vào sợi ADN đang được tổng hợp, kết quả là tạo thành phân tử đầu

dò được đánh dấu Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong đánh dấu đầu

dò cho FISH, với ưu điểm là tạo ra được đầu dò có kích thước tối ưu bằng cách điều chỉnh nồng độ DNase Phản ứng đánh dấu thực hiện tối ưu trong 60–90 phút, với kích thước đầu dò khoảng 200–500 bp [21, 22, 59]

Phương pháp tổng hợp kéo dài mồi ngẫu nhiên

Phương pháp tổng hợp kéo dài mồi ngẫu nhiên (còn được gọi là đánh dấu oligo) dựa trên phản ứng lai của hexanucleotide với sợi ADN khuôn nhờ hoạt tính kéo dài chuỗi của tiểu đơn vị Klenow thuộc enzyme ADN polymerase I Bước đầu tiên của phương pháp là gây biến tính ADN tạo ra sợi đơn, sau đó cho các đoạn hexanucleotide bắt cặp ngẫu nhiên với ADN khuôn, các đoạn này được dùng như mồi cho đoạn Klenow của ADN polymerase I tổng hợp kéo dài ADN, với nguyên liệu là các nucleotide đánh dấu [22, 93] Đầu dò thu được có kích thước tối ưu trong khoảng 200–1000 bp, với lượng từ 30–70 ng (với 10 ng mẫu ban đầu, ủ trong 1 giờ) đến 2,10–2,65 mg (3 mg mẫu ban đầu, ủ 20 giờ) Nhược điểm lớn của phương pháp

này là khó kiểm soát kích thước đầu dò, do đó tín hiệu thu được yếu và thường bị nhiễu Tuy nhiên, phương pháp này vẫn được lựa chọn với mục đích phát hiện các gen đơn bản trong hệ gen bằng kỹ thuật Southern blot [22, 59, 93]

Phương pháp PCR

Các deoxynucleotide gắn huỳnh quang có thể được enzyme ADN Taq

polymerase sử dụng như một cơ chất phản ứng trong PCR, tạo ra các phân tử ADN được đánh dấu Phương pháp này vừa có độ đặc hiệu, độ nhạy cao hơn các phương pháp đánh dấu khác, vừa cho phép tạo ra đầu dò với hiệu suất lớn (lên tới một triệu bản sao sau 20 chu kỳ phản ứng) Hơn nữa, với phương pháp PCR, người sử dụng

có thể kiểm soát kích thước đầu dò thông qua vị trí đầu 5’ của cặp mồi dùng trong phản ứng, nhờ đó tạo ra đầu dò có kích thước tối ưu phù hợp với mục đích thí nghiệm (thông thường kích thước đầu dò tổng hợp theo phương pháp này khoảng 200–600 bp) [19, 59]

Đầu dò trình tự lặp lại trên nhiễm sắc thể được tạo thành từ các trình tự lặp lại ở tâm động hoặc đầu mút Ví dụ như đầu dò đầu mút nhiễm sắc thể (với trình tự oligonucleotide TTAGGG lặp lại nhiều lần) có khả năng liên kết với tất cả các nhiễm sắc thể trong tế bào [37] Đầu dò bắt cặp với các trình tự lặp lại đặc trưng

trên từng nhiễm sắc thể thường xuyên được sử dụng hơn, với việc sử dụng các màu huỳnh quang khác nhau để nhuộm các nhiễm sắc thể khác nhau Loại này đặc biệt thích hợp cho việc phát hiện các trường hợp đơn nhiễm (monosomy), tam nhiễm (trisomy) và các dị bội khác [57]

Đầu dò toàn bộ nhiễm sắc thể là tập hợp các đầu dò nhỏ hơn, lai với các trình

tự khác nhau dọc theo chiều dài của cùng một nhiễm sắc thể, nhờ đó, có thể nhuộm màu toàn bộ nhiễm sắc thể Hình ảnh phân tích nhiễm sắc thể cho phép phân biệt các nhiễm sắc thể dựa trên màu sắc của chúng Phương pháp này thể hiện tính ưu việt hơn hẳn so với phương pháp lập bản đồ kiểu nhân dựa vào mô hình nhuộm băng truyền thống, đặc biệt là cho việc phân tích tính bất thường nhiễm sắc thể [54, 55] Người ta có thể sử dụng tới 24 màu huỳnh quang để đánh dấu các nhiễm sắc thể, từ đó phát triển hai kỹ thuật FISH độc lập nhau là đa màu (Multiplex FISH – M-FISH) và kiểu nhân phổ (Spectral Karyotyping – SKY) Đây đều là những kỹ

thuật đột phá, thường xuyên được sử dụng trong chẩn đoán và nghiên cứu [12, 38]

