Luận văn Thạc sỹ Sinh học Nghiên cứu phân lập nấm Purpureocillium Lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne SP

Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum .... K ết quả khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi trường

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

LILACINUM ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG BƯỚU

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Ngô Th ị Thu Hà

L ỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Hữu Phúc, Th.s Dương Đức Hiếu,

những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá trình làm luận văn này Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn vi sinh đã giảng dạy, chỉ dẫn cho em trong suốt quá trình học tập

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị làm việc tạiviện Sinh học Nhiệt Đới đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài

Con xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người đã xin ra con nuôi nấng, dạy dỗ và luôn động viên con trong những lúc con gặp khó khăn

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khoá vi sinh vật 22 đã cùng em chia sẽ những khó khăn trong quá trình học tập

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

M ỤC LỤC 2

B ẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT 5

M Ở ĐẦU 6

1 Lý do ch ọn đề tài 6

2 M ục tiêu của đề tài 6

3 Nhi ệm vụ 7

4 Đối tượng nghiên cứu 7

5 Th ời gian và địa điểm nghiên cứu 7

6 Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu 7

7 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu 7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 Giới thiệu chung về nấm Purpureocillium lilacinum 8

1.1.1 Vị trí phân loại 8

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu 9

1.1.3 Đặc điểm sinh học 9

1.1.4 Vai trò của Purpureocillium lilacinum 10

1.1.5 Tình hình ứng dụng nấm Purpureocillium lilacinum trong phòng trừ tuyến trùng ở Việt Nam và trên thế giới 12

1.2 Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp 13

1.2.1 Đặc trưng sinh học 13

1.2.2 Các loài quan trọng 15

1.2.3 Cơ sở phòng trừ tuyến trùng 15

1 3 Các y ếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng của nấm sợi 22

1.3.1 Các phương pháp nuôi cấy nấm sợi 22

1.3.2 Môi trường nuôi cấy 24

1.3.3 Các hợp chất cung cấp nguồn cacbon 24

1.3.4 Các hợp chất cung cấp nguồn nitrogen 24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2 1 V ật liệu 25

2 2 Thi ết bị và dụng cụ 25

2 3 Hóa ch ất 25

2 4 Môi trường 26

2.4.1 Môi trường phân lập, giữ giống nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường potato glucose agar-PGA ) 26

2.4.2 Môi trường khảo sát ảnh hưởng của pH, nguồn nitơ, nguồn cacbon, đến sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum (môi Czapek-Dox Broth) 26 2.4.3 Môi trường quan sát vi thể nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường YEA) 26 2 5 Các phương pháp nghiên cứu 26

2.5.1 Phương pháp phân lập 26

2.5.2 Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng 27

2.5.3 Phương pháp quan sát hình thái và định danh nấm sợi 28

2.5.4 Phương pháp định danh nấm sợi bằng sinh học phân tử 28

2.5.5 Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng 29

2.5.6 Phương pháp đếm tuyến trùng 29

2.5.7 Phương pháp định danh tuyến trùng bằng hình thái 30

2.5.8 Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng bởi nấm Purpureocillium lilacinum trong điêù kiện in vitro 31

2.5.9 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum 32

2.5.10 Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov 33

2.5.11 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật 33

2.5.11 Các phương pháp khác 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 34

3.1 Phân l ập và định danh chủng nấm có khả năng diệt tuyến trùng 34

3.1.1 Phân lập 34

3.1.2 Định danh 34

3.2 K ết quả định danh tuyến trùng 38

3.3 Kết quả khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp trong diều ki ện in vitro 40

3.3.1 Kết quả khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng cái loài Meloidogyne sp trong điều kiện in vitro 40

3.3.2 Kết quả thử nghiệm in vitro nấm Purpureocillium lilacinum trên trứng tuyến trùng Meloidogyne sp trên cây chuối 42

3.4 K ết quả khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum 45

3.4.1 Ảnh hưởng của pH 45

Ảnh hưởng của nguồn Nitơ và nguồn Cacbon 49

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 60

PH Ụ LỤC 64

MỞ ĐẦU

1 Lý do ch ọn đề tài

Việt Nam là một nước có nền nông nghiệp lâu đời Hàng năm chúng ta cung ứng rất nhiều mặt hàng nông sản cho nhu cầu thương mại trong nước và còn xuất khẩu sang các nước Các mặt hàng nông sản xuất khẩu tiêu biểu như: gạo, cà phê, cao su hay những mặt hàng nông sản trái cây với sản lượng lớn góp phần làm giàu cho nền kinh tế đất nước

Tuy nhiên, sản lượng nông sản thu hoạch hàng năm không ổn định có khi thất thoát Nguyên nhân gây ra thực trạng trên có thể là do ảnh hưởng của khí hậu, thiên tai và đặc biệt

là dịch bệnh

Dịch bệnh ở cây trồng do các tác nhân sinh học gây ra như: virut, nấm, tuyến trùng thì trong số các đối tượng đó vấn đề bệnh do tuyến trùng gây ra chưa được nghiên

cứu nhiều dẫn đến việc phòng bệnh gặp nhiều khó khăn

Tác hại do tuyến trùng gây ra đối với thực vật thường là tương đối nhẹ, tuy nhiên khi mật độ

ký sinh lớn chúng có thể gây hại nghiêm trọng, thậm chí chúng có thể gây chết thực vật Tuyến trùng ký sinh có thể làm giảm 12,5 % sản lượng cây trồng và thiệt hại do tuyến trùng

ký sinh đối với cây trồng nông nghiệp ước tính là hàng trăm tỷ USD mỗi năm

Tuyến trùng thực vật sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật đang phát triển, hoa, lá, hạt, thân và rễ, trong đó rễ là nơi gặp nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh nhất Tiểu

biểu như nhóm tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne spp ký sinh ở rễ một số cây như cà phê,

hồ tiêu, cà chua, cà rốt gây ra những tổn thất đáng kể đặc biệt là những mặt hàng nông sản

thế mạnh như cà phê, hồ tiêu

Để phòng trừ bệnh tuyến trùng rễ trên các đối tượng cây trồng trên có các biện pháp như: dùng các tác nhân cơ học, hoá học, sinh học Trong số các biện pháp trên thì biện pháp phòng trừ tuyến trùng bằng các tác nhân sinh học như dùng các loại vi khuẩn Pasteuria penetrans, n ấm (Nematoctonus concurrens và N haptocladus, Purpureocillium lilacinum )

đang rất được quan tâm

Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu phân

lập nấm Purpureocillium lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.”

