Nghiên cứu nhân giống cây đinh lăng lá nhỏ polycias fruticosa l harm bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Kết quả ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ sau 45 ngày.. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát tr

- -

NGUYỄN VĂN THANH

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ

(Polycias fruticosa L Harm.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

- -

NGUYỄN VĂN THANH

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ

(Polycias fruticosa L Harms.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Qua 5 tháng thực tập tại viện nghiên cứu và phát triển lâm nghiệp phía bắc đến nay em đã hoàn thành đề tài Để đạt kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu nhà trường, ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy cô giáo bộ môn công nghệ sinh học, cùng các anh chị phòng công nghệ sinh học trong viện nghiên cứu và phát triển lâm nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin bày tỏ long biết ơn sâu sắc tới Cô giáo Ths Nguyễn Thị Tình

và chị Phạm Thị Thảo đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu Do thời gian thực tập đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn !

Thái nguyên, ngày tháng năm 2016

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Văn Thanh

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng HgCl2 0.1% đến kết quả

khử trùng 27Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái

sinh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ sau 45 ngày 29Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ kinetine và BA đến khả năng

nhân nhanh chồi cây Đinh lănglá nhỏ sau 1 tháng 31Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng loại cytokine thích hợp

nhất kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng sau 3 tuần tiến hành thí nghiệm 34Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng Auxin (NAA, IBA) đến

khả năng ra rễ của chồi cây Đinh lăng lá nhỏ trong 30 ngày 36Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng một số loại giá thể đến khả

năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm sau 2 tuần 38

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Cây Đinh lăng lá nhỏ 2 Hình 2.1: Vườn đinh lăng trồng ở hộ gia đình 12 Hình 4.1: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng

HgCl2 0.1%đến hiệu quả khử trùng mẫu 28 Hình 4.2: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của một số môi trường đến khả

năng tái sinh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ 30 Hình 4.3: Thể hiện ảnh hưởng của nồng độ kinetine và BA đến khả năng

nhân nhanh chồi cây Đinh lănglá nhỏ sau 1 tháng 32 Hình 4.4: Thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng loại cytokine thích hợp

nhất kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ sau 1 3 tuần thí nghiệm 34 Hình 4.5: Thể hiên ảnh hưởng của hàm lượng Auxin (NAA, IBA) đến

khả năng ra rễ của chồi cây Đinh lăng lá nhỏ trong 30 ngày 36 Hình 4.6: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của một số loại giá thể đến khả

năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm i

MS : Murashige & Skoog

TB : Trung bình

MỤC LỤC

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 3

1.3 Yêu cầu của đề tài 3

1.4 Ý nghĩa của đề tài 3

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Sơ lược về cây Đinh lăng 4

2.1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại 4

2.1.2 Đặc điểm sinh thái 4

2.1.3 Đặc điểm hình thái 5

2.1.4 Cách trồng 6

2.1.5 Thu hái và chế biến 7

2.1.6 Thành phần hóa học 8

2.1.7 Tác dụng dược lý 9

2.2 Tình hình sử dụng Đinh lăng ở Việt Nam và trên thế giới 11

2.2.1 Trên thế giới 11

2.2.2 Ở Việt Nam 11

2.3 Cơ sở khoa học 13

2.3.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào 13

2.3.2 Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo giống sạch bệnh và nhân nhanh giống 14

2.3.3 Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng tới quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 14

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 18

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 18

3.3 Hóa chất và thiết bị sử dụng 18

3.3.1 Hóa chất 18

3.3.2 Thiết bị sử dụng 18

3.4 Nội dung nghiên cứu 19

3.5 Phương pháp nghiên cứu 19

3.5.1 Điều kiện bố trí thí nghiệm 19

3.5.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 19

3.5.3 Nội dung 1: 20

3.5.4 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2 21

3.5.5 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3 22

3.5.6 Phương pháp nghiên cứu nội dung 4 24

3.5.7 Phương pháp xử lý số liệu 26

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng HgCl2 0.1% đến đến kết quả khử trùng mẫu Đinh lăng 27

4.2 Kết quả ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi cây Đinh lăng 29

4.3 Kết quả ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng tới khả năng nhân nhanh của chồi cây Đinh lăng 31

4.3.1 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ loại cytokine đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng 31

4.3.2 Kết quả ảnh hưởng hàm lượng NAA thích hợp nhất đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng 34

4.4 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng Auxin và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của chồi cây Đinh lăng 36

4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm 37

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

I Tài liệu tiếng Việt 42

II Tài liệu nước ngoài 44

PHẦN 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nguồn tài nguyên cây thuốc của Việt Nam rất phong phú, đa dạng và

có nhiều cây thuốc quý Trong số đó có cây Đinh lăng

Đinh lăng (Polycias fruticosa L Harms.) là một loại cây dược liệu có giá trị

cao trong ngành y học cổ truyền ở Việt Nam và một số nước trên thế giới Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh tác dụng dược lý của Đinh lăng tương tự như nhân sâm và ít độc hơn nhân sâm Vỏ, rễ và lá Đinh lăng chứa saponin, alkaloit, các vitamin B1, B2, B6, C, 20 axit amin, glycosit, phytosterol, tanin, axit hữu cơ, tinh dầu, nhiều nguyên tố vi lượng: K, Mn, Ca,

