Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica)

catarrhalis lƠ nguyên nhơn th ng gặp gây ra nhi m trùng máu [44]... Tỷ l kháng kháng sinh ampicillin có xu h ng ngày càng tăng 16,1%... Nhìn chung ch t kháng sinh có các c ch tác d ng n

L I C M N

V i lòng kính tr ng và bi t n sơu sắc nh t tôi xin đ c gửi l i c m n chơn

thành t i TS Bùi Thị Việt Hà, ch nhi m b môn Vi sinh v t h c, tr ng ĐH Khoa

h c T Nhiên- ĐH Qu c gia Hà N i Ng i đư luôn t n tình ch b o, h ng d n và

t o m i đi u ki n giúp đ tôi trong su t quá trình h c t p cũng nh làm lu n văn

Tôi xin gửi l i c m n t i toàn th cán b c a b môn Vi sinh v t h c,

tr ng ĐH Khoa h c T Nhiên- ĐH Qu c gia Hà N i Trong quá trình làm lu n văn, tôi đư luôn nh n đ c s ch b o tr c ti p vƠ đ c t o đi u ki n thu n l i nh t

Đ ng th i, tôi chân thành c m n các th y giáo, cô giáo t i khoa Sinh h c nói chung và b môn Vi sinh v t h c, tr ng ĐH Khoa h c T Nhiên- ĐH Qu c gia

Hà N i nói riêng đư t n tình d y d tôi trong quá trình h c t p

Cu i cùng tôi xin gửi l i bi t n sơu sắc đ n gia đình, ng i thân và toàn th các b n trong nhóm Nh ng ng i luôn bên c nh đ ng viên, giúp đ tôi trong th i gian h c t p

Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2012

H c viên

Nguy ễn Thị Minh Thư

M C L C

1.2 Moraxella catarrhalis VÀ B NH VIểM Đ NG HÔ H P TRÊN 5

1.2.2 Vai trò c a M.catarrhalis trong b nh nhi m khu n hô h p 5

3.2.1 Phân l p và tuy n ch n ch ng vi sinh v t kháng Moraxella catarrhalis 29

3.3 ĐI U KI N NUÔI C Y THÍCH H P CHO SINH TR NG VÀ

3.4 TÁCH CHI T CH T KHÁNG KHU N T D CH CHI T TÁO MÈO

VÀ D CH LÊN MEN VI KHU N

39

3.4.1 Kh o sát h dung môi rửa gi i và pha rắn h p ph 40 3.4.2 Tách chi t phơn đo n ch t kháng khu n c a d ch lên men vi khu n 40 3.4.3 Tách chi t phơn đo n ch t kháng khu n t d ch chi t táo mèo 41 3.4.4 Sắc ký b n m ng các phơn đo n kháng khu n c a d ch lên men ch ng

TM5.2 và d ch chi t táo mèo

B NG M T S KÝ HI U VI T T T

CKS Ch t kháng sinh CMC Carboxymethylcellulose

Hình 3.1: V trí phân lo i c a ch ng TM5.2 v i các loài quan h h hàng g n 32

B ng 3.4: nh h ng c a môi tr ng nuôi c y đ n kh năng sinh tr ng và

ho t tính kháng khu n c a ch ng TM5.2

33

Hình 3.2: Ho t tính kháng khu n c a TM5.2 trên các môi tr ng 33

B ng 3.5: nh h ng c a ngu n cacbon đ n kh năng sinh tr ng và ho t

B ng 3.7: nh h ng c a pH ban đ u đ n sinh tr ng, ho t tính kháng khu n

B ng 3.11: K t qu thử ho t tính kháng khu n c a phơn đo n tách t d ch

chi t lên men

40

B ng 3.12: K t qu thử ho t tính kháng khu n M.catarrhalis c a cao d ch

chi t táo mèo t i các n ng đ khác nhau

41

B ng 3.13: K t qu thử ho t tính kháng khu n M.catarrhalis c a các phân

đo n t d ch chi t táo mèo

42

B ng 3.14: K t qu thử đ nh tính các nhóm h p ch t c a d ch chi t qu táo mèo vƠ các phơn đo n

43

M Đ U

Nhi m khu n đ ng hô h p c p là b nh lý có tỷ l tử vong đ ng đ u trong s

10 b nh lý nhi m khu n các n c có thu nh p th p Ch ng trình toƠn c u v phòng ch ng nhi m khu n hô h p c p đư đ c WHO phát đ ng, t i Vi t Nam

ch ng trình nƠy đư đ c tri n khai t năm 1984 Ki m soát và phòng ch ng b nh

đ c u tiên hƠng đ u t i các n c đang phát tri n trong đó có Vi t Nam, nh ng đư

vƠ đang ch u tác đ ng b t l i c a s phát tri n và lan truy n tình tr ng kháng kháng sinh c a vi khu n gây b nh

B nh nhi m khu n đ ng hô h p c p g m nhi m khu n đ ng hô h p trên

và nhi m khu n đ ng hô h p d i Tỷ l mắc b nh nhi m khu n đ ng hô h p trên chi m ph n l n so v i các b nh v hô h p khác, là b nh th ng gặp, mắc hàng năm, theo mùa nh ng có th gây nhi u bi n ch ng nặng nh viêm tai gi a, viêm màng não, áp xe não, áp xe sau thành h ng Khi mắc viêm đ ng hô h p trên có th lây nhi m xu ng đ ng hô h p d i gây viêm khí, ph qu n và viêm ph i nặng Có

th th y b nh gây nh h ng đáng k đ n s c kh e đặc bi t v i trẻ em, ng i già và gây thi t h i kinh t

Moraxella catarrhalis lƠ căn nguyên gơy ra ph n l n các tr ng h p mắc

b nh nhi m khu n hô h p, đặc bi t hi n nay đ c coi nh tác nhân gây b nh viêm

tai gi a ph bi n th ba sau Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae Trong khi đó M catarrhalis hi n đư kháng l i h u h t các ch t kháng sinh thu c

nhóm beta-lactam, ch còn nh y c m v i cephalosporin th h 2, 3 và ciprofloxacin

thu c h quinolon Th c tr ng kháng kháng sinh c a M catarrhalis nói riêng, các

vi khu n gây b nh truy n nhi m nói chung đư vƠ đang đem đ n gánh nặng kinh t ,

xã h i trong vi c thay th kháng sinh th h cũ bằng kháng sinh th h m i đắt ti n

V i s phát tri n c a ngành công ngh sinh h c hi n đ i đem l i m t tri n v ng l n cho n n Y h c khi tìm ki m thêm nh ng h p ch t t nhiên h tr cho vi c phòng và

