Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây Trinh nữ hoàng cung - Crinum latifolium L., Amaryllidaceae

89 Hình 3.15: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE... Hình 3.16: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

*****

NGUYỄN HỮU LẠC THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID

VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MIINH

NGUYỄN HỮU LẠC THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID

VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)

Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC

Mã số: 62.73.15.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS VÕ THỊ BẠCH HUỆ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Người cam đoan,

Nguyễn Hữu Lạc Thủy

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH v

DANH MỤC BẢNG BIỂU vii

DANH MỤC SƠ ĐỒ vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan thực vật học cây Trinh nữ hoàng cung 3

1.2 Tổng quan hóa học của chi Crinum và cây Trinh nữ hoàng cung 5

1.3 Tổng quan tác dụng sinh học chi Crinum và cây Trinh nữ hoàng cung 14

1.4 Chiết hoạt chất từ dược liệu bằng dung môi CO2 lỏng siêu tới hạn 21

1.5 Các phương pháp nghiên cứu hóa học của cây Trinh nữ hoàng cung 22

1.6 Phương pháp thiết lập chất đối chiếu 24

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Nguyên vật liệu 27

2.2 Trang thiết bị 28

2.3 Phương pháp nghiên cứu 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40

3.1 Quy trình chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid và phân đoạn flavonoid từ cây Trinh nữ hoàng cung 40

3.2 Phân lập hợp chất tinh khiết 46

3.3 Thiết lập chất đối chiếu 69

3.4 Xây dựng phương pháp HPLC, CE, dấu vân tay để định tính và định lượng alcaloid hoặc flavonoid trong lá TNHC 82 3.5 Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm bột lá

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 102

4.1 Các phương pháp chiết xuất hoạt chất từ cây Trinh nữ hoàng cung 102

4.2 Phân lập hợp chất tinh khiết 107

4.3 Thiết lập chất đối chiếu từ cao chiết Trinh nữ hoàng cung 111

4.4 Quy trình định lượng alcaloid và flavonoid từ lá Trinh nữ hoàng cung 112

4.5 Các chỉ tiêu cần thiết của Tiêu chuẩn kiểm nghiệm TNHC 117

KẾT LUẬN

KIẾN NGHỊ

DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHẦN PHỤ LỤC

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á)

J Coupling constant (Hằng số ghép)

(Sắc ký lỏng ghép khối phổ)

(Chất đối chiếu hóa học sơ cấp)

(Chất đối chiếu hóa học thứ cấp)

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Hình vẽ cây TNHC 5

Hình 1.2: Các cấu trúc hóa học của alcaloid khung crinin 6

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học alcaloid khung lycorin (A) và khung tazettin (B) 6

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học khung belladin (C) và cấu trúc khung galanthamin (D) 7 Hình 1.5: Cấu trúc hóa học khung lycorenin (E) và cấu trúc khung cheryllin (F) 7

Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của các flavonoid trong chi Crinum 8

Hình 1.7: Cấu trúc hóa học các hợp chất flavonoid trong cây TNHC 10

Hình 3.1: Hình lá và cụm hoa của cây TNHC (Crinum latifolium L.) 40

Hình 3.2: Hình hoa Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) 40

Hình 3.3: SKĐ các hợp chất phân lập từ các phân đoạn alcaloid 48

Hình 3.4: SKĐ các hợp chất phân lập từ phân đoạn alcaloid AR và flavonoid 48

Hình 3.5: Cấu trúc hóa học và dữ liệu phổ NMR (500 MHz, CDCl3) của (2) 58

Hình 3.6: Cấu trúc hóa học của 6-ethoxyundulatin 58

Hình 3.7: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC crinamidin bằng HPLC 71

Hình 3.8: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC 6-hydroxycrinamidin HPLC 72

Hình 3.9: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC lycorin bằng HPLC 72

Hình 3.10: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC hippadin bằng HPLC 73

Hình 3.11: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC astragalin bằng HPLC 73

Hình 3.12: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC isoquercitrin bằng HPLC 74

Hình 3.13: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu trong quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC 85

Hình 3.14: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu trong quy trình định lượng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC 89

Hình 3.15: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE 92

Hình 3.16: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng

thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp CE 95

Hình 3.17: Sắc ký đồ DVT – SKLM alcaloid TNHC 97

Hình 3.18: Sắc ký đồ DVT – SKLM flavonoid TNHC 98

Hình 4.1: SKĐ alcaloid TNHC bằng HPLC, kỹ thuật rửa giải isocratic 113

Hình 4.2: SKĐ alcaloid TNHC bằng HPLC, kỹ thuật rửa giải gradient 113

Hình 4.3: Điện di đồ so sánh mẫu thử alcaloid phân tích bằng CZE và MEKC 114

Hình 4.4: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong methanol 115

Hình 4.5: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong đệm dinatri tetraborat 25 mM 115

Hình 4.6: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong dung dịch acid H3PO4 115

Hình 4.7: SKĐ so sánh khả năng rửa giải mẫu flavonoid TNHC bằng HPLC với pha động methanol và acetonitril 116

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ khảo sát quy trình chiết hoạt chất từ cây TNHC 29

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ khảo sát chiết hoạt chất từ lá TNHC kết hợp hai phương pháp SFE và phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 70% 32

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết cao cồn, PĐ alcaloid và PĐ flavonoid từ lá TNHC 42

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid từ rễ TNHC 42

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid bột lá kết hợp hai phương pháp chiết 45 Sơ đồ 3.4 Sơ đồ phân lập hợp chất (2) và (3) từ PĐ alcaloid AL-SFE 50

Sơ đồ 3.5 Sơ đồ chiết alcaloid AL-SA hoặc flavonoid FL-SA 82

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Alcaloid của TNHC Crinum latifolium L 11

Bảng 3.1: Hiệu suất chiết (%) hoạt chất bằng phương pháp ngấm kiệt 41

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian lên hiệu suất chiết 43

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của áp suất lên hiệu suất chiết 44

Bảng 3.4: Kết quả tách phân đoạn mẫu AL-SFE và FL-NK bằng VLC 46

Bảng 3.5: Các hợp chất tinh khiết phân lập được từ cao chiết TNHC 47

Bảng 3.6: Kết quả phân lập alcaloid từ phân đoạn ALS1 48

Bảng 3.7: Kết quả triển khai sắc ký cột với chất hấp phụ pha đảo 49

Bảng 3.8: Kết quả phân lập (2) và (3) từ PĐ n–hexan 49

Bảng 3.9: Kết quả phân lập các (8), (9), (10) từ PĐ alcaloid AL-NK 51

Bảng 3.10: Dữ liệu phổ NMR (Máy 500 MHz, CDCl3) của hợp chất (2) 56

Bảng 3.11: Các tương tác proton trên phổ COSY, HMBC của hợp chất (2) 57

Bảng 3.12: Kết quả độ tinh khiết; hàm ẩm bằng phân tích nhiệt trọng lượng 69

Bảng 3.13: Thành phần pha động và bước sóng phát hiện của quy trình xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu CĐC bằng phương pháp HPLC 70

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC 70

Bảng 3.15: Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các CĐC bằng HPLC 74