1.2.3 Ưu điểm của kỹ thuật FISH

Kỹ thuật FISH được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử và chẩn đoán điều trị Nó có thể được ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh với các khiếm khuyết nhiễm sắc thể có khả năng di truyền, phát hiện sau sinh các thay đổi di truyền, nghiên cứu về khối u, cấu trúc và chức năng tế bào, Một lợi thế nữa từ kỹ thuật FISH là cho phép quan sát từng nhiễm sắc thể trên kiểu nhân, qua đó nhận dạng được từng gen, nhiễm sắc thể và các bất thường di truyền [90, 91] FISH cũng được ứng dụng để xác định vị trí cài nhập của gen chuyển trong hệ gen tế bào chủ mà không đòi hỏi tách chiết ADN hệ gen cũng như không cần nuôi cấy thêm [29, 79]

Kỹ thuật FISH được xem như cầu nối giữa lĩnh vực di truyền học cổ điển với di truyền học hiện đại, nó kết hợp sự chính xác của các kỹ thuật di truyền phân tử và

sự quan sát trực quan từ kính hiển vi Độ nhạy cao, độ đặc hiệu và tốc độ tiến hành

là những ưu điểm nổi bật đã giúp FISH trở thành công cụ hữu hiệu trong các nghiên cứu cơ bản cũng như chẩn đoán và điều trị [12, 26, 37]

1.2.4 Ứng dụng của kỹ thuật FISH

1.2.4.1 Ứng dụng trong phân tích kiểu nhân

Hệ thống nhận dạng nhiễm sắc thể dựa trên kỹ thuật FISH có thể được sử dụng cho mục đích phân tích kiểu nhân Phản ứng lai có thể tiến hành với một tập hợp các đầu dò khác nhau bằng một hệ thống chất phát huỳnh quang cho những phổ màu khác nhau, vì vậy có thể phát hiện đồng thời tất cả các nhiễm sắc thể trong hệ gen So với các phương pháp phân tích kiểu nhân truyền thống, chi phí các xét nghiệm FISH chỉ bằng một nửa trong khi thời gian tiến hành thí nghiệm nhanh hơn

Vì vậy, FISH nhanh chóng trở thành một công cụ quan trọng và hữu ích cho việc phân tích kiểu nhân, phục vụ cho các nghiên cứu di truyền học tế bào [50, 79]

Năm 1996, hai nhóm nghiên cứu độc lập công bố các nghiên cứu phân tích kiểu nhân sử dụng kỹ thuật FISH với 24 màu huỳnh quang, chính là hai kỹ thuật M-FISH và SKY [78, 82] Ứng dụng các kỹ thuật này, người ta đã xác định được các chuyển đoạn không tương hỗ, tái sắp xếp lại nhiễm sắc thể trong các tế bào ung thư [76] Đặc biệt, M-FISH cũng lần đầu tiên chứng minh được ở kỳ trung gian trong quá trình phân bào, các nhiễm sắc thể không phân bố ngẫu nhiên mà mỗi chiếc chiếm một vị trí nhất định trong nhân tế bào (Hình 5) [13, 83]

Hình 5 V ị trí của các nhiễm sắc thể trong nhân tế b ào ở kỳ trung gian

(A) Tín hiệu huỳnh quang thu được từ các đầu dò đánh dấu đặc hiệu với 24 nhiễm sắc thể (các cặp 1–22, nhiễm sắc thể giới tính X và Y); (B) Vị trí chính xác của các nhiễm sắc thể

ở pha G0, các vùng đen trong nhân không bắt màu huỳnh quang là khu vực của nhân con

Với các góc độ chụp khác nhau, người ta có thể xây dựng được vị trí không gian ba chiều của các nhiễm sắc thể Kết quả được phân tích trên nguyên bào sợi người [13, 83]

1.2.4.2 Ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc nhiễm sắc thể

FISH là một kỹ thuật mạnh mẽ được sử dụng trong việc phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể như thể dị bội, mất đoạn hay chuyển đoạn [30, 89]