đi u tr b nh trên Các h p ch t này góp ph n gi m tác d ng ph không mong mu n

c a các h p ch t t ng h p, gi m gánh nặng v mặt kinh t cho ng i b nh và xã

h i

T ngƠn x a, ông cha ta đư l u truy n r t nhi u bài thu c dân gian t cây, c

ch a các b nh đ ng hô h p và r t nhi u b nh khác Hi n nay táo mèo và các s n

ph m ch bi n t táo mèo đặc bi t là gi m táo mèo đ c lan truy n r ng rãi trong

c ng đ ng nh m t bài thu c ch ng béo phì, tăng c ng mi n d ch, kháng khu n,

gi m ch ng suy hô h p Trên th gi i cây táo mèo phân b t i Trung Qu c, n

Đ , Myanma, t i Vi t Nam t p trung các t nh Yên Bái, S n La, LƠo Cai, Lai Chơu

vƠ Lơm Đ ng Năm 2010 đư có nh ng nghiên c u s b v i k t qu kh quan v tác

d ng kháng khu n, trong đó có M catarrhalis gây b nh hô h p c a d ch lên men

qu táo mèo đư m ra m t h ng nghiên c u m i cũng nh đ nh h ng ng d ng

c a d ch lên men qu táo mèo trong vi c h tr và nâng cao th tr ng cho con

ng i V i m c tiêu góp ph n ch ng minh và làm sáng t vai trò ch đ o c a các tác nhân có trong d ch lên men qu táo mèo theo kinh nghi m dân gian, đặc bi t là công d ng kháng vi khu n gơy viêm đ ng hô h p trên đã kháng kháng sinh thông

d ng, chúng tôi ti n hành th c hi n đ tài: “ Nghiên cứu tác dụng chống l i vi khu ẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men qu táo mèo (Docynia indica)”

C h ng 1: T NG QUAN TÀI LI U

1.1 B NH NHI M KHU N HÔ H P NG I

Nhi m khu n hô h p là tình tr ng m t hoặc m t s b ph n thu c b máy

hô h p b viêm nhi m do vi khu n hoặc virut gây ra

V ph ng di n lâm sàng, nhi m khu n hô h p g m hai lo i: nhi m khu n

hô h p trên và nhi m khu n hô h p d i

Nhi m khu n hô h p trên không ph i là m t b nh lý riêng bi t mà g m nhi u b nh lý (các b nh tai mũi h ng) nh :

+ Viêm mũi + Viêm h ng + Viêm amidan + Viêm tai gi a + Viêm xoang

B nh nhi m khu n hô h p d i đ c coi là b nh c nh nặng nh ng trên th c

t b nh chi m tỷ l th p và không d mắc Trong khi đó nhi m khu n hô h p trên là

ch ng b nh th ng gặp hƠng năm, mắc tái di n theo mùa, tái mắc nhi u l n trong năm, d gây bi n ch ng nặng n và chi m tỷ l l n so v i các b nh v hô h p khác Theo th ng kê c a các t ch c y t Hoa Kỳ, trung bình ng i tr ng thành có th b viêm đ ng hô h p trên kho ng 2 ậ 4 l n m i năm vƠ con s nƠy cao h n r t nhi u

trẻ em, trong đó trẻ có th nhi m đ n 10 l n M i năm t i Hoa Kỳ, nhi m khu n

hô h p trên gây gi m kh năng lƠm vi c trong 170 tri u ngày, 23 tri u ngày trẻ ph i ngh h c, 18 tri u ngày ph i ngh lƠm Đi u này cho th y dù là lo i b nh đ c cho

là t kh i nh ng chúng đư gơy ra nh ng thi t h i đáng k không ch v s c kh e mà còn c v kinh t xã h i

Đ i t ng mắc b nh ch y u là trẻ em c tính trên toàn c u m i năm có kho ng trên 2 tỷ l t trẻ b b nh nhi m khu n hô h p c p, chi m 15 -20% s tử vong trong đ tu i d i 5 T i khu v c Đông Nam Ễ, trong đó có Vi t Nam b nh trên là nguyên nhân cao nh t (25%) gây tử vong trẻ, ti p theo là tiêu ch y vƠ s sinh k t h p v i các b nh khác, còn l i là do các nguyên nhân khác [22] trẻ em

b nh nhi m khu n hô h p trên gây bi n ch ng nặng viêm tai gi a (29 ậ 50%), viêm xoang (5 ậ 10%) [38]

Vi sinh v t gây b nh th ng gặp là virut (chi m 80%) và vi khu n (20%), c

th nh sau:

- Tác nhân virut gây b nh g m có:

+) Rhinovirus là m t picornavirut, phân l p đ c h n 110 serotyp- th ng

+ S c đ kháng y u c a con ng i: sinh non, suy dinh d ng,

+ Đi u ki n khí h u, th i ti t: Vi t Nam có khí h u nóng m t o đi u ki n thu n l i cho các vi sinh v t gây b nh đ ng hô h p nói riêng và các b nh nhi m khu n nói chung phát tri n Vi t Nam đ c coi là m t trong các qu c gia có tỷ l các b nh nhi m khu n cao nh t nên vi c đi u tr và phòng b nh càng tr nên c n thi t

+ Do ô nhi m môi tr ng s ng, đ i s ng kinh t xã h i kém

1.2 Moraxella catarrhalis VÀ B NH VIểM Đ NG HÔ H P TRÊN

1.2.1 Đặc đi m hình thái và nuôi c y

Moraxella catarrhalis l n đ u tiên đ c mô t vƠo năm 1896, g i là Micrococcus catarrhalis sau đó đ i thành Neisseria catarrhalis đ n năm 1984 đ i

là Moraxella (Branhamella) catarrhalis thu c chi Moraxella, h Moraxellaceae

[27]

Đơy lƠ vi khu n Gram âm, hi u khí, d ng song c u khu n, s ng c ng sinh

t i đ ng hô h p trên, m t s có pili hoặc lông nhung giúp cho chúng có th bám vào ng hô h p [38] Không ch s ng c ng sinh bình th ng trong h hô h p mà M catarrhalis còn là m t trong nh ng tác nhân gây b nh quan tr ng nh t đ i v i

đ ng hô h p c a con ng i [36]

Quá trình phân l p M catarrhalis đ c ti n hành theo tiêu chu n WHO:

B nh ph m l y t vùng h ng c a b nh nhân, ti n hành nhu m Gram và cu i cùng đem nuôi c y trong môi tr ng th ch máu 5% hoặc th ch sôcola v i đi u ki n 370C + CO2 5% [38]

1.2.2 Vai trò của Moraxella catarrhalis trong b nh nhi m khuẩn hô h p

Nhi u nghiên c u trên th gi i vƠ trong n c đư ch ra rằng M catarrhalis

là m t trong nh ng tác nhân gây b nh quan tr ng nh t đ i v i đ ng hô h p

 Các nghiên c u trên th gi i:

Trên th gi i có nhi u nghiên c u ch ra M catarrhalis là nguyên nhân ph

bi n gây b nh viêm đ ng hô h p M catarrhalis là vi khu n c ng sinh ph bi n

vòm h ng c a trẻ em [41], m t nghiên c u trên 120 trẻ s sinh đư cho th y 66% trẻ

m t tu i mang vi khu n, tăng lên đ n 77,5% trẻ hai năm tu i, đi u này cho th y trẻ em có nguy c cao b các b nh đ ng hô h p, đặc bi t là hô h p trên [20]

Nh ng nghiên c u khác cũng cho th y 48,9% gặp trẻ đ tu i t 3-12 [32] và 54%

trẻ d i 4 tu i [22] Tuy nhiên ng i l n tỷ l này th p h n v i 1% trong 561 ca

ph n trong tu i lao đ ng nh p vi n [32], 5,8% ng i l n kh e m nh vƠ tăng

đ n 26,5% ng i có đ tu i trên 60 [48] vƠ tăng cao vƠo mùa đông Timothy [47]

đư đ a ra các bi u hi n lâm sàng và d ch t h c c a M catarrhalis, đặc bi t s liên

quan gi a b nh viêm tai gi a trẻ em và b nh COPD ng i l n, hai căn b nh

truy n nhi m ph bi n nh t gây ra b i M catarrhalis Viêm tai gi a là b nh hay

gặp nh t trong th i th u c a con ng i và là lý do ph bi n nh t mà trẻ em đ c

kê đ n kháng sinh, trung bình kho ng 80% trẻ em trong 3 năm đ u đ i mắc b nh

Trong đó M catarrhalis chi m 15-20% nguyên nhơn gơy các đ t b nh viêm tai

gi a c p tính, r t nguy hi m v i trẻ em n u không phát hi n vƠ đi u tr k p th i M catarrhalis còn là nguyên nhân gây ra m t lo t các b nh v hô h p khác nh : viêm xoang c p, viêm vòm h ng, viêm ph qu n mãn tính Catlin [26] đư ch ra nh ng bằng ch ng cho th y M catarrhalis đư gơy ra b nh nhi m trùng máu, viêm màng não, viêm n i tâm m c Đặc bi t trong các báo cáo t ng h p l i v các b nh viêm

ph i, viêm tai gi a và AIDS ch ra rằng M catarrhalis lƠ nguyên nhơn th ng gặp

gây ra nhi m trùng máu [44] Nhi m trùng b nh vi n là v n đ đang r t đ c quan

tâm và M catarrhalis đ c xác đ nh là m t trong nh ng vi khu n b lây truy n,

nh t là nh ng khu phòng quá t i b nh nhân và trong nh ng tháng mùa đông

 Các nghiên c u t i Vi t Nam

Vi t Nam v i đặc đi m khí h u nóng m, trong nh ng năm g n đơy l i ch u tác đ ng m nh c a bi n đ i khí h u đư t o đi u ki n thu n l i cho các vi sinh v t gây b nh phát tri n Trên th gi i, Vi t Nam là m t trong nh ng qu c gia có tỷ l các b nh nhi m khu n cao nh t, trong đó nhi m khu n đ ng hô h p trên chi m tỷ

l cao Ngay t năm 1984 ch ng trình ch ng nhi m khu n hô h p c p đư chính

th c bắt đ u t i Vi t Nam, đư có nhi u nghiên c u v b nh hô h p xác nh n M catarrhalis là m t trong nh ng tác nhân gây b nh ch y u T i b nh vi n B ch Mai

vƠo năm 1987 [17] xác nh n tỷ l M catarrhalis chi m 3,5%, đ n năm 1998 Lê Bá

Nhàn và c ng s khi nghiên c u b nh nhi m khu n đ ng hô h p d i trẻ em t i

ph ng Kim Long, thành ph Hu đư phơn l p đ c M catarrhalis v i tỷ l 19,2%

Nghiên c u c a ĐƠo Đình Đ c và c ng s [8] t i b nh vi n B ch Mai trong 5 năm (1990-1994) cho th y ch ng vi khu n này gây nhi m b nh hô h p v i tỷ l trung bình là 2,2% T i tr m y t ph ng Hu thành ph Hà N i, năm 1991 đư phơn l p

đ c 36 ch ng M catarrhalis chi m 18,8% t ng s vi khu n gây b nh cho trẻ em,

t i b nh vi n Vi t Nam- Cuba tỷ l lên đ n 23,72% [34] Khi nghiên c u tác nhân vi sinh gây b nh viêm ph i c ng đ ng t i b nh vi n Ch R y t ngƠy 01/03/2005 đ n ngƠy 30/06/2006 đư cho th y tác nhân gây b nh ch y u là vi khu n Gram âm, trong

đó t n su t gặp cao là Haemophilus influenzae (25%) sau đó lƠ M catarrhalis v i

17% Cũng v i kh o sát t ng t di n ra t i b nh vi n Nguy n Tri Ph ng trong kho ng th i gian t tháng 1/2005 đ n tháng 9/2006 do Ph m Hùng Vân ph trách

đư cho k t qu M catarrhalis chi m 8% trong t ng s vi sinh v t gây b nh Theo

Đ Quy t [19] t tháng 6/2007 đ n tháng 6/2008 t i khoa lao và b nh ph i, b nh

vi n 103 Hà N i trên 40 b nh nhơn trong đ t bùng phát b nh ph i tắc ngh n mãn

tính cho th y M catarrhalis chi m 14,3% nguyên nhân gây b nh Cũng theo Nguy n Minh H i (2006) [10] tỷ l gây b nh t ng t là 51,6%, theo Nguy n Ng c Bích (2007) chi m 30,75% s vi khu n gây b nh Th ng kê c a vi n d ch t trung

ng vƠ b nh vi n nhi Th y Đi n v tình hình nhi m khu n đ ng hô h p, M catarrhalis chi m tỷ l 18,8-29,6% trong t ng s các ch ng phân l p đ c [2] Phân

l p vi khu n t m u b nh ph m c a b nh nhân mắc b nh viêm h ng m n tính t i

b nh vi n Tai Mũi H ng Trung ng cho b ng k t qu sau [13]:

B ng 1.1: T ỷ lệ vi khuẩn gây bệnh viêm họng m n tính

Nh ng k t qu nghiên c u trong vƠ ngoƠi n c đư cho th y M catarrhalis

là m t trong nh ng tác nhân ch y u gây ra các b nh hô h p v i tỷ l gây b nh cao

và m c đ nguy hi m c a chúng đ i v i s c kh e con ng i, đặc bi t là v i trẻ em,

ng i già M t v n đ r t đ c quan tâm và chú tr ng nghiên c u hi n nay chính là tính kháng kháng sinh c a các ch ng vi khu n gây b nh hô h p, trong đó đặc bi t là

c a M catarrhalis

1.2.3 Tính kháng kháng sinh của Moraxella catarrhalis

V n đ v th c tr ng kháng kháng sinh đư mang tính toƠn c u vƠ đặc bi t n i

tr i các n c đang phát tri n trong đó có Vi t Nam v i gánh nặng c a các b nh nhi m khu n và nh ng chi phí bắt bu c cho vi c thay th các kháng sinh cũ bằng kháng sinh m i đắt ti n Cùng v i b nh nhi m khu n đ ng tiêu hóa, b nh lây nhi m qua đ ng tình d c và nhi m khu n b nh vi n, b nh nhi m khu n đ ng hô

h p là m t trong nh ng nguyên nhơn hƠng đ u có tỷ l mắc và tử vong cao các

n c đang phát tri n Th c t vi c ki m soát b nh nƠy đư vƠ đang ch u s tác đ ng

b t l i c a s phát tri n và lan truy n tình tr ng kháng kháng sinh c a vi khu n

M catarrhalis là vi khu n Gram âm, có kh năng t ng h p enzym β- lactamaza Enzym này làm m t ho t tính kháng sinh c a nhóm kháng sinh β- lactam bằng cách th y phơn vòng β- lactam

Tr c đơy khi đi u tr các b nh nhi m khu n M catarrhalis ampicillin v n

đ c coi lƠ kháng sinh đặc tr h u hi u Tuy nhiên hi n nay kháng sinh đi u tr theo kinh nghi m nƠy đư đ c ghi nh n là b M catarrhalis đ kháng v i tỷ l cao lên

đ n 100% nh Thái Lan [30], hay 79% nh Malaysia [46] Theo báo cáo g n đơy cho th y tỷ l kháng kháng sinh thu c th h kháng sinh quinolon m i có ph

kháng r ng c a M catarrhalis cao nh t là v i ofloxacin (29,4%), tỷ l kháng th p

h n v i ciprofoxacin, levofloxacin, moxiloxacin

T i Vi t Nam, khi phân tích các ch ng M catarrhalis v tỷ l vƠ xu h ng

c a kháng kháng sinh trong s t t c các vi khu n gây b nh ph bi n trong ch ng trình Qu c gia giám sát kháng kháng sinh, Ph m Văn Ca [4] cho th y cho th y tỷ l kháng kháng sinh c a vi khu n này th p vƠo tr c năm 2000(d i 2,5%), nh ng

hi n đư cao h n 13% Tỷ l kháng kháng sinh ampicillin có xu h ng ngày càng tăng (16,1%) Các kháng sinh có tỷ l b kháng cao nh t là tetracycline và co-trimoxazole v i trên 30% Khi kh o sát tỷ l kháng kháng sinh thông d ng th ng

đ c dùng trong c ng đ ng, d ng u ng, Ph m Hùng Vân cho bi t có 50% - 60% vi khu n kháng ampicillin v i c ch ti t β-lactamaza ngƠy cƠng tăng vƠ ch còn nh y

c m v i cephalosporin th h II, III và ciprofloxacin thu c h quinolon Theo nghiên c u c a Nguy n H ng Lâm (2008) ậ (B ng 1.2) cho th y M catarrhalis đư

kháng l i hoặc nh y c m th p v i h u h t kháng sinh thu c nhóm β-lactam nh ng

nh y c m r t cao v i cefoperazol (Cephalosporin th h III) v i tỷ l 100%, cefotaxime (cephalosporin th h III) đ t tỷ l 98,04%, ceftriaxone đ t tỷ l 96,08%, cefuroxime (cephalosporin th h III) đ t tỷ l 78,43%

B ng 1.2: T ỷ lệ kháng kháng sinh của M catarrhalis

Ch t kháng sinh là nh ng ch t h u c có ngu n g c t sinh v t (vi sinh v t,

th c v t, đ ng v t), có kh năng di t hoặc kìm hãm s phát tri n các vi sinh v t khác, các ch t kháng sinh th ng có tác d ng m nh n ng đ th p vƠ đặc hi u lên các vi sinh v t khác nhau [49]

B ng 1.3: T ỷ lệ các loài có kh năng sinh CKS [9]

Sinh v t sinh CKS S l ng loài Tỷ l (%)

1.3.2 Ch t kháng sinh có ngu n g c từ vi khuẩn

1.3.2.1 Khái quát lịch sử nghiên cứu

T r t xa x a, v i s tìm tòi, khám phá vƠ tích lũy kinh nghi m th c ti n, con ng i đư phát hi n, ng d ng hi u qu nhi u ngu n d c li u vào m c đích

đi u tr y h c Và m t kỷ nguyên m i trong y h c đư đ c m ra v i phát minh vĩ

đ i c a Alexander Fleming vƠo năm 1928 khi ông phát hi n ra penicillin ậ m t ch t

kháng sinh có ngu n g c t n m Penicillium notatum [7] Năm 1942, quy trình s n

xu t penicillin G procain đ c phát minh b i Howard Florey (1898-1968) và Ernst Chain (1906-1979) Penicillin lúc nƠy đư đ c bán nh m t lo i thu c Fleming, Florey và Chain đư cùng đ c trao gi i Nobel Y h c vƠo năm 1945 cho thƠnh t u

c a mình Nhà vi sinh v t h c Mỹ, Selman Waksman (1888-1973) năm 1943 đư tìm

ra ch t kháng sinh streptomycin t vi khu n đ t, đ c sử d ng đ đi u tr các b nh

nh lao, viêm mƠng nưo VƠ đơy lƠ m t trong nh ng kháng sinh có ph r ng có kh năng kháng đ c c vi khu n Gram ơm vƠ Gram d ng

Nh ng năm 1940-1959 đ c coi là th i kỳ hoàng kim c a ch t kháng sinh, hàng lo t ch t đ c tách chi t vƠ xác đ nh: actonomixin (Waksman, 1940), chloramphenicol (Erhlich, 1947), chlotetracylin (Dugar, 1948), tetracyclin (Lloyd Conover, 1955), nystatin (1957) dùng trong đi u tr b nh nhi m n m Ngày nay, s

l ng ch t kháng sinh đư đ c phát hi n lên t i trên 10.000 ch t, trong đó hƠng trăm ch t đ c dùng trong y h c th c ti n Năm 1981, amoxicillin ra đ i, là m t kháng sinh bán t ng h p và l n đ u tiên đ c bán vƠo năm 1998 d i tên th ng

m i là amoxicillin, amoxil và trimox

T i Vi t Nam, vào nh ng năm 1951-1952 giáo s Đặng Văn Ng đư nghiên

c u s n xu t d ch l c penicillin đ rửa v t th ng cho các th ng binh [7] Tr ng

đ i h c D c Hà N i đư ti n hành r t nhi u nghiên c u, ng d ng khoa h c kỹ

thu t đ s n xu t các ch t kháng sinh nh : clotetracilin, oxytetracilin, erythromixin, neomicin,ầvƠ cũng đư thu đ c nh ng kinh nghi m nh t đ nh

