Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An (Tóm tắt LA tiến sĩ)

Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An (LA tiến sĩ)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGÔ THỊ MAI VI

NGHIÊN CỨU BỆNH ĐỐM ĐEN

(Phaeoisariopsis personata) HẠI LẠC TẠI NGHỆ AN

CHUYÊN NGÀNH : BẢO VỆ THỰC VẬT

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI, 2017

Công trình hoàn thành tại:

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn: PGS.TS NGUYỄN VĂN VIÊN

Phản biện 1: PGS.TS Ngô Bích Hảo

Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Kim Vân

Hội Khoa học kỹ thuật Bảo vệ thực vật Việt Nam

Phản biện 3: TS Hà Minh Thanh

Viện Bảo vệ thực vật

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2017

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh đốm đen do nấm Phaeoisariopsis personata (giai đoạn vô tính) hay

Mycosphaerella berkeleyi (giai đoạn hữu tính) là một trong các bệnh hại lá nguy hiểm

nhất đối với cây lạc trên toàn thế giới Thiệt hại năng suất do bệnh đốm đen trên toàn cầu ước tính gần 3 triệu USD (CABI, 2006)

Mức độ thiệt hại năng suất của bệnh đốm đen hại lạc thay đổi từ 10 – 80%, tùy theo khu vực và vụ trồng (CABI, 2006; Zhang, 2001; Dwivedi, 2003; Pensuk, 2003; Khedikar, 2010)

Trên đồng ruộng, nấm tạo cả 2 giai đoạn sinh sản vô tính và hữu tính nhưng bào tử phân sinh hình thành từ tàn dư tồn tại trong đất là nguồn bệnh quan trọng nhất Nhìn chung, nấm gây bệnh đốm đen không truyền qua hạt nhưng được xem là tác nhân truyền qua đất Khi bắt đầu vụ trồng, bào từ phân sinh nấm từ tàn dư trong đất sẽ nhiễm các lá phía dưới và nhanh chóng phát tán lên các lá phía trên và có thể

gây tàn lụi bộ lá nếu điều kiện ngoại cảnh thuận lợi (McDonald et al., 1985)

Tác nhân gây bệnh đốm đen là một loài nấm túi thuộc nhóm sinh dưỡng

“biotrophe” và quan hệ của nấm với cây lạc tuân theo quan hệ gen đối gen điển hình Hiện nay đã có một số nghiên cứu trên thế giới về tính kháng của cây lạc đối với nấm

gây bệnh đốm đen ((Dwivedi et al., 2002; Mace et al., 2006; Mondal and Badigannavar 2009; Mondal et al., 2009; Mallikarjuna et al., 2012)

Các chủng nấm khác nhau về nền di truyền có thể có phản ứng mẫn cảm khác nhau đối với thuốc hóa học cũng như khác nhau về tính gây bệnh trên các giống cây

(Adiver et al., 2009) Vì vậy, mức độ đa dạng về các đặc điểm sinh học cũng như di

truyền của nấm gây bệnh đốm đen nói riêng và tác nhân gây bệnh nói chung cần phải được nghiên cứu để áp dụng hiệu quả các biện pháp phòng chống nhưng có rất ít nghiên cứu về mức độ đa dạng của nấm gây bệnh được thực hiện Cho tới nay, mới chỉ có 2 nghiên cứu về mức độ đa dạng phân tử của nấm gây bệnh đốm đen hại lạc tại

Ấn Độ dựa trên phân tích RAPD (Adiver et al., 2009) và phân tích phổ isozyme (Adiver et al., 2008) Tương tự cũng chỉ có 2 nghiên cứu về mức độ biến động về

tính gây bệnh của nấm gây bệnh đốm đen (Hossain, 1997; Hossain and Ilag, 2000)

Tại Nghê ̣ An nói riêng và Việt Nam nói chung, bệnh đốm đen hại lạc xuất hiện

và gây hại phổ biến trên đồng ruộng Tuy nhiên, cho tới nay, chưa có một công trình nào nghiên cứu sâu và thực hiện một cách hệ thống về bệnh này ở Việt Nam Bên

ca ̣nh đó, do bệnh hiếm khi làm chết cây nên người dân cũng như các cơ quan chuyên môn chưa thâ ̣t sự ý thức được tác ha ̣i của nhóm bê ̣nh ha ̣i lá đến năng suất và phẩm chất la ̣c Chı́nh vı̀ vậy, công tác chı̉ đa ̣o trong phòng trừ bê ̣nh chưa phù hợp dẫn đến sự giảm sút nghiêm tro ̣ng về năng suất cũng như phẩm chất la ̣c của vùng

Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, việc nghiên cứu về bệnh đốm đen hại lạc là cần thiết ở Việt Nam Nghiên cứu này tập trung vào đánh giá thiệt hại, mức độ đa dạng của nấm cũng như đánh giá một số biện pháp phòng trừ bệnh trong điều kiện tỉnh Nghệ An

Các kết quả nghiên cứu của luận án sẽ là cơ sở để nghiên cứu và ứng dụng các biện pháp trừ bệnh đốm đen nhằm phòng chống hiệu quả sự phát triển, lây lan của bệnh trên đồng ruộng, góp phần làm tăng năng suất và phẩm chất lạc

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Đánh giá được thiệt hại, mức độ đa dạng và biện pháp phòng trừ nấm P

personata gây bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An

1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh đốm đen hại lạc do nấm P personata gây ra

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài tập trung nghiên cứu về đa dạng phân tử, đặc tính sinh học, tính gây

bệnh và một số biên pháp phòng chống nấm P personata

1.3.3 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

Điều tra, đánh giá tác hại và nghiên cứu về bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An Mẫu bệnh đốm đen được thu thập tại Nghệ An và một số tỉnh khác như Lào Cai, Thanh Hóa, Hà Tĩnh và Đồng Nai

Đề tài được thực hiện từ năm 2012 đến năm 2015

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài đã đánh giá được thiệt hại năng suất do bệnh đốm đen gây ra đối với cây lạc ngoài đồng ruộng tại Nghệ An Trên giống lạc L14, bệnh đốm đen có thể làm giảm năng suất tới 30,24% trong vụ xuân và tới 49,90% trong vụ thu

Bổ sung thông tin về phân loại nấm đốm đen hại lạc tại Nghệ An Trình tự vùng

gen ITS của 11 mẫu nấm thu thập đã cho thấy chúng thuộc loài Phaeoisariopsis

personata (giai đoạn vô tính) hay Mycosphaerella berkeleyi (giai đoạn hữu tính)

Dựa trên phân tích Rep - PCR cũng đã chứng tỏ quần thể nấm ở Nghệ An có mức độ đa dạng thấp và không có mối quan hệ giữa các nhóm phả hệ với đặc điểm hình thái, nguồn gốc của câc mẫu nấm thu thập

Xác định được các đặc điểm sinh học và dịch tễ đặc trưng của nấm P personata

tại Nghệ An Trong đó, khám phá khoa học quan trọng nhất là xác định được dạng sinh sản hữu tính của nấm chưa phát hiện thấy trong điều kiện tự nhiên tại Nghệ An Kết quả nghiên cứu của luận án đã chứng tỏ thuốc hoạt chất Carbendazime, dịch

chiết thực vật từ cây cà độc được (Datura metel) và cây trầu không (Piper betel) có khả năng phòng chống hiệu quả nấm P personata trong điều kiện phòng thí nghiệm,

trong nhà lưới cũng như ngoài đồng ruộng Ở ngoài đồng ruộng, có hai thời điểm xử

lý bệnh đốm đen hiệu quả nhất, bao gồm phun khi cây mọc 5 tuần, 6 tuần hoặc khi cây mọc 8 tuần và 9 tuần

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã bổ sung, đóng góp mới những dữ liệu khoa học về định danh nấm đốm đen bằng giải trình tự vùng ITS Đặc biệt, dựa trên phân tích Rep - PCR đã chứng tỏ quần thể nấm ở Nghệ An có mức độ đa dạng thấp và

không có mối quan hệ giữa các nhóm phả hệ với đặc điểm hình thái, nguồn gốc của câc mẫu nấm thu thập Kết quả nghiên cứu này gợi ý đối với nấm gây bệnh đốm đen hại lạc ở Nghệ An, các biện pháp quản lý bệnh có thể được áp dụng đồng loạt trên toàn tỉnh và tạo hiệu quả phòng chống giống nhau

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài đã xác định được các đặc điểm sinh học, dịch tễ đặc trưng của nấm, đánh giá được thiệt hại năng suất do bệnh đốm đen gây ra đối với cây lạc và nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh một cách hệ thống Kết quả nghiên cứu của đề tài đã khẳng định

được tầm quan trọng của bệnh đồng thời giải thích được sự gây bệnh của nấm P

personata hại lạc trên đồng ruộng, tìm ra thời điểm xử lý bệnh hiệu quả, từ đó làm cơ

sở cho việc đề xuất và áp dụng các biện pháp phòng trừ nhằm giảm thiểu thiệt hại của bệnh một cách hiệu quả, góp phần nâng cao năng suất và phẩm chất lạc