Hiện tượng chuyển đoạn đầu tiên được phát hiện bằng kỹ thuật FISH gây bệnh ở người là chuyển đoạn giữa cánh dài nhiễm sắc thể số 9 và cánh ngắn nhiễm sắc thể số 22, tạo nên nhiễm sắc thể Philadelphia Đột biến này có liên quan mật thiết với bệnh bạch cầu nguyên bào tủy mãn tính (chronic myelogenous leukemia – CML), 95% những người mắc bệnh gặp bất thường này [71] (một tỷ lệ nhỏ bệnh nhân được phát hiện hiện tượng chập ba nhiễm sắc thể số 8 [26]) Tuy nhiên chuyển đoạn này không phải đặc hiệu để chẩn đoán CML, do nó cũng chiếm một tỷ lệ nhỏ gây nên bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp tính (acute lymphoblastic leukaemia – ALL) Bệnh này cũng lần đầu tiên được phát hiện nhờ kỹ thuật FISH, trong đó gần 25% các trường hợp bệnh liên quan đến chuyển đoạn giữa cánh ngắn nhiễm sắc thể 12 và cánh dài nhiễm sắc thể 21 [26] Ngoài ra, còn rất nhiều các bất thường nhiễm sắc thể cũng được phát hiện nhờ kỹ thuật FISH như một số dạng ung thư, vô sinh, hội chứng Down, Prader – Willi, Angelman, Velocardiofacial,… [75]

Ở Việt Nam, trong vài năm trở lại đây, một số bệnh viện lớn như bệnh viện Trung ương Quân đội 108, Bạch Mai, Nhi Trung ương,… cũng đã đẩy mạnh ứng dụng kỹ thuật này để chẩn đoán ung thư và một số hội chứng giai đoạn trước sinh Trong giai đoạn 2004–2006, nhóm nghiên cứu thuộc ĐH Y Dược TP HCM đã nghiên cứu 1302 thai phụ có nguy cơ sinh con dị bội nhiễm sắc thể, phát hiện 136 trường hợp với nhiều dạng khác nhau như chập ba nhiễm sắc thể 13 (hội chứng Patau), chập ba nhiễm sắc thể 18, chập ba nhiễm sắc thể 21 (hội chứng Down), XO, XXX và XXY [3] Năm 2008, khoa Di truyền và Sinh học phân tử – bệnh viện Nhi Trung ương cũng đã ứng dụng kỹ thuật này để phát hiện một số bất thường trên tế

bào lympho B nuôi cấy in vitro như mất đoạn q11–13 ở nhiễm sắc thể 15 gây hội

chứng PraderWilli, mất đoạn q11 ở nhiễm sắc thể X ở bệnh nhân Turner hay mất đoạn trên nhiễm sắc thể 22 [8] Nhóm nghiên cứu này cũng phối hợp với khoa Sản, bệnh viện Bạch Mai chẩn đoán trước sinh các hội chứng Patau, Down từ tế bào dịch

ối của thai 17–25 tuần [9] Những nghiên cứu này đều sử dụng đầu dò huỳnh quang được thiết kế và tổng hợp bởi các hãng uy tín như Vysis, Kreatech, thu được kết quả khả quan và chính xác, phù hợp với những phân tích nhiễm sắc thể khác

Hình 6 Ki ểu nhân phổ của nhiễm sắc thể tủy xương bệnh nhân đa u tủy

(A) Các nhiễm sắc thể được phân tích với 24 màu huỳnh quang, những nhiễm sắc thể bất thường được đánh dấu mũi tên; (B) Những bất thường được làm rõ với số chỉ nguồn gốc chuyển đoạn; (C) Các nhiễm sắc thể được sắp xếp lại thành kiểu nhân tế bào [76]

1.2.4.3 Ứng dụng trong nghiên cứu tiến hóa và phân loại sinh vật

So với các kỹ thuật vi sinh vật học truyền thống, kỹ thuật FISH cho thấy ưu điểm nổi bật trong các nghiên cứu xác định sự có mặt của vi sinh vật cũng như định loại chúng FISH có thể được sử dụng trực tiếp trên mẫu nghiên cứu để xác định sự hiện diện và hoạt tính của các vi sinh vật gây bệnh Phương pháp này cho kết quả nhanh chóng mà không đòi hỏi các thao tác cấy chuyển và lựa chọn điều kiện nuôi cấy đặc hiệu cho từng chủng vi sinh vật, nhất là với những vi sinh vật chưa được định loại Nhờ vậy, FISH được sử dụng nhiều trong lĩnh vực sinh thái học vi khuẩn, xác định vi sinh vật, với đầu dò thường được thiết kế ở trong vùng gen ARN ribosome 16S [14, 91] Việc so sánh các trình tự ADN lặp lại bằng kỹ thuật FISH cũng cung cấp các bằng chứng về mối quan hệ tiến hóa giữa các loài [91]

