Nghiên cứu bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO NHŨ TƯƠNG NHỎ MẮT DICLOFENAC VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA CHẾ PHẨM LUẬN ÁN T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO NHŨ TƯƠNG NHỎ MẮT DICLOFENAC VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH

GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA CHẾ PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO NHŨ TƯƠNG NHỎ MẮT DICLOFENAC VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH

GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA CHẾ PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC

MÃ SỐ: 62720402 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Trần Linh

PGS.TS Nguyễn Văn Long

HÀ NỘI, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Đặng Thị Hiền

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

TS Nguyễn Trần Linh

PGS TS Nguyễn Văn Long

Những người thầy đã nhiệt tình hướng dẫn và hết lòng giúp đỡ tôi trong thời gian làm luận án vừa qua

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới toàn thể các thầy, cô giáo,

kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, Bộ môn Dược lực, Bộ môn công nghiệp dược, Bộ môn Vật lý – Hóa lý đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin trân trọng cảm ơn:

Viện kiểm nghiệm, nghiên cứu dược và trang thiết bị Y tế quân đội;

Các bác sĩ khoa mắt Bệnh viện Trung Ương Quân đội 108

Đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành những nội dung thực nghiệm trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, Phòng Đào tạo sau đại học đã quan tâm giúp đỡ tôi trong quá trình công tác, học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình bạn bè đã luôn

ở bên, giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án

Hà Nội, ngày 20 tháng 02 năm 2017

Đặng Thị Hiền

MỤC LỤC

Trang

BẢNG CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH xii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 THÔNG TIN VỀ DƯỢC CHẤT ACID DICLOFENAC 2

1.1.1 Công thức hóa học 2

1.1.2 Đặc tính lý hóa 2

1.1.3 Tác dụng, chỉ định 3

1.2 NANO NHŨ TƯƠNG 4

1.2.1 Khái niệm 4

1.2.2 Thành phần 4

1.2.3 Kỹ thuật bào chế nano nhũ tương 4

1.2.4 Đặc tính của nano nhũ tương 7

1.2.5 Ưu nhược điểm của nano nhũ tương 11

1.3 NANO NHŨ TƯƠNG NHỎ MẮT 16

1.3.1 Đặc điểm cấu tạo của mắt liên quan đến hấp thu dược chất 16

1.3.2 Một số nghiên cứu về nano nhũ tương nhỏ mắt 18

1.3.3 Đánh giá sinh khả dụng của nano nhũ tương trên mắt 22

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 34

2.1.1 Nguyên liệu 34

2.1.2 Thiết bị 35

2.1.3 Động vật thí nghiệm 36

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 36

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.3.1 Phương pháp bào chế nano nhũ tương diclofenac 36

2.3.2 Phương pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac so sánh 38

2.3.3 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ nano nhũ tương 39

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu độ ổn định 45

2.3.5 Phương pháp thử kích ứng mắt 46

2.3.6 Phương pháp nghiên cứu sinh khả dụng 48

2.3.7 Phương pháp xây dựng tương quan in vitro – in vivo 52

2.3.8 Phương pháp ghi và xử lý số liệu 55

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56

3.1 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG DƯỢC CHẤT TRONG MẪU NANO NHŨ TƯƠNG VÀ MÔI TRƯỜNG GIẢI PHÓNG 56

3.1.1 Tính đặc hiệu của phương pháp 56

3.1.2 Xác định tính tuyến tính 56

3.1.3 Xác định độ đúng 58

3.1.4 Xác định độ lặp lại 59

3.2 XÂY DỰNG CÔNG THỨC VÀ QUY TRÌNH BÀO CHẾ NANO NHŨ TƯƠNG 59

3.2.1 Bào chế nano nhũ tương bằng kỹ thuật siêu âm 60

3.2.2 Bào chế nano nhũ tương bằng kỹ thuật siêu âm kết hợp đồng nhất hóa áp suất cao 81

3.2.3 Bào chế nano nhũ tương bằng kỹ thuật phân cắt tốc độ cao 85

3.3 NÂNG QUY MÔ BÀO CHẾ 99

3.3.1 Khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm khi nâng quy mô 99

3.3.2 Đánh giá tính lặp lại của quy trình khi nâng quy mô bào chế 104

3.4 DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG CỦA NANO NHŨ TƯƠNG NHỎ MẮT DICLOFENAC 106

3.5 ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA NANO NHŨ TƯƠNG NHỎ MẮT 107

3.6 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA MẪU NANO NHŨ TƯƠNG ĐƯỢC LỰA CHỌN ĐỂ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG 108

3.7 THỬ KÍCH ỨNG MẮT TRÊN THỎ 109

3.8 NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG CỦA NANO NHŨ TƯƠNG NHỎ MẮT TRÊN THỎ THÍ NGHIỆM 110

3.8.1 Thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng 110

3.8.2 Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học 118

3.9 XÂY DỰNG TƯƠNG QUAN IN VITRO – IN VIVO TRONG THIẾT KẾ CÔNG THỨC NANO NHŨ TƯƠNG NHỎ MẮT DICLOFENAC 122

3.9.1 Đánh giá giải phóng dược chất in vitro 122

3.9.2 Mô hình hóa đồ thị giải phóng 124

3.9.3 Thiết lập tương quan 125

3.9.4 Ứng dụng tương quan in vitro – in vivo trong xây dựng chỉ tiêu giải phóng dược chất của nano nhũ tương 127

Chương 4 BÀN LUẬN 129

4.1 VỀ ACID DICLOFENAC 129

4.2 VỀ BÀO CHẾ NANO NHŨ TƯƠNG 130

4.2.1 Về công thức bào chế 130

4.2.2 Về thiết bị bào chế 132

4.2.3 Về nhiệt độ nhũ hóa 133

4.2.4 Về tỉ lệ dược chất trong pha dầu của nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac 134 4.2.5 Về cấu trúc nano nhũ tương 135

4.2.6 Về nâng quy mô bào chế 136

4.3 VỀ KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG IN VITRO CỦA NANO NHŨ TƯƠNG NHỎ MẮT DICLOFENAC 136

4.4 VỀ NGHIÊN CỨU ĐỘ ỔN ĐỊNH 139

4.5 VỀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ 140

4.6 VỀ NGHIÊN CỨU TÍNH KÍCH ỨNG 140

4.7 VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG IN VIVO VÀ THIẾT LẬP TƯƠNG QUAN IN VITRO – IN VIVO 141

4.7.1 Về đánh giá sinh khả dụng in vivo 141

4.7.2 Về định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng 144

4.7.3 Về lựa chọn mô hình dược động học 145

4.7.4 Về xây dựng tương quan in vitro – in vivo 146

KẾT LUẬN 149

ĐỀ XUẤT 150 DANH MỤC

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

BẢNG CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ADC Acid diclofenac

AIC Tiêu chuẩn thông tin Akaike (The Akaike information criterion)

ANOVA Phân tích phương sai (Analysis of variance)

AUC Diện tích dưới đường cong (The area under the curve)

AUMC Diện tích dưới đường cong nồng độ × thời điểm (Area under the first

moment curve)

BCS Hệ thống phân loại sinh dược học

(Biopharmaceutics classification system)

ECD Detector điện hóa (Electron capture detector)

FDA Cơ quan quản lý thuốc – thực phẩm (Food and Drug Administration)

GP Giải phóng

GPDC Giải phóng dược chất

GTTB Giá trị trung bình

HLB Hằng số cân bằng dầu/nước (Hydrophilic-lipophilic balance)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) HQC Mẫu kiểm chứng nồng độ cao (High quality control sample)

IPM Isopropyl myristat

IVIVC Tương quan in vitro – in vivo (In vitro – in vivo correlation)

kl Khối lượng

KTG Kích thước giọt

LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography–mass spectrometry) LLOQ Giới hạn định lượng dưới (Lower limit of quantification)

LQC Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp (Lower quality control sample)

MCT Triglycerid mạch trung bình (Medium-chain triglycerides)

MQC Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình (Middle quality control sample) MRT Thời gian lưu trung bình (Mean residence time)

MT Môi trường

MTPT Môi trường phân tán

N/D Nước/dầu

NaDC Natri diclofenac

NSAIDs Thuốc chống viêm không steroid (Nonsteroidal anti-inflammatory

drugs)

NNT Nano nhũ tương

PdI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)

PEG Polyethylen glycol

PG Propylen glycol

PL Phụ lục

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation)

SKD Sinh khả dụng

TB Trung bình

TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

TEM Hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy)

Tmax Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa (Maximum time)

tt Thể tích

USA Hợp chủng quốc Hoa Kỳ (The United States of America)

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Độ tan của amlodipin trong các loại dầu và nano nhũ tương ở 25 ± 1oC (n = 3) 11

Bảng 1.2: Một số chế phẩm nano nhũ tương nhỏ mắt 21

Bảng 1.3: Một số đặc điểm giải phẫu, sinh lý của mắt người và mắt thỏ 24

Bảng 1.4 Một số điều kiện chạy sắc ký định lượng ADC trong dịch tiền phòng 26 Bảng 2.5: Nguyên liệu sử dụng 34

Bảng 2.6: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac 35

Bảng 2.7 Thành phần tá dược bào chế nano nhũ tương acid diclofenac 36

Bảng 2.8 Điều kiện bảo quản và chu kỳ lấy mẫu kiểm tra trong theo dõi độ ổn định của NNT ADC 46

Bảng 2.9: Hệ thống phân loại các tổn thương mắt 47

Bảng 2.10: Các mô hình giải phóng khác nhau được sử dụng để phân tích dữ liệu in vitro 54

Bảng 3.11: Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ acid diclofenac 57

Bảng 3.12: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC 58

Bảng 3.13: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp HPLC 59

Bảng 3.14: Các thành phần trong công thức NNT ADC 63

Bảng 3.15: Các biến độc lập 64

Bảng 3.16: Các biến phụ thuộc 65

Bảng 3.17: Thiết kế thí nghiệm bào chế NNT bằng kỹ thuật siêu âm 66

Bảng 3.18: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới một số chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm nano nhũ tương bào chế theo CT 16 (n = 3) 67