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT LẠC TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

Cây lạc đứng hàng thứ hai sau cây đậu tương trong số các cây trồng ngắn ngày lấy dầu thực vật (cả về diện tích và sản lượng) và được trồng rộng rãi ở hơn 100 quốc gia trên thế giới

Theo số liệu của Tổ chức Nông Lương Thế giới (2013), từ năm 2000 đến

2012, cùng với sự gia tăng về năng suất, sản lượng lạc thế giới cũng tăng lên, đạt cao nhất là 38,4 triệu tấn (năm 2008), sau đó giảm xuống cùng với sự tụt giảm diện tích trồng, do đó sản lượng lạc năm 2010 chỉ đạt 35,9 triệu tấn (FAO, 2013) Các nước có sản lượng lạc lớn nhất trong niên vụ 2011/2012 là Trung Quốc, Ấn Độ, Nigeria và Mỹ Trung Quốc là nước đứng đầu với 16,8 triệu tấn, tiếp theo là Ấn Độ với 5,78 triệu tấn và Việt Nam là nước đứng thứ 12 với sản lượng 0,47 triệu tấn (FAO, 2013) Sản xuất lạc tại Việt Nam được phân bố ở hầu hết các vùng sinh thái nông nghiệp với diện tích trồng lạc chiếm khoảng 28% tổng diện tích cây công nghiệp hàng năm, tập trung chủ yếu ở các vùng như Duyên hải Nam Trung Bộ, Đồng bằng sông Hồng, Trung du và miền núi phía Bắc và Bắc Trung Bộ

Theo số liệu của Tổng cục Thống kê Việt Nam (2013), trong vòng 10 năm từ 2002-2012, mặc dù diện tích giảm từ 246,7 nghìn ha (năm 2002) xuống còn 220,5 nghìn ha (năm 2012) nhưng sản xuất lạc ở Việt Nam đã có những bước chuyển biến tích cực về năng suất, tăng từ 1,62 tấn/ha (năm 2002) lên 2,13 tấn/ha (năm 2012) Sản lượng tăng từ 400,4 nghìn tấn (năm 2002) lên 470,6 nghìn tấn (năm 2012) Năm 2012, năng suất lạc bình quân cả nước đạt cao nhất là 2,13 tấn/ha Sản lượng lạc của cả nước đạt cao nhất vào năm 2008 với 530,2 nghìn tấn (bảng 2.2)

2.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH ĐỐM ĐEN HẠI LẠC

Năm 1985, Ellis và Everhad khi kiểm tra mẫu bệnh ở Alabama và Nam

Carolina đã có kết luận rằng nấm bệnh thuộc loại Cercospora sp và đặt tên là

Cercospora personatum Hiện nay, tên nấm này được đổi thành Phaeoisariopsis personata (giai đoạn vô tính) hay Mycosphaerella berkeleyi (giai đoạn hữu tính)

Theo số liệu của Trung tâm Sinh học Nông nghiệp Quốc tế (CABI, 2006), tính trên toàn thế giới, bệnh đốm nâu và đốm đen có thể làm giảm năng suất lạc từ 10 - 80%,

con số này thay đổi tùy theo từng khu vực và mùa vụ khác nhau Theo Khedikar et al

(2010), khi cây lạc vừa bị ảnh hưởng của bệnh rỉ sắt và bệnh đốm đen thì năng suất có thể giảm 50 - 70% Ở Pakistan, khi tỷ lệ cây nhiễm bệnh đốm đen lên đến 87,2% thì thiệt

hại năng suất lên đến 70% (Ijaz et al., 2011) Ở Bangladesh, bệnh đốm lá lạc do nấm C

arachidicola và C personatum làm giảm năng suất lạc từ 30 - 48% (Hasan et al., 2016)

Ở Việt Nam, theo Mehan and Hong (1994), bệnh rỉ sắt Puccinia arachidis và bệnh đốm đen hại lạc Phaeoisariopsis personata là hại bệnh hại lá chính trên lạc,

phân bố ở khắp các vùng trồng trong cả nước Hai bệnh này kết hợp với nhau làm giảm 30 - 70% năng suất lạc

Bệnh đốm đen có thể gây hại ở tất cả các bộ phận trên mặt đất của cây lạc như thân, cành nhưng lá là bộ phận bị hại nặng nhất Nấm sản sinh ra độc tố Cercosporin kìm hãm sự hoạt động của lá gây hiện tượng rụng lá sớm