Mg, Fe, Lo, Zw và 21,10 % đường Hai hợp chất chính và quan trọng nhất trong cây Đinh lăng là polyacetylen và saponin tripterpen Trong đó, hợp chất polyetylen tách chiết được có tính kháng khuẩn rất mạnh và kháng một số dạng ung thư, còn hợp chất saponin tripterpen có tác dụng chống stress, chống trầm cảm, chống oxi hóa rất tốt [13], [14], [20]

Dựa trên những nghiên cứu về dược tính của cây Đinh lăng, một số chế phẩm từ Đinh lăng hiện nay đang được sử dụng như cao đặc Đinh lăng, tinh sâm PANA, rượu thuốc ngọt, viên ngậm DINLAN Điều này cho thấy nhu cầu

về nguồn nguyên liệu Đinh lăng để làm thuốc chữa bệnh ngày càng tăng Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu khai thác trong tự nhiên thường phân tán, cho chất

lượng không đồng đều và số lượng hạn chế Vì vậy, nhân giống in vitro là

phương pháp ưu việt nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu ổn định, cây giống đồng đều, sạch bệnh, làm tăng hoạt chất sinh học so với nguyên liệu ban đầu Cây đinh lăng mang giá trị dược liệu rất cao nhưng các chế phẩm chứa Đinh lăng còn khá ít trên thị trường, nguyên nhân là do nguồn nguyên liệu còn hạn chế, nếu trồng theo phương pháp tự nhiên thì cần phải 3 - 5 năm mới thu hoạch được rễ

Để thúc đẩy việc sử dụng Đinh lăng trong sản xuất dược phẩm cần đảm bảo vấn đề nguyên liệu, hiện nay các mô hình trồng cây đinh lăng với quy mô lớn đủ để làm vùng nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược liệu là chưa

có, vì việc nhân giống bằng phương pháp giâm hom truyền thống tuy đơn giản giá thành rẻ nhưng để có được một số lượng cây giống lớn thì phải mất rất nhiều vụ gây nuôi mất thời gian và cây con không đồng đều Mặt khác trồng theo phương pháp truyền thống phải mất thời gian dài mới được thu hoạch Vì vậy, để giải quyết những vấn đề trên thì tạo cây giống thông qua con đường nuôi cấy mô là một giải pháp hữu hiệu Với mục tiêu tạo ra giống cây Đinh lăng có thời gian sinh trưởng nhanh và đảm bảo chất lượng cũng như số lượng phục vụ cho sản xuất trên quy mô lớn, chúng tôi tiến

hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu nhân giống cây Đinh lăng

lá nhỏ (Polyciasfruticosa L Harm.) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật”

Hình 1.1: Cây Đinh lăng

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xác định được công thức môi trường phù hợp để nhân nhanh giống cây

Đinh lăng lá nhỏ (poliscias fruticosa L Harms.) bằng phýõng pháp nuôi cấy

- Xác định được loại giá thể phù hợp đến khả năng sinh trưởng và phát

triển của cây con invitro trong vườn ươm

1.4 Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa khoa học

Sau khi đề tài hoàn thành đã bổ xung vào kiến thức lý thuyết đã được học thông qua hoạt động nghiên cứu thực tiễn, giúp cho bản thân có thêm kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế, đồng thời tiếp cận với công tác nghiên cứu khoa học để phục vụ cho công việc nghiên cứu và các công tác khác

- Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu thành công sẽ tạo ra được một lượng lớn cây Đinh lăng giống sạch bệnh có chất lượng tốt, cung cấp đủ lượng giống cần thiết phục vụ cho sản xuất đại trà Nghiên cứu còn tạo ra những cơ sở khoa học cho việc nhân nhanh nhiều loài cây trồng có giá trị kinh tế khác nhau

PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về cây Đinh lăng

2.1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại

Đinh lăng có nguồn gốc ở vùng đảo Polynésie thuộc cộng hòa Pháp

nằm ở phía nam Thái Bình Dương Tên khoa học của Đinh lăng là Polyscias fruticosa L.Harms., được L.Harms mô tả và định tên vào năm 1894 Ngoài ra,

