Xây dựng quy trình chẩn đoán bệnh loạn dưỡng cơ duchenne trên người đựa trên phản ứng PCR

Mục tiêu: Sử dụng phương pháp multiplex PCR để xác định giới tính trước chẩn đoán đột biến DMD và đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến mất đoạn gen DMD.. Đối tượn

ĐOÀN THANH NIÊN CỘNG SẢN Hồ CHÍ MINH

BAN CHẤP HÀNH TP Hồ CHÍ MINH

CÔNG TRÌNH Dự THI GIẢI THƯỞNG SINH VÉN NGHIÊN cứu KHOA HỌC - EURÉKA

LẦN THỨ 11 NĂM 2009

TÊN CÔNG TRÌNH:

XÂY DựNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH LOẠN DƯỠNG

Cơ DUCHENNE TRÊN NGƯỜI DựA TRÊN PHẢN ỨNG PCR

LĨNH Vực NGHIÊN CỨU: Tự NHIÊN

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TÁC GIẢ: Phạm Ngọc Khôi

BCH TP HỒ CHÍ MINH

BAN TỔ CHỨC GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NCKH - EURÉKA LẦN 11 NĂM 2009

XÂY DựNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH LOAN DƯỠNG Cơ DUCHENNE TRÊN NGƯỜI

DƯA TRÊN PHẢN ỨNG PCR

Tháng 9 - 2009

MỤC LỤC

Trang

Tóm tắt 1

l Đặt vấn đề 3

II Mục tiêu và phương pháp 4

II 1 Mục tiêu công trình nghiên cứu 4

II

2 Phương pháp nghiên cứu 4

n.2.1 Xác định giới tính bằng multiplex pCR 4

n.2.1.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu 4

n.2.1.2 Phương pháp tách chiết DNA 4

n.2.1.3 Phương pháp multiplex PCR 5

n.2.1.4 Đảm bảo chất lượng phản ứng 6

n.2.1.5 Phương pháp điện di trên gel agarose 7

n.2.2 Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLP A 7

n.2.2.1 Bảo quản mẫu 7

n.2.2.2 Phương pháp MLP A 7

n.2.2.3 Đảm bảo chất lượng phản ứng 9

n.2.2.4 Điện di MLP A bằng hệ thống điện di mao quản CEQ™ 8000 9

n.2.2.5 Phương pháp phân tích kết quả 10

n.2.3 Đe xuất lưu đồ tầm soát trước sinh 10

III Giải quyết vấn đề 10

m l Kết quả công trình 10

m.1.1 Xác định giới tính bằng multiplex PCR 10

in.1.3 Đồ xuất lưu đồ tầm soát trước sinh 24

m.2 Thảo luận 24

in.2.1 Xác định giới tính bằng multiplex PCR 24

in.2.2 Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLP A 25

in.2.3 Đề xuất lưu đồ tầm soát trước sinh 28

IV Kết luận và đề nghị 30

5.1 Kết luận 30

5.2 Đe nghị 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC 35

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1 Nguyên lý hoạt động của hệ thống điện di mao quản CEQ™ 8000 9

Hình 2 Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát gen SRY trên 10 mẫu máu 11

Hình 3 Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát gen SRY trên 10 mẫu ối 13

Hình 4 Kết quả đột biến mất exon bằng ba bộ multiplex A, B và c 16

Hình 5 Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P034 - A2 (1) 20

Hình 6 Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P034 - A2 (2) 20

Hình 7 Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P035 - A2 (1) 21

Hình 8 Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P035 - A2 (2) 21

Hình 9 Kết quả phân tích mẫu chứng nam bằng Probemix P034 - A2 22

Hình 10 Kết quả phân tích mẫu chứng nam bằng Probemix P035 - A2 22

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐÒ VÀ Lưu ĐỒ BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1 Vùng mất đoạn các exon của gen DMD 24

