Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật tạo nguyên liệu thực phẩm giàu Glucosamine và protein từ cua đồng

Thông qua đó, góp phần đa dạng hóa các sản phẩm thực phẩm từ thủy sản vỏ cứng,tăng giá trị sử dụng của nguyên liệu, cải thiện được tình trạng ô nhiễm môi trường..  Đưa ra được quy trình

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

-

Nguyễn Thu Hiền

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Thành phố Hồ Chí Minh – 2012

Footer Page 2 of 148

Trang 3

L ỜI CẢM ƠN

Hoàn thành tốt được luận văn này, em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:

TS Lê Chi ến Phương là người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền

đạt kiến thức chuyên môn, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài Chân thành cảm ơn thầy đã giúp em gắn kết được khoa học với thực tiễn cuộc sống

TS Tr ần Thanh Thủy đã nhiệt tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến để em hoàn

thành đề tài này

Các thầy cô đã giảng dạy trong suốt khóa học để em có được kiến thức nền Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Các Thầy, Cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến cho luận văn của em

Các anh chị cán bộ phòng Công nghệ biến đổi Sinh học - Viện Sinh học Nhiệt đới TP Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Các chị học viên lớp vi sinh khóa 21 luôn giúp đỡ em trong suốt khóa học

Cuối cùng, con xin cảm ơn cha mẹ, những người thân yêu luôn bên cạnh, động viên con hoàn thành luận văn này

Nguyễn Thu Hiền

Trang 4

M ỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục kí hiệu và các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Danh mục các sơ đồ, biểu đồ và đồ thị

M Ở ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về glucosamine 3

1.1.1 Khái quát về glucosamine 3

1.1.2 Nguồn thu nhận glucosamine trong tự nhiên 3

1.1.3 Tác dụng dược lý của glucosamine 5

1.1.4 Tình hình sản xuất và sử dụng glucosamine hiện nay 6

1.2 Tổng quan về protein 6

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu 6

1.2.2 Cấu trúc protein 7

1.2.3 Chức năng sinh học 8

1.2.4 Nguồn cung cấp protein trong tự nhiên và nhu cầu sử dụng protein của cơ thể người 8

1.2.4.1 Nguồn cung cấp protein 8

1.2.4.2 Nhu cầu sử dụng protein của cơ thể người 10

1.3 Tổng quan về nguyên liệu cua đồng 10

1.3.1 Vị trí phân loại của cua đồng 10

1.3.2 Khu vực phân bố 10

1.3.3 Đặc tính sinh học 11

1.3.3.1 Hình thái 11

1.3.3.2 Cấu tạo bộ vỏ 11

1.3.4 Thành phần dinh dưỡng và tình hình sử dụng nguyên liệu cua đồng hiện nay 12

1.3.4.1 Giá trị dinh dưỡng 12

Trang 5

1.3.4.2 Tình hình sử dụng cua nguyên liệu hiện nay 12

1.3.5 Giá trị thực tiễn của cua đồng 13

1.3.5.1 Nguồn thực phẩm 13

1.3.5.2 Cua trong đông, nam dược 13

1.3.5.3 Những biến đổi bất lợi từ cua đồng 14

1.4 Tổng quan về các giống vi sinh vật sử dụng 16

1.4.1 Nấm mốc Aspergillus niger 16

1.4.1.1 Vị trí phân loại 16

1.4.1.2 Đặc điểm sinh học 16

1.4.1.3 Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của A.niger 17

1.4.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng-phát triển và tổng hợp chitinase của A.niger 18

1.4.1.5 Ứng dụng của A.niger và enzyme chitinase 19

1.4.2 Vi khuẩn Lactobacillus casei 20

1.4.2.3 Cơ sở hóa sinh của quá trình lên men lactic 20

1.4.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của L.casei 21

1.4.2.5 Các ứng dụng của vi khuẩn lactic và L.casei 23

1.4.3 Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens 25

1.4.3.3 Khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của B.amyloliquefaciens 25

1.4.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng-phát triển và tổng hợp protease của B.amyloliquefaciens 26

1.4.3.5 Các ứng dụng của B.amyloliquefaciens và protease 28

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

2.1 Vật liệu 29

2.1.1 Nguyên liệu 29

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 29

2.1.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 29

2.1.4 Các môi trường dinh dưỡng dùng trong nghiên cứu 29

2.2 Phương pháp 30

Trang 6

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu hình thái, các đặc tính sinh học của các chủng

vi sinh vật 30

2.2.1.1 Phương pháp quan sát hình thái A.niger 30

2.2.1.2 Phương pháp quan sát hình thái, đặc tính sinh học của vi khuẩn L.casei và B.amyloliquefaciens 32

2.2.1.3 Xác định sinh khối tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 35

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật và xác định hoạt độ enzyme 36

2.2.2.1 Nuôi cấy và xác định hoạt độ chitinase của A.niger 36

2.2.2.2 Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh chitinase của A.niger 37

2.2.2.3 Phương pháp nuôi cấy và xác định hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens 38

2.2.2.4 Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của B.amyloliquefaciens 40

2.2.3 Phương pháp khảo sát thành phần môi trường và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp acid của L.casei 41

2.2.3.1 Khảo sát môi trường lên men 41

2.2.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp acid của L.casei 43

2.2.4 Phân tích các chỉ tiêu của nguyên liệu và sản phẩm 43

2.2.4.1 Xác định độ ẩm 43

2.2.4.2 Xác định hàm lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl 44

2.2.4.3 Xác định hàm lượng Nitơ formol (Nformol) theo phương pháp Sorensen 45

2.2.4.4 Xác định hàm lượng nitơ amoniac (Namoniac) theo phương pháp chưng cất 46

2.2.4.5 Xác định hàm lượng calci 47

2.2.4.6 Xác định hàm lượng glucosamine tạo thành (phương pháp Elson- Morgan) 48

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 50

3.1 Kết quả quan sát hình thái, đặc điểm sinh học của các vi sinh vật 50

3.1.1 Bacillus amyloliquefaciens 50

3.1.1.2 Đặc điểm sinh học 50 Footer Page 6 of 148

Trang 7

3.1.2 Lactobacillus casei 51

3.1.3 Aspergillus niger 52

3.2 Kết quả định lượng hệ enzyme của các vi sinh vật 53

3.2.1 Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase của A.niger theo thời gian nuôi cấy 53 3.2.2 Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase của A.niger theo nhiệt độ môi trường 54

3.2.3 Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase của A.niger theo pH môi trường 55

3.2.4 Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase theo nồng độ chất cảm ứng 57

3.2.5 Kết quả khảo sát hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo thời gian nuôi cấy 58

3.2.6 Kết quả khảo sát hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo nhiệt độ môi trường 59

3.2.7 Kết quả khảo sát hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo pH môi trường 61

3.3 Kết quả khảo sát hàm lượng acid tổng được tổng hợp bởi L.casei 62

3.3.1 Kết quả khảo sát hàm lượng acid tổng theo thành phần môi trường 62

3.3.2 Kết quả khảo sát lượng acid tổng tạo ra theo hàm lượng đường 65

3.3.3 Kết quả khảo sát hàm lượng acid tổng tạo ra theo thời gian 67

3.3.4 Kết quả khảo sát hàm lượng acid tổng tạo ra theo nhiệt độ môi trường 68

3.3.5 Kết quả khảo sát hàm lượng acid tổng tạo ra theo pH môi trường 69

3.3.6 Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến khả năng tổng hợp acid bởi L.casei 70