Bảng 3.19: Phần trăm giải phóng DC, độ bền, KTG TB, thế zeta và PdI của NNT ADC 68

Bảng 3.20: Kết quả luyện mạng neuron nhân tạo bằng FormRules 2.0 69

Bảng 3.21: Giá trị R2luyện cho các biến đầu vào 77

Bảng 3.22: Thành phần công thức NNT được lựa chọn 78

Bảng 3.23: Kết quả phần trăm dược chất giải phóng dự đoán 79

Bảng 3.24: Phần trăm DC giải phóng của NNT thực tế (n = 3) 79

Bảng 3.25: Một số chỉ tiêu chất lượng của các mẫu NNT bào chế theo công thức tối ưu (n = 3) 80

Bảng 3.26 Thành phần của các công thức nano nhũ tương được lựa chọn bào chế

bằng thiết bị siêu âm kết hợp đồng nhất hóa áp suất cao 82

Bảng 3.27: Kết quả đo kích thước giọt tại các thời điểm đồng nhất hóa áp suất cao khác nhau (n = 3) 83

Bảng 3.28: Một số chỉ tiêu chất lượng của NNT khi bào chế bằng thiết bị siêu âm, siêu âm + ĐNH sau thời gian 12 phút (n = 3) 84

Bảng 3.29: Các thành phần trong công thức bào chế nano nhũ tương diclofenac với kỹ thuật phân cắt tốc độ cao 86

Bảng 3.30: Các biến độc lập 87

Bảng 3.31: Các biến phụ thuộc 87

Bảng 3.32: Thiết kế thí nghiệm cho NNT nhỏ mắt acid diclofenac 88

Bảng 3.33: Các đặc tính vật lý của nano nhũ tương diclofenac (n=3) 89

Bảng 3.34: Kết quả luyện mạng neural nhân tạo bằng FormRules 2.0 91

Bảng 3.35 Tỉ lệ dược chất trong pha dầu của một số mẫu NNT (n = 3) 97

Bảng 3.36 Một số chỉ tiêu chất lượng của mẫu nano nhũ tương (CTTƯ 2) được bào chế bằng thiết bị phân cắt tốc độ cao 98

Bảng 3.37: Kết quả kích thước giọt trung bình và tỉ lệ DC được nhũ tương hóa của các mẫu NNT có thời gian siêu âm khác nhau (n = 3) 100

Bảng 3.38: Kết quả tỉ lệ DC giải phóng theo thời gian siêu âm (n = 3) 102

Bảng 3.39: Kết quả xác định một số thông số của các NNT sau thời gian bảo quản 1 tháng ở 40±2oC, độ ẩm 75±5% và so sánh với NNT mới bào chế (n = 3) 103

Bảng 3.40: Thành phần công thức bào chế nâng quy mô 1000 ml 104

Bảng 3.41: Kết quả đánh giá chất lượng NNT ở quy mô 100 ml và 1000 ml (n = 3) 105

Bảng 3.42: Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng cho nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac 106

Bảng 3.43: Đánh giá phần trăm giải phóng dược chất của CTTƯ 2 (n = 3) 109

Bảng 3.44 Bảng chấm điểm đánh giá tính kích ứng trên mắt thỏ 110

Bảng 3.45: Đáp ứng pic của mẫu trắng và mẫu chuẩn tại thời điểm trùng với thời gian lưu của diclofenac 111

Bảng 3.46: Tương quan giữa nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng và diện tích pic 112

Bảng 3.47: Nồng độ diclofenac trong các mẫu chuẩn tính theo phương trình hồi quy 113

Bảng 3.48: Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ) 114Bảng 3.49: Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày 114Bảng 3.50: Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại khác ngày 115Bảng 3.51: Độ ổn định của mẫu sau xử lý bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ 117

Bảng 3.52: Nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng mắt trái và mắt phải thỏ (n = 6)

118

Bảng 3.53: Tỉ lệ GP in vivo của NNT so với dung dịch 120

Bảng 3.54: Các thông số dược động học tính toán nhờ phần mềm Phoenix WinNonlin 6.3 121Bảng 3.55: Kết quả AIC của các môi trường GP với các mô hình GP khác nhau 124

Bảng 3.56 Giá trị AIC theo tương quan giữa mức độ GP in vitro trong các điều kiện thử GP và mức độ GP in vivo của dược chất 126

Bảng 3.57 Phần trăm giải phóng dược chất từ NNT ADC qua môi trường pH 5,8 (n = 3) 127Bảng 3.58 Tiêu chuẩn chất lượng của nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac 128

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của acid diclofenac [142] 2

Hình 1.2: Phương pháp ĐNH ở áp suất cao [99] 6

Hình 1.3: Một số quá trình phá vỡ cấu trúc nhũ tương [89] 9

Hình 1.4: Cấu tạo lớp điện thế kép [38] 10

Hình 1.5: Cấu tạo giải phẫu mắt [2] 17

Hình 1.6: Sơ đồ bình Franz [97] 22

Hình 1.7: Mô hình thử nghiệm kỹ thuật thẩm tách micro [102] 23

Hình 1.8: Mô hình đánh giá khả năng thấm của dược chất qua giác mạc bằng phương pháp vi thẩm tích [83] 25

Hình 1.9: Một số mô hình ngăn cho thuốc nhỏ mắt 28

Hình 2.10: Sơ đồ quy trình bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac 37

Hình 2.11: Ảnh minh họa cho mức độ tách pha của NNT 41

Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ acid diclofenac và diện tích pic 57

Hình 3.13: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của lượng CDH thân nước và lượng Transcutol HP đến phần trăm giải phóng ADC sau 1 giờ 70

Hình 3.14: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của lượng CDH thân nước và lượng Span 80 đến phần trăm giải phóng ADC sau 1 giờ 71

Hình 3.15: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của lượng Span 80 và lượng Transcutol HP tới phần trăm giải phóng ADC sau 1 giờ 72

Hình 3.16: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của lượng CDH thân nước và lượng dung môi pha dầu tới độ bền của NNT ADC 73

Hình 3.17: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của pH và loại hệ đệm tới độ bền của NNT ADC 74

Hình 3.18: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của loại hệ đệm và lượng CDH thân nước tới KTG TB của NNT ADC 75

Hình 3.19: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của lượng CDH thân nước và loại hệ đệm tới thế zeta của NNT ADC 76

Hình 3.20: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của lượng Span 80 và pH tới thế zeta của NNT ADC 77

Hình 3.21: Đồ thị % DC giải phóng theo thời gian của mẫu NNT bào chế theo CTTƯ dự đoán và thực tế 79

Hình 3.22: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTG theo thời gian ĐNH 83Hình 3.23: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của lượng CDH thân dầu và lượng PG tới KTG TB của NNT ADC 92Hình 3.24: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của lượng Transcutol HP và lượng CDH thân dầu tới KTG TB của NNT ADC 93Hình 3.25: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của lượng PG và loại CDH thân nước tới PdI của NNT ADC 94Hình 3.26: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của lượng CDH thân nước và lượng CDH thân dầu đến thế zeta của NNT ADC 95Hình 3.27: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của lượng CDH thân nước và lượng Transcutol HP tới thế zeta của NNT ADC 96Hình 3.28: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc kích thước giọt trung bình vào thời gian siêu âm ở quy mô 1000 ml 100

Hình 3.29: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ GP DC in vitro theo thời gian siêu âm 102

Hình 3.30: Kết quả tính toán dự đoán tuổi thọ chế phẩm khi bảo quản ở điều kiện

5 ± 3oC 108Hình 3.31: Ảnh TEM của nano nhũ tương diclofenac 108Hình 3.32: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng và diện tích pic 112Hình 3.33: Đồ thị biểu diễn đường cong nồng độ - thời gian (n = 6) 119

Hình 3.34: Đồ thị biểu diễn mức độ giải phóng in vivo của NNT so với DD 120

Hình 3.35: Đồ thị phần trăm dược chất GP của NNT diclofenac trong một số môi trường đệm phosphat pH khác nhau 123Hình 3.36: Đồ thị phần trăm dược chất GP của NNT diclofenac trong một số môi

trường đệm phosphat pH 7,4 có thêm Tw 80 và ethanol hàm lượng khác nhau 123

Hình 3.37: Sự giải phóng dược chất theo mô hình Weibull trong môi trường đệm phosphat pH 5,8 125

ĐẶT VẤN ĐỀ

Công nghệ nano đã và đang tạo ra một cuộc cách mạng lớn trong bào chế

thuốc hiện đại Sử dụng công nghệ nano để thiết kế các hệ phân phối thuốc mới đã

tạo nên sự phát triển của ngành y học, hứa hẹn những tiến bộ đột phá trong điều trị

và chẩn đoán

Khi bào chế thuốc nhãn khoa, vấn đề SKD luôn được đặt ra với các nhà bào

chế, do mắt là một tổ chức có cấu tạo và cơ chế sinh lý phức tạp Các thuốc nhãn

khoa thường có tỉ lệ hấp thu thuốc thấp và thời gian lưu thuốc trước giác mạc ngắn

NNT là một trong số các hệ bào chế có cấu trúc nano đã và đang nhận được sự

quan tâm của rất nhiều các nhà khoa học trên thế giới Nhiều nghiên cứu đã chứng

minh, NNT làm tăng tỉ lệ hấp thu thuốc vào các mô bên trong mắt [29], tăng thời

gian lưu thuốc trước giác mạc [17], cải thiện SKD và hiệu quả điều trị tại mắt [22],

[103] Các nghiên cứu cũng chỉ ra đây là hệ phân phối thuốc tại mắt tiềm năng cho

các DC thuộc nhóm II, III trong bảng phân loại sinh dược học (BCS) [171]

Diclofenac là một DC điển hình của nhóm NSAIDs, có khả năng ngăn chặn

sự co đồng tử xảy ra trong quá trình lấy tinh thể đục, làm giảm viêm và đau trong

tổn thương biểu mô giác mạc sau phẫu thuật [10] Diclofenac là một dược chất có

độ hòa tan kém, các chế phẩm thuốc nhỏ mắt diclofenac hiện có trên thị trường chủ

yếu ở dạng dung dịch có hiệu quả điều trị không cao [65]