LƯU ĐỒ Trang Lưu đồ 4.1 Lưu đồ tư vấn và tầm soát trước sinh bệnh DMD 29

Trang

Bảng 1 Thành phần của phản ứng multiplex PCR xác định giới tính 6

Bảng 2 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng multiplex PCR 6

Bảng 3 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng MLP A 8

Bảng 4 Danh sách bệnh nhân làm bộ NST đồ karyotype 11

Bảng 5 Kết quả khảo sát gen SRY của bệnh nhân làm karyotype 12

Bảng 6 Danh sách thai nhi làm kỹ thuật FISH 13

Bảng 7 Kết quả khảo sát gen SRY của thai nhi làm kỹ thuật FISH 14

Bảng 8 Danh sách gia đình mắc DMD cùng với đột biến đã chẩn đoán 15

Bảng 9 Kích thước của 25 exon được khuếch đại trong 3 bộmultiplex PCR 15

Bảng 10 Danh sách 18 bệnh nhân DMD cùng với đột biến đã chẩn đoán 16

Bảng 11 Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P034 - A2 17

Bảng 12 Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P035 - A2 18

Bảng 13 Danh sách bệnh nhân DMD bị đột biến mất exon (MLPA) 23

Bảng 14 Tần suất mất đoạn các vùng exon của gen DMD 23

1

TÓM TẮT

Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là một trong những bệnh thần kinh - cơ di truyền phổ biến nhất với tỷ lệ mới mắc là 1/3500 trẻ trai đẻ sống Bệnh

DMD có bản chất là do đột biến gen dystrophin trên nhiễm sắc thể giới tính X Hơn 65% trường

hợp là đột biến mất hoặc lặp đoạn gen Kỹ thuật MLPA gần đây được cho là chẩn đoán mất đoạn gen rất hiệu quả

Mục tiêu: Sử dụng phương pháp multiplex PCR để xác định giới tính trước chẩn đoán đột biến DMD và đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến mất đoạn gen DMD

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Hai mươi mẫu DNA của bệnh nhân được dừng

để xác định giới tính và hai mươi mẫu DNA của bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng là bệnh DMD/BMD và đã được phát hiện đột biến mất đoạn gen bằng multiplex PCR Bảy mươi chín exon của gen được khảo sát bằng kit SALSA® MLPA® P034 - A2 và P035 - A2, điện di mao quản bằng CEQ™ 8000 và phân tích tự động bằng phần mềm Gene Marker

Kết quả: Đã hoàn thiện kỹ thuật multiplex PCR để xác định giới tính và phương pháp MLPA cho phép xác định chính xác kích thước của đoạn DNA bị đột biến, kỹ thuật phân tích

dễ dàng, trực quan, nhanh và có độ lặp lại cao Tất cả exon của gen DMD bị mất đều được khẳng định trên biểu đồ kết quả Bộ ba multiplex PCR chẩn đoán trước đó chỉ khảo sát được hai mươi lăm exon và có những exon không được phát hiện so với MLPA

Kết luận: Kỹ thuật multiplex PCR dùng để xác định giới tính chính xác, đặc hiệu; và phương pháp MLPA giúp phát hiện nhanh chóng, toàn diện các đột biến mất đoạn gen DMD và

ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex PCR

Hiệu quả kinh tế và áp dụng thực tiễn: Hoàn thiện quy trình xác định giới tính trên người bằng kỹ thuật di truyền phân tử và nhận thấy với kỹ thuật này hiệu quả kinh tế đem lại là rất lớn

so với các kỹ thuật khác hiện đang được áp dụng tại các Phòng Di truyền như nhiễm sắc thể đồ karyotype, FISH, và hiện tại quy trình này đã được triển khai nhằm khảo sát gen SRY trên NST

