Nghiên cứu sản xuất và đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm enzyme cellulase, amylase đến khả năng sinh trưởng và năng suất thịt của gà lương phượng

Đe thu nhận hoạt độ amylase và cellulase của vi nấm Trichoderma cao, ổn định cũng như khảo sát mức độ hoạt động của enzyme trong hệ tiêu hóa vật nuôi nên tiến hành “Nghiên cứu sản xuất

TÓM TẮT

Đe nâng cao khả năng sinh trưởng và sức sản xuất thịt của gia cầm nên tiến hành

“Nghiên cứu sản xuất và đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm enzyme amylase, cellulase đến khả năng sinh trưởng và năng suất thịt của gà Lương Phượng”

Nghiên cứu này được bắt đầu bằng nuôi cấy các chủng vi nấm Trichoderma trên môi trường cảm ứng và tuyển chọn các chủng Trichoderma có khả năng sinh amylase, cellulase

Sau đó, khảo sát các chủng này trên môi trường bán rắn chứa cơ chất Cơ chất được sử dụng

là bã khoai mì vì bã khoai mì là phế phẩm công nghiệp rất dồi dào và rẻ tiền Trong thành phần chính bã khoai mì đang khảo sát, tinh bột và cellulose chiếm tỷ lệ lần lượt 32,33 % và

6,96 % nên thích hợp làm cơ chất nuôi cấy nấm Trichoderma để thu nhận amylase và

cellulase

Chế phẩm enzyme - Eplus được tạo ra theo quy trình sản xuất thử nghiệm trong điều

kiện nuôi cấy nấm Trỉchoderma tối ưu là 36 giờ trên môi trường bán rắn chứa bã khoai mì

80 %, độ ẩm 60 % Trong chế phẩm chứa 12,11 % tinh bột; 2,01 % cellulose; hàm lượng đường khử 12,79 (mg/ml); hoạt độ enzyme amylase 407,8 (UI/g); cellulase 649,37 Ul/g; đạm formol 12,22 (g/1)

Khi trộn chế phẩm enzyme - Eplus vào thức ăn tổng hợp và nuôi thử nghiệm trên gà Lương Phượng, cho thấy: tỷ lệ nuôi sống tích lũy 99 - 100 %; tiêu tốn 2,2 - 2,5 kg thức ăn hỗn hợp cho 1 kg tăng trọng; trọng lượng trung bình gà trống và mái mười tuần tuổi đạt 1,92 - 2,2

kg và 1,61 - 1,7 kg; năng suất thịt đạt 76 - 79 % Bổ sung 10 - 15 % chế phẩm enzyme Eplus vào thức ăn tổng hợp là thích hợp cho nuôi gà Lương Phượng từ ba tuần tuổi trở lên

Ngoài ra, sử dụng chế phẩm enzyme Eplus hạn chế phân ướt, giảm ô nhiễm môi trường, giảm được chi phí thuốc trị bệnh cho gà, giảm được chi phí chăn nuôi

đã bị thải ra ngoài, không tận dụng hết nguồn dinh dưỡng trong thức ăn, hao tốn thức ăn và tăng chi phí chăn nuôi, hiệu quả kinh tế giảm

Vấn đề trên được giải quyết bằng phương pháp bổ sung các hệ enzyme thủy phân vào thức

ăn vật nuôi Mà một trong những hệ enzyme thủy phân đáng chú ý có nguồn gốc từ vi nấm

Trỉchoderma bởi vi nấm này có khả năng tổng hợp enzyme ngoại bào như cellulase, amylase,

pectinase, chitinase, xylanase, endo-6 -glucanase và exo-6 - glucanase, protease, lipase, phytase Trong đó, enzyme amylase và cellulase có thể thu nhận khi tận dụng bã khoai mì để nuôi vi nấm

Trichoderma do bã khoai mì chứa 32,33 % tinh bột và 6,96 % cellulose Ngoài ra, tận dụng tốt

nguồn cơ chất bã khoai mì còn góp phần giảm bớt ô nhiễm môi trường do mùi hôi thối và nấm mốc độc hại phát triển trên bã khoai mì không sử dụng

Đe thu nhận hoạt độ amylase và cellulase của vi nấm Trichoderma cao, ổn định cũng như

khảo sát mức độ hoạt động của enzyme trong hệ tiêu hóa vật nuôi nên tiến hành “Nghiên cứu sản xuất và đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm enzyme amylase, cellulase đến khả năng sinh trưởng và năng suất thịt của gà Lương Phượng”

Cellulase là một phức hệ hydrolase gồm từ cellulase Cj đến cellulase Cx và P- glucosidase Chúng phân hủy lần lượt cellulose để cuối cùng tạo ra sản phẩm đường glucose Hiện nay, cellulase từ vi sinh vật được sản xuất với quy mô công nghiệp và được ứng dụng vào nhiều trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học, chăn nuôi động vật ăn cỏ, sản xuất dược liệu (Nguyễn Đức Lượng,

2006) Và amylase là các enzyme đường hoá, có khả năng phân hủy amylose và amylopectin, glycogen và các polysaccharide tương tự giải phóng glucose Amylase có khả năng phân hủy phế thải chứa các nguồn tinh bột từ các làng nghề làm bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông sản ngô khoai, sắn Và amylase thường được bổ sung trong các hợp chất hóa học nhằm cải tạo

ao hồ, kích thích tăng trưởng và phát triển mạnh của động vật thủy sản ở các giai đoạn mong muốn Trong sản xuất chất tẩy rửa, amylase phân giải các vết bẩn cacbohydrat trong vải và quần

áo Trong công nghiệp thực phẩm, enzyme amylase được dùng trong công đoạn hồ hóa và thủy phân tinh bột (Bùi Ái Công, 2005)

Đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu về enzyme Trỉchoderma trong đó có Christian p Kubicek và ctv (1988), nhận thấy dòng nấm Trỉchoderma reeseỉ QM - 9414 có hiệu quả tốt nhất

trong việc biến cellulose thảnh đường Đen năm 2000, Gary E Harman đã nghiên cứu cơ chế tạo các enzyme phân huỷ lớp cellulose hay chitin như cellulase, chitinase, p - 1,3 glucanase của

Trichoderma Trong nước cũng có nghiên cứu của Trần Thạnh Phong và ctv (2007), đã tận dụng

bã mía kết hợp với cám mì như nguồn carbon nuôi cấy Trỉchoderma reesei VTT - D - 80133 thu

nhận cellulase Và năm 2003, Lê Thị Uyên Thảo và ctv đã tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy

Trichoderma harzianum (Việt Nam) trên môi trường bán rắn chứa bã khoai mì Kết quả hệ

enzyme thu nhận có hoạt độ cellulase 3.243,5 Ul/g, pectinase 106,1 Ul/g, xylanase 10.119,5 Ul/g

Các thí nghiệm trên chỉ dừng ở giai đoạn nghiên cứu về enzyme chưa thử nghiệm thực tế

nên chưa đánh giá hiệu quả tác dụng của enzyme từ vi nấm Trichoderma, nên nhận thấy cần nghiên cứu một qui trình sản suất enzyme của vi nấm Trỉchoderma và thử nghiệm chế phẩm

trên thực tế để chế phẩm enzyme được ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau và góp phần mang lại lợi ích cho xã hội

Chuông 2

MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Mục tiêu

Định tính và định lượng enzyme của các chủng Trichoderma để tìm các chủng có hoạt

tính enzyme cao để tạo chế phẩm enzyme amylase và cellulase Thử nghiệm chế phẩm này trên

gà Lương Phượng nhằm tìm tỷ phối trộn thích hợp của chế phẩm enzyme với thức ăn hỗn hợp Đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm enzyme đến khả năng sinh trưởng và sức sản xuất thịt của

gà Lương Phượng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Bảo quản giống Trichoderma

Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), phương pháp bảo quản giống Trichoderma phổ biến và

đơn giản là cấy truyền và bảo quản lạnh Dựa trên sự trao đổi chất theo một khoảng thời gian nhất định Sau khoảng thời gian này lại lặp lại công việc trên

Mục đích của bảo quản giống Trichoderma là sau quá trình bảo quản các tính trạng quan

trọng của giống không bị mất hoặc bị giảm Trong định tính và định lượng enzyme của

Trỉchoderma thực hiện nhiều lần và thời gian thí nghiệm kéo dài nên cần thiết bảo quản giống

theo phương pháp trên để thí nghiệm không bị gián đoạn và đảm bảo các lần lặp lại thí nghiệm

không bị sai số nhiều Và đảm bảo đánh giá chính xác hoạt độ của các chủng Trichoderma

Cách tiến hành: cấy truyền mỗi giống vi sinh vật vào 5 ống nghiệm, nuôi cấy ở nhiệt độ