Bảng 3.16: Dữ liệu phổ UV-Vis, MS và điểm chảy của các CĐC 75

Bảng 3.17: Dữ liệu phổ IR của các CĐC 75

Bảng 3.18: Kết quả đánh giá đồng nhất lô của các CĐC sau khi đóng gói 77

Bảng 3.19: Kết quả phân tích robust A của CĐC crinamidin 79

Bảng 3.20: Kết quả phân tích robust A của CĐC 6-hydroxycrinamidin 79

Bảng 3.21: Kết quả phân tích robust A của CĐC hippadin 80

Bảng 3.22: Kết quả phân tích robust A của CĐC lycorin 80

Bảng 3.23: Kết quả phân tích robust A của CĐC astragalin 81

Bảng 3.24: Kết quả phân tích robust A của CĐC isoquercitrin 81

Bảng 3.25: Kết quả xác định giá trị ấn định và giá trị công bố các CĐC 81

Bảng 3.26: Chương trình dung môi định lượng 6 alcaloid bằng HPLC 83

Bảng 3.27: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình định lượng đồng

thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6) 83

Bảng 3.28: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trong quy trình định lượng đồng

thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6) 86

Bảng 3.29: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng đồng thời 6

alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9) 87

Bảng 3.30: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình đinh lượng đồng

thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6) 88

Bảng 3.31: Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định lượng đồng thời

astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng HPLC (n = 6) 90

Bảng 3.32: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng đồng thời astragalin

và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9) 90

Bảng 3.33: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình định lượng đồng thời 6

alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 6) 91

Bảng 3.34: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trong quy trình định lượng đồng

thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 6) 93

Bảng 3.35: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng đồng thời 6

alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 9) 93

Bảng 3.36: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình định lượng đồng

thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng CE (n = 6) 94

Bảng 3.37: Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định lượng đồng thời

astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng CE (n = 6) 96

Bảng 3.38: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng đồng thời astragalin

và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 9) 96

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L – Amaryllidaceae) là dược liệu đang

được sử dụng phổ biến như thực phẩm chức năng hoặc dưới các dạng bào chế thuốc

cổ truyền và thuốc hiện đại

Công dụng được quan tâm và đã được thử nghiệm lâm sàng như điều trị u xơ tử cung,

u phì đại lành tính tuyến tiền liệt được cho là do tác dụng của thành phần alcaloid trong cây với các chế phẩm như Crila, Tadimax [16], [26]

Kế đến là công dụng kháng viêm, chống oxi hóa in vitro do nhóm flavonoid cũng đã

được nghiên cứu [16], [95]

Tuy nhiên, các nhà khoa học kỳ vọng vào tác dụng kháng khối u của loài này Cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng kháng ung thư từ cao toàn phần như: cao ethanol (có thành phần alcaloid) làm chậm sự phát triển khối u gây ra bởi tế bào Sarcoma TG 180 [11]; cao methanol ức chế NF-κB [103]; cao chiết nước kích thích sự sinh sản và hoạt hóa tế bào lympho T [139]; khả năng ức chế sự phát

triển của tế bào ung thư và hồi phục chức năng miễn dịch (in vitro) của cao chiết nước

là tác dụng đáng chú ý khi giải thích tính kháng ung thư của loài Crinum latifolium

[31], [95], [139] Các hợp chất alcaloid tinh khiết được phân lập từ Trinh nữ hoàng cung (TNHC) như lycorin, pratorimin, undulatin, crinafolin và crinafolidin đã được thực nghiệm chứng minh là có khả năng ngăn chặn chọn lọc sự phát triển của các tế bào ung thư thực nghiệm

Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của TNHC được nhiều tác giả quan tâm và rất nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố về hai lĩnh vực này – cho đến năm

2013, có khoảng 30 công trình công bố dưới dạng bài báo khoa học Tuy nhiên các nghiên cứu về lĩnh vực kiểm nghiệm thì hạn chế hơn (khoảng 6 công trình): phương pháp quang phổ định lượng alcaloid toàn phần [22]; phương pháp GC định danh thành phần alcaloid [11], [106]; phương pháp HPLC định lượng alcaloid dựa trên 1 chất đối chiếu [12], [24], [27] Chưa có nghiên cứu ứng dụng phương pháp CE và cũng chưa

có công trình công bố việc định lượng đồng thời một số alcaloid hay flavonoid trong

lá TNHC

Dược điển Việt Nam IV chưa có chuyên luận cây TNHC Do đó, vấn đề quản lý và đảm bảo chất lượng của nguyên liệu và các chế phẩm có thành phần TNHC vẫn chưa được thực hiện một cách chặt chẽ

Nguyên nhân chủ yếu là do thành phần hóa học của dược liệu vẫn chưa được nghiên cứu toàn diện; chất đánh dấu trong nguyên liệu chưa được xác định và hoàn toàn chưa

có bất kỳ chất đối chiếu có nguồn gốc từ dược liệu này được phân phối trên thị trường Với mong muốn góp phần giải quyết các bất cập hiện tại và góp phần vào công tác

“Đảm bảo chất lượng” cho dược liệu Trinh nữ hoàng cung, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu

và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid

cho cây Trinh nữ hoàng cung - Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”

với 4 mục tiêu chính như sau:

1 Chiết xuất cao cồn, các phân đoạn alcaloid, phân đoạn flavonoid và phân lập các hợp chất tinh khiết từ cây Trinh nữ hoàng cung

2 Thiết lập một số chất đối chiếu hóa học có nguồn gốc từ cây Trinh nữ hoàng cung

3 Xây dựng quy trình định tính, định lượng alcaloid và flavonoid trong lá Trinh nữ hoàng cung bằng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản

4 Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Trinh nữ hoàng cung

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

1.1.1 Họ Amaryllidaceae và chi Crinum

Họ Amaryllidaceae có tên gọi theo đa số tài liệu của các nhà thực vật học Việt nam

Crinum thuộc họ Thủy tiên theo hệ thống phân loại ngành thực vật hạt kín của A L

Takhtajan công bố năm 1987 và đã sửa đổi năm 2009 [4], [36] như sau:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Hành (Liliopsida)

Phân lớp Hành (Liliidae)

Liên bộ hành (Lilianae)

Bộ Thủy tiên (Amaryllidales)

Họ Thủy tiên (Amaryllidaceae)

Chi Crinum L

Đặc điểm hình thái của họ Thủy tiên: thân cỏ, sống nhiều năm nhờ hành hay thân rễ

Lá mọc từ gốc, mỏng hay mọng nước, gân lá song song Đối với chi Crinum, các bẹ

lá hợp thành thân giả cao 10-15 cm Cụm hoa dạng chùm, tán, ít hay nhiều hoa và có một mo bao lại Trục cụm hoa dài mọc từ mặt đất Hoa đều, lưỡng tính, 5 vòng, mẫu

3 Bao hoa: 6 phiến cùng màu dạng cánh hoa, dính thành ống dài, ít khi rời Vài loại

có tràng phụ Bộ nhị: 6 nhị đính trên 2 vòng Chỉ nhị rời hay dính nhau Bao phấn thẳng hay lắc lư Bộ nhụy: 3 lá noãn tạo thành bầu dưới 3 ô, mỗi ô chứa nhiều noãn, đính noãn trung trụ; 1 vòi nhụy, đầu nhụy chia 3 thùy Quả: thông thường là nang nứt lưng Hạt có nội nhũ [5]

Chi Crinum có khoảng 130 loài ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và vùng nóng

Ở Việt Nam, chi Crinum có 6 loài được trồng làm cảnh và làm thuốc: Crinum amabile Donn., Crinum asiaticum L., Crinum defixum Ker Gawl., Crinum giganteum Andr.,

Crinum latifolium L., Crinum moorei Hook F [4]

1.1.2 Cây Trinh Nữ Hoàng Cung (TNHC)

Tên khoa học: Crinum latifolium L

Tên thông thường: Trinh Nữ Hoàng Cung [11], Hoàng Cung Trinh Nữ [17], Tỏi lơi

lá rộng [1], [4], Náng lá rộng [4], [7], [9]

Đặc điểm hình thái: được nhiều nhà thực vật học Việt nam mô tả rất chi tiết [1], [4],