Ở Việt Nam, Viện Nghiên cứu Hải sản (Hải Phòng) cũng đã sử dụng phương

pháp này để định loại nhanh hai loài tảo giáp độc hại là Alexandrium affine và

Alexandrium pseudogonyaulax ở vùng biển nước ta [7] Ngoài ra, một số báo cáo

định loại vi sinh vật cũng đã được công bố Tuy nhiên, việc ứng dụng kỹ thuật này

trong nghiên cứu cơ bản vẫn còn khá hạn chế

1.3 INTERLEUKIN 6 Ở NGƯỜI 1.3.1 Giới thiệu

Interleukin 6 (IL–6) là một protein miễn dịch thuộc họ hematopoietin [80].Nó được gọi bằng nhiều cái tên khác nhau, như interferon–ß2 (IFN–ß2), nhân

tố kích thích tế bào B–2 (B Cell Stimulatory Factor 2 – BSF–2), nhân tố tăng trưởng

tế bào gan (Hepatocyte Growth Factor – HGF), nhân tố biệt hóa tế bào T độc (Cholinergic differentiation factor – CDF), interleukin–HP1 (IL–HP1), chất cảm ứng bạch cầu hạt đơn nhân loại 2 (monocyte-granulocyte inducer type 2 – MGI-2),… và gần đây nhất (năm 1988) là interleukin 6 (IL–6) [80]

Phân tử IL–6 bao gồm một chuỗi protein chứa 184 acid amin, được sản xuất bởi các tế bào T, đại thực bào, tế bào nội mô IL–6 được giải phóng để đáp ứng với

sự nhiễm trùng, bỏng, các chấn thương và sự hình thành khối u Nó đóng vai trò

quan trọng trong cảm ứng protein giai đoạn cấp tính, cũng như trong sự biệt hóa và tăng trưởng của tế bào B và T IL–6 có thể tác động trực tiếp lên tế bào, trung hòa tác động của các cytokin khác, và là yếu tố tương tác với glucocorticoid [40, 80]

1.3.2 Chức năng

IL–6 có nhiều dạng phân tử khác nhau, mỗi dạng có một chức năng đặc trưng khi được tiết ra bởi các tế bào khác nhau trong các điều kiện riêng biệt (kích hoạt thông qua các tác nhân khác nhau) [80]

Hình 7 M ột số ảnh hưởng của IL – 6 trong cơ thể

IL–6 kích thích sản xuất các protein phản ứng (CRP), amyloid A, fibrinogen, hepcidin, trong khi làm giảm tổng hợp albumin và cytochrome P450 trong tế bào gan IL–6 tăng cường tổng hợp globulin miễn dịch trong các tế bào B hoạt động cũng như sự biệt hóa tế bào T H 17 và T độc từ tế bào T nguyên phát Trong tủy xương, IL–6 kích thích sự trưởng thành của tế bào nhân khổng lồ thành tiểu cầu và kích hoạt tế bào gốc tạo máu IL–6 cũng hoạt động trên các tế bào nguyên bào sợi hoạt dịch để sản xuất thụ thể kích hoạt của phối

tử NF–κB (RANKL) và yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF), nhằm thúc đẩy sự biệt hóa của hủy cốt bào và mạch máu IL–6 cũng kích thích các nguyên bào sợi da để sản

xuất collagen, kích thích sự tăng trưởng của một số loại tế bào như các tế bào gian mạch,

u tủy, u tương bào [86]