 D a vào c u trúc phân tử và các nhóm ch c đặc tr ng: đơy lƠ nguyên lỦ

c b n đ c sử d ng đ phân lo i ch t kháng sinh vì chúng đóng vai trò quy t đ nh ho t tính kháng sinh

 Bacteriocin

Hi n nay con ng i đang ph i đ i mặt v i th i kỳ “h u kháng sinh” b i tình

tr ng kháng thu c, s xu t hi n c a các ch ng vi khu n đa kháng thu c, s thi u h t các nhóm kháng sinh m i [35] Trong b i c nh này song song v i vi c phát tri n các ch t kháng sinh ph r ng thì vi c nghiên c u bacteriocin là v n đ r t đáng

đ c quan tâm

Bacteriocin là peptit hoặc protein do vi khu n t ng h p, có ho t tính kháng khu n [29], thu t ng nƠy đ c đ xu t t năm 1953 [28] Ti p t “in” hoặc “cin” dùng đ bi u th các peptit có ho t tính kháng khu n ti t ra t vi khu n Ti p t này

đ c vi t thêm vào tên chi hoặc tên loài Ví d , bacteriocin ti t ra t E coli đ c

g i là colicin, t Bacillus subtilis đ c g i là subtilin Các ch cái đ ng sau tên bacteriocin ch th t bacteriocin đ c tìm ra cùng m t loài Bacteriocin đ c phát hi n h u h t các loài vi khu n, đặc bi t m t s loài có kh năng ti t hàng

ch c, th m chí hƠng trăm lo i [45] Chúng r t đa d ng v ch ng s n xu t, kích

th c phân tử, tính ch t v t lý, hóa h c, đ b n, ph kháng khu n vƠ c ch tác

đ ng T p h p các gen c u trúc, gen đi u hòa sinh t ng h p bacteriocin vi khu n

r t đa d ng, c th nằm trong h gen hoặc plasmit hoặc trong c transposon

Bacteriocin đ c phân chia thành 2 nhóm l n là bacteriocin c a vi khu n Gram âm và bacteriocin c a vi khu n Gram d ng [45] Vi khu n Gram d ng

t ng h p bacteriocin phong phú vƠ đa d ng h n nhi u so v i vi khu n Gram ơm Đa

ph n các bacteriocin có ph kháng khu n không r ng, ch y u c ch hoặc tiêu di t các vi khu n khác có m i quan h g n gũi hoặc t ng đ ng, có s c nh tranh tr c

ti p v n i s ng và ngu n dinh d ng [39] Ph kháng khu n c a bacteriocin c a vi khu n Gram d ng r ng h n so v i c a vi khu n Gram âm

B ng 1.4 So sánh bacteriocin và ch ất kháng sinh dùng trong y tế [14]

Yêu c u t ng tác Đôi khi c n cắt ngắn phân tử Đích đặc hi u

Màng t bào hoặc các đích

n i bào

Đ c tính/tác d ng ph Ch a th y Có

1.3.3 Ch t kháng khu ẩn thực v t

T th i c đ i, con ng i đư bi t dùng th c v t làm thu c ch a b nh, trong

nh ng năm g n đơy, ngƠnh d c ph m và các nhà khoa h c đư dành m i quan tâm

l n đ n d c li u và phân tích thành ph n kháng sinh th c v t b sung vào ngu n kháng sinh nhằm khắc ph c tình tr ng kháng thu c hi n nay, đem l i nh ng s n

ph m v i giá thành th p h n c tính có 14- 28% các loài th c v t đ c sử d ng lƠm d c li u trong y h c và 74% đư đ c phát hi n có ho t tính sinh h c [31]

1.3.3.1 Khái ni ệm

Kháng khu n th c v t là tên g i chung ch các h p ch t h u c có trong

th c v t có tác d ng tiêu di t hay kìm hãm s phát tri n c a vi sinh v t Các ch t kháng khu n th ng có tác d ng đặc hi u lên các loài vi sinh v t khác nhau n ng

đ th ng r t nh [50]

Nh ng tính ch t này có th thu c nhi u c u trúc hóa h c khác nhau nh : ankaloit, tannin, flavonoit, tinh d u

1.3.3.2 Khái quát l ịch sử nghiên cứu

Trên trái đ t c tính có t 250.000 đ n 500.000 loài th c v t [25], nh ng

ch m t tỷ l t ng đ i nh (1- 10%) trong s nƠy đ c sử d ng nh th c ph m cho

c con ng i vƠ đ ng v t Th c v t cũng đ c sử d ng nh lƠ ngu n d c li u quý giá cho con ng i t ngƠn x a VƠo cu i th kỷ th V tr c Công nguyên, Hippocrates đư đ c p 300 đ n 400 d c li u t th c v t Theo Moerman [44]

ng i Mỹ b n x t i Bắc Mỹ đư sử d ng 1.625 loài th c v t làm th c ph m, trong khi đó có đ n 2.564 loƠi đ c dùng làm thu c U c tính có 14-28% các loài th c

v t đ c sử d ng trong y h c và 74% đư đ c phát hi n là có ho t tính sinh h c [31] Châu Á là khu v c có n n y h c c truy n phát tri n t lơu đ i đặc bi t là t i Trung Qu c, n Đ , Vi t Namầ

V i tình tr ng kháng thu c kháng sinh hi n nay vi c nghiên c u, phát tri n

s n xu t các h p ch t có ho t tính kháng khu n t th c v t đang lƠ m i quan tâm

l n c a các nhà khoa h c, ngành y h c, d c h c Vi t Nam v i đi u ki n khí h u

và th m th c v t đa d ng, phong phú đư vƠ đang phát tri n các nghiên c u v các

ho t ch t có tính kháng khu n t th c v t d a vào nh ng bài thu c c truy n t ngƠn x a đ l i Theo các s li u th ng kê m i đơy, th m th c v t t i Vi t Nam có trên 12000 loài, trong s đó có trên 3200 loƠi đ c sử d ng làm thu c trong Y h c

c truy n [16] T i Vi t Nam đư có nhi u đ tài nghiên c u v h p ch t kháng khu n t th c v t vƠ đư thu đ c nh ng k t qu nh t đ nh trên các đ i t ng nh :

t i, đu đ , anh đƠo, lá d a, thanh long, lá l t, d a c n, dâm b t, s ng đ i, xoan, b công anh Vi t Nam, di p h chơu, đinh lăngầ