Đinh lăng còn có tên gọi khác là cây gỏi cá hay cây Nam dương lâm

2.1.2 Đặc điểm sinh thái

Đinh lăng là loại cây chịu hạn, không ưa nước, phát triển tốt ở vùng đất, tơi xốp có độ ẩm trung bình [12] Cây cũng có thể chịu bóng râm, trồng được trên nhiều loại đất, thậm chí với một lượng đất rất ít trong chậu nhỏ, cây vẫn có thể sống được theo kiểu cây cảnh bonsai [1] Đinh lăng sinh trưởng mạnh vào mùa xuân hè, ra hoa và quả vào tháng 4 đến tháng 7 Cây trồng ở các tỉnh phía bắc có hiện tượng tàn lụi vào mùa đông do khí hậu lạnh, thường

trồng bằng cành sau 2 đến 3 năm thì cây có quả, hạt Đinh lăng có khả năng tái sinh dinh dưỡng mạnh nhưng chưa quan sát được cây con mọc từ hạt Cây thường được trồng bằng cách giâm cành, cây được 4 đến 5 tuổi trở lên sẽ cho nhiều hoạt chất nhất [1], [9], [12]

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Đinh lăng (Polyscias fruticosa L Harm.) thuộc họ Ngũ gia bì

(Araliaceae) nên nó mang một số đặc điểm chung của họ này như: Là cây thân gỗ hay cây bụi, đôi khi là các cây thân thảo sống lâu năm, chúng thường

có lá kép hình lông chim hay hình chân vịt và có các hoa nhỏ mọc thành chùy lớn, rễ cây có dáng như người gồm một rễ cái và nhiều rễ phụ Tuy nhiên, Đinh lăng cũng có một số đặc điểm riêng dùng để phân biệt với các loài khác như sau:

 Thân

Đinh lăng là loại cây gỗ nhỏ, dạng bụi, xanh tốt quanh năm, cây thường cao 1 - 1,5 m (có thể cao đến 2 m hoặc hơn) Vỏ thân màu trắng nhạt, hơi xám, thân nhẵn, không có gai, ít phân nhánh, phân cành thấp, thân mang nhiều vết sẹo lá to hình chữ V, máu xám và những nốt lỗ vỏ, vỏ thân có mùi thơm nhẹ [1], [19], [33]

 Lá

Lá kép ba lần lông chim, mọc so le, dài 20 - 40 cm, không có lá kèm rõ

Lá chét có cuống nhỏ mảnh dài 3 - 15 cm, dạng màng, phiến lá chét có răng cưa không đều, đôi khi chia thùy, gốc và đầu thuôn nhọn, có chóp nhọn, dài 3

- 10 cm, rộng 0,6 - 4 cm Cuống lá dài, phát triển thành bẹ to ở phần cuối Lá

có mùi thơm khi vò nát [2], [19]

 Hoa

Hoa nhỏ thành cờ, tán ngắn dài 7 - 18 cm, cụm hoa mọc ở ngọn thành chùy ngắn mang nhiều tán, mỗi tán có 15 - 20 hoa nhỏ, lá bắc rộng, sớm rụng

Đài hoa hình chén, gồm 5 lá đài Hoa nhỏ, màu lục nhạt hoặc trắng xám, có 5 cánh hình trứng thuôn dài 2 - 3 mm, có 5 nhị, chỉ nhị ngắn và mảnh, dài khoảng 1,5 mm, bao phấn kéo dài, bầu hạ, 2 ô, có rìa trắng nhạt [2], [19], [33]

 Quả

Quả dẹt, hình trứng rộng, màu tráng bạc, dài 4 - 5 mm, rộng 3 mm và dày 1,5 - 2 mm, có vòi tồn tại Hạt hình thận và hình khối 3 cạnh màu trắng, kích thước 3 mm, 2 mm, 1 mm, vỏ hạt lồi lõm Cây ra hoa, quả vào tháng 4 đến tháng 7 [2], [33]

 Rễ

Rễ hình củ cà rốt, cong queo, dài 15 - 30 cm, đường kính 0,5 - 2,5 cm, đầu trên to, phía dưới thuôn nhỏ Mặt ngoài màu trắng xám, có nhiếu nếp nhăn dọc, nhiều lỗ bì nằm ngang, nhiều vết tích của rễ con và các đoạn rễ còn sót lại Thường hợp thành một bó rễ củ, thể chất cứng giòn, dễ bẻ gãy, mặt bẻ lởm chởm, mặt cắt ngang màu vàng, gỗ chiếm 2/3 bán kính, các tia ruột từ giữa tỏa ra, mùi thơm nhẹ, vị hơi ngọt [33]

Trong tự nhiên, dễ có sự nhầm lẫn giữa các cây cùng tên Đinh lăng nhưng không được dùng làm thuốc như:

+ Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana Baill.): Lá thường chỉ có 3 lá

chét trên một cuống dài, lá chét hình tròn, đầu tù

+ Đinh lăng lá to hay Đinh lăng lá ráng (Polyscias ilicifolia (Merr.)