Bệnh có thể phát sinh gây hại ở ngưỡng nhiệt độ 18 - 35oC và nhiệt độ tối thích

là 18 - 23oC (Pande et al., 2004) Trên đồng ruộng, nấm tạo cả 2 giai đoạn sinh sản vô

tính và hữu tính nhưng bào tử phân sinh hình thành từ tàn dư tồn tại trong đất là nguồn bệnh quan trọng nhất (CABI, 2006) Các cây ký chủ của bệnh đốm đen mới được ghi nhận ở các loài thực vật thuộc chi Arachis mà chưa ghi nhận ở các loài thực vật nào khác ngoài chi Arachis này (Arsule and Pande, 2012)

Theo Abdou and Cooper (1974) và Butler et al (1994), nấm C personatum

sinh trưởng và sinh bào tử tốt nhất trên môi trường WA + PLX và OMA + PLX ở

ngưỡng nhiệt độ 25°C Kết quả nghiên cứu của Abdou and Cooper (1974) cũng cho thấy, nấm C personatum sinh bào tử tốt nhất khi nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng

hoàn toàn nhưng khi nuôi cấy ở điều kiện tối hoàn toàn thì nấm không sinh bào tử

Tác giả Zhang et al (2001) đã tiến hành thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo nấm gây bệnh đốm đen hại lạc C personatum lên giống lạc Florunner trong nhà lưới, ở

điều kiện nhiệt độ 25 - 28oC, cường độ chiếu sáng 14h/ngày, sau đó đánh giá mức độ bệnh ở 3, 4, 5, 6, 7 và 8 tuần tuổi Kết quả cho thấy, chỉ số bệnh trên cây 5 tuần tuổi đạt cao nhất Khi lây nhiễm với nồng độ 1,6 × 105 bào tử/ml thì chỉ số bệnh cao hơn

so với công thức lây nhiễm với mật độ độ 1,6 × 103 bào tử/ml và 1,6 × 104 bào tử/ml

2.3 NHỮNG NGHIEN CỨU VỀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ BỆNH ĐỐM ĐEN

* Biện pháp canh tác

Biện pháp canh tác như vệ sinh đồng ruộng, thu dọn tàn dư cây bệnh và nhổ bỏ cỏ dại

có tác dụng phòng chống hiệu quả bệnh đốm đen (CABI, 2006; Gaddamwad et al., 2014)

* Sử dụng giống kháng

Sử dụng giống kháng bệnh được coi là ưu tiên hàng đầu trong phòng chống bệnh đốm đen hại lạc Nhiều tác giả trên thế giới đã chỉ ra rằng, sử dụng giống kháng bệnh có hiệu quả nhất Nhiều dòng/giống lạc kháng bệnh đã được nghiên cứu và đưa vào trong sản xuất như LGN123, LGN184, LGN117, GPBD4, VG9816, RHRGS

06083, RHRGS 06092, ICG 5286, ICG 2273, ICG 111426 và ICG 6022 (Kukanur et

al., 2014; Kahate et al., 2015)

Ở Việt Nam, Lưu Minh Cúc (2009) đã nghiên cứu chỉ thị vi vệ tinh trong lập bản đồ gen kháng bệnh đốm đen ở cây lạc Phân tích đa dạng di truyền 32 giống lạc cho kết quả 46/104 chỉ thị cho đa hình giữa các giống Sử dụng phương pháp chọn giống truyền thống kết hợp chỉ thị phân tử rút ngắn được thời gian chọn giống và chọn ra 17 dòng mang gen kháng bệnh

* Sử dụng nấm đối kháng

Trong số các nấm đối kháng có khả năng ứng dụng trong phòng chống bệnh cây,

nấm Chaetomium có tiềm năng lớn Nấm Chaetomium là một trong những loại nấm túi hoại sinh lớn nhất với trên 300 loài đã được mô tả (von Arx, Guarro et al 1986)

Một số loài Chaetomium, chủ yếu là các chủng thuộc 2 loài C Globosum và C

cupreum đã được chứng tỏ có hoạt tính ức chế nhiều loài nấm gây bệnh cây truyền

qua đất như Phytophthora spp., Pythium ultimum, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia

solani, Fusarium oxysporum f sp lycopersici và một số nấm hại phần trên mặt đất

như Venturia inequalis, Pyricularia oryzae, Botritis cinera, Phomopsis,

Colletotrichum (Soytong et al., 2001; Aggarwall et al., 2004) Tuy nhiên, chưa có bất

cứ nghiên cứu nào về sử dụng nấm Chaetomium trong phòng chống bệnh đốm đen hại lạc do nấm P personata gây ra đã được công bố

* Sử dụng dịch chiết thực vật

Theo Singburaudom (2015), hoạt chất hydroxychavicol trong dịch chiết thô từ lá trầu không là thành phần có hoạt tính chống nấm gây bệnh thực vật Tác giả đã đánh

giá tính kháng của dịch chiết đối với một số loại nấm như Colletotrichum

gloeosporioides, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum f sp cubense, Sphaceloma ampelinum, v.v Kết quả cho thấy, dịch chiết xuất thô từ lá trầu không ức chế sự hình

thành sợi nấm và sự nảy mầm của bào tử Ở nồng độ 1% và 10%, dịch chiết lá trầu không có khả năng ức chế 100% các loại nấm thử nghiệm trong điều kiện in vitro

Theo Kishore et al (2001), dịch chiết từ lá cà độc dược (Datura metel L.) có tác

dụng tốt trong việc ức chế khả năng nảy mầm của nấm gây bệnh đốm đen hại lạc Khi thử nghiệm với các nồng độ từ 0,01 - 10%, sau 24h, khả năng ức chế sự nảy mầm của nấm gây bệnh đốm đen đều đạt kết quả tốt, từ 93,9 - 100% Nồng độ dịch chiết 2% có

khả năng ức chế hơn 60% sự hình bào tử của nấm P personata gây bệnh đốm đen hại

lạc trong điều kiện nhà lưới Ở ngoài đồng ruộng, sử dụng dịch chiết từ lá cà độc dược

(D metel L.) có khả năng ức chế tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh đối với nấm P personata

gây bệnh đốm đen hại lạc đến khi thu hoạch (115 ngày sau trồng)

Theo Kishore and Pande (2005), ở ngoài đồng ruộng, sử dụng dịch chiết cà độc

dược (D metel L.) phun lên cây lạc ở các thời điểm 45, 60, 75 và 90 ngày sau trồng đều có hiệu quả phòng trừ bệnh đốm đen do nấm P personata đến 95 ngày sau trồng

* Phòng chống bằng chất kích kháng

Theo Zhang et al (2001), lây nhiễm nấm gây bệnh đốm đen hại lạc C

personatum trong điều kiện nhà lưới, sau đó xử lý bằng các chất kích kháng như

salicylic acid, sodium salicylate, isonicotinic acid, or benzo carbothioc acid S-methyl ester (Actigard) khi cây được 4 tuần tuổi Các chất kích

[1,2,3]thiadiazole-7-kháng SA, NaSA, BABA và INA được xử lý với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/ml; trong khi đó Actigard được xử lý với nồng độ 0,05; 0,10; 0,15 và 0,20 mg/ml Kết quả thí nghiệm cho thấy, mức giảm chỉ số bệnh đốm đen hại lạc không có sự sai khác

rõ ràng giữa các công thức thí nghiệm Khi xử lý các chất kích kháng đối với bệnh

đốm đen hại lạc C personatum thì cây lạc không tạo cảm ứng hệ thống giống như

Pappachan et al (2015), phun thuốc BVTV thuộc nhóm carbendazim (0,1%),

carbendazim + mancozeb (0,2%), difenconazole (0,1%) và tebuconazole (0,1%) có hiệu quả cao trong phòng trừ bệnh đốm đen hại lạc, trong đó phun thuốc carbendazime (0,1%) có năng suất lạc cao nhất và có hiệu quả kinh tế cao nhất

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Vật liệu, thiết bị và hóa chất nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu: Giống lạc trồng phổ biến tại Nghệ An (giống L14 và giống Sen Lai) và 33 mẫu lá lạc bị bệnh đốm đen được thu thập tại Nghệ An và một

số tỉnh khác như Lào Cai, Thanh Hóa, Hà Tĩnh và Đồng Nai

- Thiết bị nghiên cứu: Máy PCR, tủ lạnh bảo quản mẫu, nồi hấp khử trùng môi trường, buồng nuôi cấy nấm, kính hiển vi, bể ổn nhiệt, v.v

- Hoá chất dùng trong kỹ thuật PCR và các hóa chất khác như thuốc bảo vệ thực vật (Topsin M 70WP, Anvil 5SC, Daconil 75WP, Carbenvil 50SC), chất kích kháng: Salicylic acid, Bion 50WG, Oligochitosan, Aliette 800WG (Aliette 800WG là thuốc trừ bệnh nhưng cơ chế tác động của thuốc có khả năng kích kháng nên trong nội dung nghiên cứu của luận án đã sử dụng Aliette 800WP như chất kích kháng)

- Chế phẩm sinh học: Chế phẩm Ketomium và chế phẩm EMINA

- Dịch chiết thực vật: Dịch chiết lá cà độc được (Datura metel L.) và lá trầu không (Piper betle L.)

- Môi trường nuôi cấy: WA, PDA, OMA, v.v

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

+ Điều tra đồng ruộng, đánh giá thiệt hại của bệnh và các thí nghiệm phòng trừ ngoài đồng ruộng được thực hiện tại tỉnh Nghệ An

+ Các nghiên cứu liên quan đặc điểm sinh học, tính gây bệnh và mức độ đa dạng phân tử được thực hiện tại:

- Bộ môn bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Trung tâm Thực hành thí nghiệm và Trại thực nghiệm Nông học, Khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh

3.1.3 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tử năm 2012 đến năm 2015

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Đánh giá mức đô ̣ phổ biến và tác ha ̣i của bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An

- Xác đi ̣nh loài nấm gây bê ̣nh đốm đen và đánh giá mức độ đa dạng phân tử của các mẫu nấm thu thập được

- Nghiên cứu mô ̣t số đặc điểm sinh học của nấm gây bê ̣nh đốm đen ha ̣i la ̣c

- Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bê ̣nh đốm đen hại lạc do nấm

P personata gây ra

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp điều tra theo QCVN 01- 38: 2010/BNNPTNT

- Phương pháp đánh giá thiệt hại của bệnh đốm đen hại lạc đến sinh trưởng

và năng suất lạc được thực hiện theo Das and Roy (1995)

- Phương pháp phân lập đơn bào tử được thực hiện theo Urashima et al (1993)

- Các mẫu nấm thuần được chiết DNA tổng số theo phương pháp của Doyle and

Doyle (1987)

- Hai mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) đã được sử dụng để nhân toàn bộ

vùng ITS của các mẫu nấm

- Tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)

Mức độ đa dạng di truyền của nấm gây bệnh đốm đen lạc được đánh giá bằng

kỹ thuật Rep-PCR theo Versalovic et al (1991, 1994)

+ Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng và môi trường nuôi cấy

đến sinh trưởng và sinh bào tử của nấm P.personata được thực hiện theo Stenglein et

al (2006)

+ Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ bào tử và tuổi lá đến khả

năng gây bệnh của nấm P personata bằng phương pháp lá tách được thực hiện theo

- Phương pháp đánh giá khả năng phòng chống bệnh đốm đen hại lạc bằng chất

kích kháng được thực hiện theo Zhang et al (2001)

- Phương pháp đánh giá khả năng phòng chống bệnh bằng dịch chiết thực vật

được thực hiện theo Kishore et al (2001)

- Phương pháp đánh giá khả năng phòng chống bệnh bằng phẩm sinh học

được thực hiện theo Zhang et al (2001)

- Tính hiệu lực của thuốc, chát kích kháng, dịch chiết thực vật, chế phẩm sinh học theo công thức Abbott (1925)

- Số liệu phân tích đa dạng di truyền của nấm được xử lý bằng phần mềm MEGA

6.0 và NTSys 2.0 Hệ số tương đồng cho từng cặp mẫu được tính toán theo công thức:

S = (a+d)/(a+b+c+d) Trong đó S là hệ số tương đồng, a là số băng giống nhau của 2 mẫu, b là số băng chỉ xuất hiện ở mẫu thứ i, c là số băng chỉ xuất hiện ở mẫu thứ j, d

là số băng không xuất hiện ở cả 2 mẫu (nhưng xuất hiện ở các mẫu khác)

- Số liệu điều tra được xử lý trong Microsoft Office Excel Số liệu thí nghiệm được tính toán, xử lý thống kê theo phương pháp phân tích phương sai bằng chương trình IRRISTAT 4.0

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1 MỨC ĐỘ PHỔ BIẾN VÀ TÁC HẠI CỦA BỆNH ĐỐM ĐEN HẠI LẠC TẠI NGHỆ AN

4.1.1 Mức độ phổ biến của bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An

Bệnh đốm đen xuất hiện và gây hại phổ biến hàng năm trên các ruộng lạc tại Nghệ

An trong cả vụ thu và vụ xuân Trong vụ xuân và vụ thu từ năm 2012 đến năm 2014, từ vùng đồng bằng, đồng bằng ven biển đến vùng trung du và miền núi của tỉnh Nghệ An, Mức độ phổ biến của bệnh tại các điểm điều tra đều đạt mức tối đa là 100%, tất cả các

ruộng điều tra đều bị nấm gây bệnh đốm đen P personata gây hại

4.1.2 Diễn biến bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An

Qua quá trình điều tra trong 3 vụ liên tiếp (vụ xuân 2013, vụ thu 2013, vụ xuân 2014) cho thấy, sự xuất hiện của bệnh phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng của cây Bệnh bắt đầu xâm nhập khi cây bắt đàu ra hoa, đến khi cây bắt đầu đầm tia thì triệu chứng bệnh bắt đầu biều hiện Bệnh phát triển ổn định và bắt đầu tăng nhanh khi quả lạc vào chắc và tiếp tục gây hại đến khi quả chín Tuy nhiên, sự phát triển của bệnh phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết, đặc biệt là độ ẩm và lượng mưa Chính vì vậy, các huyện thuộc vùng đồng bằng ven biển như Diễn Châu, Nghi Lộc do lượng mưa nhiều và ảnh hưởng của gió biển nên bệnh phát triển mạnh và lây lan nhanh Ở Nam Đàn, lượng mưa hàng năm ít hơn nên bệnh có xu hướng gây hại nhẹ hơn Ở cả 3 huyện điều tra, điều kiện thời tiết mưa gió nhiều trong vụ thu thuận lợi cho bệnh phát triển nên mức độ gây hại của bệnh cao hơn và cây tàn lụi sớm hơn so với vụ xuân

4.1.3 Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến sinh trưởng và các yếu tố cấu thành năng suất của cây lạc

Mức độ thiệt hại của bệnh đến sinh trưởng và năng suất được đánh giá trong 2

vụ liên tiếp gồm vụ xuân vụ thu năm 2014 Kết quả cho thấy, bệnh đốm đen ảnh hưởng nghiêm trọng đên năng suất lạc, khi mức độ gây hại của bệnh càng cao thì năng suất càng giảm

Trong vụ xuân 2014, khi cây không bị bệnh (cấp 0) thì năng suất khi thu hoạch đạt 58,41 tạ/ha Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 1 thì năng suất giảm 5,02% so với cấp 0 Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 3 thì năng suất giảm 17,0% Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 5 thì năng suất giảm 30,24% Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 7 thì năng suất giảm 43,28% Thực tế điều tra cho thấy, cấp bệnh trung bình trên ruộng trong vụ lạc

xuân thường dao động từ cấp 3 đến cấp 5, do đó năng suất khi thu hoạch giảm tương ứng tử 17% đến 30,24%

Tương tự, trong vụ thu 2014, khi cây không bị bệnh (cấp 0) thì năng suất thu được

là 35,09 tạ/ha Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 1 năng suất giảm 7,24% Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 3 thì năng suất giảm 18,02% Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 5 thì năng suất giảm 34,23% Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 7 thì năng suất giảm 49,90% Khi mức

độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 9 thì năng suất giảm 64,38% Thực tế điều tra cho thấy, cấp bệnh trung bình trên ruộng trong vụ lạc thu thường dao động từ cấp 5 đến cấp 7, do đó năng suất khi thu hoạch giảm tương ứng tử 34,23% đến 49,90%

Các số liệu trên cung cấp thông tin ban đầu về thiệt hại năng suất do bệnh đốm đen gây ra trên cây lạc tại Việt Nam

4.2 XÁC ĐỊNH LOÀI NẤM GÂY BỆNH ĐỐM ĐEN VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ

ĐA DẠNG PHÂN TỬ CỦA CÁC MẪU NẤM THU THẬP ĐƯỢC

4.2.1 Xác định các mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc thu tại Nghệ An bằng giải trình tự vùng ITS

Trong nghiên cứu này, 8 mẫu nấm gây bệnh đốm đen lạc phân lập từ bốn vùng sinh thái của tỉnh Nghệ An (Đồng bằng ven biển, Đồng bằng, Trung du và miền núi) cũng như 3 mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc thu tại Lào Cai, Hà Tĩnh và Đồng Nai đã được giải trình tự trình tự trực tiếp vùng ITS từ sản phẩm PCR Sau khi lắp ráp và loại

bỏ các đoạn nhiễu ở 2 đầu, các mẫu nấm đều có kích thước đoạn đọc được từ 441 – 496

bp Trình tự các đoạn đọc được bao phủ vùng ITS1, 5.8S và ITS2 của chuỗi ITS, cho

phép xác định chính xác nấm gây bệnh đốm đen tới mức loài (Goodwin et al., 2001)

Đầu tiên, trình tự đọc được của 11 mẫu được sử dụng để tìm kiếm các chuỗi gần gũi trên GenBank Kết quả tìm kiếm (BLAST SERCH) cho thấy tất cả 11 mẫu