IL–6 trong các tế bào có thể dẫn đến sự sao chép một loạt các protein thông qua cả ba con đường dẫn truyền tín hiệu chính: protein kinase C, cAMP / protein

kinase A và con đường giải phóng canxi Khi được tiết ra bởi các tế bào T, đại thực

bào, tế bào nội mô, IL–6 đóng vai trò kích thích hệ thống miễn dịch đáp ứng lại tổn thương, đặc biệt là bỏng và các tổn thương khác dẫn đến viêm Thêm vào đó nó còn tham gia chống lại các tác nhân bên ngoài xâm nhập IL–6 cũng được tiết ra từ tế bào cơ và tăng lên trong quá trình co cơ Trong quá trình vận động, nó hoạt động như một hormone huy động cơ chất ngoại bào và tăng cường phân phát cơ chất Mặt khác, interleukin này cũng được tiết ra bởi các nguyên bào xương đóng vai trò kích thích sự hình thành xương Nó có liên quan đến nhiều bệnh như tiểu đường, Alzheimer, ung thư tuyến tiền liệt và rất nhiều bệnh khác IL–6 được biết đến với các tác động quan trọng trong sự tạo máu và hình thành tế bào máu, đóng vai trò là nhân tố sinh trưởng của các tế bào lai trong sản xuất kháng thể, các tế bào đa u tủy, [40]

1.3.3 Những ứng dụng lâm sàng

Những hiểu biết về chức năng của IL–6 có thể được áp dụng trong điều trị lâm sàng IL–6 được tìm thấy với một số lượng lớn và trên thực tế, được sản xuất bởi các mô hoạt dịch của các bệnh nhân viêm khớp dạng thấp Trong trường hợp này, nó gây cảm ứng làm tăng sản xuất kháng thể trong tế bào B Thông qua nhiều nghiên cứu, người ta phát hiện ra rằng các bệnh nhân viêm gan tự miễn có sự giảm mức độ biểu hiện IL–6, cùng với đó là sự giảm mức độ biểu hiện interleukin 1 (IL–1), yếu tố hoại tử khối u (Tumor necrosis factors – TNF) loại β Dữ liệu này cho thấy IL–6 đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của các bệnh này [80, 84]

IL–6 có thể được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như: cảm ứng hình thành tế bào tiền thân tạo máu trong môi trường sánh, thay thế lớp tế bào nuôi trong việc tạo

tế bào lai giữa chuột và người, biệt hóa in vitro tế bào TH17 [40, 42]

1.3.4 Gen mã hóa IL–6 ở người

Protein IL–6 được mã hóa bởi gen IL–6 định vị tại locus 7 trên cánh ngắn

nhiễm sắc thể 21 (7p21) trong hệ gen người Gen này gồm 5 intron và 5 exon, còn

được gọi với những tên khác như BSF2, HGF, HSF, hoặc IFNB2) [80, 84] Một số nghiên cứu gần đây đã chuyển gen mã hóa IL–6 người vào chuột để đánh giá ảnh

hưởng của cytokine này đến một số cơ quan trong cơ thể [48, 63]

Chương 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 2.1.1 Đối tượng – vật liệu nghiên cứu

Gà Lương Phượng (Gallus gallus domesticus)

Đối tượng được sử dụng trong nghiên cứu này là gà Lương Phượng Gallus

gallus domesticus được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu Gia cầm Thụy Phương,

Viện Chăn nuôi Quốc gia Trứng gà Lương Phượng là nguồn nguyên liệu được sử dụng để phân lập tế bào gốc phôi gà (chicken Embryonic Stem Cells – cESCs)

Nguyên bào sợi thai chuột

cESCs có thể duy trì in vitro trong thời gian dài mà vẫn giữ được đặc tính đa

tiềm năng với sự có mặt của lớp tế bào nuôi (feeder cells), những tế bào này vừa là giá thể, đồng thời cung cấp các nhân tố tăng trưởng giúp cESCs tăng sinh không biệt hóa Chúng tôi sử dụng nguyên bào sợi thai chuột đã bất hoạt phân bào làm tế bào nuôi cESCs Dòng tế bào này là sản phẩm của đề tài cấp Đại học Quốc gia Hà Nội “Đánh giá hiệu quả chuyển gen cecropin của vector chuyển gen transposon trên

dòng tế bào chuột nuôi cấy (Mus Musculus)”, mã số QG 09.18.