Để cải thiện sinh khả dụng của diclofenac khi dùng cho mắt và tiếp cận dạng

bào chế thuốc mới theo công nghệ nano, đề tài: ―Nghiên cứu bào chế nano nhũ

tương nhỏ mắt diclofenac và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm‖

được tiến hành nghiên cứu với các mục tiêu:

1 Xây dựng được công thức và quy trình bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt

diclofenac 0,1% ở quy mô phòng thí nghiệm

2 Nâng quy mô bào chế, dự thảo được tiêu chuẩn cơ sở, đánh giá độ ổn định

của nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac 0,1%

3 Đánh giá được sinh khả dụng của chế phẩm trên thỏ thí nghiệm và bước

đầu thiết lập được tương quan in vitro – in vivo của chế phẩm

- Rất ít tan trong nước, độ tan phụ thuộc pH nằm trong khoảng từ 17,8 mg/l ở

pH trung tính; ít hơn 1 mg/l ở pH acid Diclofenac thường tồn tại ở dạng muối hòa tan có độ tan hơn dạng acid, dạng muối natri có độ tan là 1113 mg/l; dạng muối kali

có độ tan lớn hơn 2430 mg/l ADC thuộc nhóm II trong BCS tan kém nhưng thấm tốt [71]

- Có độ tan cao trong dầu thầu dầu (1,633 ± 0,06 % (kl/tt)), dầu lạc (0,720 ± 0,09% (kl/tt)), dầu hướng dương (0,549 ± 0,03 (kl/tt)) [20], không tan/hexan, toluen; ít tan trong cloroform; tan tốt trong methanol; tan rất tốt trong dimethyl sulfoxyd, dimethyl formamid, dioxan… [143]

- Độ tan của acid diclofenac trong 2,5 g mỗi loại dầu: dầu ngô (corn oil), dầu hạnh nhân (almond oil), Miglyol 810, Miglyol 812, Miglyol 829, Labrafac PG, Labrafac lipophile ở 20 ± 2oC (% kl/kl) lần lượt là 0,34; 0,41; 0,82; 0,73; 1,15; 0,93; 0,85 [102] Độ tan của muối natri diclofenac trong 10 g dầu khác nhau ở 25oC lần lượt là (mg/10 g): dầu oliu 120 mg; isopropyl myristat 140 mg; dầu thầu dầu 150 mg; isopropyl palmitat 120 mg; acid oleic 180 mg [47]

 Hệ số phân bố dầu nước (n - octanol/nước): log P = 4,4 [131]

 Hấp thụ UV: λmax (methanol) = 285 nm, λmax (acetonitril) = 278 nm [143]

- Đo phổ hồng ngoại, sắc ký lớp mỏng: so sánh với chất chuẩn

Cơ chế tác dụng: diclofenac ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase

COX-1; COX-2, làm giảm đáng kể sự tạo thành prostaglandin, prostacylin và thromboxan

là những chất trung gian của quá trình viêm Diclofenac cũng điều hòa con đường lioxygenase và sự kết tụ tiểu cầu [4]

Dược động học tại mắt: diclofenac được hấp thu nhanh vào thủy dịch sau khi

nhỏ mắt Sau khi nhỏ một giọt lên giác mạc, Cmax đạt xấp xỉ 82 ng/ml sau thời gian

là 2,4 giờ Nồng độ tìm thấy sau 4 giờ nhỏ thuốc là 20 ng/ml Thời gian lưu trú thuốc trung bình trong thủy dịch là 7,4 giờ [49] Giống như các thuốc NSAIDs khác, diclofenac được gắn kết với 90 – 99% protein chính vì vậy mà có thể dễ dàng tìm thấy nó ở các mô của tổ chức mắt sau khi nhỏ thuốc [58]

Hiện nay trên thị trường mới chỉ có dung dịch thuốc nhỏ mắt chứa NaDC, bao gồm các biệt dược: Diclofenac Sodium Ophthalmic Solution (Apotex), Diclofenac Sodium Ophthalmic Solution (Falcon), Voltaren Ophthalmic (Novartis)… với nồng

độ 0,1 %

Chỉ định: dung dịch nhỏ mắt 0,1% NaDC giảm đau các tổn thương biểu mô do chấn thương, phẫu thuật, điều trị viêm sau phẫu thuật, các bệnh viêm mạn tính không lây nhiễm, ngăn ngừa thu hẹp đồng tử trong phẫu thuật đục thủy tinh thể, giảm các triệu chứng do viêm màng kết mạc [145]

1.2 NANO NHŨ TƯƠNG

1.2.1 Khái niệm

NNT là hệ phân tán siêu vi dị thể, có phân bố KTG nằm trong khoảng từ 20 -

500 nm, được hình thành từ hai chất lỏng không đồng tan, trong đó một chất lỏng là pha phân tán (pha nội, pha không liên tục) được phân tán vào chất lỏng thứ hai là MTPT (pha ngoại, pha liên tục), được ổn định bằng CDH và CĐDH [72], [73], [120]

8000 (glyceryl tricaprylat, tricaprylin)… cùng các chất hòa tan, đồng tan với chúng [32], [109]

- CDH: CDH ion hóa (natri lauryl sulfat), CDH không ion hóa (Tw 80, Span

80, Cre EL,…), CDH lưỡng cực (lecithin) [32], [109]

- CĐDH: Là những alcol, amin, acid, ether,… mạch 8 – 10 carbon Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, các CĐDH có thể tích phân tử càng lớn (alcol cetylic, Transcutol ) thì càng làm giảm quá trình kết tụ Ostwald [37] CĐDH hay được sử dụng như ethanol, glycerid, PEG 300, PEG 400, poloxame, Transcutol P, ethylen glycol, propanol [32], [109] Tuy nhiên, không giống với vi nhũ tương, NNT có thể không cần sử dụng CĐDH [139], [172]

Ngoài ra còn có một số thành phần khác như:

- Chất chống oxy hóa: acid ascorbic, α – tocopherol… [32]

- Chất tăng áp suất thẩm thấu: glycerin, sorbitol, xylitol, muối [32]

- Chất điều chỉnh pH: natri hydroxyd, acid hydrocloric [32]

- Chất bảo quản: methyl paraben, propyl paraben, benzalkonium clorid [32]

1.2.3 Kỹ thuật bào chế nano nhũ tương

NNT có thể được bào chế bằng một trong các kỹ thuật sau:

1.2.3.1 Kỹ thuật phân tán hay nhũ hóa sử dụng năng lượng cao

Kỹ thuật này có thể được thực hiện trên các thiết bị như: thiết bị ĐNH phân cắt tốc độ cao, thiết bị ĐNH áp suất cao, thiết bị siêu âm

a Bào chế nano nhũ tương với thiết bị đồng nhất hóa phân cắt tốc độ cao

Thiết bị ĐNH phân cắt tốc độ cao cấu tạo gồm một roto và một stato Roto được thiết kế bao gồm nhiều lưỡi cắt, stato có nhiều khe hở hướng theo chiều dọc hoặc đường chéo xung quanh trục đồng hóa Các lưỡi cắt được đặt đồng tâm và nằm bên trong stato Khi roto quay, chất lỏng được ly tâm buộc phải đi qua các khe hở của stato Một lực hút được tạo ra và làm cho một lượng lớn chất lỏng được rút lên vào khu vực bên trong roto Hai lực tác động chủ yếu làm giảm KTG: thứ nhất, lực

ly tâm gây va chạm cơ học vào phần stato; thứ hai, lực phân cắt được tạo ra trong vùng hỗn loạn giữa roto và stato Khi tốc độ ĐNH tăng, các lực phân cắt cũng tăng lên, làm giảm hơn nữa KTG [81]

Tuy nhiên, để thu được NNT với KTG TB nhỏ hơn 200 - 300 nm theo kỹ thuật này là rất khó khăn [81]

b Bào chế bằng thiết bị đồng nhất hóa áp suất cao

Đây là kỹ thuật được áp dụng rộng rãi nhất để bào chế NNT do thời gian bào chế mẫu nhanh, KTG nhỏ và khoảng phân bố KTG hẹp [167] Tuy nhiên, kỹ thuật này khi sử dụng khá tốn kém, khó vệ sinh thiết bị [89], chỉ thích hợp với NNT D/N

mà thành phần dầu ít hơn 20% Kem NNT có độ nhớt cao hoặc cứng sẽ khó bào chế được NNT có KTG nhỏ hơn 200 nm [59]

- Kỹ thuật vi lưu (microfluidizer): dựa trên nguyên tắc tia ngược dòng (jet stream) Thiết bị có một buồng tương tác Nhũ tương qua một bơm áp suất cao được chia làm hai dòng chất lỏng ở đầu vào buồng tương tác, hai dòng chất lỏng được tăng tốc do sự giảm đột ngột của đường kính ống dẫn Sau đó, hai dòng chất lỏng va chạm từ hai hướng ngược nhau dẫn đến sự phá vỡ các giọt ban đầu thành các giọt nhỏ hơn [40], [68], [167]

- Kỹ thuật ĐNH qua khe hẹp (kỹ thuật DissocubesTM): dựa trên nguyên tắc ĐNH piston khe hẹp (piston - gap) Ở các thiết bị này, nhũ tương được đẩy bởi piston dưới áp lực lớn (1500 - 2000 bar) qua một khe hẹp kích thước vài µm Áp suất động của dòng chất lỏng tăng, áp suất tĩnh giảm xuống dưới áp suất hơi của nước ở nhiệt độ phòng Kết quả, nước bắt đầu sôi tại nhiệt độ phòng, hình thành các

bong bóng khí, chúng bị nổ tung khi nhũ tương đi qua khe đồng nhất và trở lại áp

suất không khí bình thường Lực nổ của bong bóng khí đủ để phá vỡ các giọt nhũ tương thành các tiểu phân nano [137]

(a) (b)

