Nghiên cứu biểu hiện lysin của bacteriophage chủng k đặc hiệu staphylococcus aureus ở escherichia coli

Ngày nay, khoảng 70% vi khuẩn gây nhiễm trùng có mặt tại các bệnh viện có khả năng kháng ít nhất một trong những loại thuốc thường được sử dụng để điều trị.. áo cáo giám sát toàn cầu về

VŨ THỊ TRANG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN LYSIN CỦA BACTERIOPHAGE CHỦNG K ĐẶC

HIỆU Staphylococcus aureus Ở Escherichia coli

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy

Chuyên ngành/ngành: Công nghệ sinh học

Khóa học: 2012 – 2016

Thái Nguyên – năm 2016

VŨ THỊ TRANG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN LYSIN CỦA BACTERIOPHAGE CHỦNG K ĐẶC

HIỆU Staphylococcus aureus Ở Escherichia coli

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy

Chuyên ngành/ngành: Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS TS Đồng Văn Quyền – Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi được thực tập tại phòng, PGS.TS cũng là người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo để tôi hoàn thành công việc một cách hiệu quả nhất trong suốt thời gian thực tập

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ to lớn, những ý kiến đóng góp quý báu của TS Dương Văn Cường – Phó Trưởng khoa khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trong quá trình tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn các cô chú, anh chị phòng Vi sinh phân tử đã tạo cho tôi môi trường làm việc khoa học, nghiêm túc, nhiệt tình giải đáp những thắc mắc trong suốt quá trình tôi thực hiện khóa luận Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến KS Mai Thùy Linh, ThS Bùi Thị Thùy Dương – nhân viên phòng

Vi sinh phân tử, hai chị đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và đồng hành cùng với tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy, cô khoa Công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian học tập cũng như khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Vũ Thị Trang

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 2.1: Vi khuẩn thường gây nhiễm trùng trong bệnh viện và cộng đồng năm

2014 4

Bảng 2.2 Phương pháp phân loại thực khuẩn thể theo Ackermann (2009) 16

Bảng 2.3: Bảng thành phần cấu trúc của vector pET32a (+) 30

Bảng 3.1: Thành phần môi trường LB lỏng (1 lít) 33

Bảng 3.2: Thành phần của điện di DNA 33

Bảng 3.3: Thành phần của một bản gel polyacrylamide 34

Bảng 3.4: Thành phần các dung dịch dùng trong tinh sạch lysin phage 34

Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp pCR 2.1 và pET32 bằng enzyme giới hạn 36

Bảng 3.6: Thành phần phản ứng gắn gene vào vector biểu hiện 38

ảng 3.7: Thành phần phản ứng để xác định trình tự 40

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Trang

Hình 2.1: Hình thái Staphylocococcus aureus (Le Huy Chinh, 2001) 8

Hình 2.2: Quá trình lytic (sinh tan) và lysogentic (tiềm tan) của thể thực khuẩn khi xâm nhiễm vi khuẩn ( John B et al., 2007) 18

Hình 2.3: (a)Cấu trúc peptidoglycan điển hình của vi khuẩn Gram dương và biểu thị sự phân chia vị trí bám của các loại lysin; (b) Cấu trúc phân tử lysin K 21

Hình 2.4: Cấu trúc vector pET32a (+) (LaVallie ER et al., 1993) 29

Hình 3.1: sơ đồ minh họa các bước biểu hiện gene mã hóa lysin 35

Hình 4.1: Kết quả sàng lọc các dòng plasmid mang gen lysK bằng điện di trên gel Agarose 43

Hình 4.2: Kết quả chọn lọc các dòng vector tái tái tổ hợp pET32a(+) mang gen lys 44

Hình 4.3: Trình tự nucleotide và acid amin suy diễn từ gen lysK mã hóa lysin 47

Hình 4.4: Kết quả biểu hiện protein lysin 48

Hình 4.5: Điện di kết quả biểu hiện lysin ở các nhiệt độ khác nhau 50

Hình 4.6: Kết quả biểu hiện lysin ở các nồng độ IPTG 51

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

AEBSF 4- (2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride

APS Ammonium persulfat

Asp Aspartic acid

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr Ethidium bromid

FDA Food and Drug Administrationphẩm Hoa Kì) (Cục quản lý thực phẩm và dược

ICTV International Committee on Nomenclature of Viruses (Ủy ban Quốc

tế về phân loại vi rút) IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

RNA Ribonucleic acid

SDS Sodium dodecyl sulfate

TAE Tris- acid acetic- EDTA

Taq Thermus aquaticus

TEMED N, N, N’, N’ – tetramethyl- ethylenediamine

V/V Volum/ volum: thể tích/ thể tích X- gal 5- bromo- 4- chloro-3 indoly-β- D- galactoside

WHO World Health Organization(Tổ chức Y tế Thế giới)

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ iii

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.4 Ý nghĩa của đề tài 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2 : TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 4

2.1 Cơ sở thực tiễn và cơ sở khoa học của đề tài 4

2.1.1 Tình trạng kháng kháng sinh 4

2.1.2 Staphylococcus aureus 5

2.1.3 Các phương pháp điều trị bệnh do vi khuẩn 8

2.1.4 Tổng quan về thực khuẩn thể (bacteriophage) 14

2.1.5 Bacteriophage lysins 19

2.3 Đặc điểm của hệ thống biểu hiện 29

2.3.1 Vector biểu hiện 29

2.3.2 Hệ thống biểu hiện E.coli 31

PHẦN 3 : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

3.1 Vật liệu nghiên cứu 32

3.1.1 Đối tượng 32

3.1.2 Hóa chất và sinh phẩm 32

3.1.3 Trang thiết bị 32

3.1.4 Môi trường và dung dịch làm việc 33

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 35

3.3 Nội dung nghiên cứu 35

3.4 Phương pháp nghiên cứu 35

3.4.1 Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn 36

3.4.2 Phương pháp điện di trên gel Agarose 36

3.4.3 Thu nhận DNA từ gel agarose (thôi gel) 37

3.4.4 Gắn đoạn gen mã hóa lysin vào vector biểu hiện 37

3.4.5 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E coli 38

3.4.6 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 39

3.4.7 Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động 40

3.4.8 Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E coli 41

3.4.9 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 41

3.4.10 Phương pháp biểu hiện- xác định trạng thái tồn tại của lysin 42

Phần 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

4.1 Thiết kế vector biểu hiện 43

4.1.1 Kết quả thiết kế vector pET32(a+) mang gen lysK 43

4.1.2 Chọn lọc các dòng plasmid mang gen lysK bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn 44

4.1.3 Kiểm tra chiều gắn khung đọc của đoạn chèn trong vector pET32a(+) 45

4.2 Biểu hiện gene mã hóa lysin trong vi khuẩn 48

4.2.1 Biểu hiện lysin phage trong vi khuẩn E coli 48

4.2.2 Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện 49

Phần 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

5.1 Kết luận 53

5.2 Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tuy nhiên, vi sinh vật gây bệnh trở nên kháng với các loại thuốc điều trị là một vấn đề ngày càng lớn trong việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng Khả năng kháng lại kháng sinh của vi sinh vật de dọa ngày càng cao việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm… gây ra Ngày nay, khoảng 70% vi khuẩn gây nhiễm trùng có mặt tại các bệnh viện có khả năng kháng ít nhất một trong những loại thuốc thường được sử dụng để điều trị Nguy cơ xuất hiện các chủng siêu vi khuẩn có khả năng kháng tất cả các loại kháng sinh hiện có là mối lo

sợ của nhân loại và là thách thức lớn đối với giới khoa học áo cáo giám sát toàn cầu về kháng kháng sinh năm 2014 của WHO cho thấy khả năng kháng thuốc kháng sinh không còn là một dự đoán cho tương lai, nó đang xảy ra, trên khắp thế giới, gây ra nhiều rủi ro trong khả năng điều trị những bệnh nhiễm trùng phổ biến trong cộng đồng và bệnh viện

Vi khuẩn tụ cầu (Staphylococcus) là một tác nhân gây ra rất nhiều loại bệnh

nặng và có khả năng kháng kháng sinh rất cao Nhiễm khuẩn tụ cầu có thể được chữa trị bằng kháng sinh bình thường, nhưng nhiều trường hợp vi khuẩn trở lên kháng thuốc, nhiễm vào các cơ quan nội tạng gây tử vong và những di chứng nặng

nề khác Staphylococcus aureus (S aureus) là một tác nhân gây viêm, ngộ độc thực phẩm và hội chứng sốc độc với tỷ lệ tử vong cao (Noble WC et al., 1998) Năm

1941, tất cả các tụ cầu khuẩn vàng gây bệnh dễ dàng bị diệt bởi kháng sinh penicillin, nhưng chỉ 3 năm sau tụ cầu khuẩn vàng đã trở nên kháng thuốc Các

Trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa bệnh của Mỹ cho biết năm 1972 chỉ có 2% trường hợp viêm nhiễm khuẩn tụ cầu vàng kháng thuốc, nhưng năm 2004 con số

này là 63% Cũng tương tự một số vi khuẩn khác, S aureus tiết ra β lactamase để

chống kháng sinh ampicillin, hoặc axetyl transferase để chống kháng sinh chloramphenicol… Một số thống kê cho thấy hiện nay có hơn 95% loài vi khuẩn kháng thuốc penicillin, thậm chí có khả năng kháng nhiều loại thuốc kháng sinh,

điển hình như S.aureus kháng methicillin (MRSA)

Đứng trước nguy cơ trên, nhiều nhà khoa học đang nỗ lực nghiên cứu các loại kháng sinh có nguồn gốc khác từ động vật, thực vật, côn trùng để tìm ra loại kháng sinh mới an toàn, có hiệu lực cao và khó bị vi khuẩn kháng lại Một trong các chiến lược hiệu quả đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu để chống lại các vi khuẩn kháng thuốc đó là sử dụng lysin Lysins, còn được gọi là endolysins hoặc murein hydrolases, là enzyme thủy phân peptidoglycan của các phage trong giai đoạn cuối cùng của chu kỳ ly giải tế bào Khi tác dụng ngoại sinh (như lysin tái tổ hợp được tinh sạch) lên các vi khuẩn Gram dương gây ly giải nhanh chóng và tiêu diệt tế bào vi khuẩn (Loresser MJ, 2005).Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh tiềm năng lớn của các enzym này để kiểm soát và điều trị bệnh nhiễm trùng bề mặt niêm mạc và nhiễm trùng toàn thân Ngoài ra, lysin cũng

có tiềm năng trong phát hiện và loại bỏ các tác nhân gây nhiễm độc thực phẩm Các kết quả trên mở ra hướng nghiên cứu tiềm năng trong ứng dụng bacteriophage lysins tái tổ hợp như loại thuốc mới, một vũ khí mạnh trong cuộc chiến chống lại hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn (Fenton M et al., 2010) Xuất phát từ cơ

sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu biểu hiện

Lysin của bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus ở

Escherichia coli”

1.2 Mục đích nghiên cứu

Biểu hiện được lysin tái tổ hợp của Bacteriophage chủng K đặc hiệu

Staphylococcus aureus trong vi khuẩn E coli BL21 starTM ( DE3)

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

- Thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa lysin của thực khuẩn thể vi

khuẩn Staphylococcus aureus

- Biểu hiện thành công gen mã hóa lysin trong E coli chủng BL21 starTM (DE3)

- Tối ưu một số điều kiện biểu hiện lysin phage trong E coli

1.4 Ý nghĩa của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển được kháng sinh thế hệ mới thay thế, bổ sung cho kháng sinh trong việc điều trị vi khuẩn gây bệnh

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tạo được lysin tái tổ hợp có nguồn gốc từ bacteriophage chủng K đặc hiệu

Staphylococcus aureus

Phần 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1 Cơ sở thực tiễn và cơ sở khoa học của đề tài

2.1.1 Tình trạng kháng kháng sinh

2.1.1.1 Tình hình kháng kháng sinh trên thế giới

Theo Trung tâm ệnh Dynamics, Kinh tế và Chính sách (Center for Disease Dynamics, Economics &Policy) và dự án Hợp tác toàn cầu về đề kháng kháng sinh (The Global Antibiotic Resistance Partnership) đã cùng đưa ra báo cáo mới về tình hình kháng sinh toàn thế giới 2015 đề cập đến tình trạng sử dụng kháng sinh và đề kháng kháng sinh ở người và vật nuôi Theo đó trình trạng sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh đang ở mức đáng báo động, có 39 quốc gia xảy ra tình trạng kháng thuốc trên tổng số 69 quốc gia sử dụng thuốc kháng sinh Dữ liệu Resistance Map đề cập đến các bệnh nhiễm do 12 loại vi khuẩn nguy hiểm thường

gặp trong đó có E.coli, Salmonella, Methicillin-resistant S aureus (MRSA).

Bảng 2.1: Vi khuẩn thường gây nhiễm trùng trong bệnh viện

và cộng đồng năm 2014

Tên loài vi khuẩn kháng

kháng sinh

Số nước bị nhiễm trên tổng số

194 nước thành viên của WHO

Khu vực của WHO

có tình trạng kháng >

50% hoặc hơn

Nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng máu

Viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường tiết niệu

Staphylococcus aureus

Nhiễm trùng vết thương, nhiễm trùng máu

2.1.1.2 Tình hình kháng kháng sinh ở Việt Nam

Tình trạng kháng kháng sinh ở Việt Nam đã ở mức độ cao Trong những năm

gần đây, một số nghiên cứu cho thấy: Ở Việt Nam, các chủng Streptococcus pneumoniae - một trong những nguyên nhân thường gặp nhất gây nhiễm khuẩn hô

hấp – kháng penicillin (71.4%) và kháng erythromycin (92.1%) – có tỉ lệ phổ biến cao nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc

Châu Á (ANSORP) năm 2000-2001, 75% các chủng pneumococci kháng với ba hoặc trên ba loại kháng sinh, 57% Haemophilus influenzae (một căn nguyên vi

khuẩn phổ biến khác) phân lập từ bệnh nhi ở Hà Nội (2000-2002) kháng với ampicillin Tỉ lệ tương tự cũng được báo cáo ở Nha Trang

Các vi khuẩn gram âm đa số là kháng kháng sinh (enterobacteriaceae): hơn

25% số chủng phân lập tại một bệnh viện Thành phố Hồ Chí Minh kháng với kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, theo nghiên cứu năm 2000-2001 Theo báo cáo của một nghiên cứu khác năm 2009 cho thấy, 42% các chủng vi khuẩn gram âm kháng với ceftazidime, 63% kháng với gentamicin và 74% kháng với acid nalidixic tại cả bệnh viện và trong cộng đồng Xu hướng gia tăng của tình trạng kháng kháng sinh cũng thể hiện rõ rệt Những năm 1990, tại thành phố Hồ Chí Minh, chỉ có 8% các

chủng pneumococcus kháng với penicillin Đến năm1999-2000, tỉ lệ này đã tăng

lên 56% Xu hướng tương tự cũng được báo cáo tại các tỉnh phía bắc Việt Nam (Bộ

y tế - 2010)

2.1.2 Staphylococcus aureus

Chi Staphylococus là cầu khuẩn Gram dương, được giới thiệu trong cuốn Sổ

tay Hệ thống vi khuẩn học của ergey Được chia làm 2 nhóm: Hiếu khí

(Micrococcus, planococcus, và Deinococcus) và kị khí (Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Coprococus, và Sacina) Họ Micrococcaceae gồm 4 loài: Micrococcus, Stomatococus, Planococus, và Staphylococus Thuộc tính khác biệt của cầu khuẩn

Gram dương gồm sự sắp xếp của tế bào, hiếu khí bắt buộc, hiếu khí tùy ý hoặc vi hiếu khí, kị khí bắt buộc, phản ứng catalase, sự hiện diện của cytochrome, sản phẩm

lên men kị khí chủ yếu từ carbohydrates, peptidoglycan, acid teichois trên thành tế

bào, menaquinones (Scott EM et al., 2000) Sự phân loại của Staphylococus aures

Theo nhiều nghiên cứu ở Việt Nam, trong các vi khuẩn Gram dương, tụ cầu

vàng (S aureus) là loài vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và kháng lại kháng sinh

mạnh nhất Đặc biệt là gây nhiễm khuẩn huyết, gây ngộ độc thức ăn, gây nhiễm trùng bệnh viện… Tụ cầu vàng thường ký sinh ở mũi họng và có thể cả ở da Vi khuẩn này gây bệnh cho người bị suy giảm đề kháng hoặc chúng có nhiều yêu tố độc lực Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều loại bệnh khác nhau như nhiễm khuẩn ngoài da, nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp (Le Huy Chinh, 2001)

Hình dạng và kích thước

Tụ cầu là những cầu khuẩn, có đường kính từ 0,8-1,0 μm và đứng thành hình chùm nho, bắt màu Gram dương, không có lông, không nha bào, thường không có vỏ (Lê Huy Chinh, 2001)

Nuôi cấy

Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được ở nhiệt độ 10 – 450C và nồng độ muối cao tới 10%

Thích hợp được ở điều kiện hiếu và kỵ khí

– Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc S, đường kính 1-2 mm, nhẵn Sau 24 giờ ở 370C, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh

– Trên môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hoàn toàn Tụ cầu vàng tiết ra 5 loại dung huyết tố (hemolysin): a, β, δ, e, y

– Trên môi trường canh thang: tụ cầu vàng làm đục môi trường, để lâu nó có thể lắng cặn

Khả năng để kháng

Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi khuẩn không có nha bào khác Nó bị diệt ở 800C trong một giờ (các vi khuẩn khác thường bị diệt ở 600C trong 30 phút) Khả năng đề kháng với nhiệt độ thường phụ thuộc vào khả năng thích ứng nhiệt độ tối đa (450C) mà vi khuẩn có thể phát triển

Tụ cầu vàng cũng có thể gây bệnh sau một thời gian dài tồn tại ở môi trường

Sự kháng kháng sinh

Sự kháng lại kháng sinh của tụ cầu vàng là một đặc điểm rất đáng lưu ý Đa

số tụ cầu kháng lại penicillin do vi khuẩn này sản xuất được men penicillinase nhờ gen của R-plasmid Một số còn kháng lại được methicillin gọi là methicillin

resistance S aureus (viết tắt là MRSA), do nó tạo ra đươc các protein gắn vào vị trí

tác động của kháng sinh Hiện nay một số rất ít tụ cầu còn đề kháng được với cephalosporin các thế hệ Kháng sinh được dùng trong các trường hợp này là vancomycin, mặc dù vậy đã có những nghiên cứu cho thấy vi khuẩn này có khả năng kháng lại cả kháng sinh mới này (Le Huy Chinh, 2001)

– Desoxyribonuclease là enzym phân giải ADN

Streptomyces – được phân lập trong suốt giai đoạn vàng của sự khám phá ra

kháng sinh, giai đoạn từ năm 1940 đến năm 1970 Các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên được chứng minh là có hiệu quả cao trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Hiện nay hầu hết các phương pháp dựa trên các chất có nguồn gốc tự nhiên đang được phát triển nhằm thay thế thuốc cũ, tiêu biểu như glycopeptide telavancin

gần đây được cấp phép bởi FDA (Gruet P et al., 2001) Biến đổi hóa học của các

thuốc đang được hiện hành được chứng minh là phương pháp hiệu quả nhất chống lại các chủng kháng thuốc Tuy nhiên, các loại thuốc này cũng đang có xu hướng thất bại trong việc tiêu diệt các chủng kháng kháng sinh Do đó, việc tìm ra các loại thuốc mới có khả khăng chống lại vi khuẩn với khả năng tác dụng hoàn toàn mới là thật sự cần thiết Hiện nay có 7 phương pháp mới đang được tiến hành mang lại những hiệu quả nhất định bao gồm: các peptide kháng vi sinh vật (Antimicrobial peptide- AMPs), phương pháp chống độc, liệu pháp sử dụng phage và lysin phage, liệu pháp kháng thể, vaccine, các loại thuốc kháng sinh và kháng khuẩn sinh học

2.1.3.1 Các peptide kháng vi sinh vật

Peptide kháng khuẩn (AMPs) có mặt trong tất cả các loài động vật, được bảo

tồn trong quá trình tiến hóa của hệ thống miễn dịch bẩm sinh (Zasloff et al., 2002)

AMPs ở vi sinh vật nhân chuẩn có kích thước nhỏ ( 10-50 acid amin), có hoạt tính

cation và chứa cả hai phần kị nước và ưa nước (Hancock RE et al., 2006) Chúng đã

được mô tả là kháng sinh vì có khả năng phá vỡ màng và giết chết vi khuẩn Cơ chế chính xác về hoạt động của AMPs là không rõ Gần đây đã phát hiện ra một số AMPs không trực tiếp diệt vi khuẩn mà nó tham gia điều hòa miễn dịch (Bowdish

et al., 2005) AMPs là kháng sinh phổ rộng chống lại hoạt động của không chỉ vi

khuẩn mà còn virus và nấm Ở nồng độ cao hơn, nhiều loại có thể biểu hiện độc tính đối với các tế bào nhân chuẩn Magainins là AMPs từ ếch, là một trong các AMPs

tốt nhất được nghiên cứu (Berkowitz et al., 1990) AMPs của prokaryote nguồn gốc

được gọi là "bacteriocins", thường có phổ hoạt động hẹp hơn Nisin, một bacteriocin, là AMP quan trọng nhất được thương mại hóa Nó được sử dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm (Riley, 2002) Các polymyxins, lipopeptides vi khuẩn,

đã được đưa vào bệnh viện trong năm 1960, nhưng do độc tính của mình, nó được

thay thế bởi các kháng sinh khác (Falagas ME et al., 2005) Hiện nay, AMPs

thường chỉ được sử dụng trong điều trị tại chỗ và được coi là bước điều trị cuối cùng đối với nhiễm trùng gây ra bởi vi khuẩn Gram âm kháng đa thuốc như

Pseudomonas aeruginosa và Acinetobacter baumannii

Tiềm năng trong điều trị lâm sàng

Các peptide kháng khuẩn có phổ hoạt động rộng và nhanh chóng khiến chúng mang nhiều tiềm năng để có thể phát triển thành loại thuốc mới Mức độ

kháng lại các AMPs cũng được ước tính là thấp (Zasloff et al., 2002) Hầu hết các

AMPs trong các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng ngày nay được phát triển

cho các ứng dụng điều trị tại chỗ (Hancock RE et al., 2006) Tuy vậy, để phát triển

các AMP thành thuốc cũng gặp phải nhiều khó khăn Một vài AMP có thể độc mà giá thành để tổng hợp các peptide rất cao và tính bền của chúng trong các thử

nghiệm in vivo, đặc biệt là các protease cũng là một vấn đề lớn (Hancock RE et al.,

2006) Mối quan tâm về mặt lý thuyết của tính chất dược lý của các AMP liên quan chặt chẽ đến con người là việc lựa chọn sự kháng lại vi khuẩn có thể dẫn tới tạo ra các sinh vật có tiềm năng độc lực cao hơn Một thực tế rằng hoạt động của AMPs không phụ thuộc vào các trình tự amino acid đặc hiệu mà phụ thuộc vào các đặc tính hóa sinh, điều này mở ra cơ hội phát triển các peptide tổng hợp bản sao cho mục đích điều trị

Các nghiên cứu đang tiếp diễn

Hai AMP (omiganan và pexiganan) đã được đưa vào thử nghiệm có hiệu quả

ở các thử nghiệm lâm sàng pha ba, nhưng không loại nào trong số chúng được cấp

phép trong điều trị lâm sàng (Hancock RE et al., 2006) Pexiganan là chất tổng hợp

đồng phân của magainins, đã được phát triển cho điều trị tại chỗ bệnh loét bàn chân

do biến chứng tiểu đường, trong khi đó omiganan được phát triển để chống lại các

nhiễm trùng liên quan đến ống bài tiết Các dự án phát triển hai loại thuốc này vẫn đang trong giai đoạn tiến hành Nhiều peptide tổng hợp khác cũng mang lại hiệu quả trên mô hình động vật

2.1.3.2 Các chiến lược chống độc tính

Hầu hết các kháng sinh truyền thống đã được sử dụng đều tiêu diệt vi khuẩn bằng cách can thiệp vào các quá trình ngoại bào thiết yếu Một cách tiếp cận thay thế là làm giảm độc tính của mầm bệnh làm cho hệ thống miễn dịch bẩm sinh của vật chủ có thể tiêu diệt chúng một cách dễ dàng hơn Độc tính được định nghĩa là khả năng của mầm bệnh có thể gây nên bệnh Một số đối tượng chính của các nghiên cứu làm giam độc tính của mềm bệnh là các độc tính, quorum-cảm ứng, màng sinh học sinh học, chất tiết loại III và các chất kết dính Độc tố được sản xuất bởi nhiều vi khuẩn gây bệnh và trong nhiều trường hợp miễn dịch phòng vệ có thể kiểm soát tốt nếu các độc tố này làm mất sự cân bằng của cơ thể Một lượng lớn các

vi khuẩn Gram âm giải phóng độc tố của mình bởi chất tiết loại III, được sử dụng trong quá trình này một mục tiêu tiềm năng Các sản phẩm tiết loại III liên quan đến

sự hình thành của một cấu trúc hình kim mang độc tố và các phân tử phản ứng khác trực tiếp vào tế bào chủ Quorum cảm ứng - một mục tiêu tiềm năng - có thể được

mô tả như là quá trình mà các vi khuẩn "nói chuyện" với nhau khác Vi khuẩn có thể cảm nhận được nhau bằng cách nhận các phân tử nhỏ được tiết bởi các vi khuẩn khác gần đó; theo cách này, vi khuẩn có thể hành động như một cụm thay vì là cá

nhân (Kaufmann et al., 2008) Quorum cảm ứng cho phép vi khuẩn hình thành các

tấm màng sinh học, một phương pháp tiếp cận hiệu quả để kháng mạnh hơn với cả thuốc kháng sinh và đáp ứng miễn dịch Cuối cùng, các chất kết dính tế bào vật chủ

là một bước đầu quan trọng bước trong sự hình thành khuẩn lạc của vi khuẩn và do

đó là một mục tiêu đầy hứa hẹn cho thuốc kháng sinh

2.1.3.3 Liệu pháp kháng thể

Liệu pháp kháng thể đã được thương mại hóa trên thị trường, chủ yếu dùng

trong điều trị ung thư (Reichert et al., 2005) Miễn dịch bị động không phải là một

khái niệm mới, trước kỷ nguyên của kháng sinh, bệnh nhân thường xuyên được tiêm kháng huyết thanh được chiết xuất từ huyết thanh ngựa Phương pháp này cung cấp kháng thể nhằm tiêu diệt mầm bệnh một cách hiệu quả hơn Kháng thể chống lại vi khuẩn có thể được chia thành hai loại: một loại trực tiếp tiêu diệt mầm bệnh và một loại trung hòa độc tố và các yếu tố độc lực của vi khuẩn (Bebbington C

et al., 2008) Kháng thể trực tiếp tiêu diệt vi khuẩn bằng cách liên kết với chúng

giúp cho đại thực bào nhận biết và tiêu diệt Loại thứ hai thường liên kết với các yếu tố độc làm giảm độc lực của vi khuẩn, từ đó cơ thể vật chủ có cơ hội loại bỏ chúng nhờ hệ thống miễn dịch

Tiềm năng trong điều trị lâm sàng

Liệu pháp kháng thể có lợi thế lớn là tính đặc hiệu cao, nghĩa là không ảnh hưởng đến các quần thể vi sinh vật khác trong cơ thể Chỉ định kháng thể trong thử

nghiệm lâm sàng hiện nay bao gồm điều trị S aureus nhiễm trong nhóm nguy cơ

cao, cũng như dự phòng và điều trị bệnh than Kháng thể được sử dụng rộng rãi để điều trị ung thư và do đó nhiều câu hỏi liên quan về tính an toàn và dược tính có thể

đã được giải quyết Ngày nay, điều trị bằng kháng thể cũng tương đối tốn kém do giá thành sản xuất và thị trường thường nhỏ

2.1.3.4 Phương pháp sử dụng vaccine

Vaccine thế hệ cũ dựa trên các tế bào đã bị bất hoạt hoặc giết chết hoàn toàn

Kỹ thuật mới có thể sản xuất vaccine dựa trên sự biến đổi các độc tố và các protein liên kết với polysaccharide Kháng nguyên phù hợp thường được tìm ra nhờ sự đáp ứng miễn dịch của các loài động vật và sự xác định protein phản ứng miễn dịch ước đột phá về genomic đã cung cấp phương pháp mới cho việc lựa chọn các kháng nguyên Tin sinh học đã có thể để xác định các nhóm cụ thể của protein, chẳng hạn như các protein tiếp xúc bề mặt

Bằng cách này, nhiều kháng nguyên được tìm thấy được gọi là "vaccine ngược" Một phương pháp thay thế, công nghệ kháng nguyên, cũng đã được mô tả

(Meinke et al., 2005) Thư viện peptide bao phủ toàn bộ gen của một tác nhân gây

bệnh được sàng lọc cho hệ miễn dịch bằng cách thêm huyết thanh từ người đã từng phơi nhiễm với mầm bệnh Tuy nhiên các nghiên cứu để phát triển một loại vaccine

là rất khó để nghiên cứu và tốn nhiều thời gian, vaccine nghiên cứu ra cũng được sử dụng cho một số lượng đông dân số do vậy vấn đề an toàn cũng cần được nghiên cứu kỹ càng

2.1.3.5 Phương pháp kết hợp sử dụng các loại kháng sinh

Sự phát triển của nhiều loại kháng sinh đã tìm ra các kháng sinh thay thế những loại đã tồn tại trước đó Những kháng sinh tiềm năng có thể có chức năng hoặc bằng cơ chế kháng đảo ngược đối với các tác nhân gây bệnh mẫn cảm tự nhiên hoặc bởi các chủng kháng thuốc tự nhiên

Các cơ chế kháng phổ biến nhất theo hướng β- lactam lâm sàng là các sản phẩm của β-lactamase hoặc thay đổi protein gắn penicilin (P Ps) Điều trị với β-lactam kết hợp với một chất ức chế β - lactamase đã được sử dụng trong lâm sàng,

và ba chất ức chế đã được đăng ký là acid clavulanic, tazobactam và sulbactam

(Drawz SM et al., 2010) Một cơ chế kháng thuốc thông thường khác của các vi

khuẩn Gram âm là biểu hiện quá mức hệ thống bơm ngoài Đây cũng là một mục tiêu cho kháng sinh mới, mặc dù không có liệu pháp ức chế các bơm ngoài này hiện đang có sẵn trên thị trường

2.1.3.6 Liệu pháp thực khuẩn thể và lysin của chúng

Thực khuẩn (thể thực khuẩn) là virus ký sinh đặc hiệu trong vi khuẩn có trong gần như tất cả mọi môi trường Thể thực khuẩn được biết đến nhiều nhất là thể thực khuẩn sinh tan, tức là cuối cùng ly giải và tiêu diệt tế bào vi khuẩn để giải phóng một lượng lớn phage đã được nhân lên trong vi khuẩn trước đó Thể thực khuẩn khác là loại tiềm tan và không giết chết vi khuẩn chủ, chúng tích hợp vào hệ gen của vi khuẩn tạo thành dạng prophages và chỉ tấn công và chỉ ly giải vật chủ trong

các trường hợp đặc biệt hiếm gặp (O'Flaherty et al., 2009)

Tiềm năng điều trị lâm sàng

Bởi vì thực khuẩn là những kẻ thù tự nhiên của vi khuẩn, sử dụng chúng như thuốc kháng sinh có thể có vẻ khá đơn giản, sử dụng chúng làm thuốc được cho rằng có giá thành rẻ và có tính đặc hiệu cao (Hanlon GW, 2007) Tuy nhiên, nguy

cơ phát triển sự kháng thuốc cao và có thể có các vấn đề lâm sàng với sự trung hòa thể thực khuẩn bởi các phản ứng miễn dịch của vật chủ Về mặt lý thuyết, độ an toàn của thực khuẩn là rất cao vì tính đặc hiệu cao của chúng, tuy nhiên, có rất ít dữ liệu lâm sàng chính thức được công bố Một mối quan tâm chính là việc thiếu dữ liệu về hiệu quả và dược động học Thể thực khuẩn có phổ đặc hiệu rất hẹp và do đó liệu pháp thực khuẩn sẽ phải được chẩn đoán tốt để xác định chính xác tác nhân vi khuẩn gây bệnh Những chỉ định cho phage điều trị hiện đang được đánh giá bao

gồm sử dụng để bôi lên vết thương nhiễm trùng gây ra bởi, ví dụ, P aeruginosa hoặc S aureus, như cũng như nhiễm trùng mãn tính khác, chẳng hạn như nhiễm trùng P aeruginosa trong bệnh nhân xơ nang Một lĩnh vực tiềm năng sử dụng là

điều trị răng miệng cho các bệnh nhiễm trùng đường ruột Một biện pháp thay thế cho sử dụng toàn bộ hạt phage là sử dụng lysins phage Đây là những enzym có hiệu lực cao làm giảm các tế bào vi khuẩn Việc vi khuẩn phát triển khả năng đề kháng đối với lysin chưa được báo cáo (Fischetti VA, 2010)

2.1.3.7 Vật liệu sinh học kháng khuẩn

Dụng cụ, thiết bị y tế nhiễm khuẩn là một trong những nguyên nhân gây ra tình trạng nhiễm trùng bện bệnh viện phổ biến hiện nay Nhiễm trùng đường tiết

niệu liên quan đến ống thông là hình thức phổ biến nhất của nhiễm trùng bệnh viện

(Klevens et al., 2007) Các vi khuẩn phổ biến nhất liên quan đến nhiễm trùng trên các thiết bị y tế là những loài tụ cầu, Gram âm (ví dụ, E coli, P aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Acinetobacter acinus, Klebsiella spp và Proteus spp) là phổ biến nhất (Leone et al., 2003) Proteus mirabilis là tác nhân gây bệnh phổ biến

nhất liên quan đến encrustation

Tiềm năng lâm sàng

Những nỗ lực để phát triển các thiết bị y tế với tính chất kháng khuẩn đã được liên tục trong một thời gian dài Hầu hết các vật liệu polymer thường được sử dụng cho các thiết bị y tế như ống thông được dễ dàng xâm chiếm bởi vi khuẩn Vì vậy, việc nghiên cứu tạo ra lớp phủ có tính chất kháng khuẩn lên trên các thiết bị y tế là rất cần thiết Lớp sơn phủ này có thể giải phóng các chất kháng khuẩn, hoặc chống lại quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn Hiện nay ống thông tĩnh mạch trung tâm (CVC) và ống thông niệu với lớp phủ kháng khuẩn có trên thị trường Các lớp phủ kháng khuẩn phổ biến nhất được sử dụng hiện nay là những người có chứa bạc Bạc được biết đến với phổ rộng hoạt tính kháng khuẩn mạnh của nó đối với cả vi khuẩn Gram dương và

Gram âm, mà được cho là do giải phóng các ion bạc (Monteiro et al., 2009)

2.1.4 Tổng quan về thực khuẩn thể ( bacteriophage)

cơ sở rõ ràng về bản chất của thực khuẩn thể Đến năm 1930, kháng sinh penicilin lần đầu tiên được sử dụng trong việc điều trị nhiễm trùng và được phổ biến rộng rãi Liệu pháp phage không còn được chú ý nhiều như trước Mặc dù thuốc kháng sinh

đem lại nhiều lợi ích cho việc điều trị nhiễm khuẩn nhưng do sự lạm dụng thuốc, vi khuẩn ngày càng thích nghi và xuất hiện nhiều chủng có thể kháng lại thuốc kháng sinh Đến những năm cuối thế kỉ 20, các nhà khoa học cũng như các tổ chức lại dành sự quan tâm cho thể thực khuẩn như một biện pháp nhằm thay thế kháng sinh

trong lĩnh vực y học, thú y, nông nghiệp (John B et al., 2007)

2.1.4.2 Đặc điểm của thực khuẩn thể

Thực khuẩn thể có mặt ở hầu hết những nơi mà vi khuẩn được tìm thấy, và là yếu tố quan trọng trong điều hòa sự đa dạng và phân bố của vi khuẩn Hệ gen của thực khuẩn thể có thể là DNA hoặc RNA mạch đơn, mạch kép hay mạch vòng và chỉ có một bản copy duy nhất Tính phong phú của thể thực khuẩn được phản ánh ở

cả đặc điểm hình thái và hệ gen Hình thái của thể thực khuẩn rất đa dạng từ đơn giản như dạng icosahedral (khối 20 mặt, mỗi mặt là tam giác đều), dạng sợi đến những dạng phức tạp hơn gồm đuôi kết hợp với phần đầu dạng icosahedral (John B

et al., 2007)

