Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc cá thể BC3F1 của tổ hợp lai KD18 x KC25 mang QTLgen tăng số hạt trên bông

Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc quy tụ locus gen quy định tính trạng di truyền số lượng QTL hay gen vào giống mới cho phép rút n

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các thầy, cô giáo khoa Sinh – KTNN đã hết lòng giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo – TS Trần Đăng Khánh, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này Đồng cảm ơn các anh chị Bộ môn Kĩ thuật

Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp, đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành thực nghiệm thành công

Trong quá trình nghiên cứu không tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế, kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy giáo, cô giáo và toàn thể bạn đọc để đề tài được hoàn thiện hơn

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Sinh viên thực hiện

Ngô Thị Thanh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này

đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong khóa luận này đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Ngô Thị Thanh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Phạm vi nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

NỘI DUNG 4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Nguồn gốc cây lúa 4

1.2 Phân loại cây lúa 4

1.3 Giới thiệu về QTL 5

1.4 Chỉ thị phân tử và ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn giống 6

1.4.1.Chỉ thị phân tử 6

1.4.2.Ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn giống 12

1.5 Trình bày tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 15

1.5.1.Trên Thế giới 15

1.5.2.Tại Việt Nam 19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.1 Các giống lúa nghiên cứu 21

2.1.2 Mồi ADN 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Phương pháp lai hữu tính – lai trở lại giữa giống 22

2.3.2.Phương pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm 25

2.3.3 Phương pháp xử lí số liệu 31

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Kết quả 32

3.1.1 Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ 32

3.1.2 Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN 32

3.1.3 Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể trong quần thể BC3F1 33

3.2 Thảo luận 36

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 37

4.1 Kết luận 37

4.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

PHỤ LỤC 40

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AND : Axit Deoxyribonucleic

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều

dài các đoạn được nhân bản chọn lọc RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình

ADN được nhân bản ngẫu nhiên RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình

chiều dài mảnh phân cắt giới hạn STS : Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được

đánh dấu RGA : Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng

SNP : Single Nucleotide Polymorphisms – Đa hình nucleotide đơn SSR : Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn giản

Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ

cDNA : Complementary DNA – Thư viện ADN bổ trợ

PCR : Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp QTL/ QTLs : Quantity Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng số lượng TBE : Tris-Boric Acid-EDTA

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH

BẢNG

Bảng 2.1 Các chỉ thị cho đa hình giữa giống KD18 x KC25 tại vị trí

QTL/gen 22 Bảng 2.2 Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR 27với mồi

SSR 27 Bảng 2.3 Chương trình chạy của phản ứng PCR 27

HÌNH

Hình 1.1 Một số QTL/gen đã được phát hiện ở 12 NST lúa trên Thế giới 18 Hình 3.1 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 33 Hình 3.2 Kết quả điện di trên gel agarose 0,8% 34 Hình 3.3 Hình ảnh điện di trên Polyacrylamide 4,5%BC3F1 với chỉ thị

RM445 35Hình 3.4 Kết quả chạy điện di trên gel Polyacrylamide 4,5% với chỉ thị

RM21615 Hình 3.5 Kết quả chạy điện di trên gel Polyacrylamide 4,5% với chỉ thị

RM500 35

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây lúa (Oryza sativa L.) là nguồn thức ăn chính cho khoảng 2/3 dân

số thế giới và là một trong những cây lương thực quan trọng nhất ở Việt Nam Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu gạo đứng hàng đầu trên thế giới, đây là nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệp xuất khẩu Theo

số liệu thống kê năm 2014, Việt Nam với diện tích khoảng 7,8 triệu ha sản xuất được 44,84 triệu tấn thóc, không những đảm bảo an ninh lương thực Quốc gia mà còn xuất khẩu được 6,52 triệu tấn (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2014) [2] Tuy nhiên, trong những năm gần đây quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa diễn ra nhanh chóng, diện tích đất trồng lúa ngày càng bị thu hẹp

và chịu những ảnh hưởng cực đoan từ biến đổi khí hậu làm năng suất lúa bị sụt giảm rõ rệt, bên cạnh đó áp lực dân số ngày càng tăng đòi hỏi nguồn cung lương thực ngày càng vô cùng lớn Việc phát triển nguồn giống cho năng suất cao, chất lượng tốt là yếu tố quan trọng, cấp bách và có ý nghĩa cho an toàn lương thực, đảm bảo sản lượng lúa, tăng thu nhập cho người dân

Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS-Marker assisted selection) và lai trở lại (MABC – Marker Asissted Backcrossing) đã được ứng dụng rộng rãi và đã thành công tại nhiều nước trên Thế giới Trong đó, Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) đã thành công trong việc quy tụ QLT/gen chịu ngập và chịu mặn vào một số giống lúa trồng phổ biến ở các nước Đông Nam châu Á như: Ấn Độ, In-đô-nê-xi-a, Băng-la-đét Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc quy tụ locus gen quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen vào giống mới cho phép rút ngắn quá trình chọn lọc, chọn lọc được những tính trạng khó hay nhiều gen cùng một lúc Chọn giống bằng phương pháp MAS, MABC sẽ giảm được giá thành, thời gian và cho hiệu quả cao hơn so với phương pháp chọn giống

truyền thống Phương pháp này cho phép chọn lọc trực tiếp hệ gen của từng cá thể trong quần thể Việc ứng dụng chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại từ 2 đến 3 thế hệ có thể thu được con lai mang gen quan tâm Các dòng này tự thụ, thu hạt

để thử nghiệm phát triển trên đồng ruộng

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên kết hợp phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và chọn giống truyền thống để tạo ra dòng/giống lúa có

năng suất cao, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:“Ứng dụng chỉ thị phân

cho công tác chọn tạo giống lúa cao sản

- Thời gian thực hiện đề tài thực hiện: tháng 6/2015 đến tháng 05/2016

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

- Ý nghĩa khoa học

Ứng dụng chỉ thị phân tử kết hợp phương pháp lai trở lại để chọn lọc nhanh và chính xác các cá thể mang QTL/gen tăng số hạt trên bông, nhằm rút ngắn thời gian, công sức chọn lọc trên đồng ruộng, giảm số lượng lớn cá thể gieo trồng hàng vụ và khắc phục được một số hạn chế của phương pháp truyền thống

- Ý nghĩa thực tiễn Những thành công bước đầu trong lai chuyển QTL/gen tăng số hạt trên bông nhờ sử dụng chỉ thị phân tử ở lúa sẽ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi

trong công tác chọn giống nói chung, không chỉ đối với tính trạng năng suất

mà còn với nhiều đặc tính nông học quan trọng khác đáp ứng nhu cầu lương thực cho con người

Những cá thể trong quần thể BC3F1 triển vọng được chọn lọc trong đề tài này sẽ được trồng thử nghiệm và tiếp tục đánh giá, chọn tạo ra các dòng/giống lúa có tiềm năng năng suất cao, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguồn gốc cây lúa

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra nhiều ý kiến khác nhau về nguồn gốc cây lúa như sau:

Theo các tài liệu khảo cổ ở Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Thái Lan,… thì cây lúa đã có mặt từ 3000 - 2000 năm trước công nguyên Từ các trung tâm khởi nguyên là Trung Quốc và Ấn Độ, cây lúa đã phát triển theo hướng Đông Tây và đến nay có mặt khắp thế giới Vùng phân bố của cây lúa trên thế giới tương đối rộng, từ 50 vĩ độ Bắc (Trung Quốc) đến 35 vĩ độ Nam (Châu Úc)

Nhiều dẫn liệu khảo cổ học đã chứng minh tổ tiên của cây lúa là ở Đông Nam Á (Việt Nam, Thái Lan,…) Vì Đông Nam Á là một vùng có diện tích trồng luá tập trung và lớn nhất trên thế giới, có khí hậu nóng ẩm, thích hợp với sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa Ngoài ra, các tài liệu lịch sử, các di tích khảo cổ ở nhiều nước thuộc vùng này đều nói về cây lúa cũng như nghề trồng lúa.Ví dụ: Roscleviez đã tìm thấy những hạt gạo cháy, vỏ trấu ở Đông Nam Á Theo Candalle (1886) Cây lúa có nguồn gốc ở Ấn Độ Theo Sampath (1973) xác định có vết tích của cây lúa ở Thái Lan

Những các quan điểm trên đều có điểm thống nhất chung là: nguồn gốc cây lúa ở Đông Nam Á Người Đông Nam Á đã tạo ra cây lúa nước nổi tiếng

và tích lũy được vốn kỹ thuật trồng lúa khá phong phú Từ đây, cây lúa và kỹ thuật trồng lúa mới được lan tràn tới các vùng khác trên thế giới