Hình 1.2: Phương pháp ĐNH ở áp suất cao [106]

(a)- Kỹ thuật tia ngược dòng (b)- Kỹ thuật piston khe hẹp

c Bào chế bằng thiết bị siêu âm

Kỹ thuật này thích hợp với các lô mẻ nhỏ do lực siêu âm chủ yếu tập trung ở xung quanh đầu siêu âm

- Sự nhũ hóa bằng siêu âm xảy ra qua 2 cơ chế: thứ nhất, sóng âm tạo ra dao động bề mặt phân cách pha, dẫn đến sự phun trào pha dầu vào trong pha nước tạo thành các giọt nhũ tương [77]; thứ hai, lực cơ học chủ yếu được tạo ra bởi quá trình hình thành và phá vỡ các bong bóng khí (cavitation bubbles) Các bong bóng khí được hình thành và kích thước lớn dần do sự khuếch tán các phân tử hơi nhỏ hoặc khí từ MT vào trong bong bóng khí; đến một lúc nào đó, các bong bóng khí bị phá

vỡ, sinh ra năng lượng cơ học, chia nhỏ giọt nhũ tương [89]

- Ưu điểm: ít tốn kém, thiết bị dễ sử dụng

- Nhược điểm: toàn bộ mẫu có thể nóng quá mức, có thể nhiễm titan từ đầu dò siêu âm, phân bố KTG rộng [167]

1.2.3.2 Kỹ thuật tự nhũ hóa hay nhũ hóa sử dụng năng lượng thấp

Năng lượng từ thế hóa học của các thành phần trong NNT NNT được hình thành do sự chuyển pha xảy ra trong quá trình nhũ hóa

a Phương pháp điểm đảo pha

Ở nhiệt độ hằng định, thay đổi tỉ lệ dầu - nước Khi tăng tỉ lệ khối lượng nước dẫn đến sự hình thành cấu trúc phân lớp hay liên tục, đến điểm đảo pha xảy ra sự biến đổi độ cong của lớp CDH sẽ làm nhũ tương chuyển từ loại N/D sang D/N [120]

b Phương pháp nhiệt độ đảo pha

Giữ nguyên các thành phần, thay đổi nhiệt độ Phương pháp này dựa trên sự thay đổi độ tan của CDH không ion hóa loại polyoxyethylen theo nhiệt độ, CDH loại này trở nên thân dầu khi nhiệt độ tăng do sự loại nước của chuỗi polyoxyethylen [120]

- Sự phân tán xảy ra là kết quả của sự giảm sức căng bề mặt gần như bằng 0 trong một thời gian ngắn Điều này liên quan tới sự tăng diện tích bề mặt của khu vực bề mặt liên kết

- Sự nhũ hóa xảy ra khi pha mới được hình thành trong khu vực siêu bão hòa [95] NNT được bào chế theo phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn các dung môi

để hình thành được các giọt có kích thước nhỏ và cũng cần tác động năng lượng để phân chia tạo giọt Phương pháp này chỉ thích hợp với quy mô phòng thí nghiệm khó có thể triển khai ở quy mô công nghiệp [154]

1.2.4 Đặc tính của nano nhũ tương

Sau khi NNT được bào chế, việc quan trọng là cần phải xác định được đặc tính

lý hoá của chúng Các đặc tính quan trọng của NNT bao gồm phân bố KTG và chỉ

số đa phân tán, đặc tính động học, hiệu điện thế bề mặt (thế zeta), độ nhớt

1.2.4.1 Phân bố kích thước giọt, chỉ số đa phân tán

Phân bố KTG là một trong những đặc tính quan trọng nhất của NNT Sự phân

bố KTG của NNT nằm trong khoảng từ 20 – 500 nm [141], [155] Sự phân bố KTG nhỏ và trong một khoảng hẹp giúp ngăn chặn sự sa lắng, tạo keo do đó làm tăng độ

ổn định vật lý, ổn định động học tạo ra hệ phân tán đồng nhất, không có sự phân tách [55], [178], [146] Chỉ số đa phân tán (PdI - Polydispersity index) sẽ cho thấy chất lượng của hệ phân tán, giá trị đo thấp hơn 0,1 cho thấy phép đo là phù hợp và

hệ keo ổn định tốt, giá trị đo gần tới 1 cho thấy mẫu kém chất lượng và không ổn định, ngoài ra còn cho thấy KTG nằm ngoài khoảng mong muốn hoặc tồn tại một chỉ số đa phân tán rất cao [142]

1.2.4.2 Đặc tính nhiệt động học và động học

a Đặc tính nhiệt động học

NNT có năng lượng tự do cao hơn trạng thái tách pha, vì vậy NNT là hệ không cân bằng, với xu hướng tự nhiên sau một khoảng thời gian nó sẽ phân tách thành hai pha tạo thành NNT là một hệ có nhiệt động học không ổn định do sự thay đổi năng lượng tự do Gibbs (G) trong quá trình hình thành lớn hơn không

G= F - TS Trong đó F là sự thay đổi diện tích bề mặt của giao diện,  là sức căng bề mặt chuyển tiếp giữa các giọt của pha phân tán và MTPT, T là nhiệt độ, và S là sự thay đổi entropy

Trong cấu trúc NNT, năng lượng tự do Gibbs thay đổi theo hướng dương làm cho hệ phân tán giảm sức căng bề mặt dẫn đến quá trình tách lớp xảy ra tương tự như nhũ tương thô Sự sa lắng và tạo keo diễn ra dưới tác động của lực hấp dẫn và lực ly tâm [81]

b Đặc tính động học

Với dạng thuốc NNT các quá trình kết váng, sa lắng, kết bông, kết tụ thường ít xảy ra do KTG nhỏ, độ nhớt thấp, chuyển động Brown mạnh đã giảm đáng kể lực hút giữa các tiểu phân Ngoài ra, lớp CDH tương đối dày (so với bán kính tiểu phân) làm cho màng phim chất lỏng giữa các tiểu phân không bị phá vỡ hay thu hẹp lại [146] Tuy nhiên, quá trình kết tụ Ostwald (Ostwald ripening) được coi là cơ chế chính gây nên sự mất ổn định của NNT [37], [120], [146]

Quá trình kết tụ Ostwald xảy ra do các tiểu phân kích thước nhỏ có độ hòa tan trong MTPT cao hơn các tiểu phân kích thước lớn, làm cho các phân tử pha phân tán tự động khuếch tán từ tiểu phân nhỏ qua MTPT sang các tiểu phân lớn, làm tăng kích thước hệ, dẫn đến tách pha

Hình 1.3: Một số quá trình phá vỡ cấu trúc nhũ tương [96]

Tốc độ kết tụ phụ thuộc vào độ hòa tan của phân tử pha phân tán trong MTPT

và hệ số khuếch tán của nó Để giảm quá trình kết tụ Ostwald: thêm vào hệ một lượng nhỏ pha phân tán thứ hai không tan trong MTPT (hexandecan, squalen…) hoặc sử dụng các CDH hấp thụ mạnh trên bề mặt phân cách pha (CDH polyme), kết hợp nhiều CDH hay sử dụng các CĐDH

Hầu hết các hệ NNT ổn định đều có nhiệt động học và động học ổn định và chúng không bị phá hủy sau nhiều tháng hoặc thậm chí sau nhiều năm [81]

c Đặc tính điện - thế điện động zeta ( - zeta potential)

Hầu hết các hệ keo vô cơ và hữu cơ đều sẽ có một hiệu điện thế lớn lơ lửng trong nước với cường độ ion thấp và pH trong khoảng từ 5,7 đến 9 Sự xuất hiện của hiệu điện thế này sẽ làm các giọt phân tán hấp phụ phân tử nước phân cực và ion Khu vực bao quanh giọt phân tán có sự thay đổi hiệu điện thế gọi là lớp điện tích đôi Các giọt phân tán hầu hết tích điện âm ở bề mặt Khi đó các ion dương trong pha nước sẽ bị hấp phụ và hiệu điện thế giảm dần Khi đó, khu vực bên trong cùng của lớp điện tích đôi có lực hấp phụ mạnh nhất đó là bề mặt Stern Hiệu điện thế giữa bề mặt Stern và môi trường dung dịch tiếp giáp chính là thế điện động zeta

Nó có thể tích điện dương hoặc âm phụ thuộc vào loại ion bị hấp phụ trên bề mặt Stern [116], [126]

KẾT TỤ OSTWALD

KẾT VÁNG

KẾT BÔNG KẾT TỤ

Hình 1.4: Cấu tạo lớp điện thế kép [44]

Việc đo lường thế zeta là rất quan trọng để nghiên cứu sự ổn định của hệ keo Giá trị tuyệt đối lớn hơn 30 mV sẽ cho thấy một hệ nhũ tương ổn định [70]

d Độ nhớt

Độ nhớt của NNT được tạo nên bởi CDH, nước, dầu và nồng độ của chúng NNT chủ yếu tồn tại ở dạng nhũ tương D/N; một số ít tồn tại ở dạng nhũ tương nước/dầu vì vậy độ nhớt của chúng thường rất thấp Theo dõi sự thay đổi độ nhớt sẽ giám sát được sự ổn định của NNT [39] Độ nhớt của các sản phẩm thuốc nhỏ mắt thường là 10 mPa.s (10 cP), cao hơn so với độ nhớt của nước mắt là 1,5 mPa.s (1,5 cP) Độ nhớt tăng làm tăng thời gian lưu, giảm sự rửa trôi của nước mắt, kể cả khi chớp mắt Kết quả nghiên cứu với các mẫu có độ nhớt nằm trong khoảng 10 - 100 mPa.s (cP) đã kết luận độ nhớt tốt nhất cho thuốc nhỏ mắt là 10 mPa.s (cP) Ở độ nhớt này, mẫu thuốc nhỏ mắt cũng cho thấy không ảnh hưởng đến lớp biểu mô giác mạc, do có sự tăng tiết nước mắt khi chớp mắt Đồng thời, nghiên cứu cũng đã chỉ

ra độ nhớt 10 mPa.s (cP) không có tác dụng làm thay đổi đến thời gian lưu thuốc tại mắt [176]