2.1.4.3 Phân loại thực khuẩn thể n

Cho đến nay, chưa có một hệ thống phân loại thực khuẩn thể nào được thực sự chấp nhận bởi vẫn còn thiếu các dữ liệu về mối quan hệ giữa các thực khuẩn thể và

do đó thực khuẩn thể cũng không có tên gọi theo đúng quy cách như ở các vi sinh vật khác Một trong những cách phân loại thực khuẩn thể trước đây là dựa vào vật chủ mà chúng nhiễm Tuy nhiên, cách phân loại này chỉ tiện lợi cho bác sĩ và các nhà dịch tễ học Nhờ việc các kiến thức về các đặc điểm lý, hoá, sinh học của virus ngày càng được tích luỹ nên Uỷ ban Quốc tế về phân loại virus ( ICTV- International Committee of Taxonomy of Viruses) đã đề nghị một hệ thống phân loại virus dựa vào các đặc điểm cấu trúc của hạt virus (virion) cũng như axit nucleic của virus thay vì dựa trên vật chủ và dịch tễ học Số lượng virus được phân loại theo hình thái học đã lên tới hơn 5500 (Phạm Văn Ty, 2007) Việc phân loại thực khuẩn thể hiện nay được phát triển từ hệ thống phân loại được đề xuất bởi radley, được cho trong bảng 9.1 (Ackermann HW, 2009)

Bảng 2.2 Phương pháp phân loại thực khuẩn thể theo Ackermann (2009)

Đầu hình đa diện đều hoặc hơi dài (110x80nm).Đuôi có đĩa cổ, đĩa gốc, gai, lông

Họ Siphoviridae

(đuôi dài không co

được)

ADN kép, dạng thẳng

Đầu có đường kính 60nm.Đuôi không co được, có thể dài đến 570nm.Không phá

vỡ ADN ký chủ

Họ Podoviridae

(đuôi ngắn)

ADN kép, dạng thẳng

Đầu có đường kính 60nm Đuôi ngắn (17x8nm) với 6 sợi lông đuôi

Virion đều, đường kính 60nm.Lipid nằm giữa các lớp vỏ protein.Không có vỏ ngoài, không có đuôi, gai ở đỉnh

Họ Tectiviridae

(Phage có hai vỏ

capsit)

ADN kép, dạng thẳng

Virion có đường kính 60nm chứa lipid ngoài.Hai vỏ capsid, vỏ ngoài cứng, vỏ trong mềm.Sau khi tiêm ADN, xuất hiện cấu trúc đuôi dài khoảng 60nm

Tectiviruses và chứa lipid

STIV có cấu trúc tương tự như Tectiviruses, Adenoviruses và Phycodnaviruses

Họ Leviviridae

ARN đơn, (+), dạng dải

Capsid đa diện, đường kính 24nm

Họ Cystoviridae

(nhóm phage φ6) ARN kép

Virion đồng đều, đường kính 75nm, được bao bọc bởi vỏ ngoài lipid

Phage hình gậy hoặc sợi, capsid xoắn.Không làm tan tế bào chủ

Lipothrixviridae ADN kép

Virion virus có hình que dài với lớp vỏ lipoprotein

Rudiviridae ADN kép Virion có hình que thẳng, không có vỏ,

giống với virus khảm thuốc lá

Fuselloviridae ADN kép Virion có hình con quay và không có vỏ

capsid

Salterprovirus ADN kép

Hai thành viên của chi này được biết đến

là His1 và His2 Virion có hình con quay

Guttaviridae ADN kép Virion có hình giọt nước và có

Ampullaviridae ADN kép

Virion có cấu trúc rất đặc trưng và rất độc đáo với lớp áp choàng hình chai bên ngoài, cơ thể bên trong hình nón và nucleocapsid hình xoắn trôn ốc

Bicaudaviridae ADN kép

Virion bắt đầu quá trình thực thể với hình dạng là hình bầu dục hoặc hình mũi tên, bên trong chứa nucleocapsid hình xoắn trôn ốc và mọc đuôi phụ ở hai đầu

Globuloviridae ADN kép

Virion có dạng hình cầu, vỏ có chứa lipid và nucleocapsid hình xoắn ốc.Trừ việc genome của chúng chứa ADN, chúng giống như Paramyxiviruses

2.1.4.4 Ứng dụng của phage

Trước thời đại kháng sinh, liệu pháp thực khuẩn thể, một phương pháp sử dụng thực khuẩn thể để điều trị các bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi ở Liên Xô và các nước Đông Âu Từ năm 1928, Fleming tìm ra kháng sinh đầu tiên là penicillin và trong suốt những năm sau đó- là thời kì vàng kim của thuốc kháng sinh thì liệu pháp thực khuẩn thể không được quan tâm nữa Cho tới những năm gần đây, việc sử dụng tràn lan các loại thuốc kháng sinh dẫn đến tình trạng kháng thuốc ở vi khuẩn thì nhân loại lại quay về sử dụng liệu pháp phage

Bản chất của liệu pháp này là sự xâm nhập, nhân lên và tiêu diệt tế bào vi khuẩn theo 2 cơ chế là lytic và lysogentic Chu kì lytic là quá trình sinh tan, sau khi phage tiếp xúc với tế bào vi khuẩn, chúng bơm nucleic acid vào bên trong tế bào Nhờ hệ thống phiên mã dịch mã của tế bào mà nucleic acid của phage được tổng hợp Sau khi tổng hợp xong các thành phần, chúng lắp ráp các thành phần lại với nhau tạo thành phage hoàn chỉnh và ồ ạt giải phóng ra bên ngoài, gây dung giải tế bào vi khuẩn Còn đối với chu kì lysogentic, hệ gen của phage tiếp hợp vào hệ gen của tế bào vi khuẩn, tồn tại và phân chia cùng với genome vi khuẩn qua nhiều thế

hệ (Fenton M et al., 2010)

Hình 2.2: Quá trình lytic (sinh tan) và lysogentic (tiềm tan) của thể thực khuẩn

khi xâm nhiễm vi khuẩn ( John B et al., 2007)

Ngành công nghiệp thực phẩm là một lĩnh vực tiềm năng ứng dụng thể thực khuẩn vào việc bảo quản thực phẩm Năm 2006 Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kì ( FDA) đã cho phép sử dụng thực khuẩn thể để chống lại vi khuẩn

Listeria monocytogenes gây ô nhiễm thịt và gia cầm Tiềm năng lâm sàng của liệu

pháp phage cũng rất lớn, những chỉ định cho điều trị phage được đánh giá là có hiệu

quả với nhiễm trùng vết thương gây ra bởi vi khuẩn (P aeruginosa, S aureus …) Một loại cocktail phage, BFC-1, có chứa thực khuẩn cụ thể cho các chủng P aeruginosa và S aureus hiện đang được đánh giá là điều trị các vết thương bỏng (Merabishvili et al., 2009) Hướng nghiên cứu mới của liệu pháp này là chống

nhiễm trùng đường ruột bằng cách uống phage Nestle, công ty thực phẩm Thụy Sỹ,

đã tiến hành một giai đoạn I thử nghiệm an toàn của T4 phage trên người tình nguyện khỏe mạnh và gần đây bắt đầu một thử nghiệm lâm sàng cho việc sử dụng các thực khuẩn trong dung dịch bù nước theo đường uống cho trẻ tiêu chảy (Bruttin

và Brussow , 2005)