đều trùng khớp với 2 mẫu M berkeleyi duy nhất trên GenBank (mã GenBank

AB435066 và AY266147) Đáng chú ý, kết quả tìm kiếm cũng cho thấy hiện nay mới chỉ có 2 trình tự vùng ITS của nấm gây bệnh đốm đen hại lạc trên GenBank

Tiếp theo, trình tự vùng ITS của 11 mẫu nấm được so sánh với nhau và với 30

trình tự vùng ITS của các mẫu nấm Mycosphaerella đại diện sẵn có trên GenBank, kể cả

2 mẫu M berkeikeyi (AY266147 và AB435066) Các mẫu nấm trên Genbank này là các mẫu chuẩn đã được công bố (Goodwin et al., 2001) (Bảng 4.1)

Kết quả so sánh trình tự cho thấy trình tự vùng ITS của 11 mẫu nấm đều đồng nhất 100% với nhau chứng tỏ chúng đều là thành viên của cùng 1 loài

Khi so sánh trình tự của 11 mẫu nấm trong nghiên cứu này với trình tự của 30 mẫu nấm GenBank thấy chúng có mức đồng nhất rất cao, 99,7% và 100%, tương ứng

với 2 mẫu nấm M berkeleyi, AY266147 và AB435066, sẵn có trên GenBank Tất cả 11

mẫu nấm trong nghiên cứu này đều có mức đồng nhất trình tự thấp hơn nhiều, từ 69,2% đến 94,2% đối với 28 mẫu nấm GenBank còn lại (Bảng 4.1)

Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS cũng cho thấy 11 mẫu nấm trong

nghiên cứu và 2 mẫu nấm M berkeleyi sẵn có trên GenBank ở trên hình thành một

cụm loài rõ rệt, với giá trị thống kê boostrap 100% và tách biệt hẳn các nấm

5 Chưa xác định Mycosphaerella africana AF173314 93.3

6 Chưa xác định Mycosphaerella keniensis AF173300 93.3

10 Cercospora asparagi Chưa xác định AF297229 83.1

11 Cercospora beticola Chưa xác định AF297222 82.9

12 Cercospora kikuchii Chưa xác định AF291708 82.9

13 Cercospora sorghif Chưa xác định AF291707 82.9

14 Paracercospora fijiensis Mycosphaerella fijiensis AF181705 82.6

16 Asteromella brassicae Mycosphaerella brassicicola AF297227 82.5

17 Cercospora kalmiae Chưa xác định AF297226 82.2

18 Pseudocercospora musae Mycosphaerella musicola AF181706 82.1

19 Ramularia brunnea Mycosphaerella fragariae AF173312 81.0

20 Ramularia brunnea Mycosphaerella fragariae AF297235 79.9

21 Uwebraunia ellipsoidea Mycosphaerella ellipsoidea AF173302 78.4

22 Chưa xác định Mycosphaerella marksii AF173316 77.7

23 Paracercospora fijiensis Mycosphaerella fijiensis AF297234 77.4

25 Septoria tritici Mycosphaerella graminicola AF181694 74.8

26 Lecanosticta acicola Mycosphaerella dearnessii AF260818 74.5

27 Uwebraunia juvenis Mycosphaerella juvenis AF173299 74.4

28 Cladosporium iridis Mycosphaerella macrospora AF297231 70.0

29 Cladosporium allii-cepae Mycosphaerella allii-cepae AB026160 69.6

30 Cladosporium herbarum Mycosphaerella tassiana AJ238469 69.2

Hình 4.1 Phân tích phả hệ dựa trên trình tự toàn bộ vùng ITS của 11 mẫu nấm gây bệnh hại đốm đen lạc thu tại Việt Nam (đánh dấu bằng chấm đen) và các mẫu nấm

sẵn có trên GenBank

Cây được xây dựng bằng phương pháp NJ Thanh bar trình bày khoảng cách di truyền Giá trị ở các nốt là giá trị thống kê boostrap dưới dạng % (1000 lần lặp) và chỉ trình bày các giá trị >50% (Ngưỡng tin cậy nhìn chung là 75% có nghĩa trong

1000 lần lặp thì 750 lần các taxa phân nhóm với nhau)

Kết quả so sánh trình tự và phân tích phả hệ vùng ITS đã chứng tỏ tất cả 11 mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc thu thập tại Nghệ An, Hà Tĩnh, Lào Cai và Đồng Nai

là thành viên của loài M berkeleyi Nghiên cứu này cũng chứng minh trình tự vùng ITS rất bảo thủ trong loài M berkeleyi và do đó không thể sử dụng trong phân tích đa dạng nhưng lại là chỉ thị phân tử rất tốt để định danh nấm gây bệnh đốm đen hại lạc

M berkeleyi