[5], [7], [11], [14], [17], [21] Tài liệu [7] phù hợp với hầu hết các tài liệu khác: cỏ nhiều năm; thân hành, hình cầu, phía ngoài có áo mỏng, phía trên có thân giả ngắn

màu xanh nhạt, nạc, mặt trên hơi lõm xuống thành hình máng, mép lượn sóng, gân giữa lồi lên ở mặt dưới, gân bên song song, chóp nhọn, gốc dạng bẹ Cụm hoa tán, có 10-20 hoa; cuống cụm dài 60-90 cm, chiều ngang 1,5-2,0 cm, màu xanh, gốc tím nhạt

tính, màu tím hồng, đứng thẳng; cuống hoa ngắn Bao hoa dài 15-20 cm, 6 mảnh, dạng tràng, phần dưới dính nhau thành ống dài 9-10 cm, thẳng đứng hoặc cong lên, phần trên 6 thùy, hình mũi giáo, giữa lưng có 1 dải màu tím hồng, đậm hơn, nhạt dần

ra phía mép, chóp nhọn ngắn, có mũi màu hồng Nhị 6, rời nhau; chỉ nhị dài 6-7 cm,

dạng sợi, màu trắng, thẳng đứng hoặc choãi ra, đính ở họng ống bao hoa; bao phấn

màu vàng, dài 1,2-1,8 cm, 2 ô, hình dải, đính lưng, hướng trong, mở bằng khe dọc Bầu hạ, hình thoi, 3 ô, mỗi ô 5-6 noãn; vòi nhụy dài 15-18 cm, dạng sợi, dài, mảnh, phía trên màu tím thẫm nhạt dần xuống phía dưới; đầu nhụy nhỏ, dạng cầu Quả nang, hình cầu, đường kính 4-5 cm

Tài liệu [17] mô tả bộ nhị của TNHC có màu đỏ, trong khi các tài liệu khác [7], [11]

mô tả bộ phận này có màu trắng Các tài liệu còn lại đều không đề cập chi tiết này

Phân bố - Sinh thái: cây TNHC được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Thái lan, Trung Quốc,

Indonexia, Philippin, Campuchia, Lào Ở Việt Nam, cây được trồng chủ yếu ở các tỉnh từ Quảng Nam-Đà Nẵng trở vào Mùa hoa quả: tháng 8-9 Là loại cây ưa ẩm, sáng hoặc một phần bóng mát Sinh trưởng và phát triển ở khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới Mỗi năm cây cho 6-8 lá mới và đẻ thêm 3-5 hành con Cây ra hoa hàng năm vào khoảng tháng 6-8 Bộ phận dùng chủ yếu là lá và thân hành [1]

Cây TNHC đã được nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp cấy mô [20]

Hình 1.1: Hình vẽ cây TNHC: 1 Cây với thân hành và lá 2 Cụm hoa;

3 Một phần bao hoa và bộ nhị; 4 Bộ nhụy “Nguồn: Nguyễn Thị Đỏ, 2007” [7]

Năm 2012, một thứ mới của loài TNHC do nhóm tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm,

Trần Công Khánh xác định trong quần thể Crinum Việt nam là “Trinh nữ Crila” có tên khoa học Crinum latifolium L var Crilae Tram & Khanh, var n [32]

1.2 TỔNG QUAN HÓA HỌC CỦA CHI CRINUM VÀ CÂY TNHC

Thành phần hóa học của các loài trong chi Crinum được nghiên cứu từ năm 1950

Nhóm hợp chất chính là alcaloid, kế đến là nhóm non-alcaloid, trong đó đặc biệt là các hợp chất phenolic [116]

Chi Crinum được xem là đại diện cho họ Amaryllidaceae do thành phần hóa học có

hầu hết các hợp chất của các chi khác trong họ Khoảng 180 alcaloid thuộc nhiều nhóm cấu trúc khác nhau được phân lập và định danh Phần lớn chúng thuộc các khung alcaloid crinin (5,10 b-enthanophenanthridin), lycorin (benzopyrano-(3,4 g)-indol) và tazettin (2-benzopyrano-(3,4 c)-indol) [116]

Khoảng 100 các hợp chất non-alcaloid được phân lập và định danh, chúng thuộc các nhóm flavonoid, chromon, coumarin, terpenoid, steroid, ionon, alcohol, aldehyd, ceton, acid, ester và hydrocarbon mạch dài Phenolic là nhóm chiếm ưu thế trong nhóm hợp chất non-alcaloid [107], [116]

Thân hành là bộ phận được nghiên cứu nhiều nhất, các hợp chất alcaloid và flavonoid

1.2.1 Thành phần hóa học của các loài trong chi Crinum

1.2.1.1 Alcaloid của chi Crinum

Alcaloid khung crinin: đây là nhóm đại diện cho alcaloid Crinum do phần lớn các

alcaloid đều thuộc khung này với hơn 80 alcaloid đã được phân lập Cấu trúc các alcaloid khung này thay đổi theo 3 cấu trúc sau [107], [116]:

Hình 1.2: Các cấu trúc hóa học của alcaloid khung crinin

Alcaloid khung lycorin: lycorin là nhóm được xếp thứ hai sau nhóm crinin về số

lượng alcaloid với khoảng 40 alcaloid đã được phân lập Đại diện lycorin, được tìm

thấy trong 30 loài Crinum Kế đến là hippadin, pratorimin và pratorinin [107], [116]

Alcaloid khung tazettin: khoảng 13 alcaloid thuộc khung này, đại diện là tazettin và

criwellin được tìm thấy trong 6-7 loài Crinum Cấu trúc các alcaloid khung tazettin

O O

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học alcaloid khung lycorin (A) và khung tazettin (B)

Alcaloid kiểu khung belladin: 7 alcaloid đã được tìm thấy, đại diện là belladin [57],

latisodin và latisolin [55] được phân lập từ C asiaticum và C latifolium

Alcaloid khung galanthamin: galanthamin là alcaloid đại diện cho khung này, được

tìm thấy trong thân hành của 8 loài Crinum Các alcaloid còn lại (khoảng 7 alcaloid)

có cấu trúc thay đổi theo khung Galanthamin

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học khung belladin (C) và cấu trúc khung galanthamin (D)

Alcaloid khung lycorenin: các alcaloid có cấu trúc thay đổi ở các vị trí R1, R2, R3, R4 Riêng hippeastrin có cấu trúc vòng methylendioxy ở vị trí R1 và R2

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học khung lycorenin (E) và cấu trúc khung cheryllin (F)

Các kiểu khung còn lại có ít số lượng alcaloid hơn:

Alcaloid khung narciclasin: crinasiadin - C14H9NO3, crinasiatin - C22H17NO4 và

Alcaloid khung cheryllin: cheryllin - C17H19NO3 và latifin - C17H19NO3

Alcaloid khung phenanthridin: trisphaeridin - C14H9NO2 và methylendioxyphenanthridin

3-hydroxy-8,9-Alcaloid khung augustamin: augustamin - C17H19NO4.

Alcaloid khung latindin: latindin - C41H31N3O10

1.2.1.2 Các nhóm hợp chất non-alcaloid trong chi Crinum

Khoảng 100 hợp chất đã được định danh, flavonoid là nhóm được công bố với số hợp chất được phân lập nhiều nhất [107], [116]

Nhóm flavonoid: 24 flavonoid đã được phân lập từ thân hành và hoa Hai flavonoid

3’4’-dihydroxyflavan và 7-hydroxy-8-methoxyflavanon được phân lập từ Crinum

latifolium, lần đầu tiên tìm thấy trong họ Amaryllidaceae [104] Isoliquiritigenin

(2’,4,4’-trihydroxychalcon) từ C bulbispermum là cấu trúc chalcon đầu tiên được tìm thấy trong chi Crinum [112]

Flavonoid trong chi Crinum có cấu trúc thuộc các nhóm sau:

Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của các flavonoid trong chi Crinum

Nhóm coumarin: chỉ mới được tìm thấy trong loài C latifolium [104], hai hợp chất

Nhóm terpenoid và sterol: các steroid thực vật như stigmasterol, sitosterol,

dihydrositosterol đã được tìm thấy trong vài loài của chi Crinum

Nhóm acid béo: hơn 20 acid béo như linoleic, palmitic, arachidic, myristic, oleic,

palmitic, stearic… được định danh từ dịch chiết nước

R 3

O

R 1

Nhóm carbohydrat: gồm resin, pectin, hemicellulose, glucan và polysaccharid Thân

hành loài C amabile chứa 5,4% saccharid; 8,7% pectin, 8,2% hemicellulose Glucan

A và B từ loài C latifolium, glucan A chứa 12 đơn vị glucose và 110 gốc của glucose

Glucose, arabinose, xylose, galacturonic và glucuronic acid được phân lập từ dịch

chiết nước của thân hành loài C bulbispermum

1.2.2 Thành phần hóa học của TNHC - Crinum latifolium L

- Thành phần hóa học loài C latifolium khảo sát từ năm 1982 do nhóm tác giả nước

ngoài như Ghosal S [53], [55], [56], [57], [58], [59], [60], [61], [62], Kobayashi S [83], [84] thực hiện

- Những nghiên cứu ở Việt Nam về thành phần hóa học của loài này phải kể đến các công trình của các tác giả Phan Tống Sơn [9], Nguyễn Công Hào [8], [33], [102], Nguyễn Hải Nam [103], [104], Võ Thị Bạch Huệ [11], [12], [13], [14]

- Tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm với các công trình nghiên cứu chủ yếu về tác dụng sinh học [31], [106], [107], [139]

Alcaloid của TNHC: đến nay đã có 36 alcaloid được phân lập và định danh, phần lớn

thuộc khung crinin và lycorin (Bảng 1.1)

- Thành phần và hàm lượng alcaloid thay đổi đáng kể theo thời kỳ sinh trưởng, thời

kỳ trước và sau khi cây ra hoa [58], [62], [106]

- Đã có 12 alcaloid được phân lập từ TNHC trồng ở Việt nam, tài liệu [9] công bố nhiều nhất với 12 alcaloid từ dịch chiết lá và thân hành Alcaloid thuộc khung crinin chiếm số lượng nhiều nhất, gồm 7 alcaloid: 6-hydroxybuphanidrin [9], ambellin [8], [9], [11]; crinin [8], [9]; powellin [9]; crinamidin [8], [9], [11]; 6-hydroxycrinamidin [8], [9], [11], [102]; 6-hydroxyundulatin [9]; khung lycorin có pratorinin [9], lycorin [8], [9]; hippadin [9], lycorin-1-OAc [9], khung augustamin có augustamin [9], [11] -Tài liệu [11] công bố 4 alcaloid từ dịch chiết lá, trong đó 6-hydroxycrinamidin là hợp chất alcaloid tự nhiên lần đầu tiên được công bố (năm 1998)

Nhóm carbohydrat: glucan A và B [60]; lectin (methyl-α-mannopyranosid) đều được

phân lập từ dịch chiết thân hành [78]

Coumarin: từ dịch chiết methanol, tài liệu [104] công bố hợp chất coumarin

4-senecioyloxymethyl-6,7-dimethoxycoumarin Hiện tại thành phần này chưa được

phát hiện trong các loài Crinum khác

Nhóm acid hữu cơ: para-hydroxycinnamic methyl ester và 2,5-dihydroxycinnamic

ethyl ester từ dịch chiết lá tươi [33]

Flavonoid của TNHC: so với nhóm alcaloid thì flavonoid có số lượng các hợp chất

được công bố ít hơn, gồm 8 flavonoid sau [33], [103], [104]:

O

OH OH

O

OH OH

OMe

O

OH OH

OCH=CH 2

O

OMe OMe

OH

O OH OH

O

OH OMe

Bảng 1.1: Alcaloid của TNHC Crinum latifolium L

1 11-O-acetylambellin [54] C20H23NO6 OMe H OMe OAc

3 Ambellin [9],[11],[57],[92],[100],[126] C18H21NO5 OMe H OMe OH

6 Crinafolin [61] C18H21NO6 OMe OH OMe OH

8 Crinin [9], [58], [83] C16H17NO3 OMe H H H

13 Powellin [9], [84] C17H19NO4 OH H OMe H

16 6-hydroxybuphanidrin [9], [100] C18H21NO5 OMe OH OMe H

2 11-O-Acetyl-1,2-β-epoxyambellin [54] C20H23NO6 OMe H OMe OAc

4 1,2-β-epoxyambellin [57], [56] C18H21NO6 OMe H OMe OH

11 Undulatin [84],[92], [100], [130], [129] C18H21NO5 OMe H OMe H

12 6-hydroxyundulatin [9], [92] C18H21NO6 OMe OH OMe H

R 2

H

N O

O

OH OH

OH

N

R4O MeO

R 3

R 1 O

R2

O O

O

CH3

OH

O O

N O

O

O OH

O

O N

O OH

N

1.3 TỔNG QUAN TÁC DỤNG SINH HỌC CHI CRINUM VÀ TNHC

1.3.1 Tác dụng sinh học của một số loài trong chi Crinum

Các loài trong chi Crinum được quan tâm do có nhiều tác dụng sinh học Nhóm được

chú ý nhiều nhất là alcaloid [52], [58], [107], [116], kế đến là flavonoid [31], [103]

- Trước đây, các loài này được sử dụng như thuốc cổ truyền:

Thân hành và lá tươi của các loài C amabile, C asiaticum, C defixum, C giganteum điều trị các chứng mụn nhọt, sưng lở, sưng do viêm [4], [21], [58]

Cao cồn và cao nước chiết từ thân hành của loài C zeylanicum được sử dụng như vị

thuốc cổ truyền trong điều trị các chứng viêm, vết thương mưng mủ, trị rắn cắn Dịch

ép từ lá tươi dùng để trị chứng đau tai [107], [125]

- Các công trình khoa học cho thấy các loài trong chi Crinum thể hiện hoạt tính sinh

học chung của họ Amaryllidaceae [52], [107], [116] như sau:

1.3.1.1 Tác dụng kháng acetylcholinesterase:

- Thử nghiệm sàng lọc khả năng kháng acetylcholinesterase bằng phương pháp

SKLM, chất đối chiếu galantamin trên 15 mẫu cao methanol từ thân hành của 15 loài

trong họ Amaryllidaceae Kết quả cho thấy cao chiết C powellii và Amaryllis

belladonna ở nồng độ 10 mg/ml thể hiện hoạt tính cao nhất [117]

- Cao thân hành của loài C bulbispermum có khả năng kháng acetylcholinesterase với IC50 = 0,14 ± 0,039 µg/ml và C moorei với IC50 = 21,5 ± 8,40 µg/ml Hoạt tính

này được giải thích là do thành phần alcaloid [34], [51]

- Cao methanol từ thân hành của loài C jagus (45,1%) và C glaucum (40,8%) ở nồng

độ 100 µg/ml Tính kháng acetylcholinesterase có liên quan đến sự hiện diện của nhóm hydroxy trong cấu trúc của alcaloid [66]

1.3.1.2 Tác dụng chống oxi hóa:

- Liều 200 mg/kg, cao ethanol của loài C asiaticum làm giảm lượng đường trong

máu, giảm cholesterol, triglycerid được quan sát sau 15 ngày điều trị Đồng thời, các chỉ số men gan đều giảm chứng tỏ cao chiết có thể bảo vệ tế bào gan theo cơ chế chống oxi hóa trên mô gan của chuột bị tiểu đường [71]

- Cao methanol C moorei chống oxi hóa với EC50 = 5,06 ± 1,54 (µg/ml) tương đương

với vitamin C EC50 = 5,06 ± 0,2 (µg/ml) [51]

- Cao ethanol C defixum có 79,01% hoạt tính chống oxi hóa so với vitamin C là

82,71% và quercetin 85,19% cùng liều thử nghiệm (25 µg/ml) [94]

- Cao chiết từ C jagus nồng độ 50 μg/ml có % chống oxi hóa là 81,47 ± 0,3 trong khi

Vitamin C 74,1 ± 0,1 [108]

- Hỗn hợp các alcaloid như haemanthamin, crinamin, lycorin, hamayne được chứng minh có hoạt tính kháng oxi hóa cao hơn khi khảo sát riêng lẻ và thấp hơn so với cao ethanol toàn phần ban đầu [110]