Gen mã hóa Interleukin – 6 (IL–6) phân lập từ người

Trong nghiên cứu này, gen IL – 6 người được chuyển vào cESCs cADN của

gen có kích thước 639 bp với trình tự như sau:

– 50 –100 –150 –200 –250 –300 –350 –400

–450 –500 –550 –600

Vector chuyển gen

Vector được sử dụng để chuyển gen là pLenti6/V5–DEST (có nguồn gốc

lentivirus), trong đó gen IL–6 người cùng trình tự dẫn được đưa vào thay thế đoạn

ADN giữa hai vị trí attR1–attR2 trên vector gốc Đây là sản phẩm của đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen tạo ra động vật sản xuất protein dược liệu” (mã số KC.04.04/06–10) Vector cũng được sử dụng để tổng hợp đầu dò huỳnh quang cho phản ứng FISH

Hình 8 C ấu trúc vector pLenti6/V5 –DEST Gateway (ViraPower) c ủa Invitrogen

Bảng 2 Vai trò của một số yếu tố chính của vector pLenti6/V5–DEST Gateway

Yếu tố (vị trí – base) Vai trò

– HIV–1 5’ LTR (230–410) – Cho phép đóng gói virus và phiên mã ngược

của mARN virus – Tín hiệu đóng gói HIV–1 (521–565) – Tín hiệu đóng gói virus – Yếu tố đáp ứng Rev HIV–1 (RRE)

– Gen kháng chloramphenicol

(CamR) (2673–3332)

– Cho phép sàng lọc số lượng plasmid

– Gen ccdB (3674–3979) – Cho phép lựa chọn âm tính plasmid – V5 epitope (4197–4238) – Cho phép phát hiện protein dung hợp tái tổ

hợp bằng kháng thể kháng V5 – SV40 promoter và origin

(4293–4602)

– Cho phép biểu hiện cao các điểm đánh dấu lựa chọn và tái bản ngoài nhân trong tế bào biểu hiện mạnh kháng nguyên T lớn SV40

– Gen kháng blasticidin (blast)

(SV40 PA) (5514–5645)

– Tín hiệu chấm dứt phiên mã và gắn đuôi polyadenin của mARN

– Gen kháng ampicillin (6603–7463) – Cho phép sàng lọc plasmid ở E coli

– pBR322 origin (7608–8281) – Cho phép tái bản hiệu quả cao và duy trì ở E

coli

2.1.2 Dụng cụ và vật tư tiêu hao

Các dụng cụ và vật tư cần thiết để làm các thí nghiệm trong đề tài được liệt

kê ở Bảng 3

Bảng 3 Dụng cụ và vật tư tiêu hao được sử dụng trong đề tài

Tên dụng cụ, vật tư Hãng sản xuất/

Xuất xứ Mã sản phẩm

Đĩa nuôi cấy tế bào 35x10mm Corning 3294

Đầu tip 10, 200, 1000µl Corning 4840, 4844, 4862

Pipet nhựa 2, 5, 10ml Corning 4486, 4487, 4488

Lam kính, phiến kính, đĩa petri thủy tinh Trung Quốc –

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị nghiên cứu cần thiết cho đề tài được liệt kê trong Bảng 4

Bảng 4 Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài

Tên thiết bị Hãng sản xuất/

Xuất xứ

Model/

Mã sản phẩm

Kính hiển vi soi ngược Carl Zeiss Axiovert S100

Kính hiển vi huỳnh quang Carl Zeiss Axioplan2

Máy ly tâm tách mẫu Hettich

Zentrifugen EBA 21

Máy ly tâm tế bào Labnet Spectrafuge 6C

Máy nhân gen tốc độ cao Bio–Rad PTC-200 DNA

Engine Cycler

Máy soi gel Cleaver Scientific UV

Transilluminator Máy lắc vi khuẩn Sartorius OS–20

Tủ an toàn sinh học cấp hai Esco AC2–4E1

Bio-Máy định lượng ADN, ARN và protein Eppendorf Biophotometer

Các hoá chất sử dụng trong đề tài được liệt kê trong Bảng 5

Bảng 5 Các hóa chất được sử dụng trong đề tài

Tên hóa chất Hãng sản xuất/

Non–essential amino acid Gibco 11140–050 Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14190–250 Sodium pyruvate Gibco 11360–070 Leukemia inhibitory factor (LIF) Gibco A12635A Agarose Invitrogen 15510–019 ChromaTide® Alexa Fluor® 568–5–

DNA Isolation Kit for Cells and Tissues Roche 11 814 770 001

Bovine serum albumin (BSA) Roche 735 078

Dextran sulfat Sigma D8906

ADN sợi đơn (từ tinh trùng cá hồi) Sigma D9156

Ethidium bromide Sigma E7637

Fetal bovine serum (FBS) Sigma F9665