28 - 32 °c cho đến khi tạo được lượng sinh khối nhất định, mỗi giống lấy một ống dùng cho

nghiên cứu, một ống dùng sản xuất hoặc kiểm tra, một ống dùng cho bảo quản ở nhiệt độ lạnh

4 °c Sau khoảng một tháng cấy truyền và lặp lại như trên, tuân thủ chu kì cấy truyền và bảo

quản lạnh

2.2.2 Phương pháp nhân giống

Phương pháp này nhằm nhân số lượng tế bào của vi nấm Trichoderma, tạo khả năng thích

nghi dần cho vi nấm trong điều kiện cơ chất bã khoai mì tăng dần

+ Phương pháp nhân giống cấp một: mỗi ống nghiệm giống được cho vào 10 ml nước cất hấp vô trùng, khuấy đều Hút 5 ml (mật độ tế bào 105 - 106 tế bào/1 ml) cho vào môi trường nhân giống cấp một, đảo đều Bảo quản nơi khô ráo và sạch sẽ

+ Phương pháp nhân giống môi trường cấp hai: dùng kẹp lấy bào tử từ bình nhân giống cấp một rồi cho vào bình môi trường cấp hai, đảo đều, để nơi khô ráo sạch sẽ (Trần Thanh Thủy, 1999) Giống trên môi trường cấp hai được giữ ở điều kiện thích nghi cao nhất để khả năng phát

triển và sinh enzyme trên môi trường sản xuất của vi nấm Trỉchoderma là tốt nhất

2.2.3 PhưoTig pháp xác định độ ẩm

Đây là phương pháp hỗ trợ cho người làm thí nghiệm xác định độ ẩm nguyên liệu sử dụng, tính hệ số khô kiệt của nguyên liệu giúp xác định hàm lượng tinh bột và cellulose chính xác Phương pháp này có thể xác định độ ẩm của môi trường nuôi cấy để đảm bảo vi nấm

Trỉchoderma hoạt động tốt và xác định độ ẩm của sản phẩm sau khi nuôi cấy nhằm bảo quản

sản phẩm tốt hơn

Nguyên tắc: dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu phân tích Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong thực phẩm (Đồ Đại Nghĩa, 2005)

Cách tiến hành: Mẩu cần xác định độ ẩm (nghiền nhỏ)

Trong đó: w : Độ ẩm của mẫu (%)

mj: Trọng lượng chén và trọng lượng mẫu trước khi sấy (g) m 2 :

Trọng lượng chén và trọng lượng mẫu sau khi sấy (g) m : Trọng

lượng mẫu phân tích (g)

2.2.4 Xác định số lượng tế bào

Theo Nguyễn Hoàng Lộc (2006), số lượng tế bào được xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp bào tử trên buồng đếm hồng cầu

6

Xác định số lượng bào tử trong lml giống để đảm bảo sổ lượng bào tử vi nấm Trichoderma

không quá nhỏ khi cấy chuyền sang môi trường bán rắn Ngoài ra, xác định sé lượng bào tử vỉ

nấm Trichoderma cỗ trong sản phẩm nuôi cấy để kiểm tra với số lượng bào tử này cố gây hại

cho bộ máy tiêu hóa cho vật nuôi khi đùng sản phẩm enzyme đã sản xuất theo quỉ trình thử nghiệm

Cấu tạo buồng đếm hồng cầu: buồng đếm hồng cầu là một phiến kính dày hình chữ nhật, giữa là phần lõm phẳng, tại đây cỗ kẻ một lưới gồm 400 hình vuông nhỏ có diện tích tổng cộng

là 1 mm2 Ô trung tâm có 25 ô vuông lớn, mẫỉ ô vuông lớn này cố 16 ô vuông nhỏ Vi thế diện tích một hình vuông nhỏ là 1/400 mm2 và một hình vuông lởn hơn là 1/25 mm2

Cách tiến hành: tiến hành pha loãng mẫu ở các nồng độ khác nhau Đặt lá kính lên khu

vực buồng đếm Lắc đều dịch tế bào nấm Trỉchoderma và dùng micropipet để lấy dịch cho vào

khe ở mép giữa buồng đếm Tránh tạo bọt khí Đặt buồng đếm vào bàn kính hiền vỉ và để yên vài phút Chỉnh kính hiền vỉ, với vật kỉnh X 40, tìm mạng ồ đếm ở khu vực buồng đếm Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lởn (4x4=160 nhỏ)

Hình 2.1 Buồng đếm haemocytometer

Đếm số tế bào và tính toán: thể tích dịch chứa trên ô trung tâm (gồm 25 ô vuông lớn hay

400 ô vuông nhỏ) là 1 X 0,1 =0,1 mm3 (vì diện tích tổng cộng của ô trung tâm là 1 mm2) Tuy nhiên, chỉ cần đếm số tế bào trên 5 ô vuông lớn đại diện cho 25 ô vuông lởn trên ô trung tâm Khi đó, số lượng tế bào trong 1 ml (1 g) mẫu nghiên cứu được tính bằng công thức sau:

Trong đó: N : sô lượng tê bào trong 1 ml mâu nghiên cứu

a : số tế bào trong 5 ô vuông lớn ( 80 ô vuông nhỏ)

b : số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn (16x5 = 80 ô vuông nhỏ)

400 : tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm

0, 1 : thể tích dịch tế bào (tính bằng mm3) chứa trên ô trung tâm

103 : số chuyển mm3 thành ml (1000 mm3 = 1 ml)

10" : độ pha loãng mẫu

2.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng cellulose, tinh bột

Theo Nguyễn Quang Tâm (2003), hàm lượng cellulose thô, tinh bột được xác định bằng phương pháp thủy phân bằng axit và kiềm mạnh

Sử dụng phương pháp này với mục đích xác định lượng tinh bột, cellulose có trong bã khoai mì cũng như xác định lượng tinh bột, cellulose có trong sản phẩm trước và sau khi nuôi cấy vi nấm

Trichoderma Qua đó đánh giá khả năng sử dụng cơ chất của vi nấm Trichoderma

+ Xác định hàm lượng cellulose

Nguyên tắc: phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền vững của cellulose trước tác dụng của acid mạnh, kiềm mạnh Trong khi đó, các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như tinh bột, pectin ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm, nên bị oxi hóa, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp nitric với acid acetic

Cách thực hiện: cân 2 g bã khoai mì cho vào bình 500 ml + 200 ml NaOH 0,5 % Hồi lưu

và đun nhẹ trong 30 phút (lắp ống sinh hàn ngược) không để bọt trào Lọc qua giấy lọc, rửa cặn còn lại với NaOH nóng cho cặn celulose + 10ml HC1 10 % trong bình cầu (nhiệt độ thường) +

10 ml nước Javel nhỏ từ từ, vừa cho vừa khuấy đều để yên 5 phút rồi lọc, cho cặn tác dụng với

NaOH 0,5 % ở nhiệt độ 40 °c để hòa tan chất khác, lọc, lặp lại hai lần cho cellulose thật trắng

Rửa bằng nước sôi, sấy khô đến trọng lượng không đổi, đặt trong bình hút ẩm và cân

Tính hàm lượng cellulose (%) trong 1 gam mẫu: X = a 100

Trong đó: X: hàm lượng cellulose (%)

Cách tiến hành: cân chính xác 2 g bã khoai mì cho vào phễu sứ ở đáy đã lót giấy lọc cắt tròn Rửa bằng ete, bằng cồn rồi bằng nước, mỗi thứ hai lần, bằng cách hút chân không Cặn và giấy lọc được chuyển sang một cốc thủy tinh, cho vào 11 ml nước cất với 14 ml HC1 đậm đặc, khuấy kỹ Tinh bột hòa tan vào dung dịch Chuyển sang bình định mức dung dịch Chuyển sang bình định mức dung 100 ml, rửa cốc thủy tinh và dồn hết nước rửa vào bình định mức, sau đó cho nước vừa đủ 100 ml và lọc Hút lấy 50 ml dịch lọc trên cho vào một cốc thủy tinh, thêm 110

ml cốn 96 ° khuấy đều và để yên trong tủ lạnh (khoảng 10-12 giờ) để cho tinh bột kết tủa hết Chuẩn bị hai miếng giấy lọc tròn bằng nhau, sấy khô trong cùng một điều kiện và cân Lồng hai miếng giấy lọc vào nhau, giấy số 1 trên giấy số 2, để vào đáy phễu cho thật khít (nếu

hở thì không hút được chân không) Lọc kết tủa tinh bột bằng chân không và bằng cách lọc gạn Rửa sạch kết tủa với 200ml cồn 70 %, sau đó với cồn 96 0 cho đến khi hết phản ứng Cl' Tách thật khéo hai miếng giấy lọc riêng rẽ (giấy số 1 phải giữ đầy đủ kết tủa, giấy số 2 làm đối chứng

trắng), sấy ở nhiệt độ 130 °c trong một giờ, để nguội trong bình hút ẩm và cân

Hàm luợng tinh bột trong lOOg bã khoai mì: ( p - P’).100 (4)