- Cao nước C bulbispermum có chỉ số kháng oxi hóa là 42,08 ± 2,25 so với chất đối

chứng dương butylated hydroxy toluen 77,22 ± 1,27 (0,1 mg/ml) [113]

Các tác giả đều cho rằng hoạt tính chống oxi hóa là do vai trò của nhóm flavonoid và tanin có trong cây

1.3.1.3 Tác dụng kháng viêm:

Các thử nghiệm đều thực hiện trên động vật là chuột, mẫu thử là cao chiết nước hoặc methanol từ thân hành

- Hoạt tính kháng viêm theo các cơ chế khác nhau: cao methanol C asiaticum theo

cơ chế kháng histamin ở liều 50 mg/kg khi thực nghiệm trên chuột; cao C moorei

kháng enzym COX-1 (IC50 = 99,2 ± 0,96) và COX-2 (IC50 = 75,5 ± 1,5) [51]

- Hoạt tính kháng viêm của cao nước từ thân hành C giganteum liều 200 mg/kg tương

đương với diclofenac liều 5 mg/kg [77]

- Cao chiết nước C glaucum liều 400 mg/kg ức chế 60,78% cơn dị ứng phế quản trên

chuột thử nghiệm, chất đối chứng natri cromoglycat là 70,41% (50 mg/kg) [109]

1.3.1.4 Tác dụng giảm đau:

Cao nước chiết từ thân hành cùa loài C bulbispermum thể hiện khả năng giảm đau theo cơ chế giảm đau opioid [113], C giganteum liều uống 200 mg/kg ức chế cơn đau khi so sánh với aspirin [77]; phân đoạn alcaloid của loài C augustum thể hiện

1.3.2 Tác dụng sinh học và công dụng của TNHC (Crinum latifolium L.)

Dân gian sử dụng TNHC như thuốc cổ truyền: thân hành hoặc lá TNHC được xào nóng hoặc giã đắp bên ngoài trong điều trị đau khớp, mụn nhọt, áp xe mưng mủ [1] Dịch ép từ lá làm thuốc trị đau tai [52] Dịch chiết nước được sử dụng để chữa ung thư vú, ung thư tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư hầu họng, chữa bệnh đường tiêu hóa, trị viêm họng [1], [4]

Rất nhiều công trình khoa học công bố về hoạt tính sinh học của loài này trên cả in

vitro và in vivo Phần lớn các công trình do tác giả Việt Nam hoặc phối hợp với tác

giả nước ngoài, được thực hiện trên cao chiết từ lá TNHC và các sản phẩm có TNHC

Các tác dụng được công bố là tính kháng khối u, kháng viêm, kháng oxi hóa và kích

thích miễn dịch

Các công trình nghiên cứu tác dụng sinh học của TNHC như sau:

- Cao methanol chiết từ lá ức chế NF-κB, quá trình này liên quan đến tính kháng viêm

và kháng ung thư [103]

- Cao methanol và cao nước chiết từ rễ, thân hành lá và cao alcaloid của TNHC ức

chế sự phân bào trên mô hình Allium Test, độc đối với tế bào trên mô hình Brine

Shrimp Test Kết quả được so sánh với chất đối chứng colchicin [11]

- Trên mô hình gây ung thư thực nghiệm trên chuột bằng cách cấy truyền tế bào ung thư sarcoma TG-180: cao cồn và cao alcaloid ngăn chặn hiệu quả giai đoạn sinh và phát triển của tế bào ung thư [11]

- Cao chiết bằng nước nóng có tác dụng kích thích sự sinh sản của tế bào lympho T

trong thử nghiệm invitro trên bạch cầu đơn nhân to ngoại vi lấy từ máu ngoại vi người Trong thử nghiệm in vivo, tác dụng cũng tương tự: kích thích sự sinh sản và hoạt hóa

tế bào lympho T trong máu ngoại vi chuột [139] Đồng thời cao chiết này cũng ức chế sự phát triển của tế bào sarcoma thực hiện trên chuột [107], hoạt tính kháng oxi

hóa, kháng viêm in vitro [95]

- Ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và hồi phục chức năng miễn dịch in vitro

là hai hiệu quả đáng chú ý khi giải thích tính kháng ung thư của cao chiết từ lá Crinum

latifolium [95]

- Bệnh viện hữu nghị Việt Xô đã điều trị cho 158 bệnh nhân bị u tuyến tiền liệt và u

xơ tử cung từ dịch chiết lá TNHC, trên 60% bệnh nhân được chữa khỏi [16]

- Sản phẩm Crillin T chứa thành phần alcaloid và flavonoid của TNHC được thử nghiệm trên tế bào lympho người bình thường và bệnh nhân ung thư vòm mũi họng

bị suy giảm miễn dịch Kết quả cho thấy số lượng tế bào lympho T tăng gần với nhóm

sử dụng levamisol hoặc mạnh hơn levamisol khi thử trên tế bào lympho bệnh nhân

đã có suy giảm miễn dịch [31]

- Sản phẩm Panacrin có thành phần TNHC và một số dược liệu khác được nghiên cứu lâm sàng về tác dụng bổ dưỡng (tăng lực, tăng trọng, tăng tính vận động trên chuột suy dinh dưỡng); chế phẩm có độ an toàn cao [25] Sử dụng Panacrin trong hỗ trợ điều trị ung thư dạ dày sau phẫu thuật cho hiệu quả rõ rệt: các chỉ tiêu về trọng lượng

cơ thể, huyết học có sự khác biệt có ý nghĩa giữa nhóm chứng và nhóm nghiên cứu, thuốc được dung nạp tốt [18]

- Viên nang TNHC tác dụng điều trị rối loạn tiểu tiện ở bệnh nhân phì đại lành tính tuyến tiền liệt, kết quả đạt trên 96% Thuốc không gây biến đổi chỉ số sinh lý, huyết học, hóa sinh, chức năng gan, thận, tuần hoàn, máu cũng như chưa gây tác dụng không mong muốn ở hệ tiêu hóa, thần kinh trung ương và thần kinh thực vật [19]

- Viên Tadimax có thành phần chính là cao chiết từ lá TNHC và một số dược liệu khác cải thiện rối loạn tiểu tiện của chứng phì đại lành tính tuyến tiền liệt Thử lâm sàng so sánh với Tadenan trên 157 bệnh nhân: đáp ứng tốt 42%, khá 48% Thuốc tác dụng phụ trên hệ tiêu hóa, mẫn ngứa, chóng mặt (10%) Các biến đổi về tim mạch, huyết học, sinh hóa sau 2 tháng điều trị đều trong giới hạn bình thường [26]

- Crilin T là sản phẩm mới từ TNHC có tác dụng tăng cường miễn dịch tương đương levamisol hay mạnh hơn levamisol Thành phần của Crilin T bao gồm các alcaloid và flavonoid của Trinh nữ Crila Nghiên cứu được tiến hành trực tiếp trên các tế bào lympho tách từ người bình thường về lâm sàng và từ các bệnh nhân ung thư vòm mũi

họng và nuôi cấy in vitro 48 giờ Đáp ứng với mẫu thử nghiệm của tế bào lympho bị

suy giảm miễn dịch mạnh hơn đáp ứng của tế bào lympho người bình thường [31]

Tác dụng sinh học của một vài hợp chất tinh khiết được phân lập từ TNHC:

Các hợp chất alcaloid:

Alcaloid kiểu khung crinin:

- Các thử nghiệm sàng lọc sinh học chứng tỏ crinamin và haemanthamin có hiệu quả trong thử nghiệm gây chết tế bào ung thư theo chương trình ở nồng độ µM Cầu nối

α ở vị trí C-2 và nhóm –OH tự do ở C-11 là những vị trí đóng vai trò quan trọng trong tác dụng dược lý này [96]

- Pratorimin và undulatin kháng lại sự phát triển của các tế bào gây ung thư phổi trên

chuột thực nghiệm [58]

- Crinafolin và crinafolidin: hoạt tính kháng khối u, làm giảm sự tăng trưởng của tế

bào u báng S-180 trên thử nghiệm in vivo trên chuột [61]

- Lycorin, crinamin và 6-hydroxycrinamin tách từ thân hành loài C delagoense chống

lại tế bào ung thư BL-6 trên chuột [101]

- Crinin và 6-hydroxybuphanidrin kháng sự tăng sinh tế bào, hiệu quả trong việc chống lại sự tăng sinh dòng tế bào ung thư người HL-60 và MDA-MB-23 [38]

- Các alcaloid crinin, 6-hydroxybuphanidrin và 6-ethoxybuphanidrin chống lại sự tăng sinh trên các dòng ung thư người [123]

Alcaloid kiểu khung lycorin:

Đại diện là lycorin, alcaloid được tìm thấy trong rất nhiều loài của họ Amaryllidaceae Nhiều công trình nghiên cứu hoạt tính của lycorin cho thấy alcaloid này có nhiều tác dụng như kháng acetylcholineseterase, kháng ung thư, kháng viêm, kháng oxi hóa:

- Lycorin hydroclorid ngăn chặn một cách chọn lọc và đồng thời sự phát triển của tế bào ung thư buồng trứng (dòng Hey1B) Kết quả nghiên cứu này hứa hẹn một liệu pháp điều trị ung thư mới [39]

- Ức chế sinh tổng hợp protein và DNA trong tế bào chuột, kiềm hãm sự tăng trưởng

in vivo của khối u, làm giảm khả năng sống của tế bào ung thư [58]

- Với các dòng tế bào ung thư như Hep-G2 (ung thư gan), FI (ung thư màng tử cung),

RD (ung thư màng tim), lycorin đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào với IC50 là

0,15 µg/ml Các nhóm hydroxy ở vị trí C1 và C2 đóng vai trò quan trọng đối với hoạt

tính này vì các hợp chất 1,2-di-O-acetyllycorin và lycorin-1,2-di-O-β-D-glucosid

không còn hoạt tính [9]

- Hoạt tính kháng acetylcholineseterase in vitro được xác định bằng phương pháp

quang phổ với thuốc thử Ellman, IC50 = 29,3 ± 3,15 (μg/ml), chất đối chứng physostigmin IC = 1,51 μg/ml [49]

- Lycorin cũng can thiệp vào sự tổng hợp acid ascorbic ở chuột thử nghiệm, chuột bị xuất huyết dưới da khi tiêm lycorin liên tiếp trong 10 ngày với liều 10 µg/g Hiện tượng này mất đi nếu tiêm bổ sung acid ascorbic [46]

- Hoạt tính kháng viêm, giảm đau, bảo vệ gan của lycorin được thử nghiệm trên chuột Kết quả khảo sát cho thấy % hoạt tính giảm đau ở nồng độ 1 mg/kg là 11,30 ± 2,61 (%), so với morphin 10 mg/kg 51,91 ± 10,57 (%)

- Hoạt tính bảo vệ tế bào gan nồng độ 2 mg/kg với các thông số ALT và AST (U/l) lần lượt là 348,0 ± 204,4 và 390,0 ± 131,6; so sánh với carbon teatrclorid 0,8 mg/kg lần lượt là 959,4 ± 152,1 và 1931,9 ± 303,6 [43], [76]

- Tác dụng kháng sinh tổng hợp tế bào eukaryotic [74], kháng ký sinh trùng sốt rét [80], kháng virus [52]

chuột, chất đối chứng là silymarin [69], [70]

- Hippadin tác động giảm khả năng thụ thai trên chuột khi tác động ức chế thuận nghịch trên tế bào mầm của chuột cống đực ở giai đoạn trước khi sinh tinh [53]

- 1,2-β-epoxy ambellin liều 5 µg/ml chất này có tác dụng điều hòa lympho bào lá lách chuột Hỗn hợp của ambellin và 1,2-β-epoxyambellin chống phân bào được so sánh

với chất đối chiếu concavalin [56]

- Hippadin và 6α-hydroxybuphanisin gây độc tế bào khi thử nghiệm trên tế bào bạch

cầu T4 [52]

Các hợp chất non-alcaloid:

- Isoquercitrin thể hiện khả năng chống oxi hóa được xác định bằng phương pháp

với % ức chế 54,55 ở nồng độ 1000 µM [138]

- Astragalin thể hiện hoạt tính kháng viêm gây ra bởi lipopolysaccharid trên phổi

chuột bị tổn thương Sáu giờ sau khi tiêm lipopolysaccharid, nồng độ các cytokin như TNF-a, interleukin-1 (IL-1) và interleukin-6 (IL-6) từ trong dịch phổi tăng đột ngột Tuy nhiên, khi chuột được điều trị dự phòng với astragalin (50 – 75 mg/kg) thì các cytokin này giảm một cách tuyến tính theo liều sử dụng [122] Astragalin còn có tác động chống lại gốc tự do gây tán huyết trên tế bào hồng cầu người [41]

- Kaempferol là hợp chất polyphenol chống oxi hóa được tìm thấy trong nhiều loài

thực vật, nhiều nghiên cứu cho thấy kaempferol làm giảm nguy cơ các bệnh mãn tính đặc biệt là ung thư Kaempferol giúp cơ thể chống lại gốc tự do liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư và ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư Ở cấp độ phân

tử, kaempferol được cho là có thể điều chỉnh một số yếu tố quan trọng trong truyền tín hiệu của tế bào liên quan đến quá trình apoptosis, sự hình thành mao mạch, quá trình kháng viêm và sự di căn của tế bào [35]

- 4-senecioyloxymethyl-3,4-dimethoxycoumarin ức chế mạnh dòng tế bào HUVEC

in vitro, tỷ lệ ức chế là 53,5% ở nồng độ 1 µg/ml [104]

- Glucan A và glucan B bảo vệ sự giảm bạch cầu do ảnh hưởng của các tác nhân như

Tween-80 gây ra Kết quả này giải thích việc sử dụng cao chiết toàn phần từ C

latifolium trong việc điều trị rối loạn dị ứng [60]

- Lectin không thể hiện kháng các dòng tế bào ung thư trên người Tuy nhiên thể hiện

tính kháng khuẩn in vitro, kháng lại sự tái tổ hợp poxvirus [79]

- Esculetin gây tăng miễn dịch trên hệ thống đại thực bào và tế bào lympho ở thử

nghiệm in vivo và in vitro trên chuột, đây cũng là cơ chế tác động kháng ung thư của

nhóm hợp chất coumarin nói chung [85]

1.4 CHIẾT CAO TOÀN PHẦN TỪ DƯỢC LIỆU BẰNG DUNG MÔI

CO 2 LỎNG SIÊU TỚI HẠN

- Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy chất tan ra khỏi mô thực vật Tùy mục đích sử dụng và tùy điều kiện trang thiết bị mà lựa chọn kỹ thuật chiết thích hợp Nhưng phải đảm bảo yêu cầu chiết được tối đa hoạt chất và tối thiểu tạp chất Ngoài các kỹ thuật chiết ngấm kiệt hay ngâm, các kỹ thuật chiết siêu âm, vi sóng, chiết với dung môi lỏng siêu tới hạn, chiết áp suất cao đã được phát triển để nâng cao chất lượng và hiệu quả của sản phẩm [30]

- Thử nghiệm so sánh phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm, vi sóng, phương pháp SFE cho thấy chúng đều có hiệu suất chiết cao hơn so với chiết ngấm kiệt [111] Hiện nay đã có những thiết bị chiết xuất qui mô lớn, tuy nhiên việc ứng dụng chưa phổ biến, phần lớn chúng được sử dụng để chuẩn bị mẫu để phân tích bằng các phương pháp SKLM, HPLC [87], [135], CE [136], UPLC [131]