Baill.): Lá kép, có 11 - 13 lá chét, lá chét hình mác có răng cưa to và sâu

+ Đinh lăng trổ hay Đinh lăng viền bạc (Polyscias guilfoylei Baill.): Lá

kép có 7 lá chét, lá chét thường có viền trắng Loại này lại có 2 thứ là:

- Polyscias guilfoylei Baill var laciniata Baill

- Polyscias guilfoylei Baill var victoriae Baill

2.1.4 Cách trồng

Đinh lăng được trồng phân tán khắp nơi để làm cảnh, làm thuốc và làm rau gia vị Từ năm 1961, do sự nghiên cứu của Viện Y học Quân sự về tác

dụng bổ dưỡng của cây, nên Đinh lăng được trồng rộng rãi hơn cả ở các bệnh viện, trạm xá, vườn thuốc [2] Hiện nay, một số nơi đã bắt đầu trồng Đinh lăng ở quy mô sản xuất thử (1000 - 2000 m2

đã chuẩn bị sẵn Ở công ty công viên, người ta thường dâm cành ngay trong bầu để tiện cho việc vận chuyển và ra ngôi [2]

Hàng năm, cần bón thúc cho cây qua đông và phát triển vào mùa xuân

hè, bằng phân chuồng mục, nước giải, nước phân Cuốc nhẹ hoặc xới xáo quanh gốc trồng, rồi bón phân, lấp đất [2]

Đinh lăng ít bị sâu bệnh hại Nếu có, dùng Wofatoc pha với nồng độ 7 -

10 phần vạn để phun [2]

2.1.5 Thu hái và chế biến

Trong y học cổ truyền tất cả các bộ phận trên cây Đinh lăng đều có thể

sử dụng làm thuốc Tuy nhiên, rễ Đinh lăng là bộ phân chứa nhiều hoạt chất nhất nên được dùng phổ biến hơn cả [18]

Đinh lăng trồng được 5 đến 10 năm có thể thu hoạch được Rễ thu hái vào mùa thu, lúc này rễ mềm nhiều hoạt chất nhất Rửa sạch cắt bỏ phần rễ sát với

gốc thân, rễ nhỏ để nguyên, nếu rễ to chỉ dùng vỏ rễ Nếu có rễ khô thì rửa sạch đất cát, ủ mềm Thái phiến dày 3 - 5 mm, phơi khô ở chỗ mát, thoáng gió, để đảm bảo mùi thơm và phẩm chất Khi dùng thường tầm nước gừng tươi 5 % xao qua, rồi tẩm 5 % mật ong (hay mật mía), sao thơm [5], [19], [24] Ngoài ra, còn dùng lá, thân và cành làm thuốc

2.1.6 Thành phần hóa học

Vỏ, rễ và lá Đinh lăng chứa saponin, alkaloit, các vitamin B1, B2, B6,

C, 20 axit amin, glycosit, phytosterol, tanin, axit hữu cơ, tinh dầu, nhiều nguyên tố vi lượng: K, Mn, Ca, Mg, Fe, Lo, Zw và 21,10 % đường Trong lá còn có saponin tripterpen (1,65 %), một genin đã xác định được là axit oleanolic [1]

Từ lá Đinh lăng, trung tâm sâm và dược liệu TP.Hồ Chí Minh thuộc Viện Dược liệu đã phân lập được năm hợp chất polyacetylen là panaxynol, panaxydol, heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3,10 diol, heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3 ol - 10 on và heptadeca - 1,8 (Z) - dien - 4,6 diyn - 3

ol - 10 on Hai hợp chất sau chỉ có trong lá Đinh lăng mà chưa thấy có trong các cây khác thuộc chi Panax và họ Araliaceae, điều đó nói lên sự độc đáo về mặt hóa học của Đinh lăng Trong rễ Đinh lăng cũng tìm thấy năm hợp chất polyacetylen nhưng chỉ có panaxydol, panaxynol và heptadeca - 1,8 (E) - dien

- 4,6 diyn - 3,10 diol là trùng hợp với các chất trong lá Ba chất này có tác dụng kháng khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thư [1]

Hai hợp chất chính và quan trọng trong cây Đinh lăng là polyacetylen và saponin tripterpen Trong đó, hợp chất polyactylen tác chiết được có tính kháng khuẩn rất mạnh và kháng một số dạng ung thư, còn hợp chất saponin tripterpen

có tác dụng chống stress, chống trầm cảm, chống oxy hóa rất tốt Đồng thời, hai hợp chất panaxynol và heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3,10 diol trong cây Đinh lăng cũng là hai hợp chất chủ yếu trong cây Nhân sâm, điều này cho thấy khả năng sử dụng Đinh lăng thay thế Nhân sâm làm thuốc chữa bệnh [13], [14], [20]

2.1.7 Tác dụng dược lý

Đinh lăng là cây cổ truyền được sử dụng nhiều trong điều trị các bệnh như ho ra máu, kích thích tiêu hóa, chữa kiết lỵ, vết thương, tăng sức dẻo dai cho cơ thể Các đô vật thường dụng lá Đinh lăng để tăng sức dẻo dai khi thi đấu Hải Thượng Lãn Ông Lê Hữu Trác đã dùng rễ, cành và lá Đinh lăng sao vàng, sắc cho phụ nữ sau khi sinh uống thay chè để chống bệnh đau dạ con và làm tăng tiết sữa cho con bú (Bách gia trân tàng) [33], [9]