Trong đó: p = 2 + P2-PI

P ’ = 2 + P2 - P i - P T

PJ : trọng lượng giấy số 1 (g)

p2 : trọng lượng giấy số 2 (g)

PT : trọng lượng của kết tủa (g)

2.2.6 Phương pháp ly trích enzyme thô bằng phương pháp ly tâm lạnh

Bình môi trường đã nuôi cấy, cân 10 g và thêm nước cất vô trùng, đặt lên máy lắc trong

30 phút, chiết dung dịch cho vào ống ly tâm, ly tâm lạnh (4.000 vòng trong 10

phút), thu enzyme (Trương Phước Thiên Hoàng, 2001) Enzyme thô được ly trích và kiểm tra

hoạt độ, thông qua đó đánh giá hoạt độ enzyme của Trỉchoderma trong quá trình nuôi cấy ở

những điều kiện khác nhau

thích hợp cho hoạt động trao đổi chất của vi nấm Trỉchoderma

Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hơp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử Dựa trên đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalisylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

Cách thực hiện:

Dựng đường chuẩn glucose: chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, cho vào các ống nghiệm lần lượt các nồng độ dung dịch glucose 0 - 500 pg/ml, thêm nước cất và thuốc thử DNS Lắc đều các ống nghiệm này, dán nylon lên miệng ống nghiệm, đun sôi cách thủy trong 15 phút, làm lạnh về nhiệt độ phòng (bằng một chậu nước lạnh) Đo độ hấp thụ OD ở bước sóng 530 nm (AG

) với ống số 0 là ống đối chứng (Aw)

Bảng 2.1 Phương pháp dựng đường chuẩn glucose

Nồng độ dd glucose chuẩn (pg/ml) 0 100 200 300 400 500 Dung dịch glucose chuẩn (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Hiệu chuẩn độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn bằng hiệu số: (AG - Aw) Dựng đồ thị đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD), trục hoành là nồng độ glucose (mg/ml)

CG: nồng độ dung dịch glucose chuẩn (mg/ml)

AG : độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn

Aw : độ hấp thu OD của phản ứng với nước cất

Chia nồng độ (mg/ml) cho độ hấp thu OD của mỗi dung dịch glucose chuẩn để thu được giá trị hệ số glucose, sau đó tính giá trị hệ số trung bình

2.2.8 Xác định hoạt tính hệ enzyme cellulase

Nguyên tắc: sử dụng CMC như cơ chất, ủ dịch chiết enzyme với CMC trong 60 phút và

pH = 5,0 Sau khi ủ, phân tử glucose được phóng thích, đo hàm lượng glucose xác định được hoạt tính enzyme cellulase (Nguyễn Lân Dũng và ctv,1976)

Khi khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp một, cấp hai và môi trường sản xuất Ở điều kiện nuôi cấy khác nhau thì hoạt độ cellulase cũng khác nhau Để tìm điều kiện nuôi cấy nào có hoạt độ enzyme tối ưu nhất thì cần phải xác định hoạt độ cellulase

Cách thực hiện:

+ Thực hiện phản ứng thử thật: dùng pipet hút 3 ml dung dịch CMC 0,3 %; 1 ml dung

dịch enzyme và 1 ml dung dịch đệm acetate pH = 5,0 ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 40 °c trong một giờ Sau đó lấy hỗn hợp ra khỏi buồng ủ nhiệt, hút lấy 1 ml dung dịch ủ và 1 ml dung dịch

thuốc thử DNS 1 % Đun sôi cách thủy 5 - 1 0 phút, làm nguội và đo OD (A, = 530 nm), có được độ hấp thu OD là AK

+ Thực hiện phản ứng thử không: tương tự phản ứng thử thật nhưng thay 1 ml dịch enzyme bằng 1 ml dịch enzyme bị bất hoạt (enzyme được đun trong 20 phút ở 100 °C), đo OD (X = 530 nm), có được độ hấp thu OD là AT

m

Trong đó: Aj: độ hấp thu OD của dung dịch phản ứng enzyme

A k : độ hấp thu OD của phản ứng thử không

2 : thể tích hỗn hợp phản ứng (ml)

V : thể tích enzyme ban đầu (ml) n : độ pha loãng; m:

khối lượng mẫu phân tích (g)

2.2.9 Xác định hoạt tính amylase

Theo Lê Ngọc Tú và ctv (2000), phương pháp được dừng để xác định hoạt tính amylase

là phương pháp Henkeil

Thành phần cơ chất trên môi trường nhân giống và môi trường sản xuất không giống nhau thì tỷ

lệ tinh bột cũng khác nhau Hoạt độ enzyme amylase sinh ra trong những điều kiện ấy luôn có

sự tăng và giảm Sử dụng phương pháp Henkeil để lựa chọn và tìm ở điều kiện nào enzyme amylase là tối ưu nhất

Nguyên tắc: xác định lượng tinh bột bị thủy giải trên cơ sở xác định mức độ giảm cường

độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iod Đơn vị hoạt độ của enzyme là lượng enzyme

có khả năng thủy phân 1 mg tinh bột sau 30 phút ở 30°C; pH = 6,0

+ Thực hiện phản ứng thử thật: dùng pipet hút 1 mi dung dịch tinh bột 1 %; 1 mi dung

dịch NaCl 0,1 %; 2 ml dung dịch đệm phosphate 0,05 M (pH = 6,0), lắc đều Sau đó để yên

15-20 phút cho hỗn hợp đạt 30°c Cho vào hỗn hợp 1 ml dịch enzyme Tiếp tục lắc đều và giữ cho hỗn hợp ổn định ở 30 °c trong 30 phút Sau đó, cho vào hỗn hợp 5 ml HCl 0, 1 N để dừng phản

ứng Hút lml hỗn hợp phản ứng với 9 ml dung dịch Iod pha loãng 450 lần và đo OD (Ả =560

nm), có được độ hấp thụ OD là MT

+ Thực hiện phản ứng thử không: tương tự phản ứng thử thật nhưng cho 5 ml HCl vào hỗn

hợp trước khi cho dịch enzyme vào, đo OD (Ằ = 560 nm), có được độ hấp thu OD là Mk + Đường chuẩn tinh bột: từ dung dịch tinh bột 1,0 %; xây dựng đường chuẩn với dung dịch tinh bột có nồng độ từ 0 - 10 mg/ml Lắc đều các ống nghiệm, hút 1 ml + 9 ml dung dịch Iod pha loãng 450 lần, đo OD ở bước sóng 560 nm (Mc) Ống số 0 là ống đối chứng (M0)

Bảng 2.2 Phương pháp dựng đường chuẩn tinh bột

Dựng đồ thị đường chuẩn tinh bột với trục tung là mật độ quang (OD), trục hoành là

m : Khối lượng môi trường cần đo OD (g)

2.2.10 Phương pháp xác định nitơ tổng số, nitơ - amin

2.2.10.1 Xác định nitrogen formol

Theo Vụ Khoa Học Công Nghệ và Chất Lượng Thực Phẩm (2001), xác định nitrogen formol bằng phương pháp Sorensen

Sử dụng phương pháp này nhằm xác định lượng đạm formol được sinh ra trong sản phẩm nuôi

cấy vi nấm Trỉchoderma, kiểm tra được lượng đạm có thể hấp thu được có trong chế phẩm

Cách tiến hành: trung hòa formol l Á: lấy 500 ml formol /4, thêm vào đó vài giọt thuốc thử

phenolphtalein, cho NaOH 0,1 N từng giọt cho tới khi dung dịch chuyển màu hồng nhạt (pH =

9), ta được formol Vi đã trung hòa Hút 10 ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng 10 lần, thêm vào đó 10ml dung dịch formol V 2 đã trung hòa và vài

giọt phenolphtalein, lắc đều để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó định phân bằng NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng

Tính đạm formol (g/1): N f = 1,4■ 0,97 ■ (V T — V0) (8)

Trong đó: Nf : lượng nitơ - amin (g/1)

Vo : thể tíchNaOH trung bình của 3 lần thử không (ml)

V T : thể tíchNaOH trung bình của 3 lần thử thật (ml)