1.2 Phân loại cây lúa

- Phân loại theo đặc điểm sinh học

Lúa trồng (Oryza satiza) có bộ NST 2n=24 được thuần hóa từ cây lúa dại thuộc bộ Hòa thảo (Graminales), họ Hòa thảo (Graminaceae), chi Oryza

Chi Oryza phân bố rộng khắp thế giới với 19 loài (Hội nghị Di truyền

Quốc tế - 1963), có loài sống một năm, có loài sống nhiều năm Trong số đó

có hai loài lúa trồng là:

Oryza sativa L được trồng phổ biến trên thế giới

Oryza sativa L glaberrima trồng phổ biến ở một số nước Châu Phi Việc phân loại Oryza sativa cũng có nhiều quan điểm khác nhau:

Theo Kikawa và Kota (1931): Oryza sativa L được chia làm 2 loài phụ: Oryza sativa sub.sp.Japonica Kato (lúa tiên): Loài phụ Nhật Bản

Oryza sativa sub.sp.Indiaca Kato (lúa cánh): Loài phụ Ấn Độ

Theo Hoàng Thị Sản (1999) có 2 loài:

Oryza sativa L.var.UtilissimaA.Camus: Lúa tẻ

Oryza sativa L.var.Glutinosa Tanaka: Lúa nếp

Theo chất lượng và hình dạng hạt chia thành: lúa tẻ, lúa nếp, lúa hạt dài, lúa hạt tròn [7]

1.3 Giới thiệu về QTL

Tính trạng số lượng (QTL) là tính trạng thể hiện sự phân bố chuẩn liên tục trong quần thể lớn và chưa qua một chọn lọc nào Tính trạng số lượng nói chung được thể hiện rõ như là một tính trạng với sự biến đổi liên tục Tính trạng được quan tâm điều khiển bởi nhiều gen và mỗi gen đều có tác động nhỏ đối với tính trạng mục tiêu Sự xác định các vị trí của nhiễm sắc thể đơn nơi xảy ra biến đổi gen được biểu hiện rõ gọi là QTL Bản đồ QTL (Quantitative Trait Loci) được áp dụng trong trường hợp những tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển Di truyền tính trạng số lượng truyền thống không thể phát hiệnQTL trên những locut riêng biệt gắn với tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên kết của nó với những gen khác Bản đồ di truyền phân tử với mật độ cao số lượng marker phủ trên toàn bộ nhiễm sắc thể trong genome cây trồng sẽ cung cấp cho chúng

ta công cụ có khả năng nghiên cứu tính trạng di truyền số lượng phức tạp, định vị gen trên những nhiễm sắc thể và xác định các gen mục tiêu liên kết với gen khác [13]

Mục tiêu cơ bản của bản đồ QTL là tìm hiểu cơ sở di truyền của những tính trạng số lượng bằng cách xác định số lượng, vị trí, những ảnh hưởng của gen và hoạt động của những locut bao gồm tương tác gen và tương tác giữa QTL với môi trường Một mục đích khác của bản đồ QTL là xác định những marker mang tính chẩn đoán đối với những kiểu hình đặc thù nào đó, sao cho việc áp dụng MAS trở nên có hiệu quả, phục vụ yêu cầu chọn giống chống chịu khô hạn, chóng chịu mặn,…

1.4 Chỉ thị phân tử và ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn giống

Đối với chọn giống bằng cách sử dụng chỉ thị phân tử đem lại lợi ích như sau:

- Đơn giản hơn so với chọn lọc dựa trên kiểu hình

- Đặc biệt đối với các tính trạng mà phải cần nhiều lao động trong quá trình chọn lọc, có thể tiết kiệm thời gian và tiết kiệm diện tích đồng ruộng thí nghiệm

- Có thể chọn lọc ở giai đoạn cây non, rất quan trọng cho các tính trạng như chất lượng hạt, có thể chọn lọc trước khi cấy ở cây lúa

- Tăng độ tin cậy, không bị ảnh hưởng của môi trường, có thể phân biệt được dạng đồng hợp tử và dị hợp tử và chọn lọc được từng cá thể đơn lẻ

- Lợi ích tiềm tàng của chọn giống bằng chỉ thị phân tử: chính xác và hiệu quả hơn trong việc chọn lọc các kiểu gen đặc trưng, nhờ đó có thể đẩy nhanh việc phát triển các giống mới, sử dụng hiệu quả hơn các phương tiện thí nghiệm đặc biệt là ruộng thử nghiệm [5]