Y ở các bệnh nhân rối loạn giới tính Bên canh đó, với kỹ thuật MLPA khảo sát 79 exon trên gen DMD đã bước đầu thành công trong

chẩn đoán phân tử và hiện tại đang chuẩn lại quy trình chẩn đoán để sớm được triển khai nhằm ứng dụng kỹ thuật MLPA vào chẩn đoán trước sinh các trường hợp mất đoạn gen cho thai nhi

sẽ dễ dàng hơn và giúp cho việc phòng bệnh chủ động bằng tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh, cũng là bước chuẩn bị cho việc điều trị bằng liệu pháp gen trong tương lai và giảm được gánh nặng cho xã hội, nâng cao chất lượng dân số

3

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là một bệnh di

truyền lặn liên kết với giới tính Bệnh gây nên bởi sự đột biến gen dystrophin, gen này nằm ở vị

trí Xp21 trên NST X, và đến bây giờ chúng được biết như là một gen lớn nhất trong cơ thể người với chiều dài hơn 2400 kb, mã hóa bản phiên mã mRNA dài 14 kb, bao gồm 79 exon và 99,4% cấu trúc gen là intron Protein mã hóa bởi gen này là dystrophin với khối lượng phân tử là 427 kDa, có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định của màng cơ Bệnh DMD là bệnh cơ rất nặng, hầu hết những trẻ trai mắc bệnh đều có triệu chứng suy yếu cơ tiến triển, cuối cùng dẫn đến tàn phế, mất khả năng đi lại ở lứa tuổi 12 và tử vong ở lứa tuổi 20 - 25 do tổn thương cơ tim

và rối loạn hô hấp

Bệnh DMD chiếm tỷ lệ cao nhất trong số nhóm bệnh di truyền về thần kinh cơ (1/3500 trẻ trai) và gây hậu quả nặng nề cho gia đình người bệnh cùng cộng đồng xã hội Cho đến nay

bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định hoàn tất với hai vùng đột biến mất

đoạn trọng điểm (hotspot region) là vùng 5’ tận cùng (vùng exon 3 - 19) và vùng trung tâm (vùng exon 45 - 52) chiếm trên 60% tỷ lệ đột biến, đột biến điểm đứng thứ 2 chiếm 25 - 30%, còn lại là đột biến lặp đoạn chiếm tỷ lệ khoảng 10-15%

Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu ở mức độ phân tử Tuy nhiên, do khó khăn trong việc tách chiết RNA tổng số từ máu tươi, những nghiên cứu này mới chỉ xác định đột biến ở mức DNA Do chỉ mới sử dụng 19 cặp mồi để khuếch đại 19 exon hay xảy ra đột biến mất đoạn nên kết quả chỉ phát hiện được gần 40% số bệnh nhân có đột biến mất đoạn so với tỷ lệ thường gặp là 60% Điều này chứng tỏ rằng khoảng 20% đột biến nằm ở ngoài vùng 19 exon hay xảy

ra đột biến mất đoạn trên bệnh nhân DMD được nghiên cứu ở Việt Nam

Trong khi đó nếu chẩn đoán bệnh DMD bằng kỹ thuật MLPA (Multiplex

ligation-dependent probe amplification) thì có thể khuếch đại được toàn bộ chiều dài gen dystrophin

Xác định đột biến bằng kỹ thuật MLPA có thể xác định được toàn bộ đột biến mất đoạn và lặp

đoạn trên gen dystrophin ở bệnh nhân DMD Bên cạnh đó, vì bệnh DMD hầu hết chỉ xảy ra ở

các trẻ trai vì thế nếu xây dựng được quy trình xác định giới tính thì ta có thể sàng lọc được bệnh