3.4 Kết quả định danh B.amyloliquefaciens và L.casei 72

3.4.1 Kết quả định danh B.amyloliquefaciens 72

3.4.2 Kết quả định danh L.casei 72

3.5 Kết quả chế biến sản phẩm 73

3.5.1 Kết quả phân tích thành phần nguyên liệu 73

3.5.2 Kết quả khảo sát tỉ lệ cua xay: nước 73

3.5.3 Kết quả khảo sát tỉ lệ giống B.amyloliquefaciens cho vào hỗn hợp cua đồng xay 74

Trang 8

3.5.4 Kết quả phân tích hàm lượng Ntổng số, Nformol, Namoniac sinh ra trong quá

trình thủy phân hỗn hợp cua đồng xay bởi B.amyloliquefaciens 77

3.5.5 Kết quả khảo sát tỉ lệ dịch lên men bởi L.casei cho vào vỏ cua xay 78

3.5.6 Kết quả khảo sát hàm lượng khoáng calci trong vỏ cua được hòa tan theo thời gian 80

3.5.7 Kết quả khảo sát hàm lượng calci trong vỏ cua được hòa tan theo thời gian sau khi bổ sung thêm đường 82

3.5.8 Kết quả khảo sát tỉ lệ sinh khối A.niger và chitinase thô trong môi trường cho vào phần vỏ cua xay (chitin) đã được loại khoáng 85

3.5.9 Kết quả cảm quan sản phẩm, phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng và vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm 89

3.5.9.1 Cảm quan sản phẩm 89

3.5.9.2 Phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm 90

3.5.9.3 Phân tích chỉ tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm 91

3.6 Quy trình chế biến sản phẩm 91

3.6.1 Sơ đồ quy trình 92

3.6.2 Thuyết minh quy trình 93

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 95

4.1 Kết luận 95

4.2 Kiến nghị 96

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 97

Trang 9

DANH M ỤC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CFU/ml Số đơn vị khuẩn lạc trong 1ml mẫu

EDTA Acid etylen diamin teraaxetic

Trang 10

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Nguồn cung cấp protein 9

Bảng 1.2 Hàm lượng acid amin trong một số protein động vật và thực vật 9

Bảng1.3 Thành phần dinh dưỡng của cua đồng 12

Bảng 1.4 Một số nguyên liệu được dùng để lên men acid lactic 23

Bảng 1.5 Thành phần hóa học của dịch tương đậu nành và sữa đậu nành 24

Bảng 2.1 Đường chuẩn glucosamine 37

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm với enzyme 39

Bảng 2.3 Đường chuẩn tyrosin 40

Bảng 2.4 Thành phần các chất bổ sung vào môi trường 42

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái B.amyloliquefaciens 50

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái L.casei 51

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái A.niger 52

Bảng 3.4 Hoạt độ chitinase của A.niger theo thời gian 53

Bảng 3.5 Hoạt độ chitinase của A.niger theo nhiệt độ môi trường 54

Bảng 3.6 Hoạt độ chitinase của A.niger theo pH môi trường 56

Bảng 3.7 Hoạt độ chitinase của A.niger theo nồng độ chất cảm ứng 57

Bảng 3.8 Hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo thời gian nuôi cấy 58

Bảng 3.9 Hoạt độ protease theo nhiệt độ môi trường 60

Bảng 3.10 Hoạt độ protease của B amyloliquefaciens theo pH môi trường 61

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hàm lượng acid tổng 63

Bảng 3.12 Hàm lượng acid tổng sinh ra theo hàm lượng đường 65

Bảng 3.13 Hàmlượng acid tổng tạo ra theo thời gian 67

Bảng 3.14 Hàm lượng acid tổng tạo ra theo nhiệt độ môi trường 68

Bảng 3.15 Hàm lượng acid tổng tạo ra theo pH môi trường 69

Bảng 3.16 Hàm lượng acid tổng tạo ra theo tỉ lệ giống 71

Bảng 3.17 Thành phần nguyên liệu cua xay 73

Bảng 3.18 Tỉ lệ nước cho vào hỗn hợp cua xay 74

Bảng 3.19 Tỉ lệ giống B.amyloliquefaciens sử dụng thủy phân hỗn hợp cua đồng xay 75

Trang 11

Bảng 3.20 Chỉ số Ntổng số, Nformol, Namoniac 77

Bảng 3.21 Tỉ lệ vỏ cua xay: dịch lên men bởi L.casei 79

Bảng 3.22 Hàm lượng khoáng calci trong vỏ cua được hòa tan theo thời gian 81

Bảng 3.23 Hàm lượng đường bổ sung vào hỗn hợp vỏ cua xay và dịch lên men bởi

L.casei 83

Bảng 3.24 Hàm lượng glucosamine tạo thành với tỉ lệ chitin: sinh khối A.niger và

chitinase thô trong môi trường=1:1 86

Bảng 3.29 Các chỉ tiêu dinh dưỡng của sản phẩm bột cua đồng xay 90

Bảng 3.30 Các chỉ tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm trong 100g bột cua xay 91

Trang 12

DANH M ỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử glucosamine 3

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử và hệ thống sợi chitin 4

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử acid amin và mạch polypeptide 7

Hình 1.4 Bốn bậc cấu trúc của protein 8

Hình 1.5 Hình thái cua đồng 11

Hình 1.6 Cấu tạo bộ vỏ của cua đồng 11

Hình 1.7 Sơ đồ biến đổi của động vật thủy sản sau khi chết 14

Hình 1.8 Sơ đồ chuyển hóa lên men lactic đồng hình và dị hình 21

Hình 3.1a Hình thái đại thể B.amyloliquefaciens 50

Hình 3.1b Hình thái vi thể B.amyloliquefaciens 50

Hình 3.2 Vòng phân giải casein của B.amyloliquefaciens 50

Hình 3.3a Hình thái đại thể L.casei 51

Hình 3.3b Hình thái vi thể L.casei 51

Hình 3.4 Khả năng làm đông tụ sữa của L.casei 51

Hình 3.5 Khả năng làm đổi màu thuốc thử Ufermen của L.casei 52

Hình 3.6a Hình thái đại thể A.niger 52

Hình 3.6b Hình thái vi thể A.niger 52

Hình 3.7 Vòng phân giải huyền phù chitin 52

Hình 3.8 Sản phẩm bột cua xay được xử lý bằng phức hệ vi sinh vật 90

Trang 13

DANH M ỤC CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ

Sơ đồ 2.1 Quy trình bố trí thí nghiệm 30

Đồ thị 3.1 Hoạt độ chitinase của A.niger theo thời gian nuôi cấy 53

Đồ thị 3.2 Sự biến thiên hoạt độ chitinase theo nhiệt độ môi trường 55

Đồ thị 3.3 Biến thiên hoạt độ chitinase của A.niger theo pH môi trường 56

Đồ thị 3.4 Biến thiênhoạt độ chitinase của A.niger theo nồng độ chất cảm ứng 57

Đồ thị 3.5 Biến thiên hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo thời gian 59

Đồ thị 3.6 Biến thiên hoạt độ protease theo nhiệt độ môi trường 60

Đồ thị 3.7 Biến thiên hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens theo pH môi trường 62

Biểu đồ 3.8 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hàm lượng acid tổng 64

Biểu đồ 3.9 Sự biến thiên lượng acid tổng theo hàm lượng đường 66

Biểu đồ 3.10 Sự biến thiên lượng acid tổng theo thời gian 67

Biểu đồ 3.11 Sự biến thiên lượng acid tổng theo nhiệt độ môi trường 68

Biểu đồ 3.12 Sự biến thiên lượng acid tổng theo pH môi trường 70

Biểu đồ 3.13 Sự biến thiên lượng acid tổng theo tỉ lệ giống 71

Biểu đồ 3.14 Sự biến thiên Nformol khi bổ sung các tỉ lệ giống khác nhau theo thời gian thủy phân 76

Đồ thị 3.15 Sự biến thiên Ntổng số , Nformol và Namoniac theo thời gian thủy phân 78

Biểu đồ 3.16 Sự biến thiên hàm lượng Ca2+hòa tan vào môi trường dịch lên men 80 Biểu đồ 3.17 Sự biến thiên hàm lượng Ca2+ hòa tan theo thời gian 81

Biểu đồ 3.18 Sự biến thiên lượng acid tổng và pH môi trường trong thời gian trích ly calci 82

Biểu đồ 3.19 Hàm lượng Ca2+ hòa tan khi bổ sung các lượng đường khác nhau 84

Đồ thị 3.20 Hàm lượng acid tổng tạo ra khi bổ sung các lượng đường khác nhau 84

Biểu đồ 3.21 Sự biến đổi hàm lượng glucosamine theo các tỉ lệ chitin: dịch sinh khối A.niger và chitinase thô trong môi trường 88