Khái niệm về chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker Assisted Breeding-MAS) đã được đề cập cách đây hơn hai thập kỷ bởi Smith và Simpson (1986) và Soller và Beckmann (1983) Chỉ thị phân tử (molecular marker) là “những đặc tính sinh học được xác định bằng dạng hình alen gen hoặc locus gen và có thể được truyền từ một thế hệ này sang thế hệ khác”, do

đó chúng có thể được sử dụng như một thiết bị dò để theo dõi một cá thể, mô,

tế bào, nhân, nhiễm sắc thể, hoặc một gen

Một kỹ thuật chỉ thị phân tử lý tưởng cần đáp ứng một số yêu cầu sau:

1 Thể hiện tính đa hình và mức độ phân bố đều trên toàn bộ hệ gen

2 Cung cấp đầy đủ độ phân giải khác biệt di truyền

3 Tạo ra nhiều chỉ thị độc lập và đáng tin cậy

4 Đơn giản, thực hiện nhanh chóng và rẻ tiền

5 Yêu cầu một số lượng nhỏ ADN

6 Có mối liên kết với các kiểu hình riêng biệt

7 Có thể không cần thông tin trước về bộ gen của vật liệu nghiên cứu Chỉ thị phân tử được chia ra làm hai loại: chỉ thị cổ điển và chỉ thị ADN [20]

Chỉ thị cổ điển bao gồm: chỉ thị hình thái, chỉ thị tế bào và chỉ thị hóa sinh

Chỉ thị phân tử gồm 3 loại chính: chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN, chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN, chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại

 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN

* Chỉ thị RFLP (Restriction fragment length polymorphism - Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn)

Các bước tiến hành kỹ thuật RFLP là sau khi tách chiết, ADN genome được cắt bằng enzim cắt hạn chế, các phân đoạn ADN sau đó được phân tách bằng điện di gel agarose rồi được thấm truyền bằng bằng phương pháp Southern lên màng nylon và được lai với các đoạn dò được đánh dấu bằng phóng xạ hoặc huỳnh quang, cuối cùng là hiện trên phim

Chỉ thị RFLP có mức đa hình cao, đồng trội nên có thể phân biệt được các thể đồng hợp tử và các cá thể dị hợp tử và khả năng lặp lại cao Kĩ thuật cho phép phân tích đồng thời nhiều mẫu Đây là đặc điểm ưu việt của chỉ thị RFLP Tuy nhiên kỹ thuật này không được sử dụng rộng rãi vì một số hạn chế như: cần nhiều ADN chất lượng cao, phải phát triển thư viện đoạn dò cho từng loài, cần thông tin về trình tự đồng hóa, mức dộ đa hình và số lượng locus trên lần phân tích thấp, đòi hỏi nhiều thời gian, tốn kém RFLP là một trong những chỉ thị hình thành sớm nhất được sử dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền Năm 1992, Wangz đã sử dụng chỉ thị RFLP để thiết kế sơ đồ cây chủng loại phát sinh ở lúa [15]

 Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN

Kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis và cs đưa

ra năm 1985 Phản ứng kéo dài chuỗi (PCR) nhân bản các vùng ADN được xác định có biên giới là các trình tự có thể kết hợp bổ sung Cần thiết phải có ADN khuôn mẫu, Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq), các đoạn mồi, dNTPs và Mg2+

* Chỉ thị RAPD (RADNomly Amplified Polymorphic ADNs – Đa hình các đoạn ADN khuyếch đại ngẫu nhiên)

Cơ sở của kỹ thuật là sự nhân bản của ADN genome bằng phản ứng PCR với các mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình ADN do sự tái sắp xếp hoặc mất nucleotide ở vị trí bắt mồi Đây là loại chỉ thị di truyền được tạo ra dựa trên cơ sở của phản ứng PCR, sử dụng một loại mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit và quá trình nhân bội ngẫu nhiên

Sản phẩm nhân bội có thể được phân tách bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm với các hóa chất đặc trưng Nó là loại chỉ thị di truyền trội Sự khác biệt giữa 2 cá thể

có thể nhận biết bằng sự có mặt hoặc vắng mặt của những băng RAPD đặc trưng Phương pháp này đơn giản, rẻ tiền, dễ sử dụng Tuy vậy, độ chính xác còn tùy thuộc vào máy PCR và thao tác cá nhân Sự đa hình phát hiện được khi sử dụng kỹ thuật RAPD có thể là do sự thay đổi bazơ nucleotit ở vị trí gắn mồi, hoặc sự thêm hay mất nucleotit nằm trong vùng khuếch đại [16]

* Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài các đoạn ADN nhân bản chọn lọc)

Chỉ thị AFLP được tạo ra bằng cách nhân lên một cách chọn lọc AND

hệ gen đã được cắt bằng enzym giới hạn bằng máy PCR Khi xử lý enzym giới hạn ADN sẽ bị cắt thành vô số mảnh có kích thước khác nhau Mỗi mảnh cắt, đều biết trước trình tự nucleotide của chúng ở hai đầu cắt Dựa vào trình tự ở hai đầu cắt thiết kế các đoạn gắn (adaptor) Sau đó dùng enzym ligase để nối các đoạn ADN thích ứng vào hai đầu ADN đã cắt Dựa vào trình tự adaptor ta thiết kế mồi PCR Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự ở hai đầu bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản.Ưu điểm là lượng ADN sử dụng cho nghiên cứu ít, băng ADN ổn định AFLP còn cung cấp một lượng đa hình ADN lý tưởng từ ADN của bất kỳ nguồn gốc nào từ đơn

giản đến phức tạp Chỉ thị này được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm, tuy nhiên chỉ thị này là di truyền trội, khi sử dụng giá thành tương đối cao

* Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu)

STS là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000 bp có thể được phát hiện bằng kỹ thuật PCR Nó cho phép xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide đã biết trước của ADN trong genome STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những locus đã biết bằng việc sử dụng cặp mồi PCR Các đoạn mồi STS chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao với PCR Ở cây lúa, các STS được coi như là mốc chuẩn và người ta sử dụng để phát hiện tính đa hình xây dựng bản đồ di truyền liên kết như STS liên kết với gen kháng stress, chịu lạnh ở lúa [9]

* Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng)

Bản chất của kỹ thuật RGA là những cặp mồi ADN được xây dựng dựa vào những vùng bảo tồn nằm trong gen kháng Bởi vậy, sản phẩm “nhận dạng” ADN có thể là một vùng hoặc toàn bộ gen kháng Kỹ thuật RGA đã được dùng

để tách, lập bản đồ gen kháng và phân tích đa dạng di truyền

* Chỉ thị SNPs (Single nucleotide polymorphism - Đa hình của các nucleotit đơn)

SNP là những biến dạng của chuỗi trình tự ADN được tìm thấy với tần suất cao nhất trong genome người Theo phân tích chi tiết chuỗi trình tự của những phần nào đó trong genome, ADN từ hai cá thể khác nhau phần lớn đều giống nhau với số cặp base khác biệt nhau nằm ở trong khoảng cho phép 500-

1000 bp Một cặp base ở một vị trí nào đó sẽ biểu thị sự khác nhau của cá thể

có tính chất phổ biến, và một cặp base khác là biến dị, ít phổ biến hơn ở cùng một vị trí Nếu cặp base ít phổ biến hơn xuất hiện nhỏ hơn 1% trong quần thể, người ta gọi vị trí cặp base đó là một SNP

 Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại

Chuỗi lặp lại có trật tự (TADNemly Repeated Sequence) là những trình

tự lặp lại một cách có trật tự từ đầu đến cuối trong một hệ gen, thường được gọi là ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh hay vi vệ tinh tuỳ thuộc vào số lượng bản sao của chúng trong hệ gen và tính chất của chuỗi

* Tiểu vệ tinh (Minisatellite)

Tiểu vệ tinh là loại chuỗi lặp lại nhiều lần, có đơn vị lặp lại gồm từ 6 nucleotid trở lên, bao phủ một vùng từ 0,5-3kb Không giống như ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh được tìm thấy ở những vùng dị nhiễm sắc và thường thay đổi rất nhiều về kích thước Có 2 loại ADN tiểu vệ tinh Đó là ADN đầu mút NST

và ADN tiểu vệ tinh siêu biến ADN đầu mút NST nằm ở vai NST, gồm một vài kilobase

* Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats - Sự lặp lại của trình tự đơn giản)