- Chiết xuất bằng dung môi lỏng siêu tới hạn (phương pháp SFE): là phương pháp

chiết bằng các chất lỏng siêu tới hạn đã được ứng dụng thành công trong nhiều lĩnh vực môi trường, dược phẩm, thực phẩm và hợp chất tự nhiên Hiện nay công nghệ này được sử dụng phổ biến để chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học Phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp truyền thống, đặc biệt là sản phẩm chiết không chứa dung môi [37] Nguyên lý cơ bản phương pháp chính là độ hòa tan của các chất cần chiết vào dung môi ở nhiệt độ và áp suất tại đó dung môi ở trạng thái siêu tới hạn [6]

FDA và EFSA công nhận về mức độ thân thiện với môi trường [65] Ở nhiệt độ và

mang đặc tính của cả chất lỏng và chất khí [91], [97], [99], trạng thái vật lý này được

mô tả như một chất lỏng rất lưu động nên còn gọi là lưu chất [6]

- Ứng dụng SFE với dung môi CO2 lỏng đã được ứng dụng để chiết xuất nhiều nhóm hợp chất tự nhiên như tinh dầu [40], lipid [119], phenolic [120], saponin [121], coumarin [118], flavonoid [90], thuốc cổ truyền [75], [137] SFE cũng được sử dụng như phương pháp chiết hay làm sạch thuốc trừ sâu các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu [75], [86]

Ngoài trang thiết bị tốn kém và vận hành phức tạp, nhược điểm lớn nhất của SFE là cần phải thực hiện nhiều khảo sát để tìm các thông số tối ưu áp suất, thời gian, nhiệt

độ, khối lượng mẫu, dung môi hỗ trợ và tỷ lệ dung môi hỗ trợ [23]

- Phần lớn alcaloid tồn tại trong thực vật đều ở dạng muối, đây là trở ngại lớn khi ứng dụng phương pháp SFE để chiết xuất Vì vậy hầu hết các công trình nghiên cứu về chiết xuất alcaloid đều phải sử dụng dung môi hỗ trợ Các dung môi hỗ trợ thông dụng được khảo sát là methanol, ethanol và nước [64], [89], [99], [128]

Các base hữu cơ như methylamin, diethylamin, tetrahydrofural cũng thường được nghiên cứu để tăng khả năng hòa tan của alcaloid dạng base sẽ phù hợp hơn trong chiết alcaloid bằng phương pháp SFE [82]

- Để chiết alcaloid của loài Scopolia japonica cần phải thêm diethylamin mới cải

thiện hiệu suất chiết hyoscyamin và scopolamin [42]

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

1.5.1 Các phương pháp sắc ký ứng dụng phân lập hợp chất tinh khiết

- Hai phương pháp thông dụng được sử dụng để phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao toàn phần là sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng điều chế [8], [9][11], [33], [57], [83], [84]; kết hợp sắc ký lỏng trung áp và sắc ký cột nhanh để tách phân đoạn, các hợp chất tinh khiết từ các phân đoạn được kết tinh lại trong dung môi [9]

Chất hấp phụ thông dụng nhất là silica gel, hoặc Sephadex LH-20 để tách các hợp chất có phân tử lượng lớn [8] Rửa giải bằng hỗn hợp dung môi từ ether dầu hỏa, n–hexan, cloroform, ethyl acetat đến methanol

- Các hợp chất sau khi phân lập được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM, phát hiện bằng ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 và 365 nm, hơi iod và các TT đặc trưng cho

1.5.2 Các phương pháp sắc ký ứng dụng trong định tính và định lượng

Trước khi cây ra hoa: undulatin chiếm hàm lượng cao nhất (19%), đến crinamidin

(14%) Crinamidin, 6-hydroxycrinamidin gia tăng hàm lượng 6-hydroxycrinamidin

và 6-hydroxypowellin không xuất hiện trước khi cây ra hoa

Sau khi cây ra hoa: không xuất hiện buphanidrin và 6-hydroxybuphanidrin, đồng thời

hàm lượng undulatin, 6-hydroxyundulatin giảm đáng kể [106]

1.5.2.2 Phương pháp HPLC:

Định lượng alcaloid: chất đối chiếu 6-hydroxycrinamidin hoặc crinamidin

- Mẫu thử là alcaloid chiết từ lá TNHC được hòa tan HCl 0,1 N; pha động gồm dung

6-hydroxycrinamidin là 0,024 ± 0,002% tính trên dược liệu khô [11], [12]

- Mẫu thử được rửa giải gradient bằng dung dịch đệm phosphat 100 mM (pH 3) – acetonitril, bước sóng 285 nm Hàm lượng crinamidin trong dược liệu, cốm và thành phẩm viên Crila lần lượt là 989,1± 45,0; 146,0 ± 6,5; 74,7 ± 3,8 (µg/g) [24]

- Mẫu thử là alcaloid chiết từ hoa TNHC được hòa tan trong HCl 0,1 N và được xử

lý qua SFE với dung môi là đệm phosphat 100 mM (pH 3)–acetonitril (9: 1) Bước sóng phát hiện 212 nm, đầu dò UV-Vis Hàm lượng crinamidin trong nụ hoa nhỏ, búp chưa nở và hoa đã nở lần lượt là 0,0262; 0,0263 và 0,0122 (%) [28]

Định lượng flavonoid: chất đối chiếu là kaempferol Mẫu thử là bột lá và hoa TNHC

được chiết flavonoid aglycon bằng cách thủy phân mẫu thử với HCl 10%

- Hàm lượng kaempferol được xác định bằng HPLC, đầu dò UV-Vis Mẫu thử là flavonoid aglycon chiết từ hoa TNHC Pha động là dung dịch đệm phosphat 100 mM (pH 3) – acetonitril (gradient) Bước sóng 320 nm Hàm lượng kaempferol trong mẫu

nụ hoa nhỏ, búp chưa nở và hoa đã nở lần lượt 0,0; 0,0005 và 0,0132 (%) [28]

- Điều kiện sắc ký tương tự, mẫu thử là flavonoid aglycon chiết từ lá TNHC Hàm lượng kaempferol trong lá được xác định là 225,98 ± 11,34 µg/g [27]

1.5.2.3 Phương pháp quang phổ:

- Alcaloid toàn phần trong lá TNHC được định lượng bằng phương pháp quang phổ UV-Vis với kỹ thuật tạo cặp ion: hàm lượng alcaloid toàn phần được qui về chất đối chiếu 6-hydroxycrinamidin là C (%) = 0,26 ± 0,02 [11], [22]

1.5.3 Các phương pháp xác định cấu trúc

- Sau khi xác định điểm chảy, cấu trúc các hợp chất tinh khiết được xác định bằng

1.6 PHƯƠNG PHÁP THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU

1.6.1 Các khái niệm về chất đối chiếu hóa học

- Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã được qui định về hóa học, vật lý và sinh học Trong các phép thử đó các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất cần thử Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng [3], [132]

- Chất đối chiếu hóa học được phân loại theo các mức độ như sau [132]:

Chất đối chiếu hóa học sơ cấp (PCRS): là chất được công nhận rộng rãi, các chỉ tiêu

chất lượng phù hợp với tài liệu công bố, có hàm lượng được chấp nhận làm chuẩn định lượng mà không cần phải so sánh với một chất hóa học khác

Chất đối chiếu hóa học thứ cấp (SCRS): là chất đối chiếu mà các tính chất hay chỉ

tiêu chất lượng được xác định bằng cách so sánh với một chất đối chiếu sơ cấp Trong quá trình thiết lập SCRS có sử dụng PCRS để so sánh

1.6.2 Thiết lập chất đối chiếu sơ cấp

- Quy trình thiết lập PCRS gồm các bước: đánh giá nhu cầu, mục đích sử dụng, chọn nguyên liệu, phương pháp kiểm nghiệm, xác định hàm lượng, đóng gói, phân phối Thực hiện theo hướng dẫn của tài liệu do tổ chức y tế thế giới (WHO) ban hành [132]