Năm 1961, các nhà dược lý dược liệu và giải phẫu bệnh lý Viện y học quân

sự Việt Nam nghiên cứu tác dụng của Đinh lăng và đi đến kết luận: Nước sắc rễ đinh lăng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể và có tác dụng tương tự như nhân sâm Trên cơ sở kết quả nghiên cứu dược lý, Viện y học quân sự Việt Nam, năm 1964 cho thí nghiệm dùng trên người thấy với liều 0,23 - 0,50 g bột Đinh lăng mỗi ngày dưới dạng thuốc sắc hay thuốc ngâm rượu nhẹ (30o) thì có kết quả tăng sức dẻo dai của cơ thể như khi nghiên cứu trong phòng thí nghiệm [19]

Ngô Ứng Long và Xavaev (Liên Xô cũ) đã cùng nhận thấy Đinh lăng

có tác dụng tốt với các nhà du hành vũ trụ khi luyện tập trong tư thế tĩnh đầu dốc ngược Thực nghiệm trên người, viên bột rễ Đinh lăng làm tăng khả năng chịu đựng của bộ đội, vận động viên thể thao [18], [19]

Đinh lăng có tác dụng tăng lực, làm tăng cân, trên động vật thí nghiêm

và cả trên người Thân và lá cũng có tác dụng tăng lực nhưng yếu hơn so với

rễ Đinh lăng làm tăng hiệu lực điều trị của cloroquin trong bệnh sốt rét thực nghiệm trên động vật Ngoài ra, Đinh lăng còn có tác dụng tăng co bóp tử cung, tăng tiết niệu, kháng khuẩn, giúp an thần và ít độc [40]

Đinh lăng đã được nghiên cứu và chứng minh có tác dụng nội tiết kiểu Oestrogen Nước sắc Đinh lăng còn có tác dụng kháng đối với trùng roi

Euglena viridis, trùng tiêm mao Paramoecium caudatum và một số động vật

nguyên sinh khác trong nước ngâm rơm và nước ao Nước sắc Đinh lăng còn

có tác dụng chống choáng phản vệ ở mức độ vừa, bảo vệ được 60% chuột lang qua cơn choáng [39], [40]

Dựa theo kinh nghiệm dân gian, Đinh lăng được áp dụng trong điều trị bệnh nhân lị amip cấp Sau 10 ngày, hết triệu chứng lâm sàng và sau 16 ngày xét nghiệm lại trong phân hết thể amip thực huyết, hết kén Đinh lăng còn có

tác dụng kháng Entamoeba histolyrica làm đơn bào co thành kén và có tác

dụng kích thích miễn dịch gây chuyển dạng lympho bào trong thí nghiệm

nuôi cấy in vitro [1], [2], [19]

Đinh lăng đã được nghiên cứu có tác dụng kích thích miễn dịch không đặc hiệu trong thí nghiệm gây mẫn cảm chuột nhắt bằng hồng cầu cừu Sau 4 ngày, mổ tách tế bào lách và ủ với kháng nguyên trong môi trường Đếm số tế bào tạo mảng dung huyết và thấy Đinh lăng thể hiện tác dụng kích thích miễn dịch mạnh Ngoài ra, Đinh lăng còn có tác dụng chống trầm uất Trong thí

nghiệm, trên xúc vật được uống Đinh lăng cũng như trong thí nghiệm in vitro,

ủ tổ chức não hoặc gan với dịch chiết Đinh lăng và sau đó định lượng hoạt độ men MAO thấy Đinh lăng có tác dụng ức chế mạnh hoạt độ men MAO ở não

và gan Đinh lăng còn có tác dụng giảm cholesterol trong máu theo cơ chế nội sinh bằng Tween 80 [1], [2]

Dịch chiết Đinh lăng còn được thử tác dụng đối với ATPase màng tế bào, và thấy K +

Na + ATPase được kích thích bởi dịch chiết thân, rễ và lá của cây Đối với ATPase dạng hòa tan kết quả tương tự như ATPase của màng tế bào Sự kích thích hoạt tính men của dịch chiết đinh lăng có khả năng đối kháng sự kìm hãm K+

Na+ ATPase của aminazin Đinh lăng còn có tác dụng kích thích sinh dục ở động vật già, kích thích tăng sinh lực ở động vật gây mệt mỏi, tác dụng kéo dài và bền vững [1], [40]

Đinh lăng còn có tác dụng làm tăng sức đề kháng của chuột đối với tác hại của siêu cao tần và thấy có tác dụng kéo dài thời gian sống của chuột hơn

so với một số thuốc như ngũ gia bì Eleutherococcus của Liên Xô cũ, đương quy, ba kích

Đinh lăng có tác dụng trợ tim, bổ tim, dùng chung với lá Trinh nữ hoàng cung có tác dụng khỏe người khi điều trị khối u, chữa trị yếu tim, hơi thở kém [23]