2 M ục tiêu của đề tài

- Góp phần nghiên cứu khả năng phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.bởi các

ọc là nấm Purpureocillium lilacinum

3 Nhi ệm vụ

- Phân lập nấm Purpureocillium lilacinum từ côn trùng bị bệnh

- Phân loại đến loài chủng nấm Purpureocillium lilacinum

- Phân loại đến giống tuyến trùng Meloidogyne sp

- Thử nghiệm in vitro khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp của nấm Purpureocillium lilacinum

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển sinh khối và hình thành bào tử nấm Purpureocillium lilacinum

4 Đối tượng nghiên cứu

- Chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ côn trùng bị bệnh

- Tuyến trùng Meloidogyne sp phân lập từ đất và rễ cây chuối bị bệnh tuyến trùng

5 Th ời gian và địa điểm nghiên cứu

Địa điểm: Công ty TNHH Gia Tường, chi nhánh số 7 đại lộ Độc Lập, khu công nghiệp

Sóng Thần 1, huyện Dĩ An , tỉnh Bình Dương

Viện sinh học nhiệt đới, Số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, KP 6, P Linh Trung, Quận Thủ Đức, TP.HCM

Th ời gian thực hiện: từ tháng 10/2012 đến tháng 9/2013

6 Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu

Góp phần tìm hiểu về đặc điểm sinh học,điều kiện nuôi cấy và khả năng diệt tuyến

trùng bướu rễ Meloidogyne sp của Purpureocillium lilacinum

7 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu

Trên cơ sở những kết quả thu được trong quá trình khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng bướu rễ chủng vi sinh Purpureocillium lilacinum từ đó ứng dụng vào sản xuất các chế

phẩm đặc trị tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp cho cây trồng

C HƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về nấm Purpureocillium lilacinum

Tên đồng nghĩa: Paecillium Luangsa-ard, Hywel-Jones & Samson (2007); Penicillium

lilacinum Thom (1910); Penicillium amethystinum Wehmer (1923)

Spicaria rubidopurpurea Aoki (1941) Purpureocillium lilacinum (Thom) Samson (1974)

Purpureocillium là một chi nấm trong họ Ophiocordycipitaceae Chi đơn loài có

chứa loài duy nhất là Purpureocillium lilacinum, là loài nấm sợi hoại sinh phổ biến Nó

đựơc phân lập từ một loạt các môi trưòng sống bao gồm đất trồng và đất bỏ hoang, rừng, đồng cỏ, sa mạc, trầm tích cửa sông, bùn cặn nứơc thải và côn trùng Nó cũng đã đựơc tìm

thấy trong trứng giun tròn, tuyến trùng nang Ngoài ra nó còn đựơc phát hiện thường xuyên trong vùng rễ của nhiều loại cây trồng Chúng có thể phát triển ở phạm vi nhiệt độ rộng từ 8-38 oC, và nhiệt độ sinh trưỏng tối ưu trong khoảng 26-30 oC Nó cũng có khả năng chịu đựng pH rộng 2-10 và có thể phát triển trên nhiều loại bề mặt khác nhau

Purpureocillium lilacinum đựơc cho là có tiềm năng sử dụng để kiểm soát sự phát triển của tuyến trùng rễ [16],[19]

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu

Các loài đựơc mô tả bởi nhà nấm học người Mỹ Charles Thom vào năm 1910 với tên

gọi Penicillium lilacinum

Vào năm 1974 Charles Thom chuyển các loài này thành Paecilomyces Những ấn

phẩm trong thập niên 20 chỉ ra chi Paecilomyces không phải là đơn ngành mà có quan hệ

mật thiết với Paecilomyces nostocoides, Isaria takamizusanensis and Nomuraea atypicola

Chi mới Purpureocillium được tạo ra để tổ chức các đơn vị phân loại Tên gọi chung

này đề cập đến các bào tử tím được tạo ra bởi nấm này

Thể bình gồm một phần đuôi phình to, thon dần ở phần đầu giống như một cái cổ Bào tử trong chuỗi có nhiều hình dạng từ elip đến hình thoi Bào tử có thành trơn đến hơi nhám Không có bào tử chống chịu [19]

Hình 1.1: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum (hình bên trái), cấu tạo vi thể nấm

Purpureocillium lilacinum (hình bên phải) [36]

1.1.4 Vai trò của Purpureocillium lilacinum

a Tác nhân ki ểm soát tuyến trùng

Purpureocillium lilacinum là một loài nấm bông phổ biến với phạm vi phân bố rộng trên toàn thế giới (Samson, 1974) và đã được thử nghiệm rộng rãi nhất cho sự kiểm soát của

Quan sát một số nhiễm trùng giai đoạn ấu trùng ở Đông Trung Quốc có

sự khác biệt lớn trong khả năng gây bệnh giữa các chủng Purpureocillium lilacinum

(Rodriguez- Kabana et al., 1984) Ở Ba Lan, một dòng nội địa của loại nấm này loài được nghiên cứu như một tác nhân sinh học tiềm năng chống lại

tuyến trùng sần rễ trong nhà kính (Sosnowska, 2003)

Hiện nay, Purpureocillium lilacinum là loài nấm chỉ có mục đích thương mại để

kiểm soát tuyến trùng, sâu bệnh ở châu Âu, và chủng nấm 251 thương mại được đăng ký để bán ở một số nước (Atkins et al., 2005) Bởi vì nó được phân loại như một microbiopesticide [23]

Cơ chế tấn công trứng tuyến trùng:

Trứơc khi xâm nhiễm vào trứng tuyến trùng, Purpureocillium lilacinum áp sát vào

bề mặt trứng và trở nên sát gần với trứng Purpureocillium lilacinum sản xuất những tế bào

chuyên biệt điển hình để lây nhiễm ở khắp nơi trên bề mặt trứng của tuyến trùng Những tế bào chuyên biệt tương tự như những mấu lồi ở phần cuối của một sợi nấm giúp áp sát vỏ

trứng Sau khi sợi nấm xâm nhập vào vỏ trứng chúng nhanh chóng phá huỷ ấu trùng bên trong sau đó sợi nấm tạo thành cuống sinh bào tử ra phía ngoài xâm nhiễm các trứng liền kề [19]

Hình 1.2: Cơ chế tấn công trứng tuyến trùng Meloidogyne spp bởi nấm

Purpureocillium lilacinum [42]

Hình 1.3: Trứng của tuyến trùng Meloidogyne javanica bị nhấn chìm bởi sợi nấm

Purpureocillium lilacinum

b S ản xuất một số enzym

Nhiều enzym đựơc sản xuất bởi Purpureocillium lilacinum đã đựơc nghiên cứu như: serine

protease một loại enzym chống lại trứng của tuyến trùng Meloidogyne hapurpureocillium lilacinuma: protease và chitinase có thể làm suy yếu vỏ trứng của tuyến trùng [16],[19]

c Kháng khu ẩn

Purpureocillium lilacinum khi được nuôi cấy lên men chìm người ta đã chiết tách được hoạt chất sinh học có tên gọi là leucinostatins Leucinostatins là một peptide trung tính

với cấu trúc gồm: α-aminoisobutyric acid, L-leucine, β-alanine và theo sau bởi 3 acid amin

bất thường (L-threo- β-hydroxy leucine, 2-amino-2-hydroxy-4-methyl-8 oxodecanoicacid và cis-4-methyl-L-proline (theo Mori et al 1982).Leucinostatins có 6 loại đã được môt tả là A,

B, C, D, E, F Leucinostatins có khả năng kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Gram dương và nhiều loại nấm (theo Fukushima et al 1983 a,b) Tuy nhiên trong cơ chế kiểm soát tuyến

1.1.5 Tình hình ứng dụng nấm Purpureocillium lilacinum trong phòng trừ tuyến trùng ở Việt Nam và trên thế giới

a Các sản phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thế giới

Một số chế phẩm diệt tuyến trùng được sản xuất từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thị

trường thế giới

Hình 1.4: Một số chế phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thị

trường thế giới [40]

b Các sản phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum ở Việt Nam

+ Tuyến trùng: Sử dụng nấm đối kháng Paecilomyces (Palila 500 WP) liều lượng theo

khuyến cáo, hoạt chất Cytokinin (Sincosin + Agrispon) 0,2%; Etobon 0,56 SL, tưới gốc

nồng độ: 0,125 ml/lít nước; 3.000-5.000 lít nước/ha, Vimoca 10G rải quanh gốc (30g/gốc tưới đẫm nước)

PALILA : ( Purpureocillium lilacinum 500 triệu bào tử/g)

Sản phẩm đặc trị tuyến trùng, ngăn ngừa bênh chết nhanh chết chậm trên tiêu và nhiều loại cây trồng khác, làm khoẻ lại bộ rễ và hút dinh dưỡng tốt hơn