ở giai đoạn đầu mà không cần đến việc phải chẩn đoán đột biến về sau

Việt Nam hiện có tần suất bệnh khá cao, chi phí điều trị lại quá lớn trong khi nước ta nguồn lực lại có hạn vì thế không thể nào kham nổi chi phí này Do đó, chẩn đoán trước sinh là biện pháp hiệu quả làm giảm gánh nặng bệnh tật lên xã hội Vì thế việc thành lập một chương trình phòng chống bệnh DMD với những kỹ thuật di truyền thích hợp tại Việt Nam là hết sức cần thiết Công trình nghiên cứu này nằm trong chương trình phòng chống bệnh DMD như vừa

kể trên và được mang tên là ‘Thiết lập kỹ thuật chẩn đoán bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne dựa trên phản ứng PCR”

11.1 Mục tiêu công trình nghiên cứu

Xây dựng protocol cho phản ứng multiplex PCR xác định giới tính thai nhi

Sử dụng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán các loại đột biến gen dystrophin gây nên bệnh

DMD, và so sánh kết quả chẩn đoán bằng MLPA với kết quả chẩn đoán trước đó của Bệnh viện Nhi Trung ương dùng kỹ thuật multiplex PCR với 25 cặp mồi đặc hiệu Thiết lập quy trình chẩn đoán bệnh DMD trước sinh

11.2 Phương pháp nghiên cứu

11.2.1 Xác định giới tính bằng multiplex PCR

11.2.1.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu

Đối với mẫu máu: dùng ống tiêm 3ml với kim 20G lấy khoảng 3ml máu tĩnh mạch ở mặt trước cánh tay bệnh nhân trưởng thành Mầu máu ngoại vi này được cho vào ống đựng mẫu máu

có sẵn chất chống đông EDTA, sau đó mẫu được trộn nhẹ, để lắng và bảo quản ở 4°c đến khi

11.2.1.2 Phương pháp tách chiết DNA

Nguyên tắc: Mau được ly trích DNA bằng bộ ly trích DNA “High Pure PCR Template Preparation Kit” của Roche sản xuất Te bào bị phá vỡ, ly giải bằng Binding Buffer và Proteinase

K Dịch ly giải được lọc qua cột lọc với nồng độ muối cao Màng gel silica trong cột lọc giữ DNA lại và cho các chất khác trôi qua DNA tinh sạch được hòa tan vào dung dịch đệm có nồng

độ muối thấp Tách chiết DNA bằng cách sử dụng màng gel silica có ưu điểm là đơn giản và nhanh chóng mà không cần dùng

5 phenol/chloroform Cách tiến hành tách chiết DNA được đính kèm vào phần phụ lục n.2.1.3

ho á tuyến sinh dục của phôi thành tinh hoàn mà không phải buồng trứng Sau đó, tinh hoàn sản xuất các hormone sinh dục đực chịu trách nhiệm cho sự thể hiện các đặc tính thứ cấp của nam giới

ATSEA (để tăng lượng một đoạn DNA kích thước 317 bp trên NST số 16 có ở cả người nam và người nữ) được sử dụng như là một chứng nội tại cho phản ứng multiplex PCR này Phương pháp multiplex PCR thiết lập cùng lúc hai phản ứng PCR đối với một mẫu DNA, một phản ứng PCR với mồi SRY và một phản ứng PCR với mồi ATSEA Sau phản ứng khuếch đại, nếu sản phẩm xuất hiện ở cả băng SRY (93 bp) và ATSEA (317 bp) thì mẫu DNA này được xác định là nam giới, trong khi đó nếu sản phẩm chỉ xuất hiện ở băng ATSEA (317 bp) thì được xác định là nữ giới

Thành phần của phản ứng multiplex PCR dừng để xác định giới tính được trình bày trong bảng 1

Bảng 1 Thành phần của phản ứng multiplex PCR xác định giới tính

Bảng 2 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng multiplex PCR

II.2.1.4 Đảm bảo chất lượng phản ứng

Định lượng và đánh giá độ tinh sạch của DNA ở bước sóng 260/280 nm trước khi thiết lập PCR Mix

II.2.1.5 Phương pháp điện di trên gel agarose

Nguyên tắc: Điện di trên gel agarose dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường Sự phát hiện được quan sát dưới đèn uv nhờ

sự phát màu của ethidium bromide gắn xen trong DNA (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003) Cách tiến hành điện di trên gel agarose được đính kèm vào phần phụ lục

II.2.2 Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA

11.2.2.1 Bảo quản mẫu DNA

Mau DNA của bệnh nhân nghi là mắc bệnh DMD được chẩn đoán trước đó bằng bộ ba multiplex PCR A, B và c của Bệnh viện Nhi Trung ương và Đại học Y Hà Nội được bảo quản

ở điều kiện 4°c.

11.2.2.2 Phương pháp MLPA

Nguyên tắc: MLPA chỉ sử dụng duy nhất một cặp PCR primer cho quá trình khuếch đại với khả năng khuếch đại cùng lúc đến 45 vị trí DNA đích khác nhau trong cùng một phản ứng Mỗi probe MLPA gồm hai đoạn oligonucleotide lai với trình tự DNA đích tại vị trí liền kề với nhau, dài 22 - 43 nucleotide với một PCR primer xuôi và ngược giống nhau ở tất cả các probe

Đe phân biệt các sản phẩm khuếch đại, các probe còn chứa một đoạn DNA gắn chèn không tham gia vào quá trình lai có kích thước thay đổi từ 19 nt đến 364 nt Sau khi lai qua đêm với trình tự DNA đích, hai đoạn oligonucleotide của mỗi probe sẽ nối ghép (ligation) với nhau Sản phẩm nối có cả primer xuôi và ngược, và được khuếch đại bằng phương pháp PCR số lượng tương đối của mỗi sản phẩm PCR sẽ tỉ lệ với số bản sao của trình tự đích trong các mẫu khảo sát

Kích thước khác nhau của các sản phẩm sẽ được nhận biết bằng hệ thống giải trình mao quản tự động và đỉnh của mỗi sản phẩm sẽ được định lượng Các đoạn dò

nếu không được ghép nối với nhau thì chỉ mang một primer vì thế sẽ không được khuếch đại sản phẩm PCR

Bộ kit SALSA® MLPA® do MRC - Holland, Amsterdam, Hà Lan sản xuất có chứa 80 đoạn dò cho 79 exon đích và exon DP427c Trong đó 80 đoạn dò được chia đều vào hai hỗn hợp Probemix P034 - A2 và P035 - A2 Ngoài ra, mỗi kit còn chứa thêm 5 đoạn dò kiểm chứng Cách tiến hành phương pháp MLPA được đính kèm vào phụ lục 9

Chu trình luân nhiệt (Máy Bio - Rad iCycler) dùng cho phản ứng MLPA được trình bày trong bảng 3

Bảng 3 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng MLPA Bước Nhiệt độ Thời gian số chu kỳ

Nguyên tắc: Quá trình điện di diễn ra trong 1 mao quản có đưởng kính rất nhỏ khoảng

75 pm Khi có điện thế, trong mao quản sẽ xuất hiện điện trường, lúc này dung dịch đệm sẽ chạy liên tục trong mao quản từ cực (+) sang cực (-) và các phân tử tích điện chẳng hạn như nucleic acid sẽ di chuyển dưới ảnh hưởng của điện trường Các phân tử nucleic acid tích điện âm nên sẽ

di chuyển về cực (+) trong điện trường Các mẫu được phân tách nhờ sự khác nhau về khối lượng và điện tích Sợi có kích thước ngắn sẽ di chuyển nhanh hơn sợi cố kích thước dài Hệ thống điện dỉ mao quản sử dụng huỳnh quang để phát hiện các sợi DNA có kích thước dài ngắn khác nhau (hình 1) Cách tiến hành điện di phân tách đoạn MLPA bằng hệ thống điện di mao quản CEQ™ 8000 được đính kèm vào phần phụ lục

Hình 1 Nguyên lý hoạt động của hệ thống điện di mao quản CEQ™ 8000 (Nguồn: Thái Hạnh Quyên, 2009)

ưu điểm của phương pháp điện di mao quản so với điện di thường trên gel là: lượng mẫu phân tách nhỏ; độ chính xác cao; khả năng lập lại lớn; thời gian điện di và phân tích dữ liệu nhanh; hệ thống hoạt động tự động hoàn toàn từ bước bơm gel đến phân tích kết quả

IL2.2.5 Phương pháp phân tích kết quả

Kích thước của mỗi peak được xác định nhờ so sánh với thang kích thước và so sánh với mẫu chứng Sau điện di, kết quả được xuất dưới dạng file esd, rồi được phân tích tự động tìm đột biến bằng phần mem Gene Marker AFLP/Genotyping version

l 85 của SoftGenetics® LLC (Software Power Tools for Genetic Analysis)

Ket quả phân tích được biểu thị dưới dạng biểu đồ sóng (electropherogram) và dưới dạng bảng Các vị trí gen bị mất đoạn ở cá thể nam (một nhiễm sắc thể X) sẽ không có đỉnh tín hiệu xuất hiện

II.2.3 Đề xuất lưu đầ tầm soát trước sinh

Xây dựng quy trình chẩn đoán bệnh DMD trước sinh bằng cách đề xuất lưu đồ tư vấn và tầm soát dựa vào các kết quả của nội dung xác định giới tính bằng multiplex PCR và nội dung chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA in Giải quyết vấn đề

Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel (hình 2) gồm:

CNAM : Chứng nam MK: Marker 100 bp (Promega)

11 Bảng 4 Danh sách bệnh nhân làm bộ NST đồ karyotype

Bảng 5 Kết quả khảo sát gen SRY của bệnh nhân có bộ NST đồ karyotype

Ký hiệu Kiếu hình Gen SRY (Băng 93 bp) Kết luận

-Ket quả khảo sát gen SRY phù hợp với kiểu giới tính của 10 bệnh nhân trên Bên cạnh

đó, kết quả này được kiểm chứng qua phân tích karyotype cũng trên 10 bệnh nhân này Kết quả đối chiếu hoàn toàn phù hợp với kết quả khảo sát gen SRY trên NST Y Hai trong 10 kết quả karyotype được đính kèm vào phần phụ lục

Trường hợp 2: 10 mẫu nước ối của 10 thai nhi đã tiến hành kỹ thuật FISH với các ký hiệu được trình bày trong bảng 6

Để đảm bảo chất lượng cho phản ứng multiplex PCR, chứng tôi vẫn thực hiện kèm theo một chứng nam, một chứng nữ và một chứng không chứa DNA (chứng Nil)

Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel (hình 3) gồm:

CNAM : Chứng nam MK: Marker 100 bp (Promega)

Bảng 7 Kết quả khảo sát gen SRY của thai nhi làm kỹ thuật FISH

III.1.2 Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA

Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng phương pháp MLPA với hai đối tượng khác nhau:

Trường hợp 1: hai mẫu DNA của một gia đình có người mắc bệnh DMD là chị Nguyễn Thị Tuyết s (29B) và con trai chị mắc bệnh DMD là cháu Nguyễn Viết H (29C) đã được Đại học Y Hà Nội kết hợp chẩn đoán trước đó với Phòng Di truyền - Bệnh viện Từ Dũ TP.HCM bằng bộ 3 multiplex PCR vào năm 2007 với kết quả được trình bày trong bảng 7

15 Bảng 8 Danh sách gia đình mắc bệnh DMD cùng với đột biến đã được chẩn đoán

29C

c là nồng độ nucleỉc acid trong mâu sau khỉ ly trích; Ả260/280 là tỉ số OD260nm/OD280nm nhằm kiểm tra độ sạch của dung dịch sau ly trích Một dung dịch nucleỉc acid được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ so Ả260/280 nằm trong khoảng 1,8 —2 (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003) (Nguồn: Nguyễn Thị Trang và cộng sự, 2007)

Trường hợp 2: mười tám mẫu DNA của mười tám bệnh nhân nghi là mắc bệnh DMD đã được chẩn đoán trước đó bằng kỹ thuật multiplex PCR dựa trên 25 exon khác nhau do Khoa Di truyền và Sinh học phân tử - Bệnh viện Nhi Trung ương gửi đến Phòng Di truyền - Bệnh viện

Từ Dũ TP.HCM vào năm 2008 với kết quả được trình bày trong hình 5, bảng 8 và bảng 9

Bảng 9 Kích thước (bp) của 25 exon được khuếch đại trong ba bộ multiplex PCR

Exon Kích thước Exon Kích thước Exon Kích thước

thang 100 bp wt (wild type): Chửng bình thường; m: Chứng nam đột biến; 29: Mẩu 8029 bị mất cảc exon 3, 4, 6, 8, 12, 13; 30: Mẩu 8030 bị mất các exon 47, 48, 49, 50, 51, 52; 31: Mẩu

8031 bị mất các exon 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17, 19, 32, 34 (Nguồn: Ngô Diễm Ngọc và cộng sự, 2008)

Bảng 10 Danh sách 18 bệnh nhân DMD cùng với đột biến đã được chẩn đoán

17 Bảng 10 (tt) Danh sách 18 bệnh nhân DMD cùng với đột biến đã được chẩn đoán

6 6058 Mất exon 48, 49, 50 Mất exon 48, 49, 50

9 7009 Mất exon 41,42, 43 Mất exon 41,42, 43

10 7025 Mất exon 3, 4, 6 Mất exon 3, 4, 5, 6, 7

11 7047 Mất exon 3, 4, 6, 8 Mất exon 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10

15 8026 Mất exon 3, 4, 6 Mất exon 3, 4, 5, 6, 7

Bảng 11 (tt) Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P034 - A2

Bảng 12 Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P035 - A2

19 Bảng 12 (tt) Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P035 - A2

Với phương pháp MLPA, đã xác định được 12 bệnh nhân trên tổng số 20 mẫu bệnh phẩm phân tích (chiếm 60%) có đột biến mất đoạn trên 79 exon của gen DMD Các băng đặc hiệu cho exon khảo sát đều rõ; số lượng exon bị đột biến mất đoạn cũng rất thay đổi, ít nhất là 3 exon

và nhiều nhất 32 exon Kết quả phát hiện đột biến mất đoạn gen được trình bày trong hình 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9; bảng 12 và phần phụ lục

I WSijO

Hình 5 Kết quả phân tích trên phần mềm Gene Marker của mẫu 8029 bằng Probemỉx

P034 - A2 Bệnh nhân bị mất đoạn từ exon 2 đến exon 10

im Ĩ-A iMrtit i fcfthfeifM

SStaJSS S” "1

U M : Uìíis lii J ưĩlT

DSC tr.i;»

21

Hình 7 Kết quả phân tích trên phần mềm Gene Marker của mẫu 8029 bằng Probemỉx

P035 - A2 Bệnh nhân bị mất đoạn từ exon 11 đến exon 13

Mtnik'«lilY-.in HHi-ll tufelltoic*u4

'Jb Mijori aãrã aES

pi STĨ i (W '*j Ml“«?! VJI STB

Hình 8 Kết quả của Probemix P035 - A2, mẫu 8029 (mất từ exon 11 đến exon 13)