Liều độc: Đinh lăng ít độc, so với Nhân sâm còn ít độc hơn Giải phẫu những chuột chết vì liều độc thì thấy gây tổn thương nặng tổ chức cơ sở các tạng nhất là gan, thận, tim, não, cuối cùng chết Liều độc tiêm phúc mạc DL50 của Đinh lăng là 32,9 (g/kg thể trọng) trong khi đó của Nhân sâm là 16,5 (g/kg thể trọng), của Ngũ gia bì Liên Xô cũ là 14,5 (g/kg thể trọng), chứng tỏ Đinh lăng ít độc hơn 2 vị thuốc Nhân sâm và Ngũ gia bì Liên Xô cũ Cho uống với liều 50 (g/kg thể trọng), chuột vẫn sống bình thường [11]

2.2 Tình hình sử dụng Đinh lăng ở Việt Nam và trên thế giới

2.2.1 Trên thế giới

Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ đảo Polynésie ở Thái Bình Dương Hiện nay, cây được trồng rộng rãi ở Malaysia, Indonesia, Campuchia, Lào, Việt Nam, Trung Quốc [1]

Tại Ấn Độ, theo Naikarai K.M., Đinh lăng được dùng làm thuốc săn da

và trị sốt Tại Trung Quốc, Đinh lăng được sử dụng để tăng cường sức khỏe, chữa chứng mất ngủ, chữa ho, dị ứng… Ở Campuchia, người ta còn dùng lá phối hợp với các loại thuốc khác làm bột hạ nhiệt và cũng dùng làm thuốc giảm đau

trải giường cho trẻ em nằm phòng bệnh kinh giật Phụ nữ sau khi sinh uống nước sắc lá Đinh lăng khô, thấy cơ thể nhẹ nhõm khỏe mạnh, có nhiều sữa, lá tươi 50 - 100g băm nhỏ cùng với bong bóng lợn, trộn với gạo nếp nấu cháo ăn cũng lợi sữa Cả thân, rễ và lá Đinh lăng đều có thể sử dụng nhưng rễ tốt hơn thân và lá [7], [9], [11]

Hiện nay, để thuận tiện hơn cho việc sử dụng đinh lăng làm thuốc, Công ty cổ phần Dược phẩm Traphaco đã sản xuất cao đặc Đinh lăng dưới dạng thuốc bổ, viên nén hoạt huyết dưỡng não Ngoài ra, còn có một số chế phẩm từ Đinh lăng hiện dùng như tinh sâm PANA (Viện Y học Quân sự), rượu thuốc ngọt, viên ngậm DINLAN (Trung tâm Sâm Việt Nam), trà Đinh lăng

Hình 2.1: Vườn đinh lăng trồng ở hộ gia đình

2.3 Cơ sở khoa học

2.3.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào

Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức là Schleiden và Schwann đã đề xướng ra học thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi cơ thể sinh vật đều bao gồm các đơn vị nhỏ tồn tại độc lập, riêng rẽ và tách biệt đó là các tế bào

Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang bộ máy thông tin di truyền giống nhau Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau Bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật các nha khoa học đã đạt được những thành công chứng minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào Các tế bào lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ ) nếu được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy thích hợp đều có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài và

ra hoa kết quả mình thường Các loại mô đã phân hóa tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, ngoài ra chúng còn có khả năng phát triển thành tế bào mô sẹo (callus) Đó là loại tế bào không phân hóa, phân chia liên tục và có khả năng phân hóa thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh Như vậy mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Khả năng đó gọi là tính toàn năng của tế bào

Tính toàn năng là cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, là cơ sở của công nghệ tế bào thực vật đang ngày càng phát triển và hoàn thiện Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào nhanh chóng trở thành công cụ hữu hiệu trong nhiều lĩnh vực của công tác giống cây trồng, đưa nghề trồng trọt vào thế kỷ của công nghệ hiện

2.3.2 Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo giống sạch bệnh và nhân nhanh giống

Năm 1949, Limmasets và Cornuet đã phát hiện rằng, ở các cây nhiễm bệnh virus, virus phân bố không đồng nhất trên cây và thường không thấy có virus ở vùng đỉnh sinh trưởng của cây Phát hiện đó là cơ sở để Morel và Martin (1952) chứng minh giả thuyết trên bằng cách tạo được cây sạch bệnh virus từ 6 giống khoai tây qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng [1]

Năm 1976, Morel đã thực hiện bước ngoặt khi áp dụng thành công kỹ thuật này trong nhân nhanh các loài địa lan Cymbidium thông qua protocom Sau đó, việc phát hiện ra cytokinin và môi trường nuôi cấy cải tiến (Murashige & Skoog, 1962) đã tạo sức sống mới để ứng dụng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân giống thương mại ở thực vật

Ngày nay, kỹ thuật này cùng với một số cải tiến đã trở thành một phương pháp loại trừ bệnh virus được sử dụng rộng rãi đối với nhiều loại cây trồng khác nhau Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm các phương pháp:

- Nuôi cấy mô phân sinh (meristem culture) thực chất là nuôi cấy phần đỉnh sinh trưởng không kèm theo lá mầm