Đặc biệt thử nghiệm hiệu quả trên cao su, cà phê, hồ tiêu, đã khảo nghiệm và chất lượng đuợc khẳng đinh tại Đơn Dương- Đức Trọng, Chư sê, Daksong…

Trên cây trồng: cải bắp ( sú) , hồ tiêu, cà phê… [40]

1.2 Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp

Tuyến trùng sần rễ (root-knot nematodes) được coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan

trọng nhất Nhóm tuyến trùng này phân bố rộng khắp thế giới và ký sinh ở hầu hết các cây

trồng quan trọng ở các vùng khí hậu khác nhau Chúng gây nên giảm sản lượng thu hoạch cũng như chất lượng sản phẩm cây trồng Hiện nay đã thống kê khoảng gần 80 loài ký sinh thuộc chi này, trong đó có 4 loài ký sinh gây hại quan trọng nhất là: M incognita, M arenaria, M javanica và M hapurpureocillium lilacinuma Đây là các loài phân bố rộng và gây hại lớn ở các vùng nông nghiệp trên thế giới Ngoài ra một số loài khác mặc dù cũng gây hại quan trọng nhưng chúng chỉ gây hại ở 1-2 cây trồng và phân bố hẹp [18]

1.2.1 Đặc trưng sinh học

Trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra ngoài trong một bọc gelatine (còn

gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt của sần rễ Đôi khi các bọc trứng này cũng có thể nằm bên trong nốt sần Sau quá trình phát triển phôi thai, trứng phát triển thành ấu trùng tuổi 1 ngay bên trong trứng Lần lột xác thứ nhất xảy ra trong trứng và phát triển thành ấu trùng tuổi 2

Trứng nở ra ấu trùng tuổi 2 dạng cảm nhiễm (infective juvenile = IJ2) không cần có sự kích thích của rễ thực vật

Hình 1.5: Tuyến trùng cái Meloidogyne sp và khối trứng

http://www.tstcantho.com.vn/?mod=article&id=193&section_id=3

Chuẩn bị xâm nhập vào rễ IJ2 tập trung dọc theo các tế bào non ngay tại phía sau

nan điểm xâm nhập cho các IJ2 khác và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương Khi IJ2 tiếp xúc

với bề mặt rễ chúng thường dùng kim hút châm chích và xâm nhập ngay vào trong rễ Sự xâm nhập của chúng có thể xảy ra ở bất kỳ phía nào của rễ Sau khi xâm nhập vào trong rễ tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ làm cho các tế bào bị tách dọc ra, sau đó tuyến trùng định vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ và bắt đầu quá trình dinh dưỡng Khi dinh dưỡng tuyến trùng cắm phần đầu vào các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý sinh hóa của mô rễ thay đổi và hình thành các điểm dinh dưỡng cho tuyến trùng Vùng này gồm 5-6 tế bào khổng lồ (tế bào có nhiều nhân) được tạo thành trong vùng nhu mô hoặc vùng mô phloem, nơi đầu tuyến trùng Đây là sự thích nghi chuyên hóa cao

của tế bào, chúng được tạo ra và duy trì bằng tuyến trùng ký sinh Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh cũng phình to ra tạo thành sần

rễ (gall hoặc root-knot) Sần rễ thường được tạo thành trong vòng 1-2 ngày sau khi tuyến trùng xâm nhập Kích thước của nốt sần liên quan đến cây chủ, số lượng IJ2 xâm nhập và loài tuyến trùng ký sinh [5]

Hình 1 6: Chu kỳ sống của tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp

http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/Images/Carrots/Root-Knot/Root-KnotCycle.jpg

Bản thân tuyến trùng cảm nhiễm, sau khi xâm nhập vào rễ cũng bắt đầu một cách nhanh chóng quá trình thay đổi về hình thái: cơ thể chúng phình ra và các nội quan cũng dần được phát triển Quá trình phát triển của tuyến trùng trong rễ từ IJ2 trải qua 3 lần lột xác và đạt đến trưởng thành Lần lột xác cuối cùng là sự biến thái thật sự đối với con đực, từ dạng

cuộn gấp khúc trong IJ4 chúng được nở ra và có dạng hình giun, trong khi đó con cái có

dạng hình tròn như quả lê hay quả chanh Tuyến trùng Meloidogyne spp sinh sản bằng 2

cách: một vài loài sinh sản hữu tính-giao phối bắt buộc (amphimixis) và phần lớn các loài

sinh sản lưỡng tính (parthenogenessis) không cần con đực Đối với các loài hữu tính thì con đực cặp đôi ngay với con cái sau lần lột xác cuối cùng

Tuyến trùng sần rễ có quan hệ mật thiết với các điều kiện môi trường trong đó cây

chủ, nhiệt độ và các yếu tố sinh thái đất như độ ẩm, cấu trúc đất, độ thoáng khí, độ kiềm

Có thể phân biệt 2 nhóm sinh thái liên quan đến nhiệt độ là nhóm ưa nóng (các loài điển

hình như M incognita, M javanica, M exigua) và nhóm ưa lạnh (các loài điển hình như M hapla, M chitwooodi và có th ể cả M naasi) liên quan đến pha chuyển hóa lipid của tuyến

trùng xảy ra ở 10 °C Tác hại do tuyến trùng gây ra đối với cây trồng thường có liên quan đến loại đất kiềm, là môi trường tạo ra các sốc bất lợi (stress) cho thực vật

1.2.2 Các loài quan trọng

M incognita: là loài phổ biến nhất, ký sinh gây hại trên nhiều cây trồng khác nhau và phân

bố trên một vùng địa lý rộng từ 40 vĩ độ bắc đến 33 vĩ độ nam trên phạm vi toàn thế giới Đây cũng là loài ký sinh gây hại phổ biến nhất trên cây trồng Việt Nam, trong đó chúng ký sinh gây hại phổ biến nhất ở: tiêu, cà phê, cà chua, bí đỏ, đu đủ, các cây họ Cà, họ Đậu, chuối

M javanica: là loài phổ biến thứ 2 sau loài trên và có dải phân bố tương tự Đây là loài có

khả năng chịu đựng qua mùa khô hạn trong thời gian 3-6 tháng Ở Việt Nam, loài này ký

sinh tương đối phổ biến sau loài M incognita, gây hại chính cho các cây đậu phộng, chuối

M arenaria: là loài ph ổ biến thứ 3 sau, phân bố khắp thế giới như các loài M incognita và

M javanica Đây cũng là loài ký sinh gây hại tương đối phổ biến ở Việt Nam trên các cây

họ đậu

M graminicola: ký sinh gây hại chính cho lúa cạn ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Đông Nam Á, Nam Phi, Mỹ) Ở ta loài này ký sinh tương đối phổ biến trên lúa cạn (giai đoạn lúa non, khi chưa ngập nước) ở đồng bằng sông Cửu Long [18]

1.2.3 Cơ sở phòng trừ tuyến trùng

Mục tiêu phòng trừ là: giảm mật độ quần thể tuyến trùng ban đầu và giảm số cây

Nội dung phòng trừ tuyến trùng bao gồm: i) Giết tuyến trùng bằng làm mất nguồn dinh dưỡng để tuyến trùng chết đói; ii) Giết trực tiếp tuyến trùng bằng hóa chất hoặc bất kỳ

một kỹ thuật khác được áp dụng trước khi gieo trồng; iii) Sử dụng các hóa chất một cách

hợp lý để chống lại tuyến trùng trên đồng ruộng có cây trồng [18]

a Ngăn ngừa

Ngăn ngừa hoặc phòng ngừa là giải pháp đầu tiên quan trọng nhất trong quản lý tuyến trùng, vì nó là biện pháp đơn giản để giải quyết tuyến trùng trước khi chúng trở thành

vật hại được xác định trên đồng ruộng

Ngăn ngừa sự phát tán của tuyến trùng có thể cần được xem xét ở các mức độ khác nhau: trang trại (như một đơn vị sản xuất), quốc gia và quốc tế Ở quy mô quốc tế, các vấn