Ngoài ra còn đánh giá một số đặc tính khác của hệ nano nhũ tương như độ bền, phần trăm dược chất nhũ hóa, phần trăm giải phóng dược chất, pH và hàm lượng dược chất

Hạt tích điện âm

Thế zeta

Môi trường dung dịch

Lớp hấp phụ ion dương (bề mặt Stern)

Lớp khuếch tán

1.2.5 Ưu nhược điểm của nano nhũ tương

1.2.5.1 Ưu điểm

a Tăng độ tan của dược chất

Trong nghiên cứu của Faiyaz Shakeel và cộng sự (2009), NNT được sử dụng với mục đích làm tăng độ tan của aceclofenac Độ tan của aceclofenac trong NNT

đã đạt tới 198,53 mg/ml ở 25oC, tăng gấp 13235 lần so với độ tan của aceclofenac trong nước cất, trong khi hệ nano lipid rắn chỉ làm tăng độ tan lên gấp 6948 lần còn

hệ hỗn dịch nano chỉ làm tăng lên 5582 lần [136]

Kumar và cộng sự (2009) đã bào chế nano nhũ tương chứa 10 mg amlodipin với các thành phần như sau: acid oleic 2% (tt/tt), Tw 20 20% (tt/tt), Transcutol HP 10% (tt/tt), nước cất 68% (tt/tt) Chế phẩm được bào chế qua nghiên cứu đã cho thấy làm tăng độ tan của amlodipin lên gấp nhiều lần so với các loại dầu khác Kết quả được thể hiện trong Bảng 1.1 [86]

Bảng 1.1: Độ tan của amlodipin trong các loại dầu và nano nhũ tương

EL, Labrasol, Tw 80, Tw 85, ethanol, PG Kết quả cho thấy độ tan của rifampicin

cùng điều kiện thực nghiệm vì thế Sefsol 218 được lựa chọn làm pha dầu để phát triển CTTƯ Dược chất cũng có độ tan cao trong Tw 80 và Tw 85 Do đó Tw 80 và

Tw 85 được lựa chọn là CDH trong công thức Các thành phần được lựa chọn với mục đích làm tăng độ tan của rifampicin ở mức cao nhất [19]

b Tăng sự ổn định của dược chất, bảo vệ dược chất khỏi sự thủy phân và oxy hóa

NNT bethamethason được bào chế bằng phương pháp tự nhũ hóa CTTƯ được bào chế với các thành phần 0,05% (kl/tt) của betamethason, 15% (tt/tt) hỗn hợp acid oleic và Safsol (1.5:1 tt/tt), 38% (tt/tt) hỗn hợp Tw 20 và isopropanol (1:1 tt/tt), nước cất vừa đủ 100% (tt/tt) NNT được bảo quản trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 30oC, 40oC, 50oC, 60oC và được xác định hàm lượng sụt giảm sau khoảng thời gian 30, 60 và 90 ngày Kết quả cho thấy sự sụt giảm hoạt chất rất thấp sau thời gian bảo quản 3 tháng (90 ngày) ở 30 ± 0,5oC nồng độ dược chất tìm lại là 97,498%; ở 40 ± 0,5oC nồng độ dược chất tìm lại là 96,161%; ở 50 ± 0,5oC nồng độ dược chất tìm lại là 95,279%; ở 60 ± 0,5oC nồng độ dược chất tìm lại là 94,401% : chỉ ra sự ổn định về mặt hóa học của dược chất (DC) trong NNT [23]

Một DC khác cũng đang được các nhà khoa học rất quan tâm đó là insulin, insulin là DC có bản chất protein/polypeptid dễ bị thủy phân trong đường tiêu hóa,

dễ bị phân hủy bởi enzym và pH trước khi có tác dụng tại đích NNT insulin dùng theo đường uống được thiết kế để làm tăng độ ổn định của DC và tăng SKD của

insulin khi dùng qua đường tiêu hóa Qua nghiên cứu SKD in vivo trên chuột thực

nghiệm cho thấy NNT insulin dùng theo đường uống có SKD cao nhất so với các chế phẩm khác như phức hợp phospholipid - insulin đưa thẳng vào dạ dày và phức hợp insulin – phospholipid tiêm dưới da; sau 2 giờ uống NNT insulin nồng độ glusose ở chuột giảm xuống còn 29,20 ± 9,76%, thuốc kéo dài nồng độ tác dụng hơn 10 giờ nghiên cứu [173]

c Tăng hấp thu, tăng sinh khả dụng

Veerabrahma Kishan và cộng sự đã bào chế NNT dầu chứa ADC dùng đường tiêm với mục tiêu giải phóng kéo dài để điều trị bệnh viêm khớp NNT được bào chế bằng phương pháp ĐNH và siêu âm có KTG 200 – 250 nm, thế zeta -31 ± 1 mV, NNT bền với tác động của siêu âm, pha loãng và bảo quản, tỉ lệ thuốc

được nhũ tương hóa (entrapment efficiency) là khoảng 99%, nghiên cứu GP in vitro

sau 12 giờ sử dụng túi thẩm tích 3 mẫu lần lượt là 80%, 57%, và 42% Nghiên cứu

dược động học in vivo trên chuột được so sánh với thuốc tiêm diclofenac (Voveran)

Các CT được nghiên cứu bước đầu cho thấy tác dụng đối đa đạt được sau 2 giờ, tác

dụng chống viêm duy trì lên tới 12 giờ, có sự giảm nhẹ về tác dụng khi theo dõi tiếp đến 24 giờ Khi sử dụng thuốc tiêm diclofenac thì nồng độ đỉnh đạt ở 5 giờ sau đó giảm dần [162]

NNT domperidon dùng qua da được tiến hành đánh giá SKD in vivo trên chuột

bạch được nuôi dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm Chuột được chia thành 2 nhóm, mỗi nhóm 8 con, 1 nhóm được cho uống hỗn dịch thuốc chứa domperidon, một nhóm được đặt cố định NNT bào chế chứa domperidon trên da với diện tích tiếp xúc là 2 cm2 Mẫu máu 0,2 ml sẽ được lấy ở nhóm chứng và nhóm thực nghiệm, sau đó đem đi xử lý mẫu và định lượng hàm lượng domperidon Kết quả cho thấy [AUC]0 của NNT là 511,11 ± 31,8 ng/ml/h, trong khi [AUC]0 của hỗn dịch dùng đường uống là 144,80 ± 20,2 ng/ml/h Kết quả này cho thấy SKD khi sử dụng NNT domperidon dùng qua da tăng gấp 3,5 lần so với SKD đường uống [21] Jain và cộng sự (2009) đã tiến hành bào chế NNT dùng qua đường niêm mạc mũi đối với nitrendipin (NDP) SKD dùng qua đường uống của NDP chỉ vào

khoảng 10 - 20% do bị chuyển hóa mạnh qua gan Nghiên cứu GP và SKD in vivo

cho thấy dạng thuốc NNT chứa NPD có hoạt tính mạnh và có SKD khoảng 60,44%, cao hơn đáng kể so với dạng viên nén trên thị trường NDP được hòa tan trong hệ gồm Tween 80 : Transcutol P® : Solutol HS-15® với tỉ lệ 1:2:1 NNT được đánh giá

là an toàn khi dùng qua đường mũi và phù hợp với mô học mũi với KTG TB là 98,5

nm Nồng độ thuốc được tìm thấy sau 1 tháng là 99,58 ± 0,05%, và được đánh giá là không có sự thay đổi đáng kể [74]

Faiyaz Shakeel và cộng sự năm (2014) đã bào chế thành công NNT dầu/nước/dầu của 5-fluorouracil (5 - FU) bằng phương pháp tự nhũ hoá với mục đích điều trị ung thư đại tràng Một số đặc tính như hình thái bề mặt, phân bố KTG,

độ nhớt, chỉ số khúc xạ, độ truyền qua, nồng độ DC cũng đã được xác định CTTƯ được xác định có KTG nhỏ hơn 25 nm, nồng độ DC GP được xác định là hơn 99%

trong 15 phút Trong nghiên cứu độc tế bào in vitro cho thấy CTTƯ dạng NNT

5-FU có hiệu quả gấp 5 lần so với dạng 5 - 5-FU tự do [135]

d Tác dụng tại đích

Các dẫn chất oxazin của γ-tocotrienol và δ-tocotrienol đã được bào chế dưới

dạng hệ phân phối thuốc NNT lipid và được đánh giá in vivo trên chuột thí nghiệm

bởi nhóm tác giả Suryatheja Ananthula và cộng sự (2014) Kết quả thực nghiệm cho thấy các dẫn xuất oxazin của Tocotrienol ức chế đáng kể nhân tố gây tăng trưởng khối u vú ở chuột so với hợp chất gốc, hiệu quả điều trị này có liên quan tới việc

làm giảm sự phát triển của tế bào và sự tồn tại của tế bào Kết quả cũng cho thấy đây là hệ phân phối thuốc tiềm năng đối với các dẫn chất oxazin của Tocotrienol trong điều trị ung thư vú [174]

Camptothecin là một chất ức chế topoisomerase I, chống lại sự phát triển của

tế bào ung thư Tuy nhiên, ứng dụng lâm sàng của nó bị hạn chế bởi nó không tan, không ổn định và độc Mục đích của nghiên cứu Jia-You Fang và cộng sự là để phát triển dạng thuốc NNT chứa camptothecin nhằm phân phối được DC này vào hệ tuần hoàn NNT chứa camptothecin được bào chế với các thành phần perfluorocarbon, dầu dừa, sulforhodamin B, được ổn định bằng phospholipid và Pluronic F68 (PF68) NNT thu được có đường kính giọt TB 220 - 420 nm Camptothecin trong các hệ này được giải phóng từ NNT camptothecin với nồng độ dầu thấp gây độc tế bào, chống lại khối u ác tính và các tế bào ung thư buồng trứng Kính hiển vi quét laser đồng tiêu cho thấy hình ảnh dược chất giải phóng ra từ dạng bào chế NNT xâm nhập được vào trong các tế bào [53]

e Tăng hoạt tính, giảm độc tính

NNT curcumin dùng theo đường uống làm tăng hoạt tính kháng viêm của curcumin trong thực nghiệm gây phù trên tai chuột Nghiên cứu chỉ ra rằng NNT làm giảm mức độ viêm từ 43% tới 85% tương ứng KTG của NNT được bào chế là 618,6 nm và 79,5 nm Trong khi DD curcumin 0,1% gần như ít hoặc không làm giảm viêm tai chuột sau khi uống [166]