Sơ đồ 3.1 Quy trình chế biến cua đồng xay thành nguyên liệu thực phẩm giàu các thành phần được thủy phân (protein, chitin và calci hòa tan) 92

Trang 14

M Ở ĐẦU

Cua đồng là loại thủy sản có trữ lượng lớn và giá trị dinh dưỡng cao, được nhân dân ta sử dụng làm thực phẩm phổ biến từ lâu đời Bởi thịt cua đồng rất thơm ngon với hàm lượng protein chiếm đến 12,3%, đồng thời lượng khoáng chất chủ

yếu là calci rất dồi dào

Tuy nhiên, bộ vỏ của chúng chiếm hơn 50% trọng lượng cơ thể hầu như là

phế thải Nguồn phế liệu này là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất glucosamine – một hợp chất tự nhiên quý, được dùng trong y học để cải thiện các

bệnh về khớp như: thoái hóa khớp, tăng lượng dịch bôi trơn khớp, tăng độ bền của dây chằng khớp

Trong nhiều trường hợp, để sản xuất glucosamine, người ta phải dùng vỏ tôm

đã bóc khỏi thịt và dùng hóa chất để xử lý Nhưng việc đó không thể thực hiện đối

với cua đồng, ghẹ, ba khía Để có thể sử dụng nguyên liệu cua đồng một cách dễ dàng, chúng tôi tiến hành xử lý cả con (cả vỏ lẫn thịt), bằng phức hệ vi sinh vật tạo được nguyên liệu thực phẩm giàu glucosamine cùng toàn bộ protein và khoáng (chủ

yếu là calci) giàu giá trị dinh dưỡng

Thông qua đó, góp phần đa dạng hóa các sản phẩm thực phẩm từ thủy sản vỏ

cứng,tăng giá trị sử dụng của nguyên liệu, cải thiện được tình trạng ô nhiễm môi

trường Chúng tôi chọn thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật tạo

nguyên liệu thực phẩm giàu glucosamine và protein từ cua đồng.”

M ục đích của đề tài

Tạo được nguyên liệu thực phẩm mới cho con người từ cua đồng, hạn chế phế

thải ở mức tối thiểu

Nhi ệm vụ của đề tài

 Phân tích thành phần nguyên liệu ban đầu và nguyên liệu sau khi đã xử lý

 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh protease-

B.amyloliquefaciens, acid- L.casei, chitinase –A.niger

 Sử dụng VSV để chế biến cua đồng thành nguyên liệu thực phẩm

Trang 15

 Đánh giá chất lượng dinh dưỡng và vệ sinh an toàn thực phẩm của nguyên

liệu thực phẩm đã được chế biến

 Đưa ra được quy trình chế biến cua đồng thành nguyên liệu thực phẩm

Nét m ới của đề tài

 Sử dụng sinh khối B.amyloliquefaciens thủy phân protein trong thịt và vỏ cua

đồng xay để chế biến nguyên liệu thực phẩm là tác nhân thứ nhất

 Sử dụng phụ phẩm của quá trình sản xuất đậu phụ chính là dịch tương đậu

nành làm môi trường lên men tạo acid bởi L.casei, để trích ly calci trong vỏ cua,

đồng thời bảo quản thực phẩm là tác nhân thứ hai

 Sử dụng dịch sinh khối A.niger và enzyme chitinase thô để thủy phân chitin

Trang 16

Công thức phân tử của glucosamine: C6H13O5N Phân tử lượng: Mphân tử glucosamine = 179,17đvC

Tên UIPAC: (3R,4R,5S,6R)-3-amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4,5-triol

Tên gọi thông dụng: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose; 2-amino-2-deoxy-β-D glucopyranose; chitosamine; D-glucosamine; D-(+)- glucosamine [16]

Hình 1.1 C ấu trúc phân tử glucosamine [42]

 Tính ch ất lý hóa

Glucosamine là chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi, điểm nóng chảy

880C, điểm phân hủy 1100C, tan được trong nước và trong methanol sôi, hơi tan trong ethanol, không tan trong ether và chloroform [28] [42]

1.1.2 Ngu ồn thu nhận glucosamine trong tự nhiên

Glucosamine được điều chế từ chitin, một polymer của các gốc acetylglucosamine nối với nhau bằng các liên kết 1,4- glycoside Chitin là một

N-Footer Page 16 of 148

Trang 17

polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, một polymer sinh học được tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật Lượng chitin được sản xuất trên thế giới hàng năm chỉ đứng sau cellulose, trung bình một năm là 20g/m2

[51]

Trong tự nhiên, chúng hiếm khi tồn tại ở trạng thái tự do mà hầu như liên kết dưới dạng chitin- protein Điều này dẫn đến sự đề kháng với các hóa chất và các men thủy phân gây khó khăn cho việc chiết tách, tinh chế chúng Chitin thường thấy trong động vật không xương sống như giun tròn, chân khớp, trong thành tế bào nấm

và một số loài tảo Chlorophiceae Đối với động vật thủy hải sản, đặc biệt trong vỏ

tôm, cua, mai mực… hàm lượng chitin chiếm khá cao từ 14%- 35% so với trọng lượng khô Là nguồn nguyên liệu dồi dào để cung cấp chitin để chiết xuất chitosan, glucosamine phục vụ cuộc sống con người (Yildiz Bolat và cộng sự, 2010) [54][72]

Hình 1.2 C ấu trúc phân tử và hệ thống sợi chitin[59], [72]

Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đó là cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với nhau bằng các mối nối hydro và tạo thành một hệ thống sợi [39]

Chitin không tan trong nước, trong dung dịch acid và kiềm loãng, trong cồn và trong các dung môi thông thường Nó chỉ tan được trong một số acid vô cơ đậm đặc (HCl, H2SO4, H3PO4…) [67]

Chitin ổn định với các chất oxy hoá mạnh như thuốc tím (KMnO4); oxy già (H2O2); nước javen (NaOCl - NaCl)…, lợi dụng tính chất này người ta sử dụng các

chất oxy hoá trên để khử màu cho chitin [67]

Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 - 50%) thì chitin sẽ bị mất

gốc acetyl tạo thành chitosan [67]

Trang 18

Khi đun nóng trong axit HCl đậm đặcthì chitin bị cắt mạch thu được glucosamine Chitin còn bị thủy giải bởi enzyme chitinase [67]

1.1.3 Tác d ụng dược lý của glucosamine

Glucosamine đóng vai trò là tiền chất để tổng hợp glucosaminoglycan (hay mucopolysaccharide) – một hợp chất tham gia cấu tạo nên proteoglycan Proteoglycan là thành phần cơ bản cấu tạo nên sụn khớp (chiếm 15-40% so với

trọng lượng khô của sụn) cùng với collagen (60-80% so với trọng lượng khô của

sụn) và nước (chiếm 70-85% tổng trọng lượng của sụn) [50]

Glucosamine được hấp thu vào trong cơ thể chủ yếu ở dạng dẫn xuất của nó Các dẫn xuất glucosamine thông dụng được dùng phổ biến ngày nay là: glucosamine hydrochlorua, glucosamine sulfat, acetyl glucosamine [47]

Glucosamine được sản sinh trong cơ thể người từ 4- 20g/ngày từ sự chuyển hóa glucose (Vosseller et al.2002) [47]

Liều lượng glucosamine cho phép bổ sung vào cơ thể từ 0,5- 1,5g/ngày (Glaza 2002) [43]

Các bệnh liên quan đến thiếu glucosamine Đối với khớp: glucosamine đồng thời ức chế các enzym phá hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase và giảm các gốc tự do superoxide phá hủy các tế bào

sụn [47]