đề kiểm dịch thực vật quan trọng được quản lý bằng các công ước kiểm dịch thực vật [18]

b Luân canh

Luân canh được coi là biện pháp quản lý tuyến trùng đơn giản Tuyến trùng thực vật

là những ký sinh bắt buộc, chúng cần một vật chủ cho sự phát triển và nhân nuôi số lượng

Mỗi loài tuyến trùng thực vật có một phổ vật chủ, phổ này dù có thể là rộng nhất nhưng không bao gồm tất cả các loài cây trồng Mật độ tuyến trùng tăng ở các cây chủ thích hợp và suy giảm ở cây chủ không thích hợp Trong luân canh cây trồng để quản lý các cây trồng

mẫn cảm với một loài tuyến trùng đã được trồng luân canh với các cây kháng hoặc miễn nhiễm tuyến trùng Thường các cây trồng kinh tế là các cây mẫn cảm với tuyến trùng và các cây trồng luân canh là các cây kém kinh tế hơn Sự luân canh cần phải trồng như thế nào để

mật độ quần thể tuyến trùng ở mức thấp nhất khi trồng cây trồng chính Các cây luân canh

là cây miễn nhiễm hoặc có khả năng chống chịu cao với một hoặc một vài loại tuyến trùng nào đó Khả năng miễn nhiễm của chúng có thể là miễn nhiễm tự nhiên [18]

c Bi ện pháp canh tác

Tùy từng loại tuyến trùng ký sinh và loại cây trồng mà có thể lựa chọn, điều chỉnh

một số biện pháp canh tác như: gieo trồng sớm, làm khô ruộng, làm ngập nước, bón chất

hữu cơ cũng có thể giảm mật độ tuyến trùng và tránh một số tác hại gây ra do tuyến trùng

Làm ngập nước: nồng độ O2 giảm, CO2 tăng do sự giảm vi khuẩn hiếu khí, đồng thời trong đất ngập nước cũng xảy ra các phản ứng như: phản ứng nitrat, tích luỹ chất amoni,

giảm sắt, mangan và sunfat, tăng các loại acid hữu cơ, methane hydrosulfite

Bón phân hữu cơ: sự phân huỷ chất hữu cơ sẽ giải phóng các hợp chất gây độc cho tuyến trùng ký sinh Đặc biệt, sự phân giải các chất phế thải thực vật sẽ giải phóng các acid

hữu cơ như: acid acetic, propionic, butyric Nồng độ các chất này có thể lưu giữ một vài

tuần trong đất và có thể giết chết một vài loại tuyến trùng ký sinh, nhưng không độc đến các nhóm tuyến trùng sống tự do trong đất Phân từ động vật nuôi, bùn cống rãnh, chất thải thành phố, rơm rạ và các phế thải sau khi thu hoạch đều có thể sử dụng làm chất bổ sung vào đất để tăng hàm lượng chất hữu cơ

Ở Nigieria, bón vỏ khô của quả ca cao và vỏ gọt sắn cho phòng trừ tuyến trùng gây bướu rễ mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn so với sử dụng thuốc hoá học hoặc bón 3 loại phân hoá học NPK ở liều lượng cao Ở xí nghiệp Liên hiệp hồ tiêu Tân Lâm Quảng Trị, bón

20 kg phân chuồng ủ hoai mục/ gốc tiêu làm giảm 45-60% tuyến trùng bướu rễ

Meloidogyne incognita so với đối chứng [5]

Một số cây trồng và cây hoang dại cũng đã và đang được dùng làm thuốc thảo mộc phòng trừ tuyến trùng như cây xoan Ấn Độ, hạt cây củ đậu, rễ cây ruốc cá, hạt và lá cây sầu đâu rừng ở Việt Nam do chúng chứa các hợp chất như phenolic, glucid hoặc các alkaloid…

có tác dụng gây độc tuyến trùng và một số sâu hại khác.Ở Tân Lâm Quảng Trị với liều dùng 40-60g HBJ hoặc LBJ ( chế phẩm dạng bột chế biến từ quả hoặc lá sầu đâu rừng)/m2 diệt 75-98% tuyến trùng ký sinh (Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh, 1993; Nguyễn Thị

Yến , 1997) [5]

d Các bi ện pháp vật lý

Lợi ích lớn của biện pháp vật lý phòng trừ tuyến trùng là không để lại dư lượng, độc

tố như thuốc hóa học Bản chất của các biện pháp vật lý là phòng trừ tuyến trùng bằng xử lý nhiệt Tuyến trùng nhìn chung rất mẫn cảm với nhiệt Hầu hết tuyến trùng chết ở nhiệt độ cao trên 60 °C Phương pháp vật lý được áp dụng rộng rãi bằng nhiều biện pháp khác nhau như: xử lý khói, dùng hơi nước nóng xử lý đất, phơi nắng, khử trùng bằng nhiệt điện, bằng

nhiệt vi sóng, đốt đồng sau khi thu hoạch, khử trùng nguyên liệu gieo trồng bằng nhiệt, chiếu xạ [18]

e Ch ọn giống kháng và giống chống chịu bệnh

- Trồng các cây chống chịu tuyến trùng ký sinh có thể đáp ứng cho một phương pháp lý tưởng là duy trì mật độ quần thể tuyến trùng dưới ngưỡng gây hại Các cây trồng kháng tuyến trùng có một số ưu điểm vượt trội hơn các phương pháp khác cho mục tiêu quản lý tuyến trùng hại: (a) có thể hoàn toàn ngăn ngừa sự sinh sản của tuyến trùng, không giống

một vài phương pháp khác như phòng trừ hóa học; (b) sự áp dụng chúng cần ít hoặc không

cần công nghệ và hiệu quả kinh tế; (c) cho phép luân canh trong thời gian ngắn; (d) không

để lại dư lượng độc

- Ngoài tính kháng (resistance) với tuyến trùng ký sinh, cây kháng cũng cần phải chống

chịu (tolerance); những cây không chống chịu sẽ phải chịu thiệt hại nặng nề nếu trồng trên đất nhiễm tuyến trùng nặng Các cây chống chịu mà không kháng có xu hướng tăng mật độ

quần thể tuyến trùng đến số lượng tuyến trùng cao có thể dẫn đến gây hại [18]

f Bi ện pháp hóa học

Từ những năm 1950 trở lại đây các loại thuốc hóa học khác nhau đã được sử dụng

rộng rãi để phòng trừ tuyến trùng ký sinh thực vật Tuy nhiên, ngoài những mặt có lợi không thể chối cãi trong việc phòng trừ sâu bệnh hại tăng sản lượng cây trồng, việc sử dụng không hợp lý các chất hóa học cũng gây những hậu quả xấu đối với môi trường và sức khỏe

cộng đồng Đặc biệt, thuốc hóa học cũng làm cho nhiều loại tuyến trùng trở nên kháng thuốc Mặc dù hiện nay đã sản xuất được nhiều loại thuốc có hiệu quả tốt hơn, chuyên hóa hơn đối với việc phòng trừ tuyến trùng và cũng ít độc hại hơn đối với môi trường Tuy nhiên cũng chỉ nên dùng thuốc hóa học trong những trường hợp cần thiết được khuyến cáo dưới đây và đặc biệt phải sử dụng chúng một cách hợp lý [18]

g Bi ện pháp sinh học

Tuyến trùng ký sinh thực vật cũng bị tấn công bằng nhiều thiên địch tồn tại trong đất như virus, vi khuẩn, nấm, Ricketuyến trùngsia, đơn bào, Tardigrade, Tuberlaria, Enchytraeid, ve bét, côn trùng và tuyến trùng ăn thịt Vì vậy, nghiên cứu sử dụng thiên địch

của tuyến trùng có tầm quan trọng rất lớn trong việc làm giảm mật độ quần thể để hạn chế tác hại do tuyến trùng ký sinh gây ra cho cây trồng