Daunorubicin là một loại thuốc tuyến đầu trong điều trị bệnh bạch cầu tủy bào cấp tính tuy nhiên tính hữu dụng của nó bị hạn chế do độc tính mạnh trên hệ huyết học và tim mạch, gây tử vong ở nhiều bệnh nhân khi điều trị bằng Daunorubicin Raquel S Teixeira đã nghiên cứu bào chế NNT giàu lipid (LDE-daunorubicin) để làm tăng SKD và giảm độc tính của daunorubicin Nghiên cứu được tiến hành bằng cách tiêm thuốc vào hai nhóm chuột: một nhóm được tiêm LDE-oDNR (NNT giàu lipid - N-oleyl daunorubicin); một nhóm được tiêm chế phẩm daunorubicin thương mại Sau đó được tiến hành theo dõi sau 32 ngày Kết quả cho thấy nhóm được tiêm LDE tăng cân bình thường và tỉ lệ chết thấp hơn hẳn so với nhóm sử dụng chế phẩm thương mại Điều này cho thấy độc tính của daunorubicin được giảm đi khi sử dụng

nó ở dạng thuốc NNT [150]

f Sử dụng được trên nhiều đường dùng

NNT được sử dụng trực tiếp trên nhiều đường dùng khác nhau như dùng ngoài (trên da, trên mắt, trên mũi), đường tiêm, đường uống… Tất cả các đường dùng này

đều cho thấy NNT khi sử dụng làm tăng độ ổn định của DC, tăng SKD và hiệu quả điều trị [153]

1.2.5.2 Nhược điểm

a Sử dụng nồng độ cao chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt

NNT được hình thành sử dụng nồng độ cao CDH từ 20 – 50%, dẫn đến làm tăng tác dụng không mong muốn khi sử dụng [148]

Các CDH ion thường không được sử dụng do độc tính đối với mắt, CDH không ion hóa thường được sử dụng nhiều hơn CDH không ion bao gồm polyoxyethylen – polyoxy propylen copolyme (Pluronic F68™, Pluronic L-62™ và Pluronic L62D™), polysorbat 80, polyoxyethylen este hóa với acid béo (Emulphor™), dẫn xuất dầu thầu dầu hydrogen hóa (Cremophor® EL và Cremophor® RH 40), tyloxapol, PEG succinat phù hợp với đặc điểm sinh lý tại mắt

do rất ít gây kích ứng mắt Chúng thường được sử dụng với nồng độ 0,5 đến 3% kl/tt [30]

b Độ ổn định bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH, khó khăn trong quá trình bảo quản

Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH và nhiệt độ tới sự ổn định của chế phẩm NNT ramipril, Sheikh Shafiq và Faiyaz Shakeel đã bào chế 5 ml mỗi CT NNT sử dụng pha nước là các loại hệ đệm có pH khác nhau: pH = 1,2 (pha nước: đệm acid hydrocloric), pH = 2,2 (pha nước: đệm acid hydrocloric), pH = 3,0 (pha nước: đệm acid phthalic), pH = 4,0 (pha nước: đệm acid phthalic), pH = 5,0 (pha nước: đệm phthalat), pH = 5,0 (pha nước: đệm phosphat), pH = B = 7,0 (pha nước: nước cất) 3

lô mỗi CT được bào chế và bảo quản ở nhiệt độ phòng 25 ± 2°C Các mẫu được xác định sự thay đổi về tính chất vật lý và nồng độ tại các thời điểm 0, 15, 30, 45, 90, và

180 ngày Kết quả cho thấy ở pH = 7, NNT kém ổn định nhất, hàm lượng DC sụt giảm mạnh sau 90 ngày bảo quản; ở pH = 5,0 NNT ổn định nhất, sự sụt giảm nồng

độ không đáng kể sau 90 ngày bảo quản Như vậy, giá trị pH ảnh hưởng trực tiếp đến độ ổn định của chế phẩm

Dự đoán tuổi thọ của NNT (pH = 5,0) khi bảo quản ở nhiệt độ 40 ± 2°C, 25 ± 2°C, và 5 ± 2°C cho thấy NNT khi được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 5 ± 2°C có tuổi thọ là 4,7945 năm trong khi ở điều kiện bảo quản 40 ± 2°C, 25 ± 2°C tương ứng là 0,0449 và 0,2877 năm Điều này cho thấy sự khó khăn trong quá trình bảo quản chế phẩm [132]

Để nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường tới sự ổn định hóa học và vật lý của NNT giàu β-caroten, Cheng Qian và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH với các điều kiện sau:

Ảnh hưởng của nhiệt độ: 20 ml NNT (pH = 7) được cho vào các ống thủy tinh

và bảo quản ở nhiệt độ 5, 20, 37, và 55oC trong 15 ngày, để trong bóng tối

Ảnh hưởng của pH: Mẫu NNT được bào chế bằng DD đệm sau đó được điều chỉnh pH trong khoảng từ 3 - 8 bằng DD natri hydroxyd và acid hydrocloric Mỗi

20 ml mẫu NNT được chuyển vào các ống thủy tinh và để trong bóng tối ở nhiệt độ

25oC trong 5 ngày Kết quả cho thấy như sau:

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nồng độ β - caroten sụt giảm mạnh nhất khi bảo quản ở nhiệt độ 55oC và thấp nhất ở nhiệt độ 5oC Điều này cho thấy sự khó khăn trong quá trình bảo quản NNT β-caroten Nhận thấy sự thay đổi màu của NNT β - caroten thay đổi mạnh nhất ở pH = 3 và ít thay đổi ở pH = 4 và 8 [114]

Thêm nữa, trong nghiên cứu cũng chỉ ra rằng pH còn ảnh hưởng tới KTG và thế zeta của NNT

NNT aspirin được bào chế gồm các thành phần: Lauroglycol 90, Transcutol, Cre EL, và nước loại ion NNT được bào chế bằng kỹ thuật siêu âm và vi lưu Các tác giả đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của pH (2 - 10) tới sự hình thành KTG của NNT aspirin sau khi được bào chế bằng 2 thiết bị trên, kết quả cho thấy pH có ảnh hưởng lớn tới sự hình thành KTG của NNT KTG tăng khi pH tăng, đặc biệt là với phương pháp siêu âm trong khoảng pH từ 5 – 10 [148]

1.3 NANO NHŨ TƯƠNG NHỎ MẮT

1.3.1 Đặc điểm cấu tạo của mắt liên quan đến hấp thu dược chất

Mắt là một cơ quan có kích thước nhỏ có vai trò cung cấp tín hiệu ánh sáng tới các tế bào tiếp nhận ánh sáng của thần kinh thị giác và từ đó truyền chúng tới não [151] Mắt (organon visus) gồm có nhãn cầu, thần kinh mắt và những bộ phận phụ thuộc như mí mắt, lông mi, các cơ mắt, các cân mạc, tuyến lệ và các màng tiếp hợp Nhãn cầu (bulbus oculi) là một bộ phận cơ bản của cơ quan thị giác Cấu tạo bởi 3 lớp [17], [168]:

- Lớp ngoài gồm củng mạc và phía trước biến đổi thành giác mạc

- Lớp giữa là màng bồ đào, thân bè và mạch lạc mạc, chứa nhiều mạch máu, phía trước dày lên thành thể mi và mống mắt

- Lớp trong là võng mạc, chứa các tế bào nhận cảm ánh sáng là tế bào gậy và tế bào nón

Hình 1.5: Cấu tạo giải phẫu mắt [2]

Tổ chức mắt được bảo vệ bởi hàng rào sinh lý mắt ở phía bên ngoài và hàng rào máu võng mạc ở bên trong Hàng rào sinh lý của mắt bao gồm: lớp màng nước mắt, giác mạc và kết mạc Lớp màng nước mắt, có thể tích khoảng 7,4 µl, gồm 3 lớp: lớp lipid ngoài, lớp nước giữa, và trong cùng là lớp dịch nhầy bao phủ bề mặt lớp biểu mô giác mạc và kết mạc Màng nước mắt là DD đệm có pH khoảng 7,4, chứa ion, lipid, protein (lysozym, albumin, glycoprotein) Sự tương tác với protein trong lớp nước của màng nước mắt làm giảm nồng độ thuốc tự do có khả năng khuếch tán qua hàng rào mô Với mắt không viêm, nồng độ protein không ảnh hưởng nhiều do chỉ chiếm khoảng 0,7% (kl/kl) trong dịch nước mắt, tuy nhiên tỉ lệ này tăng lên khi mắt bị viêm [112], [145]

Giác mạc: gồm 3 lớp mô song song: lớp biểu mô, lớp đệm, và lớp nội mô Lớp

biểu mô giác mạc là lớp quyết định, kiểm soát sự hấp thu, vận chuyển dược chất (DC) qua giác mạc; còn lớp đệm và nội mô chỉ kiểm soát sự hấp thu của các hợp chất thân dầu nhỏ Với cấu trúc thân lipid - nước - lipid của các lớp mô của giác mạc, sự thấm qua giác mạc của các phân tử DC còn lưu lại được ở màng nước mắt phụ thuộc rất lớn vào hệ số phân bố dầu - nước của DC [112]

Kết mạc: Phần lớn các DC hấp thu qua kết mạc chủ yếu đi vào vòng tuần hoàn

máu, trước khi có thể đi vào các mô bên trong mắt, vì vậy hấp thu qua kết mạc là một yếu tố làm giảm SKD thuốc nhãn khoa, trừ trường hợp đích tác dụng của thuốc chính là kết mạc [3], [121]