1.3.3.3 Phân lo i các h ợp chất kháng khuẩn của thực vật

Th c v t có kh năng t ng h p ch t th m, h u h t là phenol hoặc d n xu t oxy Chúng đ u là h p ch t th c p, hi n nay đư phân l p đ c kho ng 12000 lo i, chi m tỷ l c tính d i 10% t ng s h p ch t th c p [42] Trong đó đa s các

h p ch t th c p có vai trò b o v cây tr ng ch ng l i nh ng sinh v t h i chúng

nh : vi sinh v t, côn trùng, đ ng v t Ví d nh nhóm terpenoid t o mùi hôi, nhóm quinon và tannin t o sắc t trên th c v t, m t s ch t t o h ng v và m t s đ c dùng lƠm d c ph m và th c ph m cho con ng i

Các h p ch t kháng khu n th c v t g m có:

 Ankaloit: berberin, piperin

 Phenol và polyphenol: phenol, axit phenol, catechol, pyrogallol, quinon, flavon, flavonoitầ

 Terpenoit: tinh d u, saponin

 Và m t s h p ch t khác nh : lectin, polyacetylen

1.3.4 C ch kháng khuẩn

Ch t kháng sinh có thành ph n và c u trúc hóa h c đặc tr ng nên không có

m t c ch tác d ng chung đ i v i vi sinh v t Đặc tính vƠ c ch ph thu c vào

b n ch t hóa h c c a t ng ch t, n ng đ và c u trúc c a vi sinh v t Nhìn chung

ch t kháng sinh có các c ch tác d ng nh sau:

 c ch quá trình t ng h p thành t bào vi khu n: penicillin, bacitracin, vancomycin Do tác d ng lên quá trình t ng h p thành t bào nên làm cho vi khu n d b phá v do thay d i áp su t th m th u

 c ch ch c năng c a màng t bào: colistin, polymycin, gentamicin, amphoterricin C ch làm m t ch c năng c a màng làm cho các phân tử có

kh i lu ng l n và các ion b thoát ra ngoài, vi khu n b tiêu di t

 c ch quá trình sinh t ng h p protein:

- Nhóm aminoglycosid gắn v i receptor trên ti u ph n 30S c a ribosom làm cho quá trình d ch mã không chính xác

- Nhóm chloramphenicol gắn v i ti u ph n 50S c a ribosom c ch enzym peptidyltransferaza d n đ n không kéo dài chu i

- Nhóm macrolid và lincoxinamid gắn v i ti u ph n 50S c a ribosom

s c ch gi i phóng axit amin kh i ph c h p aa-tARN-riboxom-mARN

 c ch quá trình t ng h p axit nucleic:

- Nhóm refampin gắn v i enzym ARN polymeraza ngăn c n quá trình sao mã t o thành ARN thông tin

- Nhóm quinolon c ch tác d ng c a enzym DNA gyraza làm cho hai

m ch đ n c a ADN không th du i xoắn, ngăn c n quá trình nhân đôi c a ADN

- Nhóm sulfamid có c u trúc gi ng PABA (axit p- aminobenzoic) có tác d ng c nh tranh PABA và ngăn c n quá trình t ng h p axit nucleic

- Nhóm trimethoprim tác đ ng vào enzym xúc tác cho quá trình t o nhân purin làm c ch quá trình t ng h p axit nucleic

1.4 CÂY TÁO MÈO VÀ D CH CHI T T QU TÁO MÈO

1.4.1 Đặc đi m thực v t học

Cây táo mèo hay còn g i là cây chua chát, tên khoa h c là Docynia indica,

thu c h hoa h ng (Rosaceae)

D ng s ng là d ng b i hoặc g nh , a sáng, chi u cao 5-10 mét, cây phân cành s m, tán tròn, trên nhánh và thân non có gai, m c r i rác trong r ng đ cao 1300-2000 mét

Lá m c so le, hình thuôn, g c tròn đ u nh n, mép lá nguyên, mặt d i có lông b c m n, mặt trên màu xanh l c, có 2 lá kèm r ng s m R ng lá hoàn toàn vào

cu i mùa đông, ra lá non vƠo tháng 3

Mùa ra hoa vào tháng 2-4, hoa màu trắng, m c thành c m 3- 5 hoa nách lá

hoặc đ u cành, cu ng ngắn, đƠi dƠy có lông trắng, hoa m ng manh và không có lông, nh ngắn, vòi nh y dƠiầ[6]

Trên th gi i cây có m t s n c nh : n Đ , Trung Qu c, Myanma, Thái Lan T i Vi t Nam, cây phân b t i: Ði n Biên (Tu n Giáo, đèo Pha Ðin), Lai Châu (Sìn H ), Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Ð ng Van, Qu n B , Mèo V c); Yên Bái (Mù Cang Ch i) [6]

1.4.3 Tác d ng d c lý

Qu táo mèo đ c dùng ph bi n trong Đông y, có th dùng thay th hay

t ng t nh v thu c s n tra v i nhi u tác d ng nh lƠm thu c b tỳ, v , kích thích tiêu hóa, giúp ăn ngon, d tiêu ch ng đ y b ng, chua, giúp tăng c ng mi m d ch,

gi m cholesterol, h m máu, đ i ti n xu t huy t, ch a toƠn thơn đau m i d i

d ng thu c sắc, cao l ng hoặc tán b t u ng

Đi u đáng chú Ủ nh t táo mèo có tác d ng h huy t áp nh làm giãn m ch ngo i vi Mặt khác còn giúp h m máu, ch ng huy t kh i lƠm giưn đ ng m ch

vành, c i thi n s c co bóp c a c tim, phòng ch ng tích c c các bi n ch ng do cao huy t áp gây ra

Ngoài ra, chúng còn có tác d ng c ch các tr c khu n: th ng hƠn, b ch

h u, l , t c u vàng, gi m ch ng suy hô h pầ

Trong dân gian, táo mèo dùng ngâm v i r u u ng đ tăng c ng s c kh e, kích thích tiêu hóa và dùng làm siro táo mèo hay ch bi n ru u vang D ch lên men

qu táo mèo - gi m táo mèo g n đơy đ c lan truy n và ph bi n r ng rãi trong

c ng đ ng v i tác d ng phòng ch ng béo phì,tăng c ng kh năng mi n d ch và

kh năng kháng khu n, ch a b nh viêm đ ng hô h p: ho, viêm amidan

1.4.5 Tình hình nghiên cứu táo mèo t i Vi t Nam

Hi n nay trên th gi i ch a có nhi u nghiên c u v cây táo mèo Docynia indica, đặc bi t là v tác d ng kháng khu n c a qu táo mèo

T i Vi t Nam, nghiên c u c a Nguy n Th Thanh Loan [15] cho th y tác

d ng ch ng béo phì và gi m tr ng lu ng c a d ch chi t qu Táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne trên mô hình chu t béo phì th c nghi m Theo Vũ Th H nh Tâm [20] nghiên c u và ghi nh n vai trò h lipit vƠ đ ng huy t c a d ch chi t qu táo mèo trên chu t Hoàng Th Minh Tân [21] qu và lá táo mèo có kh năng ch ng

r i lo n trao đ i gluxit và lipit Vũ Th Huê, Bùi Th Vi t HƠ [49] đư có nh ng nghiên c u s b ghi nh n v tác d ng kháng khu n c a d ch lên men qu táo mèo