Có 2 dạng phòng trừ sinh học (PTSH): PTSH nhân tạo bằng cách nhân nuôi các tác nhân sinh học để đưa ra đồng ruộng và PTSH tự nhiên bằng cách duy trì nguồn thiên địch

sẵn có trong tự nhiên để hạn chế mật độ tuyến trùng Hiện tại, biện pháp phòng trừ sinh học chưa thay thế thuốc hóa học do tác động chậm, giá thành các chế phẩm sinh học còn cao và không đáp ứng đầy đủ nhu cầu sản xuất Tuy nhiên, PTSH rất phù hợp trong hệ thống quản

lý tổng hợp tuyến trùng

Các tác nhân sinh học sử dụng trong phòng trừ sinh học

Hiện nay, kiểm soát sinh học đựơc xem như là một phưong pháp thích hợp nhất cho

việc kiểm soát tuyến trùng rễ Một số tác nhân kiểm soát sinh học tối ưu như nấm bông trong đất đựơc cho là hứa hẹn

Vi khuẩn Pasteuria penetrans: là loại vi khuẩn ký sinh bắt buộc ở một số tuyến trùng ký

sinh thực vật như các loại ấu trùng của Melodogyne spp., Pratylenchus spp Tuyến trùng dễ

dàng bị nhiễm với vi khuẩn này ở trong đất khi chúng tiếp xúc với nội bào tử Vi khuẩn

Pasteuria penetrans rất độc và có thể giảm mật độ quần thể tuyến trùng Melodogyne trong

chậu đến 99 % trong vòng 3 tuần Vi khuẩn Pasteuria penetrans có thể tồn tại một số năm

trong đất được làm khô bằng khí mà không hề suy giảm khả năng sống và bị ảnh hưởng rất

ít bởi các điều kiện đất hoặc thuốc phòng trừ tuyến trùng

Vi khuẩn Pasteuria penetrans ký sinh bắt buộc với một số nhóm tuyến trùng ký sinh

thực vật Chúng bám dính trên bề mặt vỏ cutin khi tuyến trùng ở trong đất Khi tuyến trùng xâm nhiễm vào cây để dinh dưỡng, bào tử của Pastueria penetrans nảy mầm xâm nhập qua

vỏ cutin giải phóng khuẩn lạc sinh sôi nảy nở khắp cơ thể tuyến trùng Khi bổ sung đất đã nhiễm bào tử Pasteuria penetrans vào đất chứa Pratylenchus scribneri làm giảm 53% tuyến

trùng trong đất và 63% tuyến trùng rễ đậu [18]

Hình 1.7: A Nội bào tử của vi khuẩn Pasteuria penetrans, B và C: Cơ chế tiệu diệt

tuyến trùng của vi khuẩn Pasteuria penetrans [43]

N ấm bẫy tuyến trùng: đây là các loài nấm có khả năng tạo ra những mạng bẫy dạng lưới

dính để bắt giữ và ăn thịt tuyến trùng Hầu hết các loại nấm bẫy được xem như không có

khả năng tạo khuẩn lạc nhanh, khả năng cạnh tranh thấp trong môi trường hoại sinh và không sẵn sàng ổn định khi bổ sung vào trong đất Tuy nhiên, khi bổ sung một nguồn carbohydrate vào đất thay cho tuyến trùng sẽ giúp nấm mọc nhanh hơn Các loài nấm bẫy khác nhau có khả năng bắt tuyến trùng khác nhau, nhưng hấu hết chúng đều ít chuyên hóa đối với đối tượng loài tuyến trùng mồi, và thông thường một khi các bẫy được tạo ra hầu hết các dạng tuyến trùng đều bị bắt bẫy Do hoạt động bẫy hạn chế và ít chuyên hóa trong tự nhiên nên những loại nấm này khó khăn để xác lập vai trò của một tác nhân phòng trừ sinh

học

Hình 1.8: N ấm bẫy tuyến trùng

N ấm nội ký sinh tuyến trùng: đây là các loài nấm có khả năng dính và xâm nhập vào cơ

thể tuyến trùng để ký sinh gây bệnh cho tuyến trùng Một số loài nấm như Nematoctonus spp., Meria coniospora đã được thử nghiệm và cho kết quả nhất định Có thể phân biệt 2 nhóm nấm nội ký sinh là:

• Nấm nội ký sinh cơ thể tuyến trùng sản xuất ra các bào tử nhỏ các bào tử này cũng chứa các năng lượng nhỏ để bắt đầu quá trình khuẩn lạc trong đất Từ đây các bào tử duy trì

sự ưu thế cho đến khi chúng dính bám vào tuyến trùng đi qua Sau đó bào tử nảy mầm

và xâm nhập qua vỏ cutin tạo khuẩn lạc trong cơ thể vật chủ tuyến trùng Loài

Nematoctonus concurrens và N haptocladus thuộc nhóm nấm này nhưng có hiệu lực không lớn đối với tuyến trùng Loài Hirsutella rhossiliensis cũng có liên quan với tuyến trùng Criconemella xenopurpureocillium lilacinumax Tuy nhiên, hiện tại rất ít kết quả

áp dụng thực tế

Hình 1.9: Nấm nội ký sinh tuyến trùng Nematoctonus sp [34]

• Nấm nội ký sinh trứng tuyến trùng có khả năng ký sinh tuyến trùng cái và trứng của một

số tuyến trùng bào nang và tuyến trùng sần rễ trước khi ấu trùng nở ra Tuy nhiên, những

nấm này không có khả năng giết ấu trùng dạng hoạt động trong đất Hầu hết trứng tuyến trùng đều mẫn cảm hơn với sự xâm nhập của nấm trước khi phát triển ấu trùng tuổi 2

Nếu con cái bị nấm ký sinh thì khả năng sinh sản của chúng sẽ bị giảm Vì vậy, những

nấm này rất hiệu quả nếu chúng có khả năng ký sinh con cái và khối trứng sớm sau khi chúng được nở ra trong rễ Các nấm ký sinh trứng là ký sinh tạm thời nan chúng có thể được nhân nuôi in vitro và sự tồn tại của chúng trong đất có thể không phụ thuộc vào sự

hiện diện của truyến trùng [18]

1 3 Các y ếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng của nấm sợi

1.3.1 Các phương pháp nuôi cấy nấm sợi

− Lên men b ề mặt là thực hiện nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt môi trường dịch thể hoặc

môi trường bán rắn

Nuôi cấy bề mặt sử dụng môi trường dịch thể (dùng cho vi sinh vật hiếu khí): môi trường ở đây có thể là những nguồn dinh dưỡng khác nhau như nước đường hoá, nước bã rượu, dịch kiềm sunfit được pha loãng theo những tỷ lệ cần thiết, sau đó bổ sung thêm nguồn nitrogen, nguồn khoáng… khi cho môi trường vào thiết bị lên men phải bảo đảm cột môi trường có chiều cao tử 3-5cm, bề mặt thoáng, rộng