Khi thiếu glucosamine thì sụn đặc biệt là sụn khớp háng, đầu gối bị hỏng, cứng,

tạo gai xương gây biến dạng khớp làm hạn chế vận động, dẫn đến bệnh viêm xương

khớp phát triển Và viêm khớp là bệnh khá phổ biến thường dẫn đến sự lão hóa sụn, làm khô và sưng tấy khớp xương Hiện vẫn chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu Thông thường nhất là sử dụng aspirin hoặc dẫn xuất ibprofan Những thuốc chống viêm không có steroid (NSAID) có thể rất nguy hiểm Có những chứng minh rằng sau

thời gian dài sử dụng NSAIDS có thể thúc đẩy sự hủy hoại khớp xương, hơn nữa,

những thuốc này có tác hại cho gan và thận [ 23], [65]

Glucosamine có thể giúp phục hồi khớp của người bệnh nhờ sự đổi chỗ glucose cho glucosamine tương tự con đường chuyển hóa glucose vào trong tế bào

Trang 19

Glucosamine có tác dụng kích thích tạo mô liên kết, giúp điều chỉnh khớp xương,

hạn chế sự thoái hóa proteoglycan và khôi phục lại sụn [47], [66]

Đối với hệ bài tiết: sự phân hủy albumin hơn mức bình thường là đặc điểm sinh hoá lên quan đến bệnh tiểu đường Glucosamine có khả năng làm giảm tốc độ bài

tiết albumin để bảo vệ chức năng thận, nên đã được thử nghiệm để chữa trị bệnh

tiểu đường Theo Skaha và cộng sự (1996), bệnh nhân bị tiểu đường sau khi uống glucosamine từ 3- 6 tuần cho kết quả tốc độ bài tiết albumin đều giảm và hiệu quả này kéo dài 3-6 tuần sau khi sử dụng thuốc [65]

Glucosamine với các tác dụng khác: glucosamine còn là thành phần cấu tạo màng tế bào và protein màng, chúng ảnh hưởng đến sự hình thành các cơ quan như: móng, tóc, da, chất hoạt dịch, màng nhầy của hệ tiêu hóa, hô hấp [65]

1.1.4 Tình hình s ản xuất và sử dụng glucosamine hiện nay

Ở Đức, glucosamine được dùng hỗ trợ điều trị viêm khớp từ năm 1969

Hiện nay các nước Anh, Mỹ, Nhật, các sản phẩm là dẫn xuất của glucosamine,

trong đó glucosamine sulfate và glucosamine hychlorua chiếm hơn 70% được sử

dụng phổ biến để chữa bệnh viêm khớp

Ở Việt Nam sử dụng một số loại thuốc có chứa glucosamine, nhưng các thuốc này chủ yếu vẫn nhập khẩu từ nước ngoài, với các tên biệt dược như Gosamil (Hàn

Quốc), Bosamin (Mỹ), Viatril (Ý)…[9], [75]

1.2 T ổng quan về protein

1.2.1 L ịch sử nghiên cứu

Protein được phát hiện lần đầu tiên ở thế kỷ XVIII bởi Beccari (1745), được

gọi là albumin (lòng trắng trứng) Mãi đến năm 1838, Mulder lần đầu tiên đưa ra thuật ngữ protein (xuất phát từ chữ Hy lạp proteos nghĩa là “đầu tiên”, “quan trọng

nhất”) Biết được tầm quan trọng và nhu cầu xã hội về protein, đến nay nhiều công trình nghiên cứu và sản xuất hợp chất này đã được công bố, đã đem lại nhiều ý nghĩa hết sức to lớn phục vụ cho nhân loại [48]

Trang 20

1.2.2 C ấu trúc protein

Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là acid amin Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide gọi là chuỗi polypeptide

Hình 1.3 C ấu trúc phân tử acid amin và mạch polypeptide[48]

Protein có cấu trúc rất phức tạp Trong thành phần hóa học của protein chứa: carbon (50-55%); oxy (22-26%); nitơ (12-19%); hydro (6-8%); và lưu huỳnh (0-2%) Mặc dù chúng rất khác nhau về cấu trúc, chức năng, thành phần hóa học, kích thước nhưng khi bị thủy phân chúng đều phân giải thành các axit amin [48]

Khối lượng phân tử được tính bằng dalton, thông thường từ hàng trăm đến hàng triệu dalton

Các chuỗi polypeptide có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein

Cấu trúc bậc 1: là trình tự sắp xếp các acid amin trong 1 chuỗi polypeptide Đây

là bậc cấu trúc đơn giản và là cơ sở quan trọng nhất của tất cả các protein

Cấu trúc bậc 2: xảy ra khi trình tự các acid amin trong 1 chuỗi polypeptide nối

với nhau bằng các liên kết hydro Cấu trúc này có 2 kiểu cơ bản là xoắn alpha và

gấp nếp beta (tấm beta)

Cấu trúc bậc 3: xảy ra khi có lực hấp dẫn có mặt giữa các vùng xoắn alpha và

tấm beta trong 1 chuỗi polypeptide Hình thành cấu trúc cuộn gập hình khối cầu

Cấu trúc bậc 4: protein gồm 2 hoặc nhiều chuỗi polypeptide cùng loại hay khác

loại kết hợp với nhau Đây là mức cấu trúc cao nhất của protein, thường chứa vùng

cấu trúc cuộn chặt gọi là các domain [48]

Trang 21

Hình 1.4 B ốn bậc cấu trúc của protein [48]

1.2.3 Ch ức năng sinh học

Protein là hợp chất hữu cơ quan trọng đặc biệt của cơ thể sống, chiếm đến hơn 50% trọng lượng khô của tế bào, đảm nhận rất nhiều chức năng quan trọng Được chia thành 3 nhóm chức năng chính như sau:

Tạo hình: vai trò quan trọng nhất của protein là tạo hình cho cơ thể Khi protein kết hợp với gluxid, lipid, acid nucleic tạo các dạng protein phức tạp như lipoprotein, glycoprotein, nucleoprotein…Những chất này tham gia trong cấu tạo tế bào và mô

Điều hòa hoạt động cơ thể: protein là thành phần cấu thành nên các hormone, enzyme là những chất tham gia vào hoạt động điều hòa chuyển hóa và tiêu hóa Protein tham gia duy trì cân bằng dịch thể trong cơ thể, sản xuất kháng thể

Cung cấp năng lượng: protein là nguồn cung cấp năng lượng và dự trữ năng lượng chính cho cơ thể Năng lượng từ protein cung cấp cho cơ thể từ 12%-15%/ngày [3], [48]

1.2.4 Ngu ồn cung cấp protein trong tự nhiên và nhu cầu sử dụng protein của cơ

th ể người

1.2.4.1 Ngu ồn cung cấp protein

Nguồn cung cấp protein chính cho con người chủ yếu từ nguồn gốc động vật chiếm hơn 50%, ngoài ra thực vật, vi sinh vật cũng là nguồn cung cấp đáng kể như sau:

Trang 22

B ảng 1.1 Nguồn cung cấp protein [4]

[Ngu ồn: bảng thành phần dinh dưỡng, (Bộ y tế, 2007)]

Giá trị dinh dưỡng một loại protein cao khi thành phần axit amin cần thiết trong

đó cân đối và ngược lại Rose và cộng sự, (1938) đã phát hiện 8 acid amin cơ thể không tự tổng hợp được và bắt buộc phải được cung cấp từ thực phẩm bên ngoài

Do đó, 8 acid amin này được gọi là acid amin thiết yếu, gồm có: isoleusine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan và valine

Động vật là là nguồn cung cấp protein chính cho con người vì protein động vật

chứa hầu như đầy đủ các loại acid amin thiết yếu với hàm lượng cao hơn hẳn so với acid amin từ thực vật (Godfrey et al., 1996) [48]

B ảng 1.2 Hàm lượng acid amin trong một số protein động vật và thực vật [4]

Thịt bò Trứng Sữa Đậu nành Ngô Lúa mì

Trang 23

1.2.4.2 Nhu c ầu sử dụng protein của cơ thể người

Cấu trúc protein cơ thể khác với các cấu trúc protein thực phẩm Cơ thể phải tự

sản xuất ra các protein của mình bằng cách chọn những acid amin cần thiết từ các protein thực phẩm và kết hợp chúng lại theo các trình tự nhất định Quá trình đó gọi

là sự tổng hợp protein

Nhu cầu sử dụng protein thay đổi rất nhiều tùy thuộc vào lứa tuổi, trọng lượng,

giới tính, những biểu hiện sinh lý (phụ nữ có thai, cho con bú, bệnh lý…) Nhu cầu khuyến nghị sử dụng protein dành cho người Việt Nam, theo tổ chức y tế thế giới (WHO, 2005) như sau:

Trẻ em 0- dưới 6 tháng tuổi: cần 2,39- 2,46 g/kg thể trọng/ngày

Trẻ em 7- dưới 1 tuổi: cần 21- 21g/ngày

Trẻ em 1 tuổi -10 tuổi: cần 35- 64 g/ngày

Trẻ vị thành niên 10- 18 tuổi: cần 68- 78g/ngày Người trưởng thành: cần 54- 112 g/ngày

Phụ nữ có thai: nhu cầu bình thường của người trưởng thành cộng thêm 10- 15g/ngày [3], [48]

1.3 T ổng quan về nguyên liệu cua đồng

1.3.1 V ị trí phân loại của cua đồng

Loài: Somaniathelphusia sinensis [30]

Cua đồng hay còn gọi là cua nước ngọt thuộc lớp giáp xác, bộ 10 chân

1.3.2 Khu vực phân bố

Cua đồng có khu vực phân bố rộng rãi tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như: Việt Nam, Lào, Campuchia, Trung Quốc, Philippine,…

Trang 24

Tại Việt Nam, loài cua đồng thường gặp nhất là Somanniathelphusa sinensis

thuộc họ Parathelphusidae Chúng có mặt ở các vùng đồng bằng từ Bắc tới Nam Cua rất phổ biến tại các khu thủy vực nước ngọt, nhất là tại các ruộng lúa [26] [30]

1.3.3 Đặc tính sinh học

1.3.3.1 Hình thái

Cua cái có 4 đôi chân bụng, cua đực có 2 đôi chân bụng biến thành

chân giao cấu Vỏ đầu ngực gồ cao,

hơi rộng ngang, màu nâu đất xanh,

hoặc tím đỏ hoặc đen

Hình 1.5 Hình thái c ua đồng

Cua đực khác cua cái ở hình thái phần bụng (thường gọi là yếm) Trứng cua

nằm ở dưới yếm và nở thành cua con

Cua đồng sinh sống ở vùng nước ngọt, ở pH từ 5,6– 8,0; nhiệt độ từ 10-310C,

tốt nhất là 15–250C, chúng sinh sản quanh năm

Tuổi thọ trung bình của cua từ 1 - 2 năm Qua mỗi lần lột xác trọng lượng cua tăng trung bình 20-50% [74]

1.3.3.2 C ấu tạo bộ vỏ

Bộ vỏ của giáp xác nói chung và cua đồng nói riêng còn được gọi là “bộ xương thứ 3” của giới sinh vật (sau bộ xương của người và động vật, khung cellulose của thực vật)

Bộ vỏ chính là sản phẩm tiết của

mô bì

Thành phần hóa học của bộ vỏ được chia thành 2 tầng

• Tầng mặt (epicuticum) là lớp

mỏng, có bản chất là lipoprotein,

cản trở trao đổi nước Hình 1.6 C ấu tạo bộ vỏ của cua đồng [1]

Trang 25

• Tầng dưới (procuticum) dày hơn, giàu chitin và protein gồm 2 tầng: tầng ngoài (exocuticum) có ngấm thêm các muối khoáng chủ yếu là calcicarbonate và calciphotphate) và protein selerotin nên rất cứng Tầng trong (endocuticum) chủ yếu

là chitin và protein relizin mềm dẻo

Trung bình trong vỏ cua chứa 30-50% calcicarbonate, 30-40% protein và 30% chitin Tuy nhiên, lượng chitin này thay đổi theo loài, theo mùa và từng giai

20-đoạn phát triển (Cho et al., 1998) [1], [59]

1.3.4 Thành ph ần dinh dưỡng và tình hình sử dụng nguyên liệu cua đồng hiện nay

1.3.4.1 Giá tr ị dinh dưỡng

Trong 100g cua ăn được với tổng năng lượng là 87Kcal chứa các thành

phần cơ bản ở bảng 1.5 như sau:

B ảng1.3 Thành phần dinh dưỡng của cua đồng [4]

(Ngu ồn: bảng thành phần dinh dưỡng, Bộ y tế 2007)

Ngoài ra, trong thịt cua đồng chứa nhiều loại vitamin như vitamin A (210µg); vitamin B1 (0,01g); vitamin PP (2,1g)…

Do đó, thịt cua đồng là loại thịt thơm ngon, dễ hấp thụ, đặc biệt không chứa cholesterol như thịt heo, thịt bò… [2], [5]

1.3.4.2 Tình hình s ử dụng cua nguyên liệu hiện nay

Trang 26

(Thống kê của FAO, 2005) Ngoài ra, năm 2004 Trung Quốc đã xuất cảng 800 tấn cua sống qua các thị trường Hong Kong, Nhật Bản, Hàn Quốc [19], [74]

 Việt Nam

Theo ước lượng sơ bộ thì sản lượng cua đồng ở Việt Nam có khoảng hàng

vạn tấn Do hiện nay kỹ thuật canh tác mới, đã xây dựng thuỷ lợi, sử dụng thuốc trừ sâu trong sản xuất lúa nên làm giảm nguồn lợi cua đồng ở nhiều địa phương [74]

Cua đồng được các địa phương ở đồng bằng sông Cửu Long như Đồng Tháp, Vĩnh Long, An Giang thử nghiệm nuôi và đạt hiệu quả khá cao với năng suất

từ 1 tấn- 1,5 tấn/1ha [74]

1.3.5 Giá tr ị thực tiễn của cua đồng 1.3.5.1 Ngu ồn thực phẩm

Cua đồng được sử dụng phổ biến làm thực phẩm trong cuộc sống hàng ngày

của đa số các nước phương Đông, đặc biệt là Việt Nam

Ở nước ta, cua đồng là món ăn tương đối rẻ nhưng không kém phần hấp dẫn

bổ dưỡng Cua đóng góp một số món ăn trong kho tàng ẩm thực : canh cua, bún riêu cua, cháo cua đồng đến những món ăn dân gian như mắm còng, mắm cáy, mắm ba khía [2], [19]

1.3.5.2 Cua trong đông, nam dược

Cua đồng còn gọi điền giải có tính lạnh, vị tanh, mặn có các tác dụng tán huyết, bổ gân cốt đả thông kinh mạch, tác động vào các kinh mạch thuộc can và cả

ngũ tạng

Trong "Nam dược Thần hiệu", Tuệ Tĩnh đã ghi: điền giải= cua đồng, vị mặn, tính hàn hơi độc, sinh phong liền gân, nối xương, trị nhiệt tả, bạt độc, trừ ghẻ lở và máu kết cục

Cua đồng giã nát lấy nước cốt, có tác dụng làm liền gân cốt, phá được các chứng ứ huyết, đọng máu, trị được hoàng đản (vàng da) Cua đồng cũng được dân gian dùng để trị các trường hợp ngộ độc do ăn khoai mì gạch cua hay giải hoàng được dùng để thoa các vết lở, ghẻ, chữa đứt tay, đứt gân, nứt thịt Mai cua hay giải xác: vị chua, tính hàn, tác dụng phá ư, tiêu tích [2]

Trang 27

1.3.5.3 Nh ững biến đổi bất lợi từ cua đồng

Cua đồng và các loại thủy hải sản khác (tôm, ghẹ, mực, nhuyễn thể….) thủy

hải sản đã chết hoặc chế biến không hợp vệ sinh thì có những tác hại rất lớn đến

sức khỏe con người Nguyên nhân chính là sau khi đánh bắt, hoặc bắt đầu chết, nguyên liệu thủy sản xảy ra hai quá trình biến đổi chính:

Hình 1.7 Sơ đồ biến đổi của động vật thủy sản sau khi chết [27]

 Quá trình t ự phân giải

Dưới tác dụng của hệ enzyme có sẵn trong cơ thể sẽ làm biến đổi nguyên liệu

thủy sản sau khi chết từ trạng thái rắn sang mềm Kết quả của quá trình này là thủy phân chủ yếu protein và lipid, tạo ra các sản phẩm đơn giản: pepton, polypeptide, acid amin dãy thơm và acid béo (acid formic, acid acetic…) Đặc biệt, khi phân hủy các acid amin chứa S2- sẽ tạo ra H2S và dẫn xuất của nó làm cho nguyên liệu thủy

sản có mùi thối, khai đặc trưng [25], [27]

Quá trình tự phân giải mạnh hay yếu, nhanh hay chậm tùy thuộc vào: giống loài thủy sản, môi trường pH, các loại muối dùng ướp bảo quản, nhiệt độ môi trường [27]

 Quá trình phân h ủy do vi sinh vật

Không có ranh giới phân biệt rõ ràng giữa quá trình tự phân và tác động của hệ

vi sinh vật Tác động của vi sinh vật xảy ra theo kiểu “gối đầu” Vi sinh vật chính là tác nhân chính gây nên sự thối rữa và hư hỏng của nguyên liệu Có 2 khu hệ vi sinh

vật lưu trú trên cơ thể động vật thủy sản là:

Trong nội tạng của thủy sản chứa từ 103-109 CFU/g Vi sinh vật thường thấy là

Clostridium putrificus và nhóm E.coli

Trang 28

Chúng xâm nhập từ ngoài môi trường vào nguyên liệu với mật độ từ 102-107CFU/cm2 Đối với giáp xác, nhuyễn thể là các loài sống ở tầng đáy nên rất dễ bị các loài vi sinh vật trong nước, đất, bùn thâm nhập vào cơ thể Điển hình như các loài

Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus,…[27]

Dưới tác dụng của vi sinh vật, sự thối rữa diễn ra nhanh chóng, bắt đầu từ mặt ngoài cơ thể xâm nhập vào bên trong Protein bị phân hủy, giải phóng NH3, môi trường dần chuyển về kiềm tính, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật gây thối phát triển., làm biến sắc nguyên liệu, xuất hiện mùi khó ngửi là các hợp chất indol, skatol…Và các chất độc hình thành như histamin, methylamine, coridin có trong thịt cua thối rữa Do đó, rất dễ bị ngộ độc thực phẩm khi ăn phải thịt hải sản chết, đặc biệt thịt của các loại giáp xác (cua, tôm, ghẹ…) Bên cạnh đó cũng sẽ bị ngộ độc do ngoại độc tố và nội độc tố của các vi sinh vật gây nên Triệu chứng thấy nhanh rõ nhất là đau bụng, tiêu chảy, sốt cao, có thể co giật, tử vong nếu không chữa trị kịp thời [29], [76]

Ngoài tác hại của quá trình biến đổi của nguyên liệu thủy hải sản nói trên, thì tình trạng nhiễm độc kim loại nặng do ăn các loại thủy sản (giáp xác, nhuyễn thể…) rất đáng để lưu tâm

Môi trường sống của các loài giáp xác, nhuyễn thể ở tầng đáy hoặc vùi trong

lớp bùn sẽ lắng đọng và tích tụ nhiều chất ô nhiễm có nguồn gốc từ hoạt động sống

của con người trong nông nghiệp, công nghiệp và sinh hoạt Nên khả năng xâm thực

của kim loại nặng (arsen, thủy ngân, chì, cadimi…) vào cơ thể của động vật giáp xác, nhuyễn thể là rất lớn, đặc biệt ở những vùng đất nhiễm phèn nặng như đồng

bằng sông Cửu Long là điều không tránh khỏi (Zeng et al., 1997), (Tam & Wong, 2000) [24]

 Các tác h ại của kim loại nặng ảnh hưởng trực tiếp đến cơ thể người

Chì: Nhiễm chì có thể dẫn đến vô sinh, sảy thai, mắc phải các rối loạn về thần kinh

Trang 29

Thủy ngân: gây ra một loạt các triệu chứng bao gồm rối loạn tâm lý, nhức đầu,

chảy máu nướu răng, đau ngực, đau bụng, mệt mỏi kinh niên, dị ứng, nổi mẩn, ảnh hưởng tới sinh sản

Arsen: hợp chất này tích lũy dần dần trong cơ thể, và nếu nồng độ đủ cao sẽ gây tử vong Những trường hợp ngộ độc nhẹ có thể sẽ là “ngòi nổ” cho các bệnh ung thư, các bệnh về tim mạch và các bệnh về đường tiêu hóa Dẫn lời của bác sĩ Nguyễn Bá Huy Cường- khoa dược đại học Curtin, Úc (2009) chỉ ra rằng muối hữu

cơ của arsen thường tích lũy trong những loại hải sản có vỏ cứng thì kém độc hơn

arsen vô cơ được dùng trong thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ hoặc để xử lý gỗ [78]

 Gi ới hạn an toàn mức độ kim loại nặng vào cơ thể người [5]

Arsen: 0,015 mg/kg thể trọng (tính theo arsen vô cơ) Chì: 0,025 mg/kg thể trọng

Thuỷ ngân: 0,005 mg/kg thể trọng

1.4 Tổng quan về các giống vi sinh vật sử dụng

1.4.1 N ấm mốc Aspergillus niger 1.4.1.1 V ị trí phân loại

Loài: Aspergillus niger [12]

Van Tieghem là người đầu tiên phát hiện và phân lập chủng nấm mốc A.niger

từ hạt chứa nhiều dầu như hạt đậu phộng, đậu tương, ngũ cốc, A.niger cũng được

phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống

Giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu tiên vào năm 1729 Năm 1901, Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này [12]

1.4.1.2 Đặc điểm sinh học

Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử đính không nằm trong bọc bào tử,

Trang 30

cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọng lớn hình cầu 20-30µm, màu nâu đen

Thể bình gồm 2 lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình chai, bào tử đính xòe ra, có hình cầu xù xì, có gai, màu nâu đến đen than, đường kính 4-5µm [11], [12]

1.4.1.3 Kh ả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của A.niger

 Gi ới thiệu về chitinase

Chitinase còn gọi là [poly β-1,4-(2- acetamido-2-deoxy)-D-glucosid glucanohydrolase Là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N-acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thuỷ giải liên kết β-1,4-glucoside giữa C1 và C4 của 2 phân tử N-acetylglucosamine liên tiếp nhau trong chitin Chitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau Việc sử dụng enzyme thô trở thành thay thế trong việc tạo ra các oligomer có nguồn gốc chitin [51]

 Ngu ồn thu nhận chitinase

Chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn: Chromobacterium, Klebsiella,

Pseudomonas, Clostridium, Vibrio và đặc biệt là ở nhóm Streptomycetes

Chitinase cũng được tạo ra bởi các loài nấm sợi Các chủng nấm mốc cho enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia,…đặc

biệt là ở các loài nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus

Chitinase còn có từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt

Đối với động vật có xương sống, chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticle) trong quá trình biến thái hay lột xác

Các thực vật bậc cao có khả năng tạo enzyme chitinase như: cao su (Hevea

brasiliensis), thu ốc lá (Nicotiana sp.), lúa mạch (Hordeum vulgare) và đặc biệt một

Trang 31

số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme chitinase [16], [53]

1.4.1.4 Các y ếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng-phát triển và tổng hợp chitinase c ủa A.niger

 Ngu ồn carbon A.niger có khả năng đồng hóa tốt các loại đường monosaccharide, disaccharide như glucose, fructose, maltose, sucrose.[17]

Chitin (có thể ở dạng huyền phù, dạng bột hay dạng thô) và các dẫn xuất của chitin vừa là cơ chất cảm ứng, vừa là nguồn carbon làm tăng khả năng sinh chitinase Nghiên cứu của Jesú de la Cruz và cộng sự (1922) chỉ ra rằng nấm sợi tạo chitinase khi có nguồn carbon là chitin chứ không phải là nguồn cellulose hay nguồn nào khác

 Ngu ồn nitrogen

Takashi và CS (2002) nghiên cứu khả năng sinh chitinase từ nấm sợi

Aspergillus sp chỉ ra rằng hoạt tính chitinase cao khi sử dụng nguồn nitrogen từ (NH4)2SO4 Bổ sung 2% cao nấm men (w/v) vào môi trường nuôi cấy bán rắn thì

hoạt tính chitinase của nấm sợi tăng lên đáng kể (Nampoothiri, 2003) [13], [17]

 Nhi ệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của

A.niger Chúng sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6-80

Khoảng pH mà A.niger sinh trưởng tốt là ở môi trường hơi acid pH=4- 6,5

Tuy nhiên, có một số chủng A.niger sinh trưởng được ở pH=2 (Patt, 1981) [13],

[68] Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm Aspergillus sp tổng hợp chitinase cao nhất ở pH môi trường từ 5- 6, Trichoderma harzianum sinh trưởng thích hợp để tổng hợp chitinase

ở pH môi trường từ 4- 6

Trang 32

 Ch ất cảm ứng

Chitinase có thể là enzyme cảm ứng hoặc enzyme cấu trúc Trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp chitinase, người ta đều bổ sung thêm cơ chất chitin nhằm kích thích khả năng sinh chitinase của vi sinh vật Nhìn chung, sự hiện

diện của chitin trong môi trường nuôi cấy hữu ích cho việc tạo chitinase (Monreal

và Reese, 1969) Trong số các cơ chất, chitin huyền phù có khả năng thúc đẩy tạo chitinase cao nhất (Bhushan, 2000) Trong hầu hết các trường hợp, khi nồng độ chitin khoảng 1-1,5% là vi sinh vật có khả năng tạo chitinase (Felse và Panda, 2000) [17]

1.4.1.5 Ứng dụng của A.niger và enzyme chitinase

 Ứng dụng của A.niger

Từ lâu, con người đã biết sử dụng A.niger để sản xuất acid hữu cơ Đặc biệt

A.niger có khả năng tổng hợp acid citric rất mạnh, lượng acid citric sử dụng trên thị trường hiện nay được sản xuất bằng phương pháp lên men tới 90%

Ngoài ra, A.niger được dùng để sản xuất các chế phẩm enzyme, chế phẩm giàu protein… phục vụ phát triển trong thực phẩm, dược phẩm và chăn nuôi do A.niger

không sinh độc tố aflatoxin [20], [41]

 Ứng dụng của chitinase

Chitinase được ứng dụng nhiều trong nông nghiệp là tác nhân đấu tranh sinh

học đối với các sinh vật gây hại (sâu bọ, côn trùng) cụ thể sản xuất các chế phẩm

bảo vệ thực vật, thuốc trừ sâu nguồn gốc sinh học Chitinase từ Bacillus cereus

YQ308 ức chế sự phát triển của nấm bệnh thực vật như Fusarium oxyporum,

Penicillium ultimum (Change & c ộng sự, 2003) [17]

Trong y học chitinase thu nhận từ Vibrio alginolyticus đã sử dụng để sản xuất

chitopentaose từ cơ chất huyền phù chitin (Murao & cộng sự, 1992) Chitohexaose

và chitoheptaose được phát hiện có tính kháng các khối u [59], [60]

Chitooligosaccharide, glucosamine và N-acetyl glucosamine là nguyên liệu dùng để sản xuất thuốc cho người được tạo ra nhờ chitinase phân cắt mạch chitin…[17]

Trang 33

1.4.2 Vi khu ẩn Lactobacillus casei

Tế bào hình que ngắn, thường có kích thước 0,5 – 1,2 x 1 – 10µm, đôi khi có

dạng hình cầu kết thành chuỗi ngắn, hiếm khi di động bằng lông roi Khuẩn lạc có kích thước 2-5mm, dạng lồi, mờ đục

Là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, kị khí không bắt buộc nhưng phát triển tốt hơn trong điều kiện không có oxy hay có bổ sung thêm 5% CO2 Hình thức dinh dưỡng là hóa dưỡng hữu cơ, đòi hỏi môi trường nuôi cấy phải giàu chất dinh dưỡng phức tạp Chúng không khử được nitrate, không làm tan gelatin, không có catalase cũng như cytochrome Lên men tạo acid lactic, hiếm khi gây bệnh [10], [20], [36]

1.4.2.3 Cơ sở hóa sinh của quá trình lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đường với sự tích lũy của acid lactic trong môi trường Có 2 kiểu lên men lactic: lên men đồng hình và lên men dị hình

Lên men lactic đồng hình: Quá trình lên men tạo sản phẩm chính là acid lactic, lượng acid lactic chiếm 90-98% tổng sản phẩm lên men

Lên men lactic dị hình: Sản phẩm lên men ngoài acid lactic còn có hàng loạt các sản phẩm khác với tỷ lệ khá cao như acid lactic 40%, ngoài ra còn có các sản

phẩm: ethanol, diacetyl, CO2 [14], [20]

Trang 34

Hình 1.8 Sơ đồ chuyển hóa lên men lactic đồng hình và dị hình [71]

1.4.2.4 Các y ếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn L.casei

 Ngu ồn carbon

Nguồn carbon quan trọng cho VK lactic là monosaccharide và disaccharide Các loại đường cung cấp cho VK lactic sử dụng là: maltose, glucose, galactose, succrose, dextrin, lactose,…[64]

Một số các VK lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất hữu cơ có

chứa nitơ Để đảm bảo cho sự phát triển của vi khuẩn này, chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường

Nguồn cung cấp nitơ cho VK lactic sử dụng chủ yếu có trong các sản phẩm

thủy phân từ thịt, casein, pepton, nấm men thủy phân…[35]

 Các mu ối vô cơ

VK lactic cần nhiều các muối vô cơ cho qua trình hoạt động của mình như

Cu2+, Fe2+, K+, Mn2+, Mg2+,… Mn2+ngăn cản quá trình tự phân của tế bào Đối với Lactobacillus thì Fe2+, Mn2+, Mg2+ có tác động tích cực lên sự phát triển và sinh acid lactic Ngoài ra, Mg2+ giúp VK sử dụng tốt hơn các loại đường [35]

Trang 35

 Vitamin

Đa số vi khuẩn lactic (đặc biệt là trực khuẩn đồng hình như L.casei) rất kén

chọn thành phần dinh dưỡng, chúng chỉ phát triển khi trên môi trường có tương đối đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng cần thiết như acid amin, peptide, protein, vitamin nhóm B (B1, B2, B6, PP),…

Ngoài vitamin và acid amin, VK lactic còn có nhu cầu lớn về các hợp chất hữu

cơ cho sự phát triển Đó chính là lý do sử dụng các muối acetat, muối citrate, Tween-80 (một dẫn xuất của acid oleic), trong thành phần môi trường nuôi cấy VK lactic [35], [64]

Nhiệt độ tối ưu cho L.casei phát triển là 30-350C [20]

 Độ pH

Hoạt động của VK lactic, đặc biệt là hệ enzyme của chúng chịu tác động mạnh

của pH Mỗi enzyme đều có vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt lực của enzyme là mạnh

nhất Tuy nhiên, pH nội bào của VK lactic lại không tương ứng với pH tối ưu của các enzyme nội bào mà nó chứa Đa số trực khuẩn lactic có thể phát triển được ở

pH = 3,8-4,0 Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn lactic ở vùng pH = 5,5-6,5 [20], [35]

 Ch ất ức chế

Các chất kháng sinh (peniciline, choloramphenycol,…) có thể ức chế sự sinh trưởng của VK lactic

Ngoài ra, trong quá trình lên men thì acid lactic được sinh ra, đầu tiên sẽ có tác

dụng ức chế các loại vi sinh vật khác Sau đó, lượng acid tích lũy đủ lớn khoảng 2,2% sẽ ức chế lại VK lactic Sự acid hóa tế bào chất gây ra sự tích lũy nội bào acid lactic, chính acid lactic là chất ức chế VK lactic