- Tùy vào mục đích sử dụng mà hàm lượng của chất đối chiếu và số lượng phòng thí nghiệm tham gia đánh giá khác nhau Với phép thử định tính và thử tinh khiết chỉ cần

1 phòng thí nghiệm đạt GLP hoặc ISO/IEC 17025 và hàm lượng có thể chỉ khoảng 90% Phép thử định lượng, hiệu chỉnh thiết bị thì ít nhất là 3 phòng thí nghiệm và hàm lượng là 99,5% hoặc cao hơn [132]

- Các chất đối chiếu đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sản xuất và đảm bảo chất lượng của ngành Dược Nhưng trên thực tế, các PCRS của Anh, Mỹ, Quốc tế, Châu Âu lại quá đắt cho nhu cầu phân tích hay nghiên cứu thường qui [98] Chính vì vậy, PCSR được các Hội đồng Dược điển của khu vực, quốc gia hoặc các phòng thí nghiệm đạt chuẩn thiết lập trên cơ sở của quy trình thiết lập chất đối chiếu thứ cấp

1.6.3 Thiết lập chất đối chiếu thứ cấp

Theo hướng dẫn của ASEAN và một số tài liệu của ISO [44], [45], ngoài những qui định chung, quy trình thiết lập SCRS có một số lưu ý:

1.6.3.1 Xác định độ đồng nhất

Sau khi nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu được đánh giá đạt yêu cầu, tiến hành đóng gói trong các lọ thủy tinh màu nâu Việc đóng gói được thực hiện trong Glove-box Các lọ đựng chất đối chiếu sau khi đóng gói được xác định độ đồng nhất [44], [45], [73] của lô sản xuất theo trình tự như sau:

- Kết quả được đánh giá bằng phân tích thống kê:

phép thống kê Cochran để đánh giá độ đồng nhất trong từng lọ

phép thống kê ANOVA một yếu tố để đánh giá độ đồng nhất lô

1.6.3.2 Đánh giá độ đồng nhất liên phòng thí nghiệm

Ít nhất phải có 3 phòng thí nghiệm tham gia đánh giá độ đồng nhất của chất đối chiếu

[44], [45], [132] Giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo của giá trị ấn định được tính theo

Giá trị công bố được tính trên các giá trị trung bình có z-score ≤ 2

Ước lượng độ không đảm bảo đo theo hướng dẫn của ISO 13528 [73]

1.6.3.3 Nhãn của chất đối chiếu hóa học:

Bao gồm các thông tin của chất đối chiếu và chứng chỉ phân tích theo hướng dẫn của ISO 31 [72]

1.6.3.4 Chương trình đánh giá lại:

Được thực hiện theo tần suất 3 năm, các chất nhạy cảm được thực hiện hàng năm Chương trình đánh giá lại được thực hiện bởi các phòng thí nghiệm tham gia thiết lập chất đối chiếu ban đầu [44], [45]

Các tài liệu tham khảo về chi Crinum và loài Crinum latifolium rất đa dạng Đã có

nhiều công trình nghiên cứu về thực vật học; về chiết tách, phân lập alcaloid, flavonoid để làm sáng tỏ thành phần hóa học; và nhiều công trình nghiên cứu tác dụng sinh học của cây TNHC

Luận án sẽ kế thừa các kết quả đã được các nhà khoa học công bố và phát huy hơn nữa các nghiên cứu về hóa học để đáp ứng việc tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu TNHC và các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu này

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Nguyên liệu

- Nguyên liệu được sử dụng trong luận án là lá, thân hành và rễ của cây Trinh nữ

hoàng cung (TNHC) – Crinum latifolium L., họ Thủy tiên – Amaryllidaceae được thu hái tại huyện Tây Sơn, tỉnh Bình Định Việc xác định đúng loài Crinum latifolium L

được thực hiện tại bộ môn Thực vật, Khoa Dược, Đại học Y Dược TpHCM

- Nguyên liệu sau khi thu hái được rửa sạch, phơi khô và xay thành bột Độ ẩm 12%

2.1.2 Dung môi và hóa chất

Dung môi - hóa chất sử dụng cho thử nghiệm chiết xuất, phân lập, SKLM: n–hexan,

diethyl ether, cloroform, aceton, ethyl acetat, ethanol, methanol, acid hydrocloric và amoniac đạt tiêu chuẩn phân tích Các dung môi này do Trung quốc sản xuất

Dung môi - hóa chất sử dụng cho thử nghiệm tinh chế hợp chất tinh khiết: n–hexan,

diethyl ether, cloroform, aceton, ethyl acetat, methanol đạt tiêu chuẩn phân tích, do Merck sản xuất

Dung môi - hóa chất sử dụng cho thử nghiệm bằng phương pháp HPLC và CE:

methanol, acetonitril đạt tiêu chuẩn HPLC; dinatri tetraborat, sodium dodecyl sulfat (SDS), natri hydroxyd, acid phosphoric đạt tiêu chuẩn phân tích, do Merck sản xuất

và isoquercitrin (98,15%) được sử dụng trong luận án đều được phân lập từ TNHC

và được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ nghiệm Viện kiểm nghiệm thuốc TpHCM xác định độ tinh khiết sắc ký bằng HPLC

2.2 TRANG THIẾT BỊ

Các trang thiết bị chính:

- Hệ thống SFE TST 20 L x3 (Đài loan)

- Hệ thống CE Agilent G7100A, đầu dò DAD

- Hệ thống HPLC Alliance 2695-2996, đầu dò PDA

- Hệ thống LC-MS Micro Quattro API ESCi Multi-mode Ionization

- Máy phân tích nhiệt trọng lượng và nhiệt vi sai TGA/DSC 1 Mettler Toledo

- Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 FTNMR Spectrometer

- Máy hồng ngoại FTIR - 8201 PC Shimadzu

- Máy quang phổ UV-Vis Shimadzu 2500

- Tủ đóng ống Labconco Protector Glove Box

- Bể siêu âm Elma S30H, tần số 37kHz, công suất 280W

- Bình chiết ngấm kiệt kích thước (8 x 15 x 50 cm)

- Bình chiết ngấm kiệt kích thước (30 x 50 x 180 cm)

- Silica gel và Silica gel RP-18 dùng cho sắc ký cột

- Cột mao quản silica nung chảy (64,5 cm; 56 cm; chiều dài hiệu quả cm; 50 μm)

Và các trang thiết bị – dụng cụ thông thường dùng trong phòng thí nghiệm

Nơi thực hiện các thử nghiệm:

- Khoa dược, Đại học Y Dược TpHCM: Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm; bộ môn Thực vật; Labo Hóa hợp chất tự nhiên

- Viện kiểm nghiệm thuốc TpHCM: Khoa Thiết lập Chất đối chiếu – Chất chuẩn; Khoa Vật lý đo lường và Khoa Kiểm nghiệm mỹ phẩm

- Trung tâm kiểm nghiệm Vĩnh Long

- Trung tâm kiểm nghiệm Bình Dương

- Nhà máy dược liệu công nghệ cao DOMESCO

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Chiết xuất hoạt chất từ cây TNHC

2.3.1.1 Chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid và phân đoạn flavonoid bằng phương pháp chiết ngấm kiệt

- Nguyên liệu: lá, thân hành và rễ TNHC được thu hái vào tháng 4/2010

- Thiết bị: bình chiết ngấm kiệt kích thước (8 x 15 x 50 cm)

- Dung môi – hóa chất: cồn 50%, 70% và 96%; cloroform, ethyl acetat, dung dịch

acid hydrocloric 1%, dung dịch amonoiac 25%

Khảo sát các nồng độ cồn (50%, 70% và 96%) lên quá trình tiến hành, hiệu suất và

độ tinh khiết của cao cồn, PĐ alcaloid và PĐ flavonoid

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ khảo sát quy trình chiết hoạt chất từ cây TNHC