Trong các chỉ thị trên, chỉ thị SSR đáp ứng được hầu hết các yêu cầu của một chỉ thị phân tử, và được sử dụng rộng rãi nhất trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu di truyền học, sinh thái học, di truyền tiến hóa, và chọn giống Chỉ thị SSR do Litt và Lutty phát hiện năm 1989, chỉ thị cần có thông tin về trình

tự, dựa trên nguyên tắc PCR, nên chỉ cần một lượng mẫu ADN nhỏ, kiểu di truyền của Menden, đồng trội, có mức đa hình cao, và ứng dụng chỉ thị này trong lập bản đồ liên kết, gắn thẻ gen, nghiên cứu quần thể [5]

Chỉ thị SSR còn gọi là chỉ thị vi vệ tinh, là loại chỉ thị lặp lại trình tự ADN ở hầu hết hệ gen thực vật Chỉ thị có tính đa hình cao và được sử dụng

để nhận biết các alen biến dị trong quần thể nghiên cứu Chỉ thị SSR ứng dụng rộng rãi trong nhiều giống cây trồng như: lúa, lúa mì, đậu tương, dưa chuột, lạc, chỉ thị cũng được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa hệ gen, và SSR cũng đã chứng minh tiện ích trong nghiên cứu chọn lọc nhờ chỉ thị và lập bản đồ di truyền số lượng SSR là những đoạn DNA lặp lại một cách có trật

tự, gồm những đơn vị có chiều dài từ 1 - 6 nucleotide lặp lại (hay kiểu lặp lại ngắn) được gọi là Microsatellites Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật nhân thật là khá phổ biến, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn lần hoặc nhiều hơn [7] Chỉ thị

có ưu điểm là đơn giản, dễ sử dụng với ký thuật PCR, điện di trên gel biến tính để xác định kích thước alen, số lượng alen trên locus lớn do đó cung cấp nhiều thông tin hơn Chỉ thị còn rất hữu dụng cho nghiên cứu về đa dạng chức năng giữa các loài có liên quan chặt chẽ, liên quan tới những thay đổi về tính thích nghi

1.4.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn giống

Trong nghiên cứu sử dụng chỉ thị ADN được ứng dụng để phân tích đa dạng di truyền rút ngắn thời gian chọn lọc đói với các tính trạng không hoặc khó đánh giá thông qua kiểu hình Giúp xác định mối quan hệ di truyền các cá thể trong cùng loài hoặc giữa các loài là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ giữa các loài Hơn nữa, nghiên cứu đa dạng

di truyền có thể tiên đoán giúp khả năng cho ưu thế lai giữa các cặp bố mẹ Tìm chỉ thị phân tử liên kết gen và lập bản đồ gen, chỉ thị ADN cũng cho phép các nhà chọn giống thực vật đặt chính xác các QTL vào bản đồ phân tử Bản đồ với tính trạng số lượng (QTL) thường có ít thông tin về sự kiểm soát gen Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp với lai trở lại để quy tụ gen khắc phục nhược điểm trong chọn giống truyền thống, gặp nhiều khó khăn [7]

Yếu tố quan trọng nhất đối với chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử là mối liên kết hay sự tương quan giữa các chỉ thị và tính trạng quan tâm Mackill và Collard (2006) đã đưa ra khái niệm chọn giống lúa dựa trên chỉ thị phân tử, là sử dụng các chỉ thị ADN liên kết chặt chẽ với locus mục tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình Chọn giống nhờ ứng dụng chỉ thị cần

thiết phải đánh giá nguồn vật liệu di truyền trước khi thực hiện một chương trình lai giống Cũng theo Mackill và cs (2006) MAS ứng dụng trong chọn tạo giống lúa có những ưu điểm nổi bật là:

Đặc biệt với các tính trạng khó đánh giá, thanh lọc dựa trên kiểu hình, tiết kiệm thời gian và nguồn lực trong quá trình chọn lọc, rất quan trọng đối với tính trạng quy định chất lượng hạt, có thể chọn lọc ở giai đoạn đầu, trước khi gieo trồng, có thể chọn ngay ở thế hệ phân ly F2 hoặc F3, không bị ảnh hưởng từ tác động của điều kiện môi trường, có thể phân biệt giữa đồng hợp

tử và dị hợp tử và chọn lọc từng cá thể

Với mục đích chính của chỉ thị phân tử là nâng cao hiệu quả của công tác chọn giống, làm giảm bớt thời gian và chi phí cần thiết để tạo được các giống cây trồng mới với tính trạng mong muốn

