Nghiên cứu chưng tách và xác định hoạt tính sinh học của tinh dầu

Đe hiểu rõ thêm về các tính năng của tinh dầu nghệ, chủng tôi đi xác định hoạt tính sinh học của nó trên một số chủng vi nấm và vi khuẩn gây bệnh hiện nay nấm men Candỉda albỉcans ATCC 2

TÁC GIẢ: Phạm Thị Quỳnh Dao

TÓM TẮT LUÂN VĂN

Từ xưa, nghệ đã được sử dụng như một cây thuốc trị bệnh Các tính năng này là do các hoạt chất có trong nghệ tạo nên Một trong những hoạt chất đó là tinh dầu Đe hiểu rõ thêm về các tính năng của tinh dầu nghệ, chủng tôi đi xác định hoạt tính sinh học của nó trên một số chủng

vi nấm và vi khuẩn gây bệnh hiện nay (nấm men Candỉda albỉcans ATCC 2310; 4 vi khuẩn Staphylococcus aureus, Streptococcus ýeacalis, Escherìchỉa coli, Pseudomonas aerugỉonsa;

2 vỉ nấm da Mỉcrosporum gypseum, Trỉchophyton mentagrophytes )

Tinh dầu nghệ được thu lấy từ hai qui trình chưng tách : tách từ bột nghệ (qui trìnhl) và oleoresin (qui trình 2) Sau đó, hai tinh dầu này được đem đi xác định thành phàn hóa học và các thông số hóa lý

Kết quả cho thấy, tinh dầu nghệ kháng rất yếu trên vi nấm men (Candida albỉcans ) và hai vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus, Streptococcusỷeacalis ); kháng mạnh trên hai vi

nấm da Nồng độ MIC của hai tinh dầu trên hai vi nấm da lần lượt là: qui

trinh 1 (^1IC Ịmcỉl] agro p h ỵ s ^11^ M gỵ p se um 1.25pl/ml); qui trinh 2 (^4ICy mentagrophys

iM^K^M.gypseum — 0.30 Ịll/ml)

Bên cạnh đó, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện ảnh hưởng tới 2 qui trình chưng tách: thời gian thu hái nguyên liệu, áp suất hơi, thời gian ngâm bột trước khi chưng, nồng độ cồn EtOH Kết quả thu được là: bột nghệ nên được thu hoạch vào cuối mùa sẽ cho hàm lượng tinh dầu cao nhất Bột nên được ngâm trước 3h và chưng ở 4 atm sẽ cho thời gian chưng tách ngắn

và hàm lượng tinh dầu cao Nồng độ cồn EtOH tốt nhất cho qui trình 2 là 98%

The components of turmeric (Curcuma longa L.) is so useful for health One of them is turmeric oil, this component have been used like a traditioinal medicine.We studied the

antifungi and antibacteria of turmeric oil and the others in one yeast ( C albicans ), two

dermatophytes, and four bacteria The result showed that all 2 isolates of dermatophytes could

be inhibited by turmeric oil at serm 1.25 pi - 0.3 pi The others component can’t inhibit these fungi and bacteria

Besides, we studied the elements effect to process that produce turmeric oil Turmeric oil was produced from two processes Steam distillation from turmeric powder and steam distillation from oleoresin.Those element were: time of harvesting, pressure of distillation vessel, time of soaking turmeric powder and concentration of EtOH in extracting oleoresin.lbe result was: turmeric should be harvested at the last of crop; turmeric should be soaked before 3h and pressure that produced turmeric best was 4atm Concentration of EtOH was 98% to extract oleoresin best

MỤC LỤC

MUCLUC i

DANH MUCHÌNHVẼ iii

DANH MUC BẢNG BIỂU iv

DANH MUC CÁC TỪ VIẾT TÂT V PHẢN I: TỒNG QUAN 1

I1 Giới thiêu chung về nghê và các vi nấra vi khuẩn khảo sát: 1

1.1.1

Nghê Curcuma longa L : 1

1.1.2

Mỏt số hoat tính sinh hoc của các hoat chất: 1

1.1.3 Vi nấm, vỉ khuẩn khảo sát: 2

I.2.Các công trình trong và ngoài nước về hoat tinh sinh hoc của nghê Cưrcuma longaL.: 3