Phương pháp lên men này yêu cầu thiết bị đơn giản, nhưng đòi hỏi diện tích sử dụng lớn, khó tự động hoá quy trình sản xuất

Nuôi cấy bề mặt sử dụng môi trường bán rắn hay lên men bán rắn (có thể sử dụng cho vi sinh vật hiếu khí và kị khí)

Ở phương pháp này nguyên liệu thường dùng là:

• Các loại hạt: thóc, gạo nếp, đậu tương…

• Các loại manh: mảnh sắn, mảnh bắp…

• Các loại phế liệu: bã mía, bã thơm, trấu, cọng rơm, ra…

• Ngoài các nguyên liệu nói trên, để làm môi trường lên men người ta cần trộn các chất dinh dưỡng khác (các hợp chất có N, khoáng hoà tan trong nước) Nguyên liệu sau

xử lý đảm bảo độ ẩm 60-75% sẽ được tãi ra nia, khay có độ dày 2-3cm (đối với vi sinh vật hiếu khí hay ủ đống, ủ kín (dùng cho vi sinh vật kị khí)

Đối với các vi sinh vật hiếu khí cần có hệ thống quạt thổi khí vô trùng

Trong lên men bán rắn, ngoài yêu cầu nguyên liệu môi trường có độ ẩm 60-75%, cần

phải đảm bảo lên men trong điều kiện bầu không khí có độ ẩm 95-100%

− Lên men chìm

• Lên men chìm (dùng cho cả vi sinh vật hiếu khí và kị khí) Khi lên men chìm vi sinh

vật được nuôi cấy ở môi trường dịch thể, chúng phát triển theo chiều đứng của cột môi trường

• Trong quá trình lên men này cần liên tục theo dõi và thực hiện một số công việc sau:

• Thực hiên quá trình khuấy đảo và sục khí: nhằm đảm bảo cung cấp O 2 đầy đủ theo nhu cầu của từng loại vi sinh vật

• Điều chỉnh pH của môi trường lên men: mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một giá trị

pH nhất định của môi trường nuôi cấy

• Tuy nhiên trong quá trình lên men vi sinh vật lại tạo ra một số chất có tính acid hay

kiềm khiến pH của môi trường không còn thích hợp cho hoạt động sống của vi sinh

vật Do đó phải điều chỉnh pH bằng các dung dịch như NaOH, HCl, NH4OH, urê

…hay hay bổ sung dung dịch đệm để ổn định pH của môi trường

• Theo dõi và điều chỉnh nhiệt độ của môi trường lên men: cũng như độ pH của môi trường, nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh

vật và hiệu quả lên men [7]

1.3.2 Môi trường nuôi cấy

Trong quá trinh nuôi cấy nhân giống vi sinh vật môi trường nuôi cấy cần các nguyên

tố đa lượng (C, H, O, N, S, P, Mg) và một lượng nhỏ các nguyên tố vi lượng (Mn, Bo, Co, Cu…)

Trong số các nguyên tố đa lượng thì C và N có ảnh hưởng rất lớn đến sinh khối và số lượng bào tử của nấm sợi [7]

1.3.3 Các hợp chất cung cấp nguồn cacbon

Cacbon tham gia vào hầu hết các cấu trúc của tế bào, từ tế bào chất đến thành tế bào,

từ phân tử enzyme đến acid nucleic Vì vậy hợp chất carbohydrat có ý nghĩa hàng đầu đối

với sự sống của tế bào vi sinh vật

Nguồn carbohydrat vi sinh vật sử dụng được rất phong phú Từ dạng tinh khiết (glucose, saccharose…) đến dạng tạp chất (rĩ đường, dịch kiềm sunfite…) Một số nhóm vi sinh vật sử dụng được cả khí thiên nhiên, hydrocacbon (methane, alkan…)

1.3.4 Các hợp chất cung cấp nguồn nitrogen

Nitrogen tham gia vào các thành phần cấu trúc nên tế bào vi sinh vật, giúp tế bào hoàn thiện được mọi chức năng của hoạt động sống Nguồn nitrogen là nguồn dinh dưỡng quan trọng không kém gì nguồn cacnon

Nitrogen được cung cấp cho tế bào dưới nhiều dạng khác nhau:

Dưới dạng các hợp chất vô cơ và hữu cơ khá thuần khiết như: NH4+,

NO3-, pepton các loại, các amino acid

Trong lên men công nghiệp người ta thường sử dụng nguồn nitrogen dưới dạng sản

phẩm thô gọi là nguồn nitrogen kĩ thuật bao gồm các loại sau: dịch thuỷ phân nấm men, bột đậu nành, cao ngô, khô lạc hay bánh dầu phông, nước mắm, nước tương [7]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 1 V ật liệu

- Côn trùng bị nhiễm nấm trên lá cây chanh, bưởi, sung

- Đất và rễ cây chuối bị bệnh tuyến trùng nốt sưng

2 2 Thi ết bị và dụng cụ

Tủ cấy vô trùng

Nồi hấp vô trùng Cân phân tích Metuyến trùngler AE 260 Kính hiển vi quang học Leca Tủ sấy

Kính lúp soi nổi Nikon SMZ 800 Bếp gas

Lò vi sóng National

D ụng cụ

- Ống nghiệm, bình erlen, lam và lamen, đĩa Petri, đũa thủy tinh, bình đựng mức, cốc đong, que trans

- Que cấy đầu vuông, kim mũi mác

- Pipet, vải muslin 2 lớp, giấy thấm

- Rây lọc có khích thước lỗ khác nhau: 0.5mm, 15 μm

- Que gắp tuyến trùng, các giếng, đĩa đếm tuyến trùng, bình hút ẩm

a Phương pháp thu mẫu

Thu thập những xác côn trùng vào buổi sáng Nếu cơ thể chúng mềm và bẩn, chúng

có thể bị nhiễm vi khuẩn hoặc virus Nếu cơ thể chúng cứng, điều đó chứng tỏ sự nhiễm

nấm

Tiến hành thu mẫu ở 3 khu vực khác nhau trên 3 đối tượng cây trồng là: chanh, bưởi,

ỗi khu vực thu thập 10 mẫu Vì số lượng côn trùng bị bệnh thu được rất ít nên chúng

tôi tiến hành phối trộn chung hết tất cảc các mẫu thu được Sau đó tiến hành các phương pháp phân lập [6]

b Phương pháp phân lập

Tiến hành khử trùng mẫu xác côn trùng bằng HgCl2 0.1% Sau đó rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng nhiều lần

Dùng đũa thuỷ tinh vô trùng nghiền mẫu với 10ml nước cất vô trùng

Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1

, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 Dùng pipet vô trùng hút 0.1 ml dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-6 và tiến hành trãi đĩa trên môi trường PGA [6]

c Phương pháp làm thuần (Phương pháp cấy đỉnh sinh trưởng nấm)

Cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm là quá trình cấy truyền đỉnh sinh trưởng của một sợi

nấm để tạo một mẫu nấm thuần

- Đổ môi trường PGA vào đĩa Petri để nghiêng sao cho phần thạch ở một phía của đĩa nông

- Cấy truyền một miếng nhỏ nấm từ đĩa phân lập vào một bên đĩa nơi thạch sâu hơn

- Đặt đĩa dưới kính lúp soi nổi và điều chỉnh tiêu điểm sợi nấm ở rìa tản nấm (Các sợi nấm

sẽ mọc rất thưa ở phần nông của thạch)

- Điều chỉnh nguồn sáng (gương) nhằm đạt độ tương phản tốt giữa môi trường và sợi nấm