- Nuối cấy đỉnh sinh trưởng (meristem tip culture) bao gồm chóp sinh trưởng và một số mầm lá Trong thực tế nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được dùng phổ biến để tạo cây sạch bệnh

- Nuối cấy đỉnh chồi (Shoot tip) thường dùng để nhân nhanh invitro, khác với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chủ yếu ở kích thước mẫu nuôi cấy Đỉnh sinh trưởng nhỏ (0,1 - 0,5 mm) so với đỉnh chồi (0,5 - 5,0mm)

2.3.3 Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng tới quá trình nuôi cấy

mô tế bào thực vật

Hiện nay người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic Những chất

này được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo

và hỗ trợ nhau Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất định Trong nuôi cáy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin

- Nhóm Auxin

Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lý học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất Auxin là những hormon thực vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan, kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng tế bào Chính chức năng này đã được người ta sử dụng và đánh giá hoạt tính của nó Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α - naphtylaxetic (α - NAA), Indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc nhưng có tác dụng kích thích quá trình phân chia tế bào thường được sử dụng nhiều nhất, NAA có tác dụng tạo rễ cho cây con Tuy nhiên, tầm quan trọng của bất cứ chất điều tiết sinh trưởng nào đều có thể được đánh giá thông qua

số các công trình nghiên cứu về chúng

Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện thông qua nhiên cứu bệnh nấm lúa von Nhóm này có tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cho cây lùn có thể cao lên được, như ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng Đại diện cho nhóm này là axit giberilic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp

- Nhóm Cytokinin

Việc phát hiện ra xytokinin gắn liền với kỹ thuật nuôi cây mô tế bào thực vật Năm 1955 Miller và Skoog phát hiện và chiết xuất từ tinh dịch cá thu một hợp chất có khả năng kích thích sự phân chia tế bào rất mạnh mẽ trong nuôi cấy mô gọi là kinetin (6 - furfuryl - aminopurin - C10H 9N 5O)

Letham và Miller (1963) lần đầu tiên đã tách được xytokinin tự nhiên ở dạng kết tinh từ hạt ngô gọi là zeatin và có hoạt tính tương tự kinetin Sau đó người

ta đã phát hiện xytokinin có ở trong tất cả các loại thực vật khác nhau và là một nhóm phytohormone quan trọng ở trong cây Trong các loại xytokinin thì

3 loại sau đây là phổ biến nhất: Kinetin (6 - furfuryl - aminopurin), 6 - benzin

- aminopurin và Hiện nay người ta đã phát hiện ra nhiều loại xytokinin trong các bộ phận đang sinh trưởng của cây Nhiều nghiên cứu khẳng định rằng xytokinin được hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ Ngoài ra một số cơ quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp xytokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh Người ta cũng đã phát hiện ra kinetin là loại xytokinin có nhiều ở trong nước dừa Xytokinin được vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, có thể vận chuyển theo hướng ngọn và hướng gốc Xytokinin có thể ở dạng tự do và dạng liên kết tương tự như các phytohormone khác Ở trong cây chúng bị phân giải dưới tác dụng của enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là urê Các xytokinin tổng hợp được

sử dụng trong kỹ thuật nuôi cấy mô là kinetin và benzyladenin

Vai trò đặc trưng của xytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh

mẽ Vì vậy người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, nguyên nhân là do xytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp axit nucleic và protein dẫn đến kích sự phân chia tế bào Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi Người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng giữa tỷ lệ auxin (phân hóa rễ) và xytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa rất quyết định trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn Nếu tỷ lệ auxin cao hơn xytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ xytokinin cao hơn auxin thì kích thích ra chồi Ðể tăng hệ số nhân giống, người ta thường tăng nồng độ xytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi Ở trong cây rễ là cơ quan tổng hợp xytokinin chủ yếu nên rễ phát triển

mạnh thì hình thành nhiều xytokinin và kích thích chồi trên mặt đất cũng hình thành nhiều Xytokinin kìm hãm quá trình già hóa của các cơ quan và của cây nguyên vẹn Nếu như lá tách rời được xử lý xytokinin thì duy trì được hàm lượng protein và chlorophin trong thời gian lâu hơn và lá tồn tại màu xanh lâu hơn Hiệu quả kìm hãm sự già hóa, kéo dài tuổi thọ của các cơ quan có thể chứng minh khi cành dâm ra rễ thì rễ tổng hợp xytokinin nội sinh và kéo dài thời gian sống của lá lâu hơn Hàm lượng xytokinin nhiều làm cho lá xanh lâu

do nó tăng quá trình vận chuyển chất dinh dưỡng về nuôi lá Trên cây nguyên vẹn khi bộ rễ sinh trưởng tốt thì làm cho cây trẻ và sinh trưởng mạnh, nếu bộ rễ

bị tổn thương thì cơ quan trên mặt đất chóng già Xytokinin trong một số trường hợp ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt và của củ Vì vậy nếu xử lý xytokinin có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt củ mầm