Ch ng 2 - NGUYÊN LI U VÀ PH NG PHÁP

2.1 NGUYÊN LI U

2.1.1 Ngu n gi ng

Các ch ng Vi sinh v t ki m đ nh l y t B o tàng Gi ng chu n VSV, Vi n VSV và Công Ngh Sinh h c - ĐH Qu c gia Hà N i, g m các ch ng; Shigella flexneri Klebsiella VTCC-B-814;E coli VTCC-B-883; Salmolella typhi VTCC-B-

897; Vibrio VTCC-B-652, Moraxella catarrhalis ATCC 43617

Ch ng Moraxella catarrhalis kháng kháng sinh, Staphylococcus aureus phân

l p t i B nh vi n Tai ậ Mũi ậ H ng Trung ng

2.1.2 Hóa ch t và thi t b

 Hóa ch t

- Các thành ph n hóa ch t dùng lƠm môi tr ng

- Các hóa ch t dùng trong tách chi t h p ch t thiên nhiên: DMSO, silicagel, florisil 100- 200 U.S.mesh,ethylaxetat, metanol, n-Butanol,ầ

 Thi t b : t m, máy lắc n nhi t, máy đo pH, máy ly tơm l nh, máy cô chân không, thi t b đông khô, h th ng chi t pha rắn, c t sắc kỦầ

2.2 PH NG PHỄP

2.2.1 Ph ng pháp lên men qu táo mèo

Sử d ng 1kg qu táo mèo t i, rửa s ch, cắt thành các ph n nh , đ nguyên

h t, cho vào bình th y tinh B sung 3 lít n c đun sôi m (kho ng 400C), 300 g

đ ng, 30 g mu i , đ y kín bình bằng v i màn Sau m t tháng thu d ch lên men qu táo mèo ậ gi m táo mèo

2.2.2 Ph ng pháp phơn l p vi khuẩn

D ch lên men qu táo mèo đư thu đ c nh vào các gi ng th ch trên đĩa petri

có ch a sẵn vi khu n Moraxalla catarrhalis Đ trong t l nh t 4-8 gi , sau đó đ

vào t m K t qu sau 72 gi cho th y gi m táo mèo có kh năng c ch s sinh

tr ng c a vi khu n M catarrhalis Vì v y, ti n hành phân l p vi khu n t d ch lên

men qu táo mèo Pha loãng d ch gi m bằng n c c t khử trùng theo h th p phân các n ng đ khác nhau t 10-1 đ n 10-6 vƠ tran đ u trên đĩa petri ch a môi tr ng

đ 6000 vòng/phút, 4oC trong 15 phút sau đó đ c nh v i l ng 0,1 ml vào m i

l th ch Đ c k t qu sau 2 ngày ho t tính kháng sinh xác đ nh d a vƠo kích th c vòng vô khu n (D-d, mm) Trong đó, D lƠ đ ng kính vòng vô khu n, d lƠ đ ng kính l khoan

2.2.3 2 Xác định ho t tính enzym

Xác đ nh kh năng sinh enzym ngo i bào (proteaza, kitinaza, xenlulaza, amylaza) trong d ch nuôi c y bằng ph ng pháp khu ch tán trên th ch ch a 1% c

ch t t ng ng (cazein, kitin, CMC, tinh b t tan)

Môi tr ng g m c ch t và th ch đ c khử trùng 1atm trong 30 phút, sau

đó đ c đ vào các đĩa petri đư đ c vô trùng, v i đ dày th ch kho ng 3mm, đ i ngu i, dùng khoan nút chai đ đ c các l th ch trên môi tr ng Nh 200µl d ch nuôi c y vi sinh v t vào các l th ch, r i đ vào t l nh 4-5h cho enzym khu ch tán vào th ch, sau đó chuy n vào t m 30-32oC Sau 24 gi đem ra hi n vòng phân

gi i bằng cách nhu m mƠu các đĩa bằng dung d ch Lugol (v i c ch t là CMC, kitin, tinh b t) và bằng axit triclo axetic v i c ch t là cazein

Ho t tính enzym đ c xác đ nh qua kích th c vòng phân gi i theo công

th c: Ho t tính enzym = D-d (mm) Trong đó: D lƠ đ ng kính vòng phân gi i, d là

đ ng kính l khoan

2.2.4 B o qu n gi ng

Vi khu n đ c nuôi trong ng th ch nghiêng th ch th ng, nuôi nhi t đ phòng Sau kho ng 10-14 ngày khi vi khu n đư m c t t c t vào t mát nhi t đ 4-

6oC Sau 1-2 tháng c y truy n l i m t l n

Nhằm b o qu n đ c gi ng lơu h n, đ gi ng trong ng cát, trong paraffin

l ng vô trùng gi l nh sâu trong glycerin hoặc đông khô, b o qu n đ c t 6 tháng

đ n 2 năm

2.2.5 Xác đ nh sinh kh i bằng ph ng pháp đo m t đ quang học-OD

S l ng t bào VSV trong d ch nuôi có th xác đ nh gián ti p bằng cách đo

m t đ quang h c D ch nuôi đ c pha loãng 5 l n, đo OD b c sóng 620nm 2.2.6 Xác đ nh các y u t nh h ng t i kh năng sinh tr ng và ho t tính kháng khu ẩn của vi khuẩn

Vi khu n đ c lên men trên môi tr ng d ch th trong bình nón dung tích 250ml v i các thành ph n và các y u t liên quan nh sau:

 Lựa chọn môi tr ờng nuôi cấy thích hợp

Ch ng nghiên đ c nuôi c y lắc 220 vòng / phút trên các môi tr ng khác nhau nhi t đ và pH thích h p Sau 2 ngƠy xác đ nh pH sau nuôi c y, m t đ t bào và ho t tính kháng khu n

 nh h ởng của pH

Nuôi lắc vi khu n 220 vòng/phút nhi t đ thích h p sau khi đư đi u ch nh

pH ban đ u c a môi tr ng các giá tr pH khác nhau v i b c nh y bằng 1 Xác

đ nh OD, pH, ho t tính kháng khu n sau nuôi c y

 nh h ởng của nguồn cacbon

B sung vƠo môi tr ng nuôi c y thích h p 1% các ngu n cacbon khác nhau là: kitin, tinh b t tan, dextrin, glucoza, CMC, lactoza, b t ngô Ti n hành nuôi c y

lắc vi khu n v i v n t c 220 vòng/phút Sau 2 ngƠy xác đ nh OD, pH sau khi nuôi

c y, ho t tính kháng khu n

 nh h ởng của nguồn nitơ

B sung ngu n nit khác nhau vƠo môi tr ng thích h p v i các hƠm l ng 1%: NaNO2, NaNO3, (NH4)2SO4, b t đ u t ng, cao n m men, peptone Các b c

ti p theo ti n hƠnh t ng t nh trên

 nh h ởng của thời gian nuôi cấy

Vi khu n đ c nuôi c y lắc trên môi tr ng v i ngu n cacbon, nit , pH thích

h p, c sau 24h l i l y m u đ xác đ nh OD, pH, ho t tính enzym, ho t tính kháng khu n