2.2.10.2 Phưotig pháp xác định đạm tổng số

Xác định đạm tổng số bằng phương pháp Kjeldhal (Vụ Khoa Học Công Nghệ và Chất Lượng Thực Phẩm, 2001) Theo nguyên tắc là chuyển toàn bộ nitơ trong mẫu thành dạng amon sulfate, giải phóng NH3 bằng kiềm, hấp thu NH3 bằng axit boric và xác định Nbằng phương pháp trung hòa dung dịch chuẩn HC1 hoặc H2S04

Xác định lượng đạm tổng số trước và sau khi sấy khô nhằm kiểm tra trong sản phẩm có thành phần đạm thối gây hại hay không

Cách tiến hành: cân 1 g (hoặc lml dung dịch) mẫu cho vào ống đốt, thêm 2 g hỗn hợp muối và 25 ml H2S04 đậm đặc 5 giọt parafin, cho vào máy phá mẫu, tiến hành phá mẫu cho đến khi dung dịch có màu trong suốt, để nguội và thêm khoảng 50 ml nước Tiến hành cất đạm: lắp ống đốt vào máy cất đạm khoảng 350 giây, NH3 được hấp thu bằng 50 ml dung dịch axit boric 5% đã cho thuốc thử bromocresol Định lượng NH3 bằng cách chuẩn độ với HC1 0,25N đến khi chuyển từ màu xanh sang màu tía nhạt

Tính % khôi lượng N trong mâu N{%) = - - - — - (9)

m

Trong đó: a : thể tích dung dịch axit chuẩn sử dụng cho mẫu thử (ml)

b : thể tích dung dịch axit chuẩn sử dụng cho mẫu trắng (ml)

N :nồng độ đương lượng axit chuẩn m : khối lượng mẫu (g)

0,01401 : mili đương lượng gam N (g)

2.2.11 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.2.11.1 Thử nghiệm phân giải amylase, cellulase của các chủng Trichoderma

Nguyên tắc: khi có mặt cơ chất, tế bào vi nấm sẽ tổng hợp enzyme tương ứng thông qua

cơ chế cảm ứng và chính cơ chất là yếu tố kích thích tế bào tiết enzyme thực hiện phản ứng phân giải (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Cách tiến hành: môi trường cảm ứng hệ enzyme amylase và cellulase được chuẩn bị (mục

22.4.2), cấy mỗi chửng Trỉchoderma lên giữa đĩa môi trường Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, trong

60 giờ Sau đó, cho thuốc thử Lugol, lắc đều và để yên 15 phút Đo đường kính vòng phân giải

tinh bột và CMC Chọn các chủng Trỉchoderma có đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC

lớn

2.2.11.2 Tuyển chọn chủng Trichoderma có họat độ amylase và cellulase cao

Chọn chủng là giai đoạn quan trọng trong sản xuất chế phẩm enzyme Một chửng tốt sẽ cho năng suất xử lý bã khoai mì tốt và chất lượng sản phẩm chứa enzyme cao, tăng khả năng cạnh tranh với các chế phẩm enzyme trên thị trường

Cách tiến hành: các chủng được chọn (mục 2.3.11.1) nuôi cấy trên môi trường bán rắn chứa 5 % bã khoai mì, nuôi cấy trong 48 giờ, 3 ml giống (106 tế bào/ml) Ly trích enzyme dạng

thô, định hoạt tính Chọn chửng Trỉchoderma có hoạt tính enzyme amylase, cellulase cao Và

tiếp tục khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu trên môi trường bán rắn

2.2.11.3 Khảo sát điều kiện nuôi cấy Trichoderma trên môi trường bán rắn

Để vi nấm Trỉchoderma có thể hoạt động tốt trên môi trường cơ chất (bã khoai mì) với

lượng lớn thì cần phải có điều kiện nuôi cấy thích hợp Tiến hành chuẩn bị giống các chửng

Trỉchoderma được chọn; môi trường nhân giống

+ Khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp một, cấp hai

Khảo sát thời gian nuôi cấy: mỗi chủng Trichoderma có giai đoạn phát triển khác nhau,

thời gian để toàn bộ lượng enzyme sinh ra kết hợp được với cơ chất cũng khác nhau Do đó khảo sát thời gian nuôi cấy để tìm giai đoạn lượng đường khử sinh ra nhiều nhất và khi đó hoạt độ enzyme cũng là cao nhất

Cách tiến hành: nuôi cấy các chủng Trichoderma với các giai đoạn (giờ) là 24; 36; 48;

60 và 72 trên môi trường bán rắn đã chuẩn bị sẵn, cùng tỷ lệ giống (106 tế bào/ml đối với môi trường nhân giống cấp một; 106 tế bào/g đối với môi trường nhân giống cấp hai) Đo hoạt tính enzyme amylase, cellulase Xác định thời gian sinh enzyme cao nhất

- Khảo sát thể tích giống, tỷ lệ giống: lượng cơ chất nhất định được nuôi cấy trong khoảng thời gian cố định thì chỉ phù hợp với tỷ lệ giống xác định

Cách tiến hành: Môi trường nhân giống được chuẩn bị (phụ lục 1) Nuôi cấy các chủng

Trichoderma trong thời gian tối ưu đã xác định với thể tích (ml) giống thay đổi

1; 2; 3; 4 và 5 đối với môi trường nhân giống cấp một và tỷ lệ (%) giống thay đổi 1; 2; 3; 4 và 5 đối với môi trường nhân giống cấp hai Đo hoạt tính enzyme amylase, cellulase Xác định thể tích và tỷ lệ giống phù họp với môi trường nhân giống cấp một và hai

+ Khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường môi trường sản xuất Khi thay đổi điều kiện sống

từ môi trường nhân giống sang môi trường sản xuất thì cơ chế cảm ứng cơ chất của Trỉchoderma

diễn ra mạnh mẽ nhất với giai đoạn nuôi cấy, tỷ lệ giống, tỷ lệ cơ chất hoàn toàn khác Nên tìm

điều kiện nuôi cấy Trỉchoderma thích hợp nhất trên môi trường sản xuất là cần thiết để thu nhận

lượng enzyme amylase và cellulase tối đa

Cách tiến hành:

- Khảo sát thời gian nuôi cấy: môi trường sản xuất (phụ lục 1) được nuôi cấy trong với các giai đoạn (giờ) 24; 30; 36; 42; 48 và 62, tỷ lệ giống cấp hai là 3 % (106 tế bào/g) Đo hoạt tính enzyme amylase, cellulase Chọn thời gian tối ưu sinh enzyme amylase và cellulase nhiều nhất

- Khảo sát tỷ lệ giống thích hợp: tương tự khảo sát tỷ lệ giống trên môi trường nhân giống cấp hai

- Khảo sát tỷ lệ bã khoai mì: trong giai đoạn đầu, khi nồng độ cơ chất tăng tốc độ phản ứng sẽ tăng Nhưng khi tốc độ phản ứng cực đại, dù có tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng cũng hoàn toàn không có khả năng tăng theo (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Do đó, cần khảo sát

tỷ lệ bã khoai mì nhằm tìm tỷ lệ cơ chất phù hợp với tỷ lệ giống cấp hai đã xác định Và ở thời điểm khảo sát, lượng enzyme amylase và cellulase thu được là cao nhất

Cách tiến hành: môi trường sản xuất được chuẩn bị, nhưng thay đổi tỷ lệ (%) bã khoai mì lần lượt 70; 75; 80; 85 và 90, nuôi cấy trong khoảng thời gian và tỷ lệ giống cấp hai thích hợp

đã xác định Đo hoạt độ enzyme amylase và cellulase Chọn tỷ lệ bã khoai mì thích hợp nhất

2.2.11.4 Nuôi cấy các chủng Trỉchoderma ở điều kiện tối ưu

Sau khi xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu, tiến hành nuôi cấy trên môi trường sản

xuất để thu nhận enzyme amylase và cellulase của các chủng Trichoderma Sau khi thu nhận, trộn chủng Trichoderma có enzyme amylase cao với chủng có enzyme cellulase cao, để sản

phẩm sau cung có hoạt độ enzyme cao

Cách tiến hành: chuẩn bị bình giống cấp hai (mục 2.3.11.3) và nuôi cấy các chủng

Trỉchoderma đã chọn (mục 2.3.11.2) nuôi cấy trong điều kiện tối ưu xác định (mục 2.3.11.5)

Thu sản phẩm nuôi cấy Sau đó, trộn hai chế phẩm enzyme amylase, cellulase của hai chủng T

13 3 và T.92 theo tỷ lệ 1:1, tạo chế phẩm Eplus có enzyme cao

2.2.12 Xác định các chỉ tiêu của chế phẩm enzyme

Chuẩn bị sản phẩm nuôi cấy (mục 2.3.11.4) Phối trộn các sản phẩm có hàm lượng

enzyme amylase, cellulase theo tỷ lệ 1 : 1 và sấy thông gió 50 °c đến khi độ ẩm còn 10 - 13 %,

tạo ra sản phẩm sinh học Eplus Tiến hành xác định các chỉ tiêu: cellulose, tinh bột, đạm tổng

số, đạm formol, pH trước và sau khi nuôi cấy; độ ẩm sau khi sấy thông gió; đếm số bào tử; hàm lượng glucose

2.2.13 Khảo sát tỷ lệ trộn vào thức ăn cho gia cầm

Khảo sát ảnh hưởng hệ enzyme thủy phân lên tăng trọng và sức sản xuất thịt của gà Lương Phượng nhằm tìm tỷ lệ trộn chế phẩm enzyme với thức ăn gia cầm

Cách tiến hành: gồm 2 giai đoạn +

Nuôi gà con (1-3 tuần tuổi)

Vệ sinh tẩy uế chuồng trại, khử trùng bằng vôi sống; rơm chặt nhỏ bảo đảm khô, hút

ẩm tốt, sạch, được khử trừng trước khi đưa vào Trải dày 15-17 cm Chuẩn bị chụp sưởi:

bóng điện 50 w® 100W/chụp

Sàn chuồng sàn lưới bằng kẽm kích thước 2 mét X 1 mét X 1 mét

Chuẩn bị thức ăn, nước uống Cho gà uống nước sạch, trong có pha thuốc Bio -

Vitamin Plus (lg/1) Cho gà ăn thức ăn Con Cò dành cho gà từ 1 - 42 ngày tuổi Chế độ nhiệt trong chuồng: Điều chỉnh độ cao chụp sưởi phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường và tuổi của gà

Chế độ chiếu sáng: đèn chiếu sáng công suất 25 - 30W, tuần đầu: 24 giờ/ngày/đêm; tuần thứ 2: 23 giờ/ngày/đêm; tuần thứ 3 trở đi: 23 - 22 giờ/ngày/đêm Độ thông thoáng khí: có thiết bị làm thông khí

+ Nuôi gà dò (3 tuần tuổi ): phân 5 lô và bố trí 5 lô thí nghiệm đảm bảo sự lặp lại, đồng đều (3 tuần tuổi, 8 trống và 12 mái) và đánh số từ 1 - 20 theo trọng lượng giảm dần để tiện cho việc theo dõi tăng trọng Cho ăn ban ngày với cám Con Cò trộn chế phẩm Eplus theo năm tỷ lệ như sau : 0 % ( lô đối chứng), lô I (5 %), lô n (10 %), lô m (15 %) và lô IV (20 %)

+ Tiêm chủng cho gia cầm: đảm bảo tiêm vaccine đúng cách, đủ liều

Bảng 2.3 Lịch tiêm chủng phòng bệnh cho gà Lương Phượng

Đánh giá kết quả thử nghiệm chế phẩm enzyme trên cơ sở số liệu theo dõi:

- Trọng lượng trung bình (g) của các lô qua các tuần

- Tăng trọng tuyệt đối (g/con/ngày)

- Lượng thức ăn tiêu thụ, trong mỗi tuần (g/con/tuần)

- Lượng thức ăn tích lũy (g/con)

- Tiêu tốn thức ăn cho 1 kg tăng trọng (kg)

- Tỷ lệ nuôi sống tích lũy (%)

- Khảo sát quầy thịt

- Phân tích thống kê và khẳng định kết quả

2.2.14 Phương pháp đánh giá sinh trưởng và sức sản xuất thịt của gia cầm

Khi gia cầm được nuôi trong những môi trường như nhau nhưng khác khẩu phần thức ăn thì khả năng sinh trưởng và sức sản xuất thịt khác nhau Phương pháp nêu trên giúp đánh giá sự khác biệt sinh trưởng và sức sản xuất thịt giữa lô có dùng chế phẩm enzyme Eplus ở tỷ lê khác nhau và lô không dùng chế phẩm Eplus

2.2.14.1 Chỉ tiêu về sinh trưởng

Trong đó, TTTĐ: tăng trọng tuyệt đối (g/con/ngày); PN: trọng lượng bình quân ở tuần n (g); p N_j: Trọng lượng bình quân ở tuần n-1 (g)

2.2.14.2 Chỉ tiêu về tiêu tốn thức ăn

Ỵ TATT

ỵ^SGĩT

Trong đó, LTATT: lượng thức ăn tiêu thụ (g/con/tuần); ^ TATT : tổng lượng thức ăn trong

tuần (g); ỴsSGTT : tổng số gà trong tuần (con)

+ Lượng thức ăn tích lũy (g/con): là lượng thức ăn mỗi gà tiêu thụ mỗi tuần cộng dồn lại cho tới khi cân gà

Trong đó, TLNSTL: tỷ lệ nuôi sống tích lũy (%); SGf số gà ở thời điểm khảo sát (con);

SG 0: số gà ban đầu (con)

2.3.14.4 Chỉ tiêu về khảo sát năng suất thịt gà

Theo Bùi Hữu Đoàn (2009), phương pháp giải phẫu có thể xác định sức sản xuất của gà Tiến hành mổ khảo sát lúc gà đạt được 10 tuần tuổi, lấy ở mỗi lô 4 con ( 2 trống, 2 mái) có trọng lượng từng con ở lô này tương đương trọng lượng từng con ở lô khác Cân trọng lượng sống (g,

TLS), cân trọng lượng sau cắt tiết, cân trọng lượng sau nhổ lông Tiến hành mổ khảo sát các chỉ

tiêu sau:

+ Tỷ lệ móc hàm : là trọng lượng sau khi cắt tiết, bỏ lông, bỏ lòng

TLS

Trong đó, TLMH: tỉ lệ móc hàm (%); TIMH\ trọng lượng móc hàm (g)

+ Tỷ lệ quầy thịt:trọng lượng sau khi cắt tiết, bỏ lông, bỏ lòng, bỏ đầu, bỏ cổ, bỏ chân

ĨTQT = ^^100 TLS

( 15 )

Trong đó, TTQT: tỷ lệ quầy thịt (%); tlQT: trọng lượng quầy thịt (g)

+ Tỷ lệ ống tiêu hóa (dạ dày cơ và ruột): TLOTH =

Trong đó, TLĐ: tỷ lệ đùi (%); tlĐ: trọng lượng đùi (g)

TLS

Trong đó, ŨQT: trọng lượng quầy thị (g); NTad: trọng lượng nôi tạng ăn được (g) Nội

tạng ăn được: mề (bỏ vật chất bên trong), gan, tim, phổi, thận, mỡ nội tạng

2.2.16 Phưưng pháp xử lý sổ liệu

+ Phần mềm phần mềm Exel: xử lý số liệu thô, vẽ đồ thị

+ Phần mềm STATGRAPHICS Plus version 5.1 xử lý ANOVA

Chương 3 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả định tính bằng đo đường kính vòng phân giải

Thực hiện thí nghiệm theo mục 2.3.11.1, đo đường kính vòng phân giải và kết quả trình bày ở bảng 3.1 và 3.2 Các số liệu trong hai bảng trích từ phụ lục 3

Bảng 3.1 Đường kính (mm) vòng phân giải CMC

Trong môi trường cảm ứng chứa CMC, các chủng T.87, T.92, T.133 và T.221 có khả năng thực hiện cơ chế cảm ứng tốt với cơ chất, enzyme cellulase tiết ra nhiều hơn các chủng còn lại nên đường kính phân giải lớn và rõ hơn Trong đó chửng T.92 (d = 71,67 mm) có đường kính

phân giải CMC lớn nhất Chọn các chủng Trỉchoderma này tiếp tục khảo sát hoạt tính enzyme

cellulase trên môi trường bán rắn chứa 5% bã khoai mì

Bảng 3.2 Đường kính (mm) vòng phân giải tinh bột của hệ enzyme amylase trên môi trường

Trong cùng một cột và khác tên chủng Trichoderma, các giả trị sai sổ có kỉ tự theo sau khác nhau

có sự khác biệt về mặt thống kê (P < 0,05; F=193,67) Các giá trị trích từ phụ lục 3

Qua kết quả đo đường kính bảng 3.1 và 3.2, thấy rằng các chủng Trichoderma được khảo

sát có hệ enzyme amylase và cellulase kém Chọn các chủng T.92, T.87, T.133 và T.221 để khảo sát sơ lược hoạt tính enzyme amylase trên môi trường bán rắn cấp một có chứa 5%bã khoai mì

Sau đó, chọn chửng Trỉchoderma có hoạt tính enzyme amylase cao để khảo sát điều kiện nuôi

cấy để thu nhận enzyme amylase

3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy và đo hoạt tính enzyme amylase, cellulase

Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu của các chủng Trỉchoderma được chọn lần lượt được

Trong cùng một cột và khác tên chủng Trichoderma, các giá trị sai số của hoạt độ amylase cỏ

kỉ tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê (P < 0,05; F Amy ia Se =22,55) Các giá trị sai so của hoạt độ cellulase có kỉ tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống

kê (P > 0,05; Fceiiuiase = 0,49) số liệu trích từ phụ lục 5

Kết quả bảng 3.3, hoạt độ amylase và celluase của chủng T.133 và T.92 cao hơn hoạt độ chủng T.221 và T.87 Trong thời gian 48 giờ, bào tử chủng T.211 và T.87 rất nhiều, già và có

màu xanh đặc trưng của Trỉchoderma trong khi bào tử T.92 và T.133 có màu trắng phủ đầy môi

trường nuôi cấy Lượng enzyme sinh ra nhiều khi bào tử còn non nên trong thời điểm khảo sát hoạt độ amylase và cellulase các chửng T.92 và T.133 cao, chọn chủng T.92 và T 133 để khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường nhân giống và sản xuất

Tiếp tục khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp một với thời gian nuôi cấy khác nhau và thể tích giống khác nhau Sản phẩm sau khi nuôi cấy được lấy 10 g, pha loãng mẫu 100 lần bằng 100 ml nước cất, lắc mẫu 20 phút, ly tâm lạnh thu enzyme thô, xác định hoạt độ enzyme amylase và cellulase, tìm khoảng thời gian và thể tích nuôi cấy tối ưu thích hợp trên môi trường nhân giống cấp một có hoạt độ enzyme amylase và cellulase nhiều nhất

Bảng 3.4 Khảo sát thời gian nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp một

Bảng 3.5 Khảo sát thể tích giống môi trường nhân giống cấp một

Chủng Thể tích giống Hoạt độ amylase Hoạt độ cellulase

Trong cùng một cột của chủng T.92 và khác thể tích nuôi cấy, các giá trị hoạt độ enzyme có sự khác biệt

về mặt thong kê (P < 0,05; F Amyiase=60,69 và F C eiiuiase = 47,89) Trong cùng một cột của chủng T.133

và khác thể tích nuôi cay, các giá hoạt độ enzyme có sự khác biệt về mặt thong kê (P < 0,05; F Amylase—

5 , 09 và F Ceiiuiase = 30,97) số liệu trích từ phụ lục 5.

Kết quả bảng 3.4, thấy khoảng thời gian 60 giờ cả hai chủng T.92 và T 133 có hoạt độ

amylase và cellulase cao nhất Khoảng thời gian 24 - 48 giờ, vi nấm Trỉchoderma tận dụng chất

dinh dưỡng có sẵn trong môi trường nên lượng enzyme tiết ra chưa nhiều Thời gian nuôi cấy

càng dài, khi chất dinh dưỡng có sẵn đã hết, Trichoderma phân tiết enzyme nhiều để phân giải

cơ chất và thời điểm 60 giờ lượng enzyme tiết ra nhiều nhất Trong môi trường nhân giống cấp

một, lượng cơ chất rất ít (5 % bã khoai mì), khi cơ chất cạn dần thì lượng enzyme phân tiết giảm

nên thời điểm khảo sát 72 giờ hoạt độ enzyme amylase và cellulase thấp

Trong quá trình phân giải cơ chất, Trỉchoderma thủy phân môi trường bán rắn với một

lượng vừa đủ nhu cầu tồn tại Nên lượng enzyme tiết ra tỷ lệ thuận với thể tích giống Các thể tích khảo sát được nêu trong bảng 3.5, ở thể tích giống 3 ml có hoạt độ enzyme amylase và cellulase cao nhất, phù hợp lượng cơ chất có trong môi trường nhân giống cấp một Nuôi cấy 60 giờ, với thể tích giống 4-5 ml, bào tử phát triển rất nhiều, lượng enzyme rất ít

Sau khi khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp một, chọn bình giống tốt nhất và tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp hai

Bảng 3.6 Khảo sát thời gian nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp hai

Giai đoạn 48 giờ, lượng enzyme amylase và cellulase sinh ra nhiều nhất Với khoảng thời

gian này, bào tử Trỉchoderma sản sinh enzyme nhiều nhất, lượng đường khử sinh ra cực đại

Sau khoảng thời gian này, lượng enzyme giảm dần nhờ cơ chế điều hòa của chúng

Bảng 3.7 Khảo sát tỷ lệ trộn giống cấp một vào môi trường nhân giống cấp hai

Chủng

Trỉchoderma

Giống (%)

Hoat đô amylase ’ (UÌ/g) Hoat đô cellulase (ỦI/g)

F Amy i ase =68,8 và F C eiiuiase = 36,64) sổ liệu trích từ phụ lục 5.

Trên môi trường nhân giống cấp hai, tỷ lệ giống cấp một 3 % là thích hợp nhất Hoạt độ enzyme tối ưu sinh ra trên môi trường nhân giống cấp hai nhiều hơn môi trường nhân giống cấp một vì nồng độ cơ chất tăng thì cơ chế cảm ứng cơ chất cũng tăng, nên lượng enzyme sinh ra nhiều hơn

Chọn được bình nhân giống cấp hai tốt nhất, tiếp tục khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường sản xuất Tương tự trên môi trường nhân giống cấp một và cấp hai, khảo sát thời gian nuôi cấy, tỷ lệ trộn giống cấp hai, tỷ lệ bã khoai mì trên môi trường sản xuất Đo hoạt độ enzyme amylase và cellulase, xác định thời gian nuôi cấy tối ưu, tỷ lệ giống cấp hai, tỷ lệ bã khoai mì thích họp nhất trên môi trường sản xuất Kết quả khảo sát này được trình bày trong bảng 3.8; 3.9

và 3.10

Bảng 3.8 Khảo sát thời giạn nuôi cấy trên môi trường sản xuất

Chủng

Trỉchoderma cấy (giờ) Thời gian nuôi

Hoat đô amylase ' (uVg)

Hoat đô cellulase

Trong cùng một cột của chủng T.92 và khác thời gian nuôi cấy, các giá trị hoạt độ enzyme có

sự khác biệt về mặt thong kê (P< 0,05; FAmyiase=38,74; Fceiiuiase = 338,13) Trong cùng một cột của chủng T.133 và khác thời gian nuôi cấy, các giá trị hoạt độ enzyme cỏ sự khác biệt về mặt thống kê (P< 0,05; FAmyiase=47,89 và Fceiiuiase = 33,47) Sổ liệu trích từ phụ lục 5

Bảng 3.9 Khảo sát tỷ lệ trộn giống cấp hai vào môi trường sản xuất

Chủng

Trỉchoderma

Giống

(%)

Hoat đô amylase

Bảng 3.10 Ket quả hoạt độ amylase, cellulase theo tỷ lệ (%) bã khoai mì

5

Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy trên môi trường sản xuất (75 % bã khoai), nhận thấy nuôi cấy trong khoảng thời gian 36 giờ là tốt nhất Trong khoảng thời gian này bào tử còn non,

chưa có màu xanh đặc trưng của vi nấm Trichoderma, lượng enzyme phân tiết nhiều Sau khoảng

thời gian 36 giờ, lượng enzyme giảm đi đáng kể

Qua bảng 3.9, biết được tỷ lệ trộn giống cấp hai vào môi trường sản xuất tối ưu ở tỷ lệ

giống 2 % đối với T.92 và 4 % đối với T.133 Ở tỷ lệ giống này, phức hợp enzyme - cơ chất là

cực đại nên hoạt độ enzyme amylase và cellulase là cao nhất Với thành phần môi trường cố định, khi tỷ lệ giống quá ít hay quá nhiều thì lượng enzyme sinh ra và lượng cơ chất có sẵn không tương xứng nên phức hợp enzyme và cơ chất tạo ra không nhiều Do đó, hoạt độ enzyme amylase

và cellulase thấp

Trong giai đoạn đầu, nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ sinh enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất Do đó, khi nồng độ cơ chất tăng tốc độ phản ứng sẽ tăng Nhưng khi tốc độ phản ứng cực đại, dù có tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng cũng hoàn toàn không có khả năng tăng theo Kết quả bảng 3.10 đã thế hiện được điều

đó Với tỷ lệ bã khoai mì 70 - 75 %, hoạt độ enzyme tăng dần và đạt cực đại ở tỷ lệ giống 80 %

Nhưng ở tỷ lệ giống 85 - 90 % hoạt độ enzyme giảm dần

3.3 Khảo sát các chỉ tiêu của sản phẩm

Sau khi khảo sát và tìm được các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho môi trường sản xuất, tiến hành nuôi cấy hai chủng T.92 và T.133 trong điều kiện đó, thu sản phẩm, sấy thông gió ở

50°c, trộn hai sản phẩm theo tỷ lệ 1 : 1 và tiếp tục khảo sát chỉ tiêu sản phẩm

Bảng 3.11 Kết quả các chỉ tiêu của sản phẩm trộn trước nuôi cấy và sau khi sấy

Sau khi nuôi cấy nấm Trỉchoderma lượng cellulose và tinh bột giảm so với môi trường

trước khi nuôi cấy Vì cơ chất đã bị thủy giải bởi enzyme amylase và cellulase từ nấm

Trỉchoderma Lượng đạm tổng số giảm vì bị thất thoát trong khi sấy thông gió Lượng đạm

formol tăng nhờ nấm phân giải protein trong cơ chất để đảm bảo nhu cầu phát triển cho cơ the

pH giảm, vì có lượng nhỏ axit hữu sinh ra trong quá trình trao đổi chất của vi nấm Trỉchoderma

Hoạt độ hoạt độ amylase và cellulase giảm so với hoạt độ enzyme amylase (1463,33 UI/g)

và celllulase (6328,5 Ul/g) của sản phẩm nuôi cấy chưa được sấy Nguyên nhân là do enzyme

bị mất hoạt tính khi sấy thông gió

Chế phẩm Eplus có hoạt độ amylase và cellulase thấp hơn 1,4 lần chế phẩm Amavo T của hãng AMAVO

29

Hình 3.1 Sản phẩm nuôi cấy vi nấm Trichoderma C: sản phẩm nuồi cấy chưa

sấy; R: sản phẩm nuôi cấy đã sấy thông giỏ

3.4 Qui trình sản xuất chế phẩm Eplus

Khay ủ trong 36 giờ, giống 2%

cho nuôi chửng T.92, 4 % cho nuôi chủng T.133

Thu và trộn các sản phẩm nuôi cấy

Sấy thông gió và tạo sản phẩm Eplus

Thức ăn

cho gia súc

Sử dụng trong

Thức ăn cho gia cầm

1

Xử lý phế phẩm nông nghiệp

Sơ đồ 3.1 Quy trình sản xuất chế phẩm Eplus

3.5 Kết quả thử nghiệm chế phẩm enzyme trên gà Lương Phượng

Đánh giá hiệu quả của chế phẩm enzyme Eplus qua thử nghiệm theo mục 2.3.13 Kết quả khảo sát khả năng sinh trưởng của gà Lương Phượng được trình bày trong bảng 3.12; 3.13; 3.14; 3.15 và 3.16 Thực hiện thí nghiệm khảo sát trọng lượng trung bình các lô qua các tuần nhằm đánh giá tống thể, tìm giai đoạn bổ sung chế phẩm enzyme của các lô thí nghiệm cho vật nuôi

Bảng 3.12 Trọng lượng trung bình 5 lô gà Lương Phượng trong 8 tuần nuôi (g)

Các giá trị so sánh trong cùng một hàng và khác lô số liệu thống kê thuôc phụ lục 6

Qua bảng 3.12 nhận xét trọng lượng trung bình 5 lô gà tuần 1 (giai đoạn 2-3 tuần tuổi, lúc phân lô) tương đương nhau không có sự khác biệt trong thống kê (P = 1,0000); phương sai (F = 0,00) Mục đích phân lô có trọng lượng ban đầu tương đương nhau để theo dõi tăng trọng, so sánh sự khác biệt giữa các lô chính xác hơn

Giai đoạn 3-6 tuần tuổi, sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05) Giai đoạn này

gà rất nhạy cảm, tác động chế phẩm enzyme thủy phân ở giai đoạn này có khả năng hỗ trợ tích cực tiêu hóa thức ăn

Giai đoạn 6 - 1 0 tuần tuổi, sự khác biệt trọng lượng trung bình giữa các lô chưa đủ sức chứng tỏ sự khác biệt trọng lượng giữa các lô nghiệm thức ( p > 0,05) Vì trọng lượng từng con trong mỗi lô tăng trọng gần như nhau, không có biên động lớn

Hình 3.2 Gà Lương Phượng qua các giai đoạn phát triển AI V à A2: gà Lương Phượng 1-2 tuần tuổi; BI và B2: gà Lương Phượng 7 tuần tuổi; Cĩ, C2, C3 và C4: gà Lương Phượng 10 tuần tuổi

Bảng 3.13 Kết quả tăng trọng tuyệt đối của từng lô gà qua 8 tuần nuôi (g/con/tuần)

So sánh giũ ! trị trong cùng một hàng và khác lô Giả trị \ thống kê thuộc phụ lục 6

Bảng 3.14 Lượng thức ăn tiêu thụ của gà Lương Phượng 10 tuần tuổi (g/con/tuần)

Phân tích kết quả khảo sát tăng trọng tuyệt đối bảng 3.13 của mỗi lô qua các

tuần, các lô I - rv tăng trong đều và ổn định; lô V(đc) tăng trọng không đều

Giai đoạn 3 - 5 và 6 - 9 tuần tuổi, sự khác biệt tăng trọng tuyệt đối giữa các lô có ý nghĩa

về mặt thống kê (P < 0,05) Các giai đoạn này, tác động của chế phẩm là tích cực, cải thiện tăng trưởng cho gà Lương phượng

Giai đoạn 5 - 6 v à 9 - 1 0 tuần tuổi, sự khác biệt tăng trọng tuyệt đối giữa các lô chưa

đủ sức chứng tỏ sự khác biệt trọng lượng giữa các lô nghiệm thức ( p > 0,05)

Bảng 3.15 Lượng thức ăn tích lũy của gà Lương Phượng ở 8 tuần thử nghiệm (g/con)

Bảng 3.16 Tiêu tốn thức ăn cho 1 kg tăng trọng của gà Lương Phượng trong 8 tuần

Lượng thức ăn tiêu thụ, tích lũy và tiêu tốn thức ăn cho 1 kg tăng trọng khảo sát ở bảng 3.14; 3.15 và 3.16 thấy rằng lô IV và lô đối chứng đều cao hom các lô còn lại Trong đó lô tốt nhất lầ lô II Giai đoạn 2-7 tuần tuổi, tiêu tốn thức ăn cho 1 kg tăng trọng thấp hơn giai đoạn

7 - 1 0 tuần tuổi Khi tuổi gà càng cao thì tốc độ sinh trưởng của gà sẽ chậm lại Trong khi đó tập tính sinh sản sẽ hoàn thiện dần

Bảng 3.17 Tỷ lệ nuôi sống tích lũy của gà Lương Phượng trong 8 tuần thử nghiệm (%)

Trong cùng một hàng và khác lô, các giá trị tỷ lệ sổng tích lũy trung bình cỏ chữ sổ khác nhau

có sự khác nhau vế mặt thống kê (P<0,05; Phương sai (f)= 23,58) Ket quả thong kê thuộc phụ lue 6

Thật vậy, kết quả khảo sát tỷ lệ nuôi sống tích lũy trình bày ở bảng 3.17 đã chứng minh được điều đó Gà ở các lô có bổ sung chế phẩm Eplus với tỷ lệ 10; 15 và 20 % thì có sức kháng bệnh cao, tỷ lệ hao hụt thấp hơn và con giống sinh trưởng tốt, đồng đều hơn lô I lô đối chứng Như vậy, chế phẩm enzyme amylase và cellulase giảm được tổn thất trong chăn nuôi Kết quả khảo sát khả năng tăng trưởng của gà Lương Phượng đã khẳng định ảnh hưởng tích cực của chế phẩm Eplus

Sau khi khảo sát các chỉ tiêu tăng trưởng, tiến hành giải phẫu bốn con gà (2 trống, 2 mái)

ở lô I - V để khảo sát sức sản xuất thịt của gà được nuôi Kết quả cân trọng lượng sống bốn con

gà và tính trọng lượng trung bình hai trống ở lô I - V lần lượt: 2100; 2190; 2175; 2145 và 2090,5

Và trọng lượng sống trung bình hai con mái (g) của lô I - V lần lượt:1700; 1700; 1700; 1727,5

và 1683,5 Tiến hành cắt tiết, nhổ lông, cắt đầu ở vị trí xương atlat, cắt hai chân và mổ lấy nội tạng Phân chia nội tạng ăn được và không ăn được và tiến hành khảo sát các chỉ tiêu về năng suất thịt Tất cả các bộ phận giải phẫu được cân và tính toán tỷ lệ Kết quả trình bày bảng 3.18; 3.19 và 3.20