Nhóm cytokinin là nhóm chất hóa học có ảnh hưởng quyết định đến kích thích phân chia tế bào Đại diện cho nhóm này gồm: 6 - benzyl aminopurine (BAP), 6 - Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin

Rất nhiều cytokinin được phát hiện trong những nghiên cứu liên quan đến nuôi cấy mô, nó kích thích phân hóa cơ quan của những tế bào không phân chia Nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học đã sử dụng kết hợp BAP

và NAA để tạo chồi từ mắt ngủ hay đỉnh sinh trưởng Rachael keolanui đã sử dụng BAP để tạo chồi khoai môn từ các mắt ngầm và đỉnh sinh trưởng

- Nhóm Ethylen

Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây nhưng gần đây nó mới được coi là một hormon thực vật Ethylen thường được sử dụng để làm chính quả như ở chuối, hồng, hồng xiêm làm ra hoa đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng đến quá trình phân bào Đối với cà chua trong điều kiện nồng độ ethylen cáo xẽ kéo dài khoảng ra rễ ở thân cây

Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng đến tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây ngăn ngày thông qua hiệu quả tổng hợp ARN và protein

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu: Mô phân sinh đỉnh cây Đinh lăng khỏe mạnh,

sạch bệnh do Viện nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cung cấp

- Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu vào mẫu, nhân nhanh và ra rễ cây

Đinh lăng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

- Viện nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Máy chuẩn pH Hanna HI2210

- Cân điện tử (Olhous- Vietlabcu)

- Lò vi sóng Sanyo

- Tủ sấy Memmert

- Nồi hấp vô trùng ALP

- Tủ cấy vô trùng cấp II Airtech

- Micropipette

Ngoài ra còn có các trang thiết bị khác của Viện nghiên cứu và Phát

triển Lâm nghiệp

3.4 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng của HgCl2 0.1% đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn

- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi cây Đinh lăng

- Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng tới khả năng nhân nhanh của chồi Đinh lăng

- Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Auxin(NAA, IBA)và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của chồi cây Đinh lăng

- Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến khả năng sinh

trưởng và phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Điều kiện bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

- Các bình nuôi cấy In vitro được đặt trong phòng nuôi cấy có chế

độ chiếu sáng 16h sáng / 8 h tối với cường độ chiếu sáng 2000-

2500 lux Nhiệt độ phòng nuôi cấy :25 ± 20 C

- Độ ẩm không khí : 65 – 70 %

3.5.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

+ Sử dụng môi trường MS (Murashinge & Skoog, 1962), B5 (Gamborg’s), WPM có bổ sung Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5g/l, pH: 5,6-5,8

+ Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm auxin và Cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm

+ Thể tích môi trường nuôi cấy trong mỗi bình nuôi cấy là 50-70 ml/bình

+ Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1,1 atm trong 18 phút

3.5.3 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp khử trùng đến

khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn từ mẫu Đinh lăng

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng vô trùng mẫu

- Chuẩn bị mẫu:

Mô phân sinh đỉnh cây Đinh lăng được rửa sạch bằng nước máy để loại

bỏ bụi bẩn Sau đó rửa mẫu bằng xà phòng loãng, rửa sạch mẫu dưới vòi nước máy để loại bỏ hết xà phòng và bụi bẩn còn lại bám trên mẫu

- Khử trùng mẫu: Mẫu đã rửa sạch sẽ được khử trùng bằng HgCl2 0,1%

ở các khoảng thời gian khác nhau Sau đó, rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 - 7 lần Ngâm mẫu trong nước cất khoảng 5 phút

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn

toàn, có 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, cấy 15 mẫu cho mỗi công thức Tiến hành theo dõi và đánh giá sau 7 ngày nuôi cấy

+Tỷ lệ mẫu sống bị nhiễm:

+Tỷ lệ mẫu chết:

3.5.4 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi cây Đinh lăng

- Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm có 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 15 bình, mỗi bình cấy một mẫu

- Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi trong 30 ngày

+ Tỷ lệ bật chồi không nhiễm (%):

3.5.5 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3

+ Sử dụng môi trường có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin và Cytokinin vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm

+ Sử dụng chồi sạch bệnh, sinh trưởng tốt có chiều dài từ 0,5-1cm, dùng pank đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi đưa vào môi trường đã được chuẩn bị trước

+ Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi Sau đó tiến hành theo dõi số chồi, hệ số nhân và chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường)

- Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi trong 30 ngày

+ Số chồi mới hình thành (chồi/mẫu)

+ Hệ số nhân (lần):

Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi thu được (chồi)

Tổng số chồi nuôi cấy (mẫu) + Chất lượng chồi bật:

Chồi tốt: Chồi mập, xanh

Chồi trung bình: Chồi mập, xanh nhạt

Chồi kém: Chồi bé, xanh nhạt

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nồng độ loại cytokine(kinetine,BA) đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ

- Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm có 7 công thức, mỗi công thức

nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy một mẫu

- Công thức thí nghiệm