2.2.7 Tách chi t các h p ch t trong d ch lên men vi khu ẩn và d ch lên men qu

táo mèo [18]

2.2.7 1 Phương pháp đông khô

Đông khô lƠ quá trình mƠ n c đ c l y ra kh i m u khi các m u đang

tr ng thái l nh sâu đơy m u đ c lƠm l nh trong môi tr ng chân không Thi t

b đông khô s hút n c và cu i cùng m u đ c lƠm khô đ n m c nh t đ nh (m u

đ c hƠn kín đ cho môi tr ng ch a m u lƠ chơn không) Đơy lƠ ph ng pháp ph

bi n có hi u qu cao dùng đ b o qu n các đ i t ng vi sinh v t khác nhau nh n m

s i, n m men, vi khu n và m t s virut nh ng đôi khi cũng đ c sử d ng đ đ a

d ch chi t thƠnh d ng cao chi t

2.2.7 2 Phương pháp sắc ký cột

 Kh o sát hệ dung môi rửa gi i và pha rắn hấp phụ

Nh i pha h p ph rắn (Silicagel 0,063-0,2mm, Florisil 100-200 U.S.mesh) vào c t xilanh c 1 (d = 5mm) t ng l ng nh , lắc đ u, thông s thi t k c t đ c trình bày b ng 2.1:

B ng 2.1: Thông s ố thiết kế cột nhồi

Pha h p ph Kh i l ng (g) Chi u cao c t nh i (cm)

Pha m u vƠo methanol n ng đ kho ng 0,01 g/ml r i đ a lên c t 0,2 ml dung

dch nƠy Đ a c t lên h th ng chi t pha rắn vƠ thử nghi m s b đ kh o sát ch t

h p ph vƠ h dung môi rửa gi i

H dung môi rửa gi i đ c thử nghi m lƠ:

n-Hexan, Cloroform, Ethylaxetat, n-Butanol n-Hexan, Cloroform, Aceton, methanol n-Hexan, n-Butanol, Aceton, N c

K t qu nghiên c u s b th y ch t h p ph silicagel vƠ h dung môi rửa gi i n-Hexan, Cloroform, Aceton, methanol có th tách phơn đo n t ng đ i t t vƠ phù

h p Do đó ta đi kh o sát quá trình tách phơn đo n d ch chi t táo mèo vƠ d ch lên men trên c t sắc kỦ nh i to h n

 Phân đo n dịch chiết trên sắc ḱ cột

- Nhồi cột: Silicagel đ c s y 3000C trong 2h vƠ đ ngu i trong bình hút

m sau đó nh i c t có đ ng kính 1cm, chi u cao là 22cm

- Luyện cột: dùng metanol đ ho t hóa pha rắn, lƠm t đ pha rắn có th

sẵn sàng ti p xúc vƠ t ng tác v i các ch t tan Tránh không làm khô pha rắn trong

và sau khi luy n c t

- Cân b ằng cột: t ng t nh b c 2 (nh ng ph i dùng chính dung môi ch a

m u nh ban đ u đ cho vào c t) dùng metanol

- Đưa mẫu vào cột: pha các m u cao chi t trong methanol n ng đ

0,01g/ml Đ a 5ml dung d ch trên lên c t nh i

- Rửa gi i trên cột: dùng h dung môi rửa gi i lƠ: n-Hexan, Cloroform,

Aceton, methanol v i tỷ l ph i tr n khác nhau sao cho m c đ phơn c c tăng d n

T c đ dòng đi u ch nh sao cho th i gian ti p xúc gi a dung môi rửa và pha rắn kéo dài trong 1-2 phút

Ki m tra các phơn đo n trên sắc kỦ b n m ng đ thu gom các phơn đo n có

k t qu tri n khai t ng t nhau trong cùng m t h dung môi có k t qu g n gi ng nhau

2.2.7.3 Phương pháp kỉm tra phân đo n bằng sắc ḱ b n m̉ng

c a b n kho ng 0,5-1 cm thì l y ra, đánh d u m c dung môi trên b n m ng, s y khô

b n m ng r i soi UV hoặc phun các thu c thử hi n mƠu nh dung d ch H2SO4 10%

r i s y khô cho dung môi bay h t đ v t tri n khai trên b n m ng đ c hi n rõ Các h dung môi tri n khai đư thử nghi m khi nghiên c u các phơn đo n trên

b n m ng bao g m:

1 TEAF - Tuluen: Ethylacetae: Acetone: Acid Focmic = 5:3:1:1

2 Ethylaxetat: axit focmic: n c = 8:1:1

3 Toluen: Ethylaxetat: axit focmic = 5:4:1

4 [Axit acetic (2,4%) ậ Etanol ậAcetonitril (35: 5: 10)] - Metanol : (70: 30)

5 Metanol ậ Axit acetic ậ N c (36,7%: 0,3%: 63%)

6 Axit acetic (0,28%) ậ Metanol ậ Acetonitril (35: 5: 10)

7 n-Butanol ậ Axit acetic ậ N c (85: 5: 10)

8 n-Butanol ậ Etyl acetat ậ Dimetyl formamit ậ N c (10: 6: 3: 2)

9 Toluen ậ Etyl acetat ậ Aceton ậ Axit formic (15: 2: 2: 1)

10 Benzen ậ Aceton (4:1): Benzen ậ Pyridin ậ Axit formic (36: 9: 5)

2.2.8 Kh o sát s b thành ph n hóa học d ch chi t qu táo mèo vƠ phơn đo n kháng khu ẩn

2.2.8.1 Th ử định tính flavonoit

Ph n ứng Shinoda Pha m u thử trong ethanol v i m t l ng thích h p, b

sung vài gi t axit clohidric đặc và chia dung d ch thành hai ng nghi m

ng 1: dùng lƠm đ i ch ng

ng 2: th vài m nh Mg vƠo, đun trên ng n lửa đèn c n trong vài phút K t

qu d ng tính khi trong ng nghi m xu t hi n màu h ng, đ hay da cam

Ph n ứng diazo hóa: Dung d ch thử đ c pha t ng t nh trên Cũng chia

ng 2: Nh b sung vài gi t axit sulfuric K t qu s xu t hi n màu vàng

đ m n u dung d ch thử có ch a flavon hoặc flavonol MƠu đ hay nâu cho th y s

có mặt c a chalcon và auron