Một số hướng trong sử dụng chỉ thị phân tử vào chọn giống

1 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong lai ngược (Marker-assisted backcrossing)

2 Tập hợp gen hay tính trạng tốt (Pyramiding)

3 Chọn lọc từ các thế hệ ban đầu

4 Sử dụng tổng hợp các biện pháp Chọn giống nhờ chit thị kết hợp lai trở lại (MABC) là phương pháp được sử dụng rộng rãi và thành công nhất trong chọn tạo giống phân tử thực

tế Mục đích của MABC là chuyển một hoặc một vài QTL/gen quan tâm từ một nguồn vật liệu di truyền vào các dòng/giống lúa ưu tú để cải tiến tính trạng mục tiêu Không giống phương pháp lai trở lại truyền thống, MABC được dựa trên các chỉ thị alen có mối quan hệ hoặc liên kết với QTL/gen quan tâm thay vì đánh giá kiểu hình tính trạng mục tiêu Các bước MABC được thực hiện theo các trình tự sau:

Chọn lọc các bố mẹ cặp bố mẹ cho mục đích lai tạo, bố hoặc mẹ là giống đặc trưng thích ứng dụng, được sử dụng như cây tái tục hay cây nhận gen và các giống mang khác mang QTL/gen quan tâm được sử dụng như cây cho gen, trong đó cần có hoặc xác định các tính trạng mong muốn cần chuyển

và các alen chỉ thị ADN liên quan với gen tính trạng

Phát triển quần thể cây F1 và xác định sự có mặt của các alen chỉ thị ở giai đoạn đầu phát triển nhằm loại bỏ những con lai không phù hợp và thực hiện lai trở lại với các con lai F1 mang gen với cây nhận gen

Phát triển quần thể lai trở lại BC1F1, sàng lọc các cá thể bằng các chỉ thị ở gian đoạn đầu phát triển, và lai trở lại với các cá thể mang gen mong muốn (dị hợp tử) với cây nhận gen Lặp lại bước này ở các mùa vụ tiếp theo từ 2 đén 4 thế hệ, phụ thuộc vào các yêu cầu thực tế nghiên cứu

Phát triển quần thể lai trở lại cuối cùng, và sàng lọc các cá thể với các chỉ thị cho tính trạng mục tiêu và loại bỏ các cá thể mang alen đồng hợp tử từ cây nhận gen Có các cá thể với chỉ thị alen yêu cầu cho tự thụ và thu mẫu Phát triển thế hệ con cái của dòng lai tự thụ xác định các chỉ thị và thu các cá thể đồng hợp tử với cây nhận gen của tính trạng mục tiêu cho mục đích đánh giá sau này và phát triển giống

Ưu điểm của MABC so với phương pháp lai trở lại truyền thống thể hiện

ở ba điểm chính sau:

+ Chọn lọc hiệu quả các locus mục tiêu + Giảm thiểu những liên kết kéo theo + Lấy lại nhanh chóng nền di truyền của giống nhận gen trong chu kỳ chọn lọc

+ Hiệu quả trong việc chuyển locus gen quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen vào giống mới và rút ngắn quá trình chọn lọc

Phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại là hết sức quan trọng, hỗ trợ cho chọn giống truyền thống và quyết định sự thành công trong quá trình chọn tạo giống [5]

1.5 Trình bày tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.5.1 Trên Thế giới

Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử là xác định chỉ thị phân tử liên kết QTL/gen và lập bản đồ QTL/gen Với sự ra đời của hàng loạt các kỹ thuật chỉ thị phân tử đã cho phép xác định các QTL liên kết đến các tính trạng nông sinh học, yếu tố cấu hành năng suất Nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử và lập bản đồ QTL/ gen điều khiển môt tính trạng năng suất là một việc làm khó vì năng suất hay yếu tố cấu thành năng suất là tính trạng di tryền

số lượng, nó là tổ hợp tính trạng như: số hạt chắc trên bông, số bông trên khóm, khối lượng nghìn hạt Những năm gần đây, nhiều QTL /gen quy định tính trạng cấu thành năng suất đã được xác định trên rất nhiều quần thể từ các tổ hợp lai giữa giống hay các loài phụ QTL/gen năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất được xác định trên tất cả các nhiễm sắc thể của lúa

Trên nhiễm sắc thể số 1:

Các nhà khoa học trên thế giới đã xác định được nhiều tính trạng liên quan đến năng suất trên nhiễm sắc thể số 1 như: Ba QTLs quy định tính trạng khối lượng nghìn hạt tại vị trí gần chỉ thị phân tử RM283-RM259 [14] Một QTL liên kết tính trạng số hạt trên bông tại vị trí chỉ thị phân tử RM1-RM490 [11] Một QTL liên kết tính trạng tỷ lệ đậu hạt tại vị trí RM265-RM315 [14]

Nhiễm sắc thể số 2:

QTL quy định khối lượng nghìn hạt được xác định tại vị trí chỉ thị phân tử RM240-RM266 [15] Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt được xác định tại vị trí chỉ thị phân tử RZ123-RZ446 trên vai dài của nhiễm sắc thể số 2 [17]

Nhiễm sắc thể số 3:

Một số tác giả đã xác định QTL liên kết tính trạng khối lƣợng nghìn hạt trên nhiễm sắc thể số 3 Một trong số đó là QTL đƣợc xác định tại vị trí tâm động [18] QTL thứ ba đƣợc xác định trên vai ngắn Hai QTLs liên kết tổng

số hạt trên bông trên vai dài của nhiễm sắc thể 3 Một QTL liên kết số hạt trên bông Gần chỉ thị phân tử RM282, một QTL cho số hạt chắc trên bông cũng đƣợc xác định [16]

Nhiễm sắc thể số 4:

Ba QTLs/gen liên kết với tính trạng khối lƣợng nghìn hạt đƣợc các nhà khoa học xác định hai QTLs tại vị trí gần chỉ thị phântử CDO244-RG864 [19] Hai QTL quy định tính trạng năng suất tại vị trí gần tâm động.Hai QTL quy định tính trạng năng suất tại vị trí gần tâm động [19]

Nhiễm sắc thể số 5:

Ba QTLs quy định tính trạng năng suất đƣợc xác định trên nhiễm sắc thể số 5 tại vị trí R1674-RG360 [18], và gần tâm động liên kết chỉ thị RZ296 Hai QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử RG360-R3166 trên vai ngắn và tại RG13-RG470 [17]

Nhiễm sắc thể số 6:

Ba QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt đƣợc xác định một tại vị trí R2869-C226, một tại C751A-RZ667 và một tại R2549-C962 Ba QTLs quy định tính trạng số hạt trên bông đƣợc xác định tại vị trí trên vai ngắn của nhiễm sắc thể số 6 [12]

Nhiễm sắc thể số 7:

Ba QTL quy định tính trạng khối lƣợng 1000 hạt liên kết chỉ thị phân tử

RG128-C1023 trên vai ngắn, RM125 gần tâm động, và -RZ626.Ghd7 là gen

quy định tính trạng tăng số hạt trên bông đã đƣợc phát hiện từ giống lúa

Minghui 63 Ghd7 nằm gần tâm động, trên nhiễm sắc thể số 7 [15]

Nhiễm sắc thể số 8:

QTLs quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử C1121-RZ562 gần tâm động.Bốn QTLs quy định số hạt chắc trên bông đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử RG333-C1121, RM25-RG978, RM210-RZ66, và CDO99 [17]

Nhiễm sắc thể số 9:

Một QTL quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân

tử RM257-RG667 [12].Ba QTLs quy định tính trạng năng suất liên kết chỉ thị phân tử C1232-R1164 và RM219-RZ698 [12]

Nhiễm sắc thể số 10:

Bốn QTLs quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử C153A-RM222 trên vai ngắn nhiễm sắc thể 10 [12] Hai QTLs quy định tính trạng tổng số hạt trên cây liên kết chỉ thị phân tử RM239-RZ56, C405-C371 trên vai dài [13]

Nhiễm sắc thể số 11:

Ba QTLs quy định tính trạng khối lƣợng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân

tử RM20B-RM167 trên vai ngắn nhiễm sắc thể số 11, G44-G257 và RZ536 Ba QTLs quy định tính trạng số hạt trên bông liên kết chỉ thị phân tử RM20-C104, RZ537-RZ900, và RM254-C950 [13]

RG103-Nhiễm sắc thể số 12:

Hai QTLs quy định tính trạng tổng số hạt trên cây liên kết chỉ thị phân

tử RG574và RG341 hay RG869 [19] Ba QTLs quy định tính trạng số hạt trên bông đƣợc xác định liên kết chỉ thị phân tử RM20A-C732B, RG869, CDO459-RG235 [17]