PHẢN n : GIẢI OUYÉT VẮN ĐẺ 5

lĩ 1 Nghiên cứu quá trình chưng tách và xác đinh hoat tính sinh hoc của tinh dầu nghê Curcuma ton ga L 5

n.1.1 Mục đích : 5

n.1.2 Các bước tiến hành : 5

n.2.Phương pháp nghiên cửu : 5

n.2.1 Qui ừình thu lấv tinh dầu và các hoat chất khác : 5

H2.2.Phưcmg pháp xác đinh hoạt tính sinh học : 8

n.3.Két quả và bàn luân : 11

n.3.1.Kháo sát chọn nguyên liệu: 11

n.3.2.Kết quả khảo sát các thông số ảnh hưởng lên quá trình tách tinh dầu nghê: 13

n.3.2.1.2 Két quả kháo sát sự ảnh hưởng của thài gian ngậm bột trước chưng: 15

n.3.4 Kẻt quả khảo sát hoat tính sinh hoc: 21

n.3.4.1 Kết quả khảo sát đinh tính 22

PHẢN ni: KẾT LUÂN VẢ ĐẼ NGHI 28

m.l.Két luân : 28

m.2.Đẻ nghi: 28

PHẢN IV: TẢI LIÊU THAM KHẢO 30 PHULUC

DANH MUC HINH VE

Hình 2.1 : Mô hình kết quả thử nghiệm tính kháng nấm và kháng khuẩn

Hình 2.2: Đồ thị biểu diễn thời gian chưng cất

Hình2.3: Đồ thị biểu diễn thời gian chưng cất tinh dầu và hàm lượng tinh dầu theo thời gian ngâm

Hình 2.4.Đồ thị biểu diễn hàm lượng các hoạt chất thu được theo nồng độ EtOH Hình 2.5

Đồ thị kết quả khảo sát định lượng trên hai vi nấm da

Bảng 2.6: Kết quả hàm lượng các hoạt chất từ nghệ

Bảng 2.7: Kết quả hàm lượng các hoạt chất thu được từ hai qui trình 1 và 2

Bảng 2.8: Kết quả khảo sát sơ bộ hai mẫu tinh dầu

Bảng 2.9: Két quả thảnh phần hóa họccủa tinh dầu nghệ

Bảng 2.10: Kết quả khảo sát định tính trên vi nấmc albỉcans

Bảng 2.11: Kết quả khảo sát định tính trên vi nấmM.gypseum

Bảng 2.12: Kết quả khảo sát định tính trên vi nấmT.mentagrophỵtes

Bảng 2.13: Kết quả khảo sát định tính trên vi khuẩn S.aureus

Bảng 2.14: Kết quả khảo sát định tính trên vi khuẩn S.ýeacalis

Bảng 2.15: Kết quả khảo sát định tính trên vi khuẩn E.coli

Bảng 2.16: Kết quả khảo sát định tính trên vi khuẩn p.aerugỉonsa

Bảng 2.17: Kết quả khảosát địnhlượng trên hai vi nấm da của BN1

Bảng 2.18: Kết quả khảosát địnhlượng trên hai vi nấm da của BN2

Bảng 2.19: Kết quả khảosát địnhlượng trên hai vi nấm da của nghệtươi

Bảng 2.20: Kết quả khảosát địnhlượng trên hai vi nấm da của ketoconazol

DANH MUC CÁC TỪ VIẾT TẮT

c albicans : Candida albicans

M.gypseum : Mỉcrosporum gypseum

T.mentagrophytes : Trichophyton mentagrophytes

s.aureus : Staphylococcus aureus

S.feacalis : Streptococcusfeacalis

p.aerugionsa : Pseudomonas aerugionsa

OLEORESIN

Oleoresine bao gồm các chất tạo màu và hương thơm , không chứa thành phần cellulose như ở thân rễ Oleoreisine chứa curcumin (30%-40%), lