Xác định đồng thời một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng sắc ký lỏng khối phổ LC MS MS

Bookmark not defined.. Bookmark not defined.. Bookmark not defined.. Nguy n Th Nhung Tr ng HKH T Nhiên Hìnhă3.1:ăS căkíăđ mix PSP chu n 100 ng/mL ch y ch ngătrìnhăgradientă4 Error!. Hình

Trang 1

I H C QU CăGIAăHÀăN I

=======

NGUY N TH NHUNG

XỄCă NHă NG TH I M T S C T GỂYăLI TăC

TRONG NHUY N TH HAI M NH V B NG

Trang 2

Nguy n Th Nhung Tr ng HKH T Nhiên

An toƠn v sinh th c ph m Qu c Gia v i s h ng d n c a PGS.TS LêăTh ă

H ngăH o

TSăLêăTh ăH ngăH o đƣ đ nh h ng nghiên c u, h ng d n vƠ góp ý giúp

em hoƠn thƠnh khóa lu n nƠy Tôi xin g i l i c m n t i ThS.ăNguy năTh ă

HƠăBình đƣ h ng d n vƠ giúp đ tôi hoƠn thƠnh khóa lu n nƠy

toƠn v sinh th c ph m Qu c gia, TS Tr năCaoăS n vƠ các cán b khoa c

đi u ki n giúp tôi hoƠn thƠnh đ tƠi

đ c bi t lƠ các th y cô trong b môn Hoá Phơn tích, đƣ cho tôi nh ng ki n

th c quý giá trong quá trình h c t p vƠ th c hi n đ tƠi nƠy

hoá K24, đ c bi t lƠ nh ng ng i b n trong nhóm hoá phơn tích K24 đƣ giúp đ ,

bên tôi, chia s khó kh n, đ ng viên vƠ giúp đ tôi trong h c t p vƠ trong

cu c s ng

Tôi r t mong nh n đ c ý ki n đóng góp c a th y cô vƠ các b n sinh viên

Hà N i, ngày 07 tháng 11 n m 2016

Nguy n Th Nhung

Trang 3

M C L C

T V N 1

CH NG I: T NG QUAN 2

1.1 Gi i thi u v đ c t nhuy n th gơy li t c 2

1.1.1 Gi i thi u v STX 4

1.1.2 Gi i thi u v NEO 4

1.1.3 Gi i thi u v GTX-1 5

1.1.4 Gi i h n t i đa cho phép (ML) 6

1.1.5 Nh ng tác h i c a đ c t nhuy n th gơy li t c 7

1.2 Các ph ng pháp xác đ nh đ c t gơy li t c trong nhuy n th hai m nh v 9

1.2.1 Các ph ng pháp th sinh h c 9

1.2.2 Ph ng pháp xét nghi m mi n d ch ELISA 10

1.2.3 Ph ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) 11

1.2.4 K thu t đi n di 13

1.2.5 Ph ng pháp s c ký l ng kh i ph (LC-MS), (LC-MS/MS) 13

CH NG 2: I T NG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 16

2.1 i t ng vƠ n i dung nghiên c u 16

2.1.1 i t ng nghiên c u 16

2.1.2 N i dung nghiên c u 16

2.2 Ph ng pháp nghiên c u 16

2.2.1 Ph ng pháp chu n b m u 16

2.2.2 Ph ng pháps c ký l ng kh i ph (LC-MS/MS) 17

2.2.3 Th m đ nh ph ng pháp 23

Trang 4

2.2.4 Ph ng pháp x lý s li u 26

2.3 Ph ng ti n nghiên c u 26

2.3.1 Thi t b , d ng c 26

2.3.2 Dung môi, hóa ch t 27

CH NG 3: K T QU VÀ TH O LU N Error! Bookmark not defined. 3.1 T i u hóa các đi u ki n ch y thi t b LC-MS/MS Error! Bookmark not defined. 3.1.1 T i u hóa các đi u ki n ch y c a thi t b kh i ph MS/MS Error! Bookmark not defined. 3.1.2 T i u hóa các đi u ki n ch y s c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) Error! Bookmark not 3.2 Kh o sát quy trình x lý m u Error! Bookmark not defined. 3.2.1 Ch n qui trình x lí m u Error! Bookmark not defined. 3.2.2 Kh o sát nh h ng c a nhi t đ lên quá trình chi t m u Error! Bookmark not defined. 3.2.3 Kh o sát quá trình pha loƣng d ch chi t Error! Bookmark not defined. 3.2.4 Kh o sát th tích dung môi chi t Error! Bookmark not defined. 3.3 Th m đ nh ph ng pháp phơn tích Error! Bookmark not defined 3.3.1 Tính đ c hi u / ch n l c Error! Bookmark not defined. 3.3.2 Gi i h n phát hi n (LOD), gi i h n đ nh l ng (LOQ) Error! Bookmark not defined 3.3.3 Xác đ nh kho ng tuy n tính Error! Bookmark not defined. 3.3.4 chính xác (accuracy) c a ph ng pháp phơn tích (đ đúng vƠ đ ch m) Error! Bookmark not defined 3.4 Áp d ng phơn tích m u th c t Error! Bookmark not defined. K T LU N VÀ KI N NGH Error! Bookmark not defined TÀI LI U THAM KH O Error! Bookmark not defined PH L C

Trang 5

DANHăSACHăBANGăBIểU

B ng 1.1: C uătrúcăhóaăh căvƠăđ cătínhăc a m tăvƠiăđ c t PSP 3

B ng 1.2: M t s n căđƣăđ aăraăquiăđ nh gi i h n t iăđaăchoăphépă(ML)ăc a các PSP 6

B ng 1.3: M t s nghiênăc u s d ng ph ngăphápăHPLC-FLDăđ xácăđ nh

PSP 11

B ng 2.1: B ng pha dung d ch chu nălamăviêc Error! Bookmark not defined

B ng 3.1: Ion m c a t ng ch t Error! Bookmark not defined.

B ngă3.2:ă i u ki n t i u cho ESI-MS/MS Error! Bookmark not defined.

B ngă3.3:ăCácăthôngăs t i u MS/MS Error! Bookmark not defined.

B ng 3.4: Ch ngătrìnhăgradient Error! Bookmark not defined

B ng 3.5: L a ch năquyătrìnhăchi t m u Error! Bookmark not defined

B ng 3.6: Kh oă sátă nh h ng c a nhi tă đ lênă quáă trìnhă chi t m u

Error! Bookmark not defined

B ng 3.7: Kh oăsátăquáătrìnhăphaăloƣngăd ch chi t Error! Bookmark not

defined

B ng 3.8: Kh oăsátăth tíchădungămôiăchi t Error! Bookmark not defined.

B ng 3.9: Ion m vƠăionăconăc a STX, GTX-1, NEO Error! Bookmark not

defined

B ng 3.10:ăLODăvƠăLOQăc a STX, GTX-1, NEO Error! Bookmark not

defined

Trang 6

B ng 3.11: S ph thu c c a di nă tíchă pică vƠoă n ngă đ c aă cácă PSP

B ng 3.12: l p l iăvƠăđ thu h i c a STX, GTX-1,ăNEOătrênăn n m u

Ngao Error! Bookmark not defined.

B ngă3.13:ă l p l iăvƠăđ thu h i c a STX, GTX-1,ăNEOătrênăn n m u HƠu Error! Bookmark not defined.

B ng 3.14: K t qu phơnătíchăm u th c t trênăđ aăbƠnăHƠăN i Error!

Bookmark not defined

Trang 7

Hìnhă3.1:ăS căkíăđ mix PSP chu n 100 ng/mL ch y ch ngătrìnhăgradientă4

Hìnhă3.2:ăS đ quyătrìnhăx lýăm u 1Ti năhƠnhăx lýăm uătheoăquyătrìnhă2 theoătácăgi Van De Riet Error! Bookmark not defined.

Hìnhă3.3:ăS đ quyătrìnhăx lýăm u 2 Error! Bookmark not defined.

Hìnhă3.4:ăS đ quyătrìnhăx lýăm u 3 Error! Bookmark not defined.

Hìnhă3.5:S căkíăđ cácăPSPă100 ng/mL trongăquyătrìnhă3 Error! Bookmark

not defined

Hìnhă3.6:ăS căkíăđ quyătrìnhăkhôngăgiaănhi tăkhiăthêmăchu n mix PSP 100

ng/mL Error! Bookmark not defined

Hìnhă3.7:ăS căkíăđ quyătrìnhăgiaănhi tăkhiăthêmăchu n mix PSP 100 ng/mL

Hìnhă3.8:ă th kh oăsátăs nh h ng c aăquáătrìnhăphaăloƣngăđ n hi u su t

Trang 8

thu h i Error! Bookmark not defined

Hìnhă3.9:ă th kh oăsátăs nh h ng c a th tíchăchi tăđ n hi u su t thu

Hìnhă3.10:ăQuyătrìnhăx líăm u t i u Error! Bookmark not defined.

Hìnhă3.11:ăPh kh i c aăcácăPSP Error! Bookmark not defined

Hìnhă3.12: S căđ m u tr ngăkhôngăcoătốnăhiêuăchơtăphơnătốch Error!

Hìnhă3.13: S căđ m u chu n m c 200 ng/mL Error! Bookmark not

defined

Hìnhă3.14: S căđ m u tr ngăthêmăchu n m c 200 ng/mL Error!

Hìnhă3.15:ăS căkíăđ STX t i LOD 10 ng/mL (t ngăđ ngă100ăµg/kgătrênă

m u) Error! Bookmark not defined.

Hìnhă3.16:ăS căkíăđ NEO t i LOD 15 ng/mL (t ngăđ ngă150ăµg/kgătrênă

Hìnhă3.17:ăS căkíăđ GTX-1 t i LOD 15 ng/mL (t ngăđ ngă150ăµg/kgătrênă

Hìnhă3.18:ă ngăchuơnăSTXătheoădiênătốchăpic Error! Bookmark not defined

Hìnhă3.19:ă ngăchuơnăGTX-1 theoădiênătốchăpic Error! Bookmark not

defined

Trang 9

Hìnhă3.20:ă ng chu năNEOătheoădiênătốchăpic Error! Bookmark not defined

Trang 10

nh

Trang 11

Trang 12

Nguy n Th Nhung 1 Tr ng HKH T Nhiên

các loƠi hai m nh v nói riêng đƣ vƠ đang phát tri n r m r nhi u đ a ph ng

ô th hóa, ô nhi m môi tr ng lƠm môi tr ng bi n ngƠy cƠng b suy thoái t o đi u ki n cho s xu t hi n vƠ bùng n c a các loƠi vi t o bi n đ c h i

Các loƠi thơn m m hai m nh v lƠ đ i t ng trung gian chính đ gơy ra hi n

t ng ng đ c ng i vƠ các sinh v t b c cao nh chim bi n, thú bi n c bi t

s có m t các nhóm đ c t đ c t gơy li t c PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) Chính vì v y, nghien c u phát hi n các đ c t c n đ c quan tơm đ gi m nguy

c nh h ng đ n s c kh e c ng nh tính m ng c a con ng i

tính m ng con ng i lƠ do đ ng v t nhy n th b nhi m vƠ tích l y đ c t PSP do

n ph i t o đ c nhóm Dinoflagellates bao g m loƠi Dinophysis spp, Aurocentum,

thi t, lƠ công c r t t t ph c v cho công tác thanh tra, ki m tra an toƠn th c ph m

Do đó, chúng tôi ti n hƠnh nghiên c u phát tri n ph ng pháp “Xác đ nh đ ng

M c tiêu c a th c hi n đ tƠi lu n v n lƠ:

- Xơy d ng ph ng pháp xác đ nh đ ng th i m t s đ c t gơy li t c trong

- S à à à t s c t à à à à n th hai m nh v

à t i H àN i

Trang 13

1.1 Gi iăthi uăv ăđ căt ănhuy năth ăgơyăli tăc

trên th n kinh STX lƠ đ c t PSP đ c phát hi n s m nh t vƠo n m 1957, vƠ k

t đó đ n nay đƣ có 57 d n xu t đ c mô t [28]

có th b phá h y khi n u n hay đun nóng [15], [18] Chúng có th đ c chia thƠnh 4 phơn nhóm chính [8], [22], [28]:

Trang 14

Hìnhă1.1:ăCôngăth c c u t o t ngăquátăc aăcácăđ c t PSP

B ng 1.1: C u tr úcăhóaăh căvƠăđ cătínhăc a m tăvƠiăđ c t PSP

O NH2O

californianeus

- Lý hóa tính: Các đ c t PSP không b phơn h y b i nhi t môi tr ngacid

nh ng không b n v ng vƠ d b oxy hóa trong môi tr ng ki m

- Tác h i: Các tri u ch ng nhi m đ c PSP có th xu t hi n sau khi n vƠi phút cho đ n 10 gi Tri u ch ng bao g m c m giác tê môi, c , m t, cùng c m th y

nh có ki n bò trong các ngón tay vƠ ngón chơn, nh c đ u, chóng m t vƠ bu n nôn, nói n ng không còn m ch l c, m ch đ p nhanh, th khó Tr ng h p n ng

có th d n đ n t vong do suy hô h p

Trang 15

GTX-1 vƠ đ n NEO c t ít gơy đ c nh t lƠ đ c t GTX-2

- Xơm nh p: qua đ ng n u ng, hít th

- C ch tác d ng: Saxitoxin vƠ các d n ch t khác phong b kênh Na+

c a các t bƠo th n kinh do đó chúng gơy nh h ng đ n ho t c ho t đ ng th n kinh vƠ các

Trang 16

Trang 17

- Công th c thu g n: C10H17N7O9S

- Kh i l ng mol phơn t : 411.34848g/mol

1.1.4 Gi i h n t iăđaăchoăphépă(ML)

m t pháp lí ho c xem nh có th ch p nh n đ c trong nhuy n th hai m nh

v , mƠ không gơy h i cho ng i s d ng

B ng 1.2: M t s n căđƣăđ aăraăquiăđ nh gi i h n t iăđaăchoă

phépă(ML)ăc aăcácăPSPănh ăsauă[13]:

t n c/

Vùng lƣnh th S n ph m c t M c cho phep

Chơu Âu Nhuyên thê PSP 80µg/100g

Nhơt Nhuyên thê PSP 400 MU/100g

HƠn Qu c Nhuyên thê Gonyautoxins 400 MU/100g

́c ng v t có v PSP, NSP, DSP,

ASP 40-80 µg/100g

M Nhuyên thê PSP 80 µg/100g

Trang 18

Nh n xét: Hi n nay Vi t Nam ch a đ a ra qui đ nh gi i h n t i đa cho phép

1.1.5 Nh ngătácăh i c aăđ c t nhuy n th gơyăli tăc

 nh h ng đ n đ ng v t giáp xác thơn m m

nh nghêu, trai, sò v m, hƠu Nh ng đ t bùng phát t o n hoa x y ra c a sông,

bi n có mƠu đ , có khi mƠu xanh, mƠu xám… a s các loƠi t o n hoa lƠm môi

tr ng x u đi, lƠm gi m l ng oxi hòa tan trong n c lƠm cho đ ng v t bi n ch t hƠng lo t [14]

hƠng n m t tháng 3 đ n tháng 9 G n đơy, trong kho ng tháng 3-6/2012 Cát

BƠ H i Phòng c ng đƣ xu t “th y tri u đ ”, tuy nhiên lo i t o nƠy có tên Noctiluca scintillans không sinh đ c t , nên không có nguy c gơy đ c cho ng i

[11]

 nh h ng c a t o đ c trong ao tôm

Trên các ao nuôi tôm sú Penaeus monodon vƠ P orientalis Ơi Loan, Trung

Qu c vƠ Malaysia có nhi u gi ng t o n hoa do môi tr ng giƠu ding d ng bao

g m: Euglena spp, Noctiluca scintillan, Alexdrium tamarense, Chattonella spp,

chúng gơy ra tình tr ng thi u oxy máu, ti t ra đ c t PSP, ASP lƠm gi m sinh

tr ng tôm, gơy b nh, ho c tr c ti p gơy ch t tôm

vùng bi n Khánh Hòa đƣ lƠm ch t kho ng 20 t n tôm hùm v i thi t h i c tính

Trang 19

 nh h ng x u đ n s c kh e con ng i

ng i, nhi m đ c t nhuy n th gơy li t c (PSP) lƠ do n ph i nhuy n th

ch a đ c t nƠy Nhuy n th b nhi m vƠ tích l y các lo i đ c t nƠy lƠ do n t o

đ c

khi n nhuy n th b nhi m v i các tri u ch ng: c m giác kim chơm ho c tê nh

đ n li t c hô h p hoƠn toƠn Trong tr ng h p n ng có th t vong do li t c hô

M i n m, các tr ng h p ng đ c do PSP v n đ c ghi nhơn trên toƠn th gi i

T n m 1970 có kho ng 1.600 tr ng h p ng đ c do PSP đƣ đ c báo cáo, d c

bi t lƠ B c M vƠ Chơu Âu Bên c nh đó, có thêm kho ng 900 tr ng h p ng

đ c PSP đ c ghi nh n các vùng trên th gi i mƠ tr c đó PSP ch a đ c bi t

đ n

Nh t, tr ng h p ng đ c đ u tiên đ c ghi nh n vƠo cu i nh ng n m 1960 Malaysia, Philippin vƠ Indonesia, các ca ng đ c đ u tiên đ c báo cáo vƠo

nh ng n m 1970 vƠ đ u nh ng n m 1980 Trong su t 20 n m qua, d ng nh có

s gia t ng các v ng đ c PSP do vi c nuôi vƠ tiêu th nhuy n th đ c m

r ng

 Nhóm nhuy n th đ c xác đ nh trong nh ng v ng đ c PSP g m ch

y u đ ng v t thơn m m hai m nh v g m v m, ngao, hƠu, đi p vƠ sò C n chú ý:

do PSP tích l y trong nhuy n th nên chúng có th gơy ng đ c cho ng i c khi không có hi n t ng th y tri u đ Tác d ng đ c lên đ ng v t

PSP có th gơy đ c lên nhi u đ ng v t khác nh cá, chim, ch, gƠ, chu t, th , chó mèo Trong các thí nghi m trên đ ng v t, PSP lƠm ch t thú th nghi m do gơy

th n kinh trung ng, h th ng tim m ch vƠ li u 1 µg/kg tr ng l ng c th đƣ

Trang 20

gơy t ng huy t áp

 H p th vƠ th i các đ c t PSP trong c th th y s n

Trong quá trình l c th c n, các t bƠo vƠ bƠo t c a t o giáp đƣ chuy n vƠo th c

c th đ ng v t nhuy n th , các đ c t t p trung nhanh chóng trong n i t ng vƠ

gian vƠ v trí trong đ ng v t C khép v không tích l y đ c t mƠ th c t cho

th y đƣ lƠm b t ho t đ c t ng tiêu hóa, mƠng, tuy n sinh d c vƠ mô mang gi

l i đ c t v i tr ng l ng khác nhau gi a các mô vƠ gi các loƠi Sau khi h p th

vƠ phơn b , các đ c t có th b bi n đ i Các loƠi hai m nh v có cách x lý vƠ

khác nhau, ví d : v m tích l y các đ c t PSP nhi u h n hƠu trong cùng hoƠn

c nh Các nghiên c u nuôi trong phòng thí nghi m cho th y v m h p th d dƠng các đ c t c a t o giáp nh ng v i l ng đ c t t ng đ ng nh th thì hƠu

1.2.1.ăCácăph ngăphápăth sinh h c

chính trong h u h t các ch ng trình giám sát ng đ c th y s n MBA đ c s

c a AOAC

Trang 21

PSP trong m u đ c chi t tách b ng dung d ch HCl 0,1N, d ch chi t đ c tiêm vƠo chu t theo t l 1 mL d ch/20 g chu t, quan sát bi u hi n c a chu t trong vòng 60 phút vƠ xác đ nh th i gian ch t c a chu t D a vƠo th i gian ch t

c a chu t tra b ng Sommer s xác đ nh đ c giá tr đ n v chu t (MU), t đó tính đ c n ng đ đ c t PSP trong m u [23], [30]

Tác gi Ơo Vi t HƠ ậ Vi n H i D ng H c Nha Trang [1] đƣ ti n hƠnh

t PSP trong nghêu Meretrix lyrata t i m t s vùng nuôi tr ng đi m khu v c C n

Gi Tác gi đƣ ti n hƠnh tiêm phúc m c chu t nh t tr ng (Swiss wiss) (có tr ng

l ng 20g ́ 2g) 1 mL d ch chi t thô, sau đó theo dõi tri u ch ng vƠ th i gian

m c đ phát hi n c a ph ng pháp MBA (36 µg/100g, v i h s CF = 0.18)

- u đi m: th i gian th c hi n nhanh, có kh n ng đánh giá đ c t ng các

đ c t vƠ không đòi h i trang thi t b ph c t p

- Nh c đi m lƠ đ nh y th p, không th t đ ng hóa, không đ nh danh chính xác lo i ch t đ c, b nh h ng b i các đ c tính đ ng v t vƠ đ c bi t lƠ v n

đ đ o đ c [22], [23] Do đó, nhóm ph ng pháp nƠy hi n nay không còn đáp

ng đ c nhu c u vƠ d n đ c thay th b ng các ph ng pháp hoá h c

1.2.2.ăPh ngăphápăxétănghi m mi n d ch ELISA

phát hi n kháng nguyên hay kháng th trong m u xét nghi m, vƠ th ng đ c quan sát b i s thay đ i mƠu s c Usleber vƠ c ng s b ng cách s d ng các kháng th đa dòng đƣ phát tri n thƠnh công kit th nghi m cho STX Gi i h n phát hi n lƠ 4 ng/g mô nhuy n th [26]

- u đi m: D th c hi n vƠ th i gian phơn tích ng n

Định dạng
Số trang	43
Dung lượng	1,31 MB