Liệu pháp này tuyệt đối an toàn cho người và vật nuôi Tuy nhiên phổ hoạt động hẹp hay độ đặc hiệu cao của phage mà yêu cầu cần chẩn đoán chính xác tác nhân lây nhiễm Liệu pháp thực khuẩn thể cũng có nguy cơ làm phát triển tính kháng cao của vi khuẩn nhiễm trùng Giải pháp thay thế cho việc sử dụng toàn bộ thực khuẩn thể là việc chỉ sử dụng protein của thực khuẩn thể, đó là lysins Đây là enzyme có hoạt tính mạnh nhằm tiêu diệt các tế bào vi khuẩn Phát triển sức đề

kháng của vi khuẩn đối với lysins chưa được báo cáo (Fischetti VA et al., 2010)

2.1.5 Bacteriophage lysins

2.1.5.1 Cấu trúc Bacteriophage lysins

Bacteriophage lysin (gọi tắt là lysin) là các enzyme được tạo ra trong quá trình xâm nhiễm của các phage, chúng nhắm đến đích là peptidoglycan vi khuẩn một cách rất đặc hiệu ở giai đoạn cuối cùng trong chu kỳ lây nhiễm và tạo điều kiện cho quá trình giải phóng hạt virus mới khỏi tế bào vi khuẩn (Hanlon GW, 2007) Các enzyme này cũng được biết đến như là phage lysozyme, lysin hay

muralytic/mureolytic enzyme (Martin J et al., 2005) Hiện nay, lysin đang là hướng

nghiên cứu được rất nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm vì chúng có nhiều ưu thế hẳn hơn kháng sinh như phage xâm nhiễm vào vật chủ một cách đặc hiệu và tạo ra lysin do đó các lysin của phage không có tác động xấu lên các hệ vi sinh vật thông thường khác, đặc biệt là các vi sinh vật có lợi

Ngoài ra, có rất ít vi khuẩn có khả năng kháng lại lysin, lysin cũng được sử dụng thành công trên nhiều động vật mô hình để kiểm soát vi khuẩn kháng kháng sinh được phát hiện trên bề mặt niêm mạc mà các mô bị nhiễm vi khuẩn (Hanlon

GW, 2007; Fischetti VA et al., 2010) Tuy vậy nhược điểm chính của lysin là không

thể tác động vào bên trong lớp màng bên ngoài của các vi khuẩn Gram âm do vậy các liệu pháp sử dụng lysin thường chỉ tác động trực tiếp lên các vi khuẩn Gram dương ( Hanlon GW, 2007) Nguyên nhân là do cấu tạo thành tế bào vi khuẩn Gram – dương chủ yếu là thành phần peptidoglycan từ 30%- 95%, hầu như không có lipoid nên lysin có thể xâm nhập vào thành tế bào Còn đối với thành vi khuẩn Gram – âm, thành phần lipoid cao, chiếm tới 20% (Cao Văn Thu, 2008)

Lysins thường bao gồm của một trong bốn vùng phân cắt peptidoglycan (muralytic) và một vung gắn với vách tế bào chủ (Borysowski J, 2006).Tuy nhiên một số lysins bao gồm hai vùng xúc tác như LysK, Phi11 và MV-L của thực khuẩn

thể Staphylococcus aureus (O’Flaherty et al., 2005) Vùng domain đầu N- chứa

vùng xúc tác của các enzyme (như muramidase, glucosaminidase, endopeptidase hoặc amidase), tức là chúng sẽ phân cắt các liên kết chính trong peptidoglycan Vùng domain đầu C- là vùng liên kết đặc hiệu với chất nền (thường là cacbonhydrate) ở vách tế bào chủ vi khuẩn Phản ứng phân cắt cần thiết phải có sự

liên kết giữa vùng gắn của enzyme và vách tế bào vi khuẩn (Fischetti VA et al.,

2010) Nói chung, các nghiên cứu về lysin cho đến nay đều chỉ ra rằng enzyme này

có chứa hai vùng trong cấu trúc bao gồm một vùng xúc tác đầu N- và một vùng đầu C- gắn vào vách thế bào vi khuẩn Các enzyme này được phân loại thành bốn nhóm khác nhau tùy thuộc vào vị trí phân cắt bao gồm (a) N-acetylmuramidases (lysozymes) và (b) N-acetyl-β-D-glucosaminidases (glycosidases) có tác dụng thủy phân các liên kết glycosidic β-1-4 ở đường deoxyribo của vách tế bào, (c) N-

acetylmuramoyl-L-alanine amidases tách những liên kết amide giữa đường và các gốc peptide của vách tế bào vi khuẩn, (d) L-alanoyl-D-glutamate và endopeptidases cắt đạc hiệu các liên kết giữa các peptide khác nhau phân cắt các peptide của

peptidoglycan vách tế bào (Feton M et al., 2010) Vùng đầu gắn C của đa số các

lysin chịu trách nhiệm cho việc gắn enzyme trên cơ chất đặc hiệu của nó trên vách

tế bào vi khuẩn thông qua liên kết không phân cực của các phân tử cacbonhydrat (Loessner MJ, 2002) xúc tác N-terminal Một số nghiên cứu cho rằng sự có mặt của đầu bám C là cần thiết cho hoạt tính cắt của một số endolysin (Zimmer M, 2002; Loessner MJ, 2002; Sass P, 2007), tuy nhiên điều này không phải đúng trong tất cả các trường hợp Một số enzym tăng hoạt động phân cắt khi loại bỏ các vùng bám đầu C Ví dụ, khi LysK được cắt ngắn đến vùng endopeptidase đầu N làm hoạt tính phân giải của nó tăng lên gấp đôi so với enzyme kiểu dại (Horgan M, 2009)

Lysin của phage DNA xâm nhiễm vào vi khuẩn Gram dương thường có kích thước trong khoảng 25-40 kDa trừ PlyC LYSIN ở streptococci là 114kDa Enzyme này rất đặc biệt vì duy nhất chúng bao gồm sản phẩm của 2 gene riêng biệt là chuỗi nặng PlyCA (50-kDa) và chuỗi nhẹ PlyCB (8-kDa) (d’Herelle FH, 1917)

Hình 2.3: (a)Cấu trúc peptidoglycan điển hình của vi khuẩn Gram dương và biểu thị sự phân chia vị trí bám của các loại lysin; (b) Cấu trúc phân tử lysin K

(1) N-acetylmuramidases; (2) N-acetyl-β-D-; (3) N- glucosaminidases acetylmuramoyl-L-alanine amidases; (4) L-alanoyl-D-glutamate endopeptidases and interpeptide bridge-specific endopeptidases Abbreviations: GlcNAc (N-acetyl glucosamine), MurNAc (N-acetyl muramic acid)

2.1.5.2 Đặc tính sinh học của bacteriophage lysins

Lysin phage sử dụng như một enzyme tái tổ hợp nhằm mục đích kháng khuẩn nên nó được đánh giá theo các tiêu chí sau: độc tính,miễn dịch, sự phát triển đề

kháng của vi khuẩn, hiệu quả, quá trình tổng hợp (Fenton M et al., 2010)