- Dùng que cấy dẹp đã khử trùng cấy một miếng thạch nhỏ chứa đỉnh sinh trưởng của một

sợi nấm sang một đĩa môi trường thích hợp

2.5.2 Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng

− Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường PGA tiến hành hấp khử trùng Sau khi hấp

xong để nghiêng một góc 45 ° C các ống thạch này trên giá gỗ

− Tiến hành cấy truyền giữ giống nấm trên bề mặt thạch nghiêng Sau đó bảo quản các

ống giống này trong điều kiện lạnh (3-5 ° C)

− Thời gian cấy truyền lại đối với nấm mốc là 3-6 tháng [8]

2.5.3 Phương pháp quan sát hình thái và định danh nấm sợi

a Quan s át đại thể

Cấy nấm sợi vào ống thạch nghiêng, sau 3 ngày cho 5ml nước cất vô trùng vào ống Dùng que cấy vô trùng gạt đều bào tử nấm sợi trong ống giống, sau đó lăn nhẹ ngón tay để

tạo thành dịch huyền phù Dùng que cấy vô trùng nhúng nhẹ vào dịch huyền phù rồi cấy nhẹ

1 điểm vào đĩa Petri có chứa môi trường PGA Quan sát từng ngày khuẩn lạc về các đặc điểm sau:

- Tốc độ phát triển của khuẩn lạc

- Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của khuẩn lạc

- Hình dạng khuẩn lạc, mép khuẩn lạc và sợi nấm

- Giọt tiết

- Sắc tố tiết vào môi trường

b Quan sát vi th ể (tiêu bản phòng ẩm)

− Chuẩn bị các đĩa Petri vô trùng chứa lam, lamen và một miếng giấy lọc

− Chuẩn bị một đĩa Petri môi trường PGA với độ dày môi trường thật mỏng

− Dùng kim mũi mác vô trùng cắt lấy một miếng thạch từ đĩa Petri môi trường PGA (kích thước miếng thạch 1x1cm) dặt lên lam chứa trong đĩa Petri vô trùng được chuẩn bị ở trên

− Dùng que cấy đầu vuông lấy một ít bào tử nấm Purpureocillium lilacinum từ các

ống giống chấm vào 2 điểm đối diện của miếng thạch PGA trên lam Sau đó đậy lamen lên và dùng nước cất vô trùng làm ướt miếng giấy lọc trong đĩa Petri

− Sau 3 ngày nuôi cấy lấy tiêu bản phòng ẩm ra và nhuộm bằng xanh metylen loffer Quan sát tiêu bản phòng ẩm dưới kính hiển vi về các đặc điểm: cấu trúc hệ sợi nấm (có hay không có vách ngăn), cấu trúc cuống sinh bào tử, thể bình, hình dạng và cách

sắp xếp bào tử [3]

2.5.4 Phương pháp định danh nấm sợi bằng sinh học phân tử

− Thu nhận DNA

• Phá màng tế bào và màng nhân bằng proteinase đặc hiệu để giải phóng DNA, đồng

thời phân huỷ các protein liên kết với DNA

• Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và chloroform (hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có

chứa DNA

• Làm kết tủa các acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu các acid nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản

− Chạy PCR

• Biến tính: trong một hỗn hợp đầy đủ các thành phần cho sự sao chép, DNA được

biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử (khoảng 94°-95° C), trong 30 giây-1 phút

• Lai: nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn Nhiệt độ này dao động khoảng từ 40°-70° C và kéo dài trong vòng 30 giây- 1 phút

• Tổng hợp: nhiệt độ tăng lên đến 72° C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây- vài phút

− Giải trình tự DNA [3]

2.5.5 Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng

Rây lọc được xếp một lớp giấy lên trên và đặt vào đĩa Petri, sau đó lấy rễ cho vào rây

lọc, điều chỉnh lượng nước vừa ngập rễ trên rây, đậy nắp và đặt yên tĩnh trong 48h ở nhiệt

độ phòng Tuyến trùng sống chui qua rây lọc, lắng đọng xuống đáy đĩa Petri

Nhấc rây ra khỏi đĩa Petri thu lại dịch nước chứa tuyến trùng trong đĩa Petri [2]

2.5.6 Phương pháp đếm tuyến trùng

Tuyến trùng được đếm bằng đĩa đếm tuyến trùng dưới kính hiển vi soi nổi

Nếu mẫu có ít tuyến trùng:

• Đổ dung dịch tuyến trùng vào đĩa đếm sau đó lắc nhẹ cho dung dịch tuyến trùng dàn đều

• Đếm toàn bộ tuyến trùng theo các dãy ô cho toàn bộ đĩa hay đếm đại diện một

số ô hoặc dãy, sau đó tính trung bình một ô và nhân với tổng số ô trong đĩa

Nếu mẫu quá nhiều tuyến trùng có thể pha loãng dung dịch tuyến trùng thành 30ml, sau đó lấy 1ml để đếm, lặp lại 5 lần như vây, tính trung bình số lượng tuyến trùng trên 1ml

rồi nhân với 30 [2]

2.5.7 P hương pháp định danh tuyến trùng bằng hình thái

a Phương pháp xử lý, làm tiêu bản tuyến trùng theo De Grisse (1969)

− Ngày thứ nhất: nhặt tuyến trùng chuyển vào giếng có chứa 0.5ml dung dịch I (99ml Formalin 40% + 1 ml glycerine) Với mỗi mẫu nhặt khoảng 200 con để định loại, với

mẫu có ít tiến hành định loại toàn bộ mẫu Đặt giếng có tuyến trùng (có đậy lam kính) vào bình hút ẩm chứa 1/10 thể tích ethanol 96 % Để bình hút ẩm trong tủ ấm ở nhiệt độ

40 °C ít nhất 12 giờ

− Ngày thứ 2: lấy giếng ra khỏi bình hút ẩm, nhỏ vài giọt dung dịch II ( 95ml ethanol 96% + 5 ml glycerine) vào giếng, đậy lam kính lên giếng để ethanol bay hơi chậm và đặt trong tủ ấm Cứ sau 2 giờ thì nhỏ 2 giọt dung dịch II, thực hiện 4 lần Quá trình này

nhằm làm mất nước tuyến trùng Để giếng trongâm1 qua đêm, bổ sung vài giọt dung

dịch III (50ml ethanol 96%+ 50ml glycerine) giúp làm mất nước và làm trong tuyến trùng

− Ngày thứ 3: tuyến trùng đã được sử lý làm mất nước, làm trong nằm trong dung dịch glycerine tinh khiết được sử dụng để lên tiêu bản định loại [1]

b Phương pháp lên tiêu bản tuyến trùng theo Maeseneer (1963)

− Hơ nóng ống đồng và cắm vào đĩa paraffin Sau đó chấm ống đồng lên lam để tạo thành vòng paraffin

− Nhỏ một giọt glycerine thuần khiết vào giữa vòng paraffin Dùng que gắp tuyến trùng đã được xử lý trong các giếng vào giọt glycerine (khỏang 5-10 tuyến trùng, chú ý các con tuyến trùng phải xếp cùng chiều và không chồng lên nhau)

− Đặt khoảng 3 viên paraffin xung quanh vòng paraffin sau đó đậy lamen lên Đặt lam và lamen có tuyến trùng lên thanh sắt nóng cho paraffin chảy ra [1]

c Phương pháp định danh tuyến trùng

− Quan sát dưới kính hiển vi quan học lần lượt ở các vật kính 10X, 20X, 40X, 100X Phác

hoạ sơ bộ hình thái tuyến trùng như: kích thước, có kim hút hay không có kim hút, hình

dạng vùng môi, cơ quan sinh dục…

− Dựa vào đặc điểm hình thái đặc trưng cho từng nhóm tuyến trùng như: lớp cutin, amphid, vùng môi, buồng trứng, kim hút để định loại sử dụng khoá phân loại theo tài

liệu của Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh (2000) [1]