Bảng 3.18 Khảo sát quây thịt con gà trông

Móc hàm 81,324a 81,550a 80,450ab 79,450b 79,060a 6,51 Quầy thịt 69,400a 70,300a 68,250ab 67,550b 67,300b 76,63 Ống tiêu hóa 6,652c 6,725* 6,850* 7,121b 7,800a 92,2

ức 20,3 85ab 21,1652a 20,440ab 20,200b 20,450ab 6,67 Đùi 22,670ab 23,745a 22,62ab 22,665ab 22,365ab 27,53

Trong cùng

1

một hàng và khác lô, các tỷ lệ có các chữ sô theo sau khác nhau cỏ sự khác biệt

về mặt thống kê (P < 0,05)

Bảng 3.19 Khảo sát quầy thịt con gà mái

Bảng 3.20 Năng suất thịt gà trống và mái

37

Hình 3.5 Một số hình ảnh giải phẫu gà Lương Phượng 10 tuần tuổi 1: quầy thịt; 2: nội tạng(G: gan;

T: tim: L: ỉảch); 3: ức gà vàđùl (Đ: đùi; ư: ức: 4: ức gà

Qua kết quả thử nghiệm chế phẩm Eplus với gà Lương Phượng có sự khác biệt giữa lô dừng chế phẩm và lô không dùng chế phẩm Chứng tỏ chế phẩm Eplus có khả năng hỗ trợ tiêu hóa cải thiện năng suất cho chăn nuôi gia cầm Lô dùng chế phẩm có khả năng sinh trưởng và

có sức sản xuất thịt cao hơn

Đó là do beta-mannan có trong thức ăn cản trở sự tiếp cận của các enzyme nội sinh đối với các chất dinh dưỡng nằm trong bào chất của thức ăn, từ đó làm giảm sự tiêu hóa thức ăn Beta-mannan cùng với các chất thuộc nhóm NSP lại có độ nhớt cao (vì hút nước mạnh), khi bám vào lông nhung thì cũng cản trở sự hấp thu các chất dinh dưỡng qua niêm mạc ruột Enzyme amylase và cellulase trong chế phẩm Eplus có tác dụng phá vỡ chất xơ thuộc nhóm NSP của vách tế bào thực vật trong thức ăn, giúp các enzyme nội sinh có cơ hội tiếp xúc và phân giải các chất dinh dưỡng như tinh bột, protein, chất béo trong bào chất, giảm độ nhớt của dịch ruột, tăng khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng, tăng tỷ lệ tiêu hóa, tăng giá trị năng lượng thức ăn Nên lượng thức ăn tiêu thụ, tiêu tốn thức ăn cho 1 kg tăng trọng, lượng thức ăn tích lũy các lô dùng chế phẩm ít hơn lô đối chứng Điều đó rất quan trọng, sử dụng chế phẩm Eplus giảm được chi phí chăn nuôi và tránh lãng phí thức ăn

Theo Vũ Duy Giảng (2009), enzyme thuộc nhóm thủy phân có tác dụng phá vỡ mannan tạo ra các phân đoạn mannose oligosaccharide (MOS) MOS có tác dụng như một prebiotic, nó tranh giành vị trí bám dính của vi khuẩn bệnh trên vách ruột và loại bỏ những vi khuẩn bệnh ra khỏi ruột, nó cũng kích hoạt hệ miễn dịch của ruột, làm cho ruột khỏe Tỷ lệ nuôi sống tích lũy

lô I; H; ni; IV cao hơn lô V( đc), chứng tỏ enzyme trong chế phẩm có khả năng hoạt động

và và phân cắt tốt các mannan có trong thức ăn hỗn hợp

Dưới tác dụng của enzyme thủy phân trong chế phẩm, sức sản suất thịt lô n và m cao nhờ cơ thể đã tận dụng tốt năng lượng cung cấp Ngoài ra khi quan sát bề mặt phân lô I; H; III;

rv khô hơn lô V(đc) Đó là do nhóm NSP lại được chia thành hai nhóm là NSP hòa tan và NSP không hòa tan NSP tan có khả năng giữ nước cao gấp đôi nhóm NSP không tan (1 g NSP tan giữ 13,5 g trong khi NSP không tan chỉ giữ được 6,15 g nước) Các enzyme do động vật tiết ra

từ bộ máy tiêu hóa (enzyme nội sinh) không có khả năng phân giải được các chất thuộc nhóm NSP (Dương Thanh Liêm, 2008) Khi có mặt enzyme thủy phân, NSP bị phân cắt giải phóng nước, phần lớn nước được cơ thể hấp thụ nên thải ra ngoài rất ít

Tuy nhiên nếu đưa enzyme từ ngoài vào cơ thể gia cầm sẽ tạo nên hiệu ứng phản hồi âm,

ức chế cơ thể tạo ra những enzyme tương tự nên lâu dài sẽ làm cho vật nuôi lệ thuộc vào nguồn enzyme cung cấp từ ngoài, thoái hóa hệ thống tiêu hóa của vật nuôi, chăn nuôi không có hiệu quả kinh tế do phải gánh thêm chi phí enzyme bổ sung Do đó tùy theo mô hình thức ăn, mục đích nuôi (gà giống hay gà thương phẩm) mà chọn và sử dụng liều lượng enzyme cho phù hợp với nhu cầu của gia cầm Sử dụng enzyme tiêu hóa bổ sung vào thức ăn cho gia cầm khi cơ thể gia cầm phân tiết enzyme tiêu hóa kém; những giai đoạn vật nuôi không tiết đủ enzyme tiêu hóa thức ăn; thay đổi đột ngột thức ăn làm cơ thể không có khả năng tổng hợp và phân tiết kịp; do thức ăn có những cơ chất mà cơ thể vật nuôi không có enzyme tiêu hóa; giai đoạn vỗ béo, lượng thức ăn tiêu thụ nhiều, thức ăn tiêu hóa không kịp đã bị thảy ra ngoài Ngoài khả năng hỗ trợ tiêu hóa, enzyme làm giảm mùi hôi, phân giảm ẩm ướt, chuồng nuôi khô ráo hơn, góp phần bảo

vệ môi trường tốt hơn (Dương Thanh Liêm, 2008)

Chương 4

KÉT LUÂN VÀ ĐÈ NGHI

• •

4.1 Kết luận

Trong số các chủng Trichoderma đã khảo sát trên môi trường cảm ứng, T.92 (Trichoderma

virens) và T.133 (Trichoderma asperellum) có hoạt độ enzyme amylase, cellulase cao nhất

Trên môi trường nhân giống cấp một và cấp hai, hai chửng T.92 và T.133 đều được nuôi

cấy lần lượt 60 giờ; 3 ml giống và 48 giờ; 3 % giống thì thu hoạt tính amylase và cellulase cao

nhất

Trên môi trường sản xuất, chủng T.92 và T.133 có điều kiện nuôi cấy tối ưu sinh enzyme

amylase, cellulase là 36 giờ, tỷ lệ bã khoai mì 80 %; chửng T.133 nuôi cấy tỷ lệ giống 4 % và 2

% là tỷ lệ giống nuôi cấy chủng T.92 Sản phẩm sau nuôi cấy được trộn tỷ lệ 1 : 1, sấy thông gió

ở 50°c có độ ẩm 13 %, có hàm lượng đường khử 12,79 (mg/ml), hoạt độ enzyme amylase 107,8

UI/g, cellulase 349,37 Ul/g; đạm formol 12,22 (g/1)

Chế phẩm Eplus sản xuất theo qui trình thử nghiệm được bổ sung 10 - 15 % vào trong

thức ăn hỗn hợp và nuôi trên gà Lương Phượng Ket quả trọng lượng trung bình gà trống và mái

10 tuần tuổi đạt trọng lượng 1,92 - 2,2 kg và 1,61 - 1,7 kg; tiêu tốn 2,2 - 2,5 kg thức ăn cho 1 kg tăng trọng; năng suất thịt đạt 76 - 79 % Ngoài ra, chế phẩm enzyme Eplus làm giảm nước trong phân Chế phẩm enzyme Eplus hỗ trợ gà tăng trưởng tốt hơn, sức đề kháng cao hơn, tăng sức sản xuất thịt của gà Lương Phượng; phân gà ít mùi hôi, giúp bảo vệ môi trường

4.2 Đề nghị

Nghiên cứu hoạt tính các hệ enzyme, protease, glucanase, pectinase, phytase được thu

nhận nuôi nấm Trỉchoderma trên môi trường sản xuất với thành phần chính là bã khoai mì Tiếp

tục khảo sát và lựa chọn các thông số tối ưu (nhiệt độ, pH, độ ẩm) thu nhận enzyme có hoạt tính cao

Hoàn thiện qui trình sản xuất chế phẩm enzyme Eplus và bổ sung vào thức ăn gia cầm dạng công nghiệp