Độc tính: thực khuẩn thể chỉ xâm nhiễm vi khuẩn, không lây nhiễm sang các

tế bào động vật có vú Lysin không có khả năng gây độc cho con người và vật nuôi Cho đến nay, điều này được chứng minh bằng cách xử lý tiền lâm sàng thành công với nhiễm khuẩn toàn thân trong mô hình chuột mà không có dấu hiệu của ngộ độc Điều trị bằng lysin, có thể tại chỗ, toàn thân hoặc tiêm tĩnh mạch được quan sát đều không có hại hay bất kì tác dụng phụ nào trong các thử nghiệm in vitro và in vivo

(Loesser MJ et al., 2005)

Miễn dịch: Lysin là một protein, do vậy nó có khả năng đáp ứng miễn dịch

khi tiêm Phản ứng này có thể làm giảm khả năng hoạt động của lysin Khám phá

này được phát hiện bởi các thử nghiệm lâm sàng (Fischetti VA et al., 2008) Khi huyết thanh thỏ hyperimmune được nâng lên so với lysin pneumococccal Cpl-1, kết quả thấy rằng hoạt động lytic trong ống nghiệm đã chậm lại nhưng không bị

chặn, kết quả tương tự cũng được nhìn thấy với B anthracis và S pyogenes lysins (Fischetti VA et al., 2005) Trong cơ thể phân tích cho thấy, năm trong số sáu

trường hợp, những con chuột nhận được ba liều tiêm tĩnh mạch Cpl- 1 dương tính với Immunoglobin G ( IgG), ức chế hoạt động ly giải của enzyme ở mức độ ôn hòa

(Loeffler JM et al., 2003)

Vi khuẩn đề kháng: Việc tìm thấy vi khuẩn kháng lysin là rất khó vì thực

khuẩn thể đã phát triển một cách tự nhiên với tế bào vi khuẩn qua hàng triệu năm mới có thể tạo ra lysin- enzyme cần thiết có việc giải phóng các thế hệ con cháu của

phage (Loesser MJ et al., 2005)

Hiệu quả: Các nghiên cứu in vivo và in vitro đã chứng minh hiệu quả hoạt

động của lysin (Jado I et al., 2003; Becker SC et al., 2008; Loffler JM et al., 2003)

Khi Cpl-1 (lysozyme / muramidase) và Pal (amidase) đã được sử dụng kết hợp, lượng vi khuẩn giảm rõ rệt, ở mức độ lớn hơn so với dùng một loại lysin trong mô hình nhiễm trùng máu ở chuột Trong một nghiên cứu gần đây trong ống nghiệm, lysin LysK của phage tụ cầu khuẩn và lysostaphin đã chứng minh được sức mạnh

kháng khuẩn tổng hợp (Becker SC et al., 2008) Hiệu quả cũng đã được chứng minh

khi kết hợp lysin và kháng sinh trong ống nghiệm Hai enzyme phế cầu khuẩn,

Cpl-1 và LytA đã được sử dụng khi kết hợp với một số thuốc kháng sinh bao gồm penicillin, gentamicin, cefotaxime và moxifloxacin Vì vậy kết luận rằng đa số trong các trường hợp, hoạt động kháng khuẩn của lysin được tăng cường khi sử dụng kết hợp với kháng sinh hoặc với một loại lysin khác

2.1.5.3 Ứng dụng của bacteriophage lysins

 Lysins chống lại các vi khuẩn gây bệnh khác nhau

Staphylococcus aureus và MRSA

S aureus tác nhân gây ra các bệnh nhiễm trùng khác nhau, từ nhiễm trùng da

đến nhiễm trùng máu, viêm nội mạc, viêm màng não, viêm vú bò MRSA là nguyên nhân quan trọng nhất của việc chăm sóc sức khỏe liên quan đến kháng thuốc kháng sinh trên toàn thế giới mà có thể gây tử vong khi nằm viện trong thời gian dài

(Lowy FD et al., 1998; Gruet P et al., 2001) MRSA xuất hiện ngày càng phổ biến

và tăng tỷ lệ mắc phải trong cộng đồng LysK lysin từ thể thực khuẩn K của tụ cầu

khuẩn đã được công bố là có khả năng chống lại chín loài Staphylococcus , kể cả MRSA và VRSA trên đối tượng là người và bò (O’Flaherty S et al., 2005; Horgan

M et al., 2009; Becker SC et al., 2008) Một lysin tụ cầu khuẩn khác là LysH5 được

nghiên cứu là có thể loại bỏ S aureus trong sữa

Một thử nghiệm khác cũng chứng minh Phi11 có tác dụng chống nhiễm trùng thiết bị y tế Các lysin tụ cầu khuẩn đầu tiên được thử nghiệm trên cơ thể chuột nhiễm trùng là MV- L từ MR11 phage Kết quả là loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn lây nhiễm Mặc dù có phản ứng miễn dịch với lysin nhưng hoạt động lytic vẫn diễn ra bình thường

Streptococci

Trong các mô hình chuột bị nhiễm trùng, Cpl-1 kháng khuẩn tốt và ngăn chặn

được các bệnh như viêm tai giữa, viêm nội mạc, viêm màng não do vi khuẩn Các

lysin Pal cũng đã được sử dụng thành công để loại bỏ sự xâm nhiễm của phế cầu

khuẩn pneumonococal ở mũi họng chuột Các nghiên cứu cho thấy rằng Cpl-1 và

Pal lysins có tiềm năng xuất sắc trong công tác phòng chống, kiểm soát và xử lý của niêm mạc và nhiễm trùng phế cầu khuẩn toàn thân PlyC lysin từ thể thực khuẩn C1

của streptococcal có khả năng chống lại các nhóm A, C và E của streptococci Nhóm A streptococci ( GAS) như S pyogenes là một nguyên nhân phổ biến của

viêm họng, viêm khớp (Nelson D et al., 2001)

Theo khảo nghiệm 10 ng PlyC loại bỏ hoàn 107

GAS trong năm giây PlyG S

là một lysin liên cầu khuẩn tái tổ hợp được nghiên cứu và hoạt động chống lại nhóm

A, , C, G và L streptococci PlyG S tiêu diệt vi khuẩn G S gây viêm âm đạo ở phụ nữ mang thai và được sử dụng như một chất tẩy rửa để loại bỏ G S từ trẻ sơ

sinh (Cheng Q et al., 2005) Điều này giúp giảm tỉ lệ viêm màng não và nhiễm trùng

máu ở trẻ sơ sinh Trong một nghiên cứu khác, kỹ thuật đột biến DNA đã được sử dụng

để sản xuất PlyG S đột biến có hoạt lực gấp 28 lần PlyG S hoang dại

Enterococci

Enterococci là loại vi khuẩn cư trú chủ yếu trong hệ đường ruột của động vật

có vú Tuy nhiên khi hệ vi khuẩn đương ruột bị xáo trộn, các vi khuẩn này bắt đầu xâm lấn và gây nhiễm trùng (nhiễm trùng máu, viêm nội mạc, viêm đường tiết

niệu) Phần lớn các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi E faecalis và E faecium, cả hai

đều có xu hướng kháng thuốc kháng sinh vancomycin, làm cho các bệnh nhiễm

trùng rất khó để tiêu diệt (Yong P et al., 2004) Lysin PlyV12 thể thực khuẩn

E faecalis hoạt động lytic mạnh trong ống nghiệm chống lại một loạt các chủng

lâm sàng VRE ((Vancomycin-Resistant Enterococcus) Đây là lysin có phổ rộng,

còn có hoạt lực với Staphylococcus và nhóm A, B và C streptococci

Bacillus anthracis