H L FJ fcHdrril MpHt «*» *4-4-4

Mhppr ’•* y* ¿MueiJhiiw m - ps

r 4-.i :•*>*** t>r.*Âĩ'jji tmmmrlụr* »ÌC»:fW.J4aHM T-tin

M-nl n Iii.j.1111,-; F TỊI lỊỊi rmrẩảoai

Fa*ut l*HL CM&S&&-1MỈ& fm* 1 ‘

»-.«r* "ĩ iiãjL,'jTMi m nnanjUÿi fbufhte Ç»«iKf<jg îrij miW Ị*jẹmMwmỴ,

ĨMÉ: 5«fcÌÉĩJHfcắ3MBi fafcHl »•m* y* ! ra _

■iỊB«rtWi 'JfcAA^CO^ Î'ÎMÎÎirBPiÇSd

KM4A*' dure un mai

13 Htte-nM 5W 3 f>M 1

H !t» 4519 Jtaa 1*300

n lEW'V-fl «¡*4 5 1 crifi

11 1'*4í *EÏ1 liai 1 ¿Lflî (7 itwïjfcriü lüi nsi

ã ?M' ¿ 4Ï 3ĨỈ1 lia 1

-I IH 51, ÍM fl 1 ÍỈA 3N t EU5 -k,£ Tf a— rflï

¿a pÉiSEfï *rs“ i lïffl

y ỊV», *>** TM s ^ 5« UUM.' -TiJ:' ÍM 1 |l (TV

ET Itwjpti JH a l'Xfl

*' ;|*í' ».Tộ 33"î nsa

- 1

ton 9 1 Ï7 1 -lûfi 1 ỦÚ8

ïï üu nsi 1 Otq

_ 1

Hình 9 Kết quả của Probemix P034 - A2, Chứng nam

H fié CiMK-.t-.iPrr«il 'rfiUUwl IM :«o

Æl—mH -'rVM Om VI Ti JkdK-Ûii ! ,jr U/>A

rmrt rt.B.iJ ITr-;*JO K*I 1 nn'J1)jJiN riÉMii^Litri -r llli>i|yinbf,

23 Bảng 13 Danh sách bệnh nhân DMD bị đột biến mất exon (MLPA)

PCR)

Đột biến mất exon (MLPA)

Số exon bị mất (MLPA)

Bảng 14 Tần suất mất đoạn các vùng exon của gen DMD

1 Exon 3 - 1 9 (Vừng hotspot đầu tận cùng 5 ’) 7 (58,3)

3 Exon 45 -52 (Vùng hotspot trung tâm) 4 (33,4)

í-i* « 44 4 Í Í Ỉ ỈPC ?0ÍI> «0<K> ÍẶ?Ỉ 710# 78Í5 7(47 SM4 stỉt *0ỈS «s* »MI

Biểu đồ 1 Vũng mất đoạn các exon của gen DMD

HI 1.3 Đề xuất lưu đồ tầm soát trưức sinh

Lưu đồ tư vấn và tầm soát trước sinh bệnh DMD được xây dựng dựã vào các kết quả của nội dung xác định giỗi tính bằng multỉplex PCR và nội dung chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA Đề xuất được trình bày bằng lưu đồ 1 m.2 Thảo luân

m

ra.2.1 Xác định giới tính bằng multiplex PCR

Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy:

Mau nam và mẫu nữ ở phản ứng muỉtỉplex PCR đều xuất hiện băng đặc hiệu cho chứng nội tại ATSEA (317 bp) và ở mẫu nam xuất hiện thêm băng đặc hiệu cho gen SRY (93 bp), chứng tỏ phản ứng multiplex PCR xác định giới tính được thiết lập hoàn toàn đặc hiệu

Chứng không cố DNA (chúng Nil) không cho tín hiệu, chứng tỏ phản úng không bị ngoại nhiễm, điều này cho thấy các chần đoán của chúng tôi về giới tính là chính xác và không xảy

ra trường hợp dương tính giả Mau chửng nam và chứng nữ cho sản phẩm đúng kích thước, không xuất hiện băng phụ chứng tỏ phản ứng đặc hiệu và không xảy ra trường hợp âm tính gỉả