Trang 36

Vì thế acid lactic tạo thành trong quá trình lên men cần được trung hòa liên tục

để tối ưu cho sự phát triển nằm trong khoảng pH từ 5,0- 6,5.[10], [35]

1.4.2.5 Các ứng dụng của vi khuẩn lactic và L.casei

 S ản xuất acid lactic

Nhu cầu sử dụng acid lactic trên thế giới rất lớn từ 12-15% tổng lượng acid/năm (Akerberg and Zacchi, 2000) và quan trọng đối với ngành công nghiệp

thực phẩm (Lượng, 2006), [20], [73]

Vì vậy, việc nghiên cứu tận dụng các loại môi trường rẻ tiền để lên men sản

xuất acid lactic rất cần thiết Một số loại nguyên liệu đã được ứng dụng làm nguyên

liệu lên men:

B ảng 1.4 Một số nguyên liệu được dùng để lên men acid lactic [71]

Rỉ đường L delbrueckii 107,0 Beunavennature P

Calabia&cộng sự (2002) Ngũ cốc Enterococcus faecalis

RKY1 102,0 Oh & cộng sự (2005)

Gỗ L delbrueckii

Cellulose L.coryniformis

ssp.toquen ATTC 2560 24 Miura & cộng sự (2003)

Whey Enterococcus faecalis

Ngoài ra, đã có vài công trình nghiên cứu tận dụng dịch tương đậu nành để làm môi trường lên men lactic

Dịch tương đậu nành là thành phần nước ép sau quá trình đông tụ sữa trong quy trình sản xuất đậu phụ Loại nước này thải ra môi trường làm ô nhiễm nguồn nước Tuy nhiên, dịch tương đậu nành chứa nhiều chất dinh dưỡng còn sót lại của

hạt đậu nành Hackler và cộng sự (1963), đã chỉ ra rằng 16% chất khô và 9% protein đã đi vào dịch tương đậu nành [45]

Trang 37

Nguyễn Thị Cẩm Vy (2010), đã phân tích thành phần dịch tương đậu nành và được trình bày ở bảng 1.5 như sau:

B ảng 1.5 Thành phần hóa học của dịch tương đậu nành và sữa đậu nành[37]

Các nghiên cứu tận dụng dịch tương đậu nành:

Ben Ounis & cộng sự (2007) sử dụng dịch tương đậu nành đã qua lọc điện thu

hồi protein và khoáng chất để nuôi Lactobacillus plantarum LB17 [73]

Vaideki T S (2005), đã sử dụng màng siêu lọc để thu hồi đường, protein, isoflavine [73]

Nguyễn Thị Cẩm Vy (2010), đã nghiên cứu chế biến thức uống chức năng từ

dịch tương đậu nành và sữa đậu nành [37]

Vi khuẩn lactic ngoài khả năng lên men lactic, chúng còn có khả năng sản sinh

ra các chất kháng sinh gọi là bacteriocin và được ứng dụng nhiều trong bảo quản

thực phẩm [10], [20]

 M ột số ứng dụng khác

Chế biến thực phẩm: các vi khuẩn lactic được dùng để sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa Trong sản xuất các loại sữa chua đều có sử dụng quá trình lên men lactic Nhờ có quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic mà casein được kết tủa,

tạo cho sản phẩm có hương vị đặc trưng Người ta bổ sung calcilactate vào thành

phần sữa bột dinh dưỡng, bánh ngọt… để tăng lượng calci cho cơ thể Trong nông

Trang 38

nghiệp, ứng dụng vi khuẩn lactic để ủ chua thức ăn gia súc do trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm acid lactic còn có một số chất có giá trị như chất thơm, vitamin, kháng sinh,…nên thức ăn gia súc ủ chua rất có giá trị về mặt dinh dưỡng, góp phần tăng năng xuất vật nuôi Sử dụng VK lactic để sản xuất các chế phẩm probiotic, khi đưa probiotic vào đường tiêu hóa của gia súc, gia cầm, các VSV có

lợi sẽ nhanh chóng phát triển, nhân nhanh số lượng, tạo môi trường acid ở ruột non

và ruột già, tiết ra các chất kháng sinh làm ức chế VSV có hại, hạn chế các bệnh đường ruột [20]

1.4.3 Vi khu ẩn Bacillus amyloliquefaciens

Trực khuẩn nhỏ, thẳng, kích thước 0,5-2,5 x 1,2-10µm, thường xếp thành cặp đôi hay chuỗi ngắn, 2 đầu tế bào tròn hoặc hơi vuông Bào tử hình bầu dục có kích thước 0,9-0,6µm

Là trực khuẩn gram dương, catalase dương tính, hiếu khí, khi còn non di động

bằng tiêm mao, già tiêm mao rụng nên mất khả năng di động Khuẩn lạc khô, hoặc

nhớt, màu trắng xám hay trắng đục, hơi nhăn có mép lõm mép lồi, tạo thành lớp màng mịn bám chặt trên bề mặt thạch [36], [70]

1.4.3.3 Kh ả năng sinh tổng hợp enzyme protease của B.amyloliquefaciens

 Gi ới thiệu enzyme protease

Protease là các enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự

Trang 39

Nhiều protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin

Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế (1984) đã đề nghị sử dụng thuật

ngữ peptidase để chỉ các enzym thủy phân mối liên kết peptide (thuộc phân nhóm E.C 3.4) [69]

 Ngu ồn thu nhận protease

Người ta có thể thu nhận protease từ nhiều nguồn khác nhau: động vật, thực

vật và vi sinh vật Vi sinh vật chính là đối tượng có thể sản xuất enzym nói chung

và protease nói riêng với số lượng nhiều và giá thành rẻ

Protease vi sinh vật có thể được thu nhận từ Bacillus subtilis, B.mesentericus,

B.thermorpoteoliticus Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích

hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzym được sử dụng [52], [56] Protease thu nhận từ nấm mốc: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng:

A.oryzae, A.terricola, A.fumigates,…các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả

ba loại protease: acid, kiềm và trung tính Các protease của nấm hoạt động trong vùng pH khá rộng (pH = 4-11) và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất cao

Protease thu nhận từ xạ khuẩn: người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả

năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae, S.erythreus, [23]

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết từ S.grieus, enzym này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới

90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid [56]

1.4.3.4 Các y ếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng-phát triển và tổng

h ợp protease của B.amyloliquefaciens

Trang 40

Ostroko và cs (1977), glucose, saccharose, maltose và sorbitol là nguồn carbon tốt

nhất cho sự tổng hợp protease ở B.subtilis [36]

Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy VSV có thể là các chất hữu cơ (protein

và các sản phẩm thủy phân của protein) hay các muối vô cơ chứa nitơ (amoni, nitrat) Giá trị dinh dưỡng của các nguồn nitơ khác nhau tùy thuộc vào khả năng thu

nhận nitơ từ nguồn là NH3 Nguồn nitơ hữu cơ thường ảnh hưởng tốt đến quá trình

tổng hợp protease Vì vậy chúng có vai trò như chất cảm ứng trong quá trình này Nguồn nitơ hữu cơ thường dùng: pepton, casein, albumin, bột đậu tương, Nguồn nitơ vô cơ: (NH4)2SO4, các muối clorua, sulphate, nitrate amon Phối hợp nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp protease

 pH môi trường

pH môi trường thường ít bị tác động khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề sâu ( nuôi cấy chìm), pH có ảnh hưởng rất lớn đến sự tích lũy protease trong môi trường pH của môi trường thay đổi sau khi thanh trùng MT và đặc biệt thay đổi rất lớn trong quá trình nuôi cấy Trong quá trình nuôi

cấy, tùy theo thành phần MT và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật mà pH của môi trường sẽ chuyển dần về phía acid hay kiềm Các loài thuộc

giống Bacillus đa số tổng hợp nên protease trung tính và kiềm tính

B.amyloliquefaciens tổng hợp nên protease trung tính, pH môi trường phù hợp trong khoảng 6,4- 7,5 [69]

Định dạng
Số trang	145
Dung lượng	5,83 MB