2.5.8 Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng bởi nấm Purpureocillium lilacinum trong điêù kiện in vitro

a Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát sự nở của trứng tuyến trùng

Meloidogyne sp b ởi nấm Purpureocillium lilacinum

Cách tiến hành:

− Chuẩn bị huyền phù trứng tuyến trùng:

• Dùng kim mũi mác tách lấy khối trứng tuyến trùng cho vào ống nghiệm chứa nước cất Cho thêm 4-5 ml NaClO 1,05% vào lắc trong vòng 5 phút Sau đó để yên cho các mãnh vở lắng xuống trong 30 giây

• Dùng pipet hút phần trong ở phía trên của ống nghiệm chuyển lên ray lọc kích thước 15 μm Sau đó dùng nước cất vô trùng rửa sạch NaClO

• Chuyển ray lọc chứa trứng tuyến trùng vào đĩa Petri chứa dung dịch ampicilline 0.1% để khử trùng trong 10 phút Sau đó dùng nước cất vô trùng rửa lại [14]

Bố trí thí nghiệm: lô thí nghiệm: 1ml huyền phù bào tử nấm Purpureocillium lilacinum

(105 bào tử/ml) + 0.5ml huyền phù trứng tuyến trùng (khoảng 100 trứng/ 0.5ml) cho vào ống nghiệm

− Lô đối chứng: 1ml nước cất vô trùng + 0.5ml huyền phù trứng tuyến trùng (khoảng

100 trứng/ 0.5ml) Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 1 tuần

− Thu kết quả: quan sát và đếm số lượng trứng không nở, IJ2 chết, IJ2 sống trong các đĩa đếm tuyến trùng dưới kính lúp sôi nổi Đối với trứng tuyến trùng bị ký sinh bởi

nấm Purpureocillium lilacinum dùng kim tiêm 500cc thu ngẫu nhiên 100 trứng tuyến trùng chuyển lên lam nhuộm bằng xanhmethylen loffer và quan sát bằng kính hiển vi [10], [14]

− Cách đánh giá kết quả:

T ỉ lệ trứng không nở= số trứng không nở/ (trứng + IJ2)X 100

T ỉ lệ IJ2 chết= IJ2 chết/ tổng IJ2x100

b Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng cái Meloidogyne sp

bởi nấm Purpureocillium lilacinum trong điều kiện in vitro

− Tiến hành nuôi cấy huyền phù bào tử nấm Purpureocillium lilacinum (105

bào tử/ml) trên các đĩa Petri môi trường PGA

− Sau 5 ngày nuôi cấy nấm Purpureocillium lilacinum trên môi trường PGA tiến hành

cấy tuyến trùng cái Meloidogyne sp (5 tuyến trùng cái/ 1 đĩa PGA) vào mép khuẩn

lạc nấm Purpureocillium lilacinum Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 4 ngày

− Sau mỗi ngày thu kết quả thí nghiệm bằng cách dùng nước cất vô trùng cho vào các đĩa Petri rồi dùng kim mũi mác thu tuyến trùng cái Quan sát sự lây nhiễm nấm

Purpureocillium lilacinum trên tuyến trùng cái bằng cách làm tiêu bản nhuộm với xanh metylen loffer và soi dưới kính hiển vi [10]

2.5.9 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sinh khối

và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum

a Nghiên c ứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh khối và số lượng bào tử

Tiến hành nuôi cấy nấm Purpureocillium lilacinum trong các bình tam giác 250ml

chứa môi trường Czapek-Dox Broth (100 ml/ bình) với các giá trị pH khác nhau: 6, 6.5, 7, 7.5 Đặt các bình này trong tối, nhiệt độ phòng và tiến hành nuôi cấy tĩnh

Sau 14 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối và bào tử bằng cách cho dịch nuôi cấy

lọc qua giấy lọc kích thước 15-20 μm thu lấy sinh khối trên giấy lọc và dịch lọc chứa bào

tử Việc thu sinh khối và dịch bào tử được tiến hành trong tủ cấy vô trùng [17]

b Nghiên c ứu ảnh hưởng của nguồn Nitơ và Cacbon đến sinh khối và số lượng bào t ử

Tiến hành nuôi cấy nấm trong môi trường Czapek-Dox Broth nhưng thay thế nguồn nitơ cao nấm men bằng nguồn nitơ khác nhau như: (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3 Đặt các bình này trong tối, nhiệt độ phòng và tiến hành nuôi cấy tĩnh

- Sau 14 ngày nuôi cấy trong các bình tam giác tiến hành thu sinh khối và bào tử Cách thu sinh khối và bào tử tiến hành tương tự như ở mục 2.5.9.1

- Tương tự ảnh hưởng của nguồn cacbon cũng tiến hành nuôi cấy trong môi trường Czapek- Dox Broth nhưng thay thế glucose bằng các nguồn cacbon khác nhau như: huyền phù tinh bột, saccharose Sau 14 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối và bào tử

2.5.10 Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov

- Sinh khối nấm sợi được xác định dựa vào trọng lượng khô tuyệt đối

- Lọc dịch lên men qua giấy lọc, rửa sạch sinh khối nấm sợi bằng HCl 1N và nước cất

Sấy khô tờ giấy lọc có sinh khối nấm sợi ở 80- 105 °C đến trọng lượng không đổi Sinh khối đựơc tính theo sự chênh lệch trọng lượng tờ giấy lọc có sinh khối và tờ giấy lọc khô đã cân trước đó [3]

2.5.11 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật

Nguyên tắc:

- Cấy một thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng trong đĩa Petri

- Xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc lên sau thời gian nuôi cấy vì

mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển của một tế bào

- Dùng pipet đã vô trùng lấy 0.1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch

- Dùng que gạt dàn thật đều trên khắp mặt thạch để tách riêng rẽ từng tế bào

- Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ liên tiếp Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa Petri và lấy kết quả trung bình

- Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm có nhiệt độ và thời gian thích hợp [8]

- Cách đếm

S ố tế bào/g mẫu = M.a.10 n

.N

M: số khuẩn lạc trung bình trong một đĩa

A: số giọt trong 1ml dịch mãu

n: hệ số pha loãng

2.5.11 Các p hương pháp khác

Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm Stargraphic plus 5 [5]

Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm Excel [4]

C HƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Phân l ập và định danh chủng nấm có khả năng diệt tuyến trùng

3.1.1 P hân lập

Chúng tôi tiến hành phân lập chủng nấm từ các mẫu xác côn trùng bị nhiễm nấm theo

mục 2.5.1 Tiến hành định danh sơ bộ bằng các phương pháp ở mục 2.5.3 và căn cứ vào đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc chúng tôi phân lập được 1 chủng nấm

Hình 3.1: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum

3.1.2 Định danh

Sau khi phân lập và làm thuần, tiến hành định danh sơ bộ nấm bằng cách nuôi chủng

nấm này trên môi trường PGA ở nhiệt độ phòng trong vòng 7 ngày Tiến hành quan sát hình

dạng, màu sắc của khuẩn lạc Làm tiêu bản phòng ẩm quan sát cấu trúc hệ sợi (sự phân nhánh, vách ngăn của sợi nấm), màu sắc sợi nấm, hình dạng và cấu trúc cơ quan sinh sản (cuống sinh bào tử, thể bình, bào tử)

Kết quả định danh sơ bộ

Q uan sát đại thể

Hình 3.2: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum ( PGA, 7 ngày, 28 °C)

Quan sát vi th ể