Các yếu tố trước giác mạc cộng với thời gian tiếp xúc với màng hấp thu ngắn

là lý do chính làm cho lượng thuốc được hấp thu vào các mô bên trong thấp hơn 5% tổng lượng thuốc được đưa vào [18]

Ngoài ra, mắt được bảo vệ bởi hàng rào máu mắt Hàng rào này chia làm hai phần: hàng rào máu - thủy dịch và hàng rào máu - võng mạc Hàng rào máu mắt trước bao gồm các tế bào nội mô trong uvea Hàng rào này ngăn chặn sự xâm nhập của albumin trong huyết tương vào dịch tiền phòng và cũng hạn chế sự xâm nhập của DC thân nước từ máu vào thủy dịch Viêm có thể làm gián đoạn tính trọn vẹn của hàng rào này gây ra sự hấp thu không có giới hạn vào khoang trước Trong thực

tế, tính thấm của hàng rào này vẫn chưa đặc hiệu [41], [79]

1.3.2 Một số nghiên cứu về nano nhũ tương nhỏ mắt

NNT gần giống với dạng thuốc nhỏ mắt thông thường do có hơn 90% pha ngoại là nước trong thành phần công thức Đây là hệ phân phối thuốc mới, có nhiều

ưu điểm như: duy trì giải phóng thuốc hằng định tới giác mạc, có tính thấm cao vào sâu các mô bên trong mắt và thủy dịch cũng như có thể dễ dàng tiệt trùng [151] NNT cũng chịu ảnh hưởng của hàng rào bảo vệ mắt, cấu trúc dễ bị phá vỡ bởi các ion trong nước mắt và hoạt động cơ học của mắt Các dạng thuốc nhỏ mắt thông thường khi được nhỏ vào mắt sẽ bị rửa trôi nhanh chóng, điều này cũng xảy ra tương tự với pha nước của dạng thuốc nano nhũ tương, tuy nhiên pha dầu có thể vẫn tồn tại trong túi cùng kết mạc một thời gian dài và giữ chức năng như hệ kiểm soát đưa thuốc [128] Dạng bào chế nhũ tương có thể kéo dài thời gian lưu của giọt thuốc nhỏ mắt trên lớp biểu mô giác mạc, từ đó làm tăng tính thấm của DC vào các

mô bên trong mắt Vì vậy, mắt không hấp thu DC theo cơ chế DC được giải phóng

ra khỏi giọt dầu, hòa vào màng nước mắt, mà theo cơ chế phân bố trực tiếp từ giọt dầu vào màng tế bào trên bề mặt mắt Do vậy, nhũ tương có kích thước nano có ưu điểm rõ rệt vì làm tăng thời gian lưu so với thuốc nhỏ mắt thông thường và cải thiện đáng kể SKD của thuốc nhỏ mắt [124]

Cơ chế tăng tính thấm ở mắt của NNT được tìm hiểu rõ hơn trong nghiên cứu so sánh tính thấm của indomethacin trên mắt thỏ của cả 2 loại NNT mang điện tích dương và điện tích âm Góc tiếp xúc với giác mạc của giọt nước muối sinh lý,

nhũ tương mang điện tích âm, nhũ tương mang điện tích dương lần lượt là 70o, 38o, 21,2o, và hệ số sức căng bề mặt lần lượt là -47, -8,6 và -2,4 mN/m Do đó, cả 2 loại NNT đều có khả năng thấm ướt giác mạc tốt hơn so với DD nước muối sinh lý [80] NNT indomethacin được thiết kế với tá dược chitosan tạo nhũ tương cation dùng cho mắt cho thấy khả năng bám dính tốt với giác mạc, giải phóng indomethacin chậm và kéo dài, làm tăng hiệu lực chống viêm cho cả các mô bên trong và bên ngoài Nghiên cứu so sánh cho thấy NNT indomethacin có chứa chitosan sau khi được nhỏ vào mắt sau 1 giờ, nồng độ thuốc trong giác mạc và trong thủy dịch cao hơn gấp 30 lần so với nhỏ DD thuốc thông thường [29]

NNT dùng cho nhãn khoa được nghiên cứu với nhiều các hợp chất khác nhau như: dorzolamid (Hussein O Ammar và cộng sự, 2009), NNT bào chế được cho thấy có nhiệt động học ổn định, tính chất lý hóa phù hợp với sinh lý mắt, khả năng lưu giữ, giải phóng kéo dài và tăng hiệu lực sinh học hơn so với các chế phẩm trên thị trường [26]; Sohail Akhter và cộng sự đã bào chế các hệ nano gồm NNT chứa ganciclovir (chứa triacetin, Span 20, Transcutol P), hệ tiểu phân nano (chứa Chitosan), hệ phân tán niosome kết dính niêm mạc Các hệ tiểu phân đã bào chế đều

có kích thước khoảng 23 – 200 nm Nghiên cứu dược động học trên mắt thỏ, so sánh với dung dịch DC đều ở nồng độ 0,3% thì [AUC]0t của NNT cao nhất (3690,7

± 21,8 ng.giờ/ml), cao hơn hệ tiểu phân Chitosan (3318,1 ± 29,4 ng.giờ/ml), gấp 2,5 lần hệ phân tán niosom (1441,9 ± 20,0 ng.giờ/ml), gấp 6 lần so với dạng DD (559,6

± 14,2 ng.giờ/ml) Bên cạnh đó, NNT còn thể hiện được tác dụng kéo dài hơn hai hệ tiểu phân nano còn lại khi Tmax cao nhất 1,4 giờ và Cmax thấp nhất 449 ± 6,5 ng/ml

so với 589 ± 8,9 ng/ml (hệ tiểu phân chứa chitosan) và 523 ± 8,2 ng/ml (hệ phân tán niosom) [22] Jinqui Shen và cộng sự đã nghiên cứu bào chế NNT nhỏ mắt chứa flurbiprofen axetil (là một thuốc giảm đau chống viêm không steroid, ít tan trong nước, dễ gây kích ứng mắt) sử dụng phương pháp ĐNH ở áp suất cao với dầu thầu dầu là dung môi pha dầu, và Tw 80 là tác nhân nhũ hóa NNT bào chế được có KTG TB khoảng 150 nm; PdI 0,2; tỉ lệ DC được nhũ tương hóa hơn 98%; so sánh với DD dầu flurbiprofen axetil thì [AUC]010 giờ trong thuỷ dịch cao hơn đến 6,7 lần, kéo theo đó là tác dụng cũng được kéo dài lên đến 8,71 ± 0,94 giờ [139], [140] Masazumi Yamaguchi và cộng sự bào chế NNT difluprednat (hợp chất chống viêm bản chất glucocorticoid tổng hợp, ít tan trong nước) chứa 0,05% (kl/tt) DC; 4,0% (kl/tt) Tw 80; 5,0% (kl/tt) dầu thầu dầu bằng phương pháp ĐNH ở áp suất cao, cho nhũ tương có KTG TB 108,4 nm; kết quả nghiên cứu chỉ ra không có hiện tượng

tách pha hay thay đổi KTG khi bảo quản ở nhiệt độ 25oC và 40oC trong 6 tháng

Nghiên cứu tính thấm in vivo qua giác mạc thỏ của NNT difluprenat, so sánh với

hỗn dịch chứa 0,05% dược chất (kl/tt) thì thấy nồng độ chất chuyển hóa của difluprednat trong thủy dịch sau 1 giờ, 3 giờ kể từ khi nhỏ cao gấp 5,7 và 3,1 lần; còn AUC trong giác mạc, thủy dịch cao gấp 4,6 và 4,1 lần [172]

NNT chứa acetazolamid được bào chế với các thành phần như sau: CT 18a gồm 1% hoạt chất acetazolamid, dầu lạc 3%, Tw 80 25,65%, Cre EL 25,65%, Transcutol P 5,7%, nước 39%; CT 18b gồm 1% hoạt chất acetazolamid, dầu lạc 2%,

Tw 80 17,1%, Cre EL 17,1%, Transcutol P 3,8%, nước 59% Kết quả nghiên cứu cho thấy hai CT NNT có hiệu lực và thời gian làm giảm nhãn áp kéo dài hơn so với chế phẩm thương mại brinzolamid (Azopt®) và viên nén Cidamex® trên thị trường [103]

T Hagigit và cộng sự đã đánh giá SKD in vivo của NNT cation (cationic

nanoemulsion) DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammoniumpropan) trong điều trị bệnh tăng trưởng mạch máu vào võng mạc (neovascularization) CT của NNT (% tt/tt): MCT (1,66), poloxame - 188 (0,425), glycerin (2,25), lipoid E - 80 (0,5), DOTAP (0,33), α - tocopherol (0,01), khuấy từ 16000 vòng/phút trong 5 phút, sau

đó làm lạnh nhanh tới 20oC và được ĐNH áp suất cao ở 10000 psi trong 5 phút, điều chỉnh pH đến 7,4; lọc qua màng 0,2 μm NNT có KTG là 95 ± 2 nm, thế zeta

56 ± 2 mV Kết quả ức chế tăng mạch máu vào võng mạc lên đến 64 % khi điều trị bằng NNT bào chế được Toàn bộ kết quả của nghiên cứu đã cho thấy NNT cation chứa DOTAP có nhiều tiềm năng hứa hẹn với hiệu quả lâm sàng cao trong ngăn chặn điều trị bệnh tăng sinh mạch máu tại mắt [69]

Yan Liu và cộng sự đã nghiên cứu NNT azithromycin (kháng sinh macrolid, rất ít tan trong nước) với các thành phần: DC 1%; triglycerid 8,5%; lecithin đậu nành 1,8%; stearylamin 0,3%; α - tocopherol 0,05%; Tw 80 0,4%; Cre EL 0,3%; glycerin 2,2% Kết quả cho thấy KTG 124,5 ± 25,6 nm; thế zeta 23,5 ± 5,5 mV; tỉ lệ

DC được nhũ tương hóa là 90,6 ± 2,4 % (phương pháp siêu lọc, màng thẩm tích 10 kDa) So với dung dịch DC 1%, NNT có SKD cao gấp 1,73 lần và có thời gian lưu

ở kết mạc lâu hơn do giọt NNT tích điện dương [92]

M Gallarate và cộng sự đã bào chế NNT timolol maleat (điều trị bệnh tăng nhãn áp); DC 0,043%; IPM 5%; lecithin đậu nành 1%; Tw 80 1%; glycerin 2,5%; EDTA 0,1%; chitosan; PVA, PEG KTG 71,0 ± 0,8 nm; pH 5,1; thế zeta +34,90 mV; độ nhớt 1,87 mPa.s; ổn định ở 25ºC và 40ºC sau 6 tháng; dung nạp tốt với mắt thỏ Giọt dầu tích điện dương tương tác tĩnh điện với các mucin tích điện âm của giác mạc nên tăng độ hấp thu DC qua giác mạc [62]

Một số chế phẩm nano nhũ tương nhỏ mắt được trình bày ở Bảng 1.2

Tubilux

Phục hồi lớp lipid của tuyển lệ đạo sau phẫu thuật khúc xạ

Nhũ tương phospholipid

SootheXP®

Emollient

Dầu khoáng Restoryl

Bausch

Lomb

Phục hồi lớp lipid của tuyến lệ đạo sau phẫu thuật khúc xạ hoặc phẫu thuật khác

Nhũ tương dầu

Durezol® Diflupren

Sirion therapeuti

Nhũ tương anion

Refresh Dry

eye therapy®

Glycerin Polysorbat 80 Allergan

Điều trị chứng khô mắt

Nhũ tương anion

1.3.3 Đánh giá sinh khả dụng của nano nhũ tương trên mắt

1.3.3.1 Đánh giá sinh khả dụng in vitro

Đánh giá sinh khả dụng in vitro của nano nhũ tương được thực hiện trên các

thiết bị khác nhau sử dụng màng giải phóng và môi trường giải phóng thích hợp, cụ thể như sau:

Màng GP: thường sử dụng màng thẩm tích hoặc túi thẩm tích có giới hạn KLPT thường là 12 - 14 kDa [87]; đôi khi sử dụng màng lọc cellulose acetat với kích thước lỗ lọc thường là 0,2 µm Các màng này thường được xử lý bằng môi trường khuếch tán trước khi tiến hành thí nghiệm

- Môi trường khuếch tán: thường là đệm phosphat pH 7,4 [26] hoặc DD nước mắt nhân tạo [63] Môi trường khuếch tán được điều nhiệt, duy trì ở một khoảng nhiệt độ thích hợp và được khuấy trộn với tốc độ nhất định

- Nhiệt độ: 34 ± 0,5oC (nhiệt độ bề mặt nhãn cầu) [63], [26] hoặc 37 ± 0,5ºC [36]

- Thiết bị đánh giá giải phóng thuốc:

 Bình Franz (Hình 1.6): mẫu NNT được chứa ở ngăn cho phía trên (donor),

môi trường khuếch tán ở ngăn nhận phía dưới (receptor), màng thử giải phóng được đặt giữa hai phần Sau thời gian nhất định, lấy mẫu từ môi trường khuếch tán để định lượng, và bổ sung lại thể tích môi trường khuếch tán mới tương ứng [54], [87]

Hình 1.6: Sơ đồ bình Franz [104]

 Thiết bị thẩm tách micro (Hình 1.7): kim thăm dò được cắm vào lọ thủy tinh

chứa NNT ở nhiệt độ nhất định, môi trường khuếch tán được truyền qua kim thăm

dò với tốc độ thích hợp, mẫu thẩm tách micro được lấy tại các thời điểm và đem phân tích HPLC

Hình 1.7: Mô hình thử nghiệm kỹ thuật thẩm tách micro [110]

 Thiết bị thử hòa tan: NNT được chứa trong túi thẩm tích với 2 đầu được kẹp

chặt [26], [163] hoặc trong một ống thủy tinh hình trụ đường kính 2,5 cm, chiều dài

10 cm, một đầu được bao bởi màng thẩm tích, một đầu nối với thiết bị quay [29] Tại những thời điểm nhất định, lấy mẫu từ môi trường khuếch tán (bổ sung thể tích môi trường mới tương ứng) và định lượng DC bằng phương pháp thích hợp

Hoặc sử dụng kỹ thuật cân bằng ngược túi thẩm tích: NNT được đưa trực tiếp vào môi trường khuếch tán đã đặt các túi thẩm tích kín (trong túi có sẵn môi trường khuếch tán) Sau những khoảng thời gian nhất định, lấy một túi thẩm tích ra để định lượng DC [36], [127]

1.3.2.2 Đánh giá sinh khả dụng in vivo

a Định lượng dược chất trong dịch sinh học và mô hình dược động học tại mắt

Để đánh giá SKD, dược động học hay tác dụng dược lý của một thuốc bất kì trước hết phải tiến hành các thử nghiệm đánh giá trên động vật Với thuốc nhỏ mắt, thỏ là động vật thường được lựa chọn bởi có sự giống nhau tương đối giữa cấu tạo giải phẫu và các thông số sinh lý cơ bản giữa mắt người và mắt thỏ (Bảng 1.3)

[101]

Bảng 1.3: Một số đặc điểm giải phẫu, sinh lý của mắt người và mắt thỏ

Tốc độ thay thế nước mắt (μl/phút) 0,6 - 0,8 0,5 - 2,2 Tốc độ chớp mắt tự phát 4 - 5 lần/giờ 6 - 15 lần/phút

Hiện tại, có khá nhiều phương pháp để đánh giá SKD của thuốc nhỏ mắt trên thỏ tuy nhiên đều gặp phải hạn chế bởi lượng mẫu lấy được từ mỗi thời điểm rất ít

và rất khó lấy mẫu Các phương pháp phổ biến có thể kể đến là:

- Định lượng DC trong dịch tiền phòng

- Định lượng DC ở một số mô trong mắt (giác mạc, kết mạc …)

- Đo các đáp ứng trên lâm sàng (đếm số bạch cầu với thuốc chống viêm,

đo nhãn áp với thuốc chống tăng nhãn áp…)

Như vậy, để thực hiện các nghiên cứu đánh giá SKD in vivo của thuốc nhãn

khoa, một trong những nội dung quan trọng là xây dựng được quy trình chiết tách,

xử lý mẫu, định lượng dược chất trong dịch sinh học Mỗi phương pháp đánh giá SKD đều có những ưu, nhược điểm riêng và được áp dụng tùy theo mục đích nghiên cứu Tuy nhiên, với những thuốc mà đích tác dụng là trong nhãn cầu thì lựa chọn định lượng DC trong dịch tiền phòng cho thấy sự phù hợp nhất, bởi tiền phòng

là khu vực trung gian vận chuyển các chất đến các mô và tổ chức trong mắt [101] Tại mắt, dịch tiền phòng (aqueous humor) được rút ra khi đưa thuốc vào mắt sau

một khoảng thời gian nhất định nhằm định lượng nồng độ DC thấm qua giác mạc Các nghiên cứu trên thế giới đã đưa ra rất nhiều các phương pháp khác nhau để định lượng dược chất trong dịch tiền phòng, ví dụ như Kuhlmann và cộng sự (1997) đã

sử dụng HPLC có detector huỳnh quang để phát hiện diclofenac có trong thủy dịch

và huyết thanh người Diclofenac được phát hiện qua dẫn xuất huỳnh quang của nó

là acid carbazol – 1 – acetic sau khi diclofenac đi qua cột chiếu tia UV Phương pháp được cho là đáng tin cậy để xác định DC diclofenac trong dịch sinh học với giới hạn phát hiện dưới là 1 ng/ml [83] Seyda Demircan và cộng sự (2005) đã sử dụng phương pháp HPLC với detector điện hóa (HPLC-ECD) để định lượng diclofenac có trong đáy võng mạc (subretinal) và trong dịch tiền phòng, giới hạn định lượng dưới của DC là 20 ng/ml [43] Xiang Li và cộng sự cũng đánh giá SKD dựa vào định lượng nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng nhưng với kỹ thuật đặt màng vi thẩm tích vào mắt thỏ, loại bỏ được đáng kể dao động cá thể so với các phương pháp khác (Hình 1.8) [90]: nước muối sinh lý được dẫn vào tiền phòng qua mao quản, dịch thẩm tích được rút ra sau những khoảng thời gian nhất định và đem

Bảng 1.4 Một số điều kiện chạy sắc ký định lượng ADC trong dịch tiền phòng

Ultrasphere octyl (5 μm, 150 x 4,5 mm i.d.)

Acid acetic

băng 1,65% :

acetonitril (chứa 0,065%

triethylamin )

= 495 : 505

3 ng/ml (Vtiêm mẫu

Regis SPS

100 RP-8 (5 μm, 150 x 4,6 mm i.d.)

Acetonitril : natri acetat (30 mM) pH 3

= 40 : 60 hoặc

50 : 50

0,5 ng/ml (Vtiêm mẫu

Nucleosil 100-5 C18 (5 μm, 250 x 4,6 mm i.d.)

Acid acetic băng 1,65% : acetonitril (chứa 0,065%

triethylamin )

= 50 : 50

10 ng/ml (Vtiêm mẫu

λkt=286 nm

λpx=360 nm

Regis SPS

100 RP-8 (5 μm, 150 x 4,6 mm i.d.)

Acetonitril : natri acetat (30 mM) pH 3

= 60 : 40

1 ng/ml (Vtiêm mẫu

=20 μl)

Ngoài ra, phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (ultra performance liquid chromatography (UPLC)) kết hợp khối phổ đã được sử dụng để phân tích định lượng ofloxacin trong dịch tiền phòng sử dụng tobramycin làm chuẩn nội Cột phân tích là Waters Acquity UPLC BEH C18 (150 × 2,1 mm, 1,7 μm) DD rửa giải gồm hỗn hợp nước: acetonitril với tỉ lệ 95:5 (v/v) chứa 0,1% acid formic, tốc độ dòng chảy là 0,3 ml/phút Tổng thời gian phân tích là 3 phút, thời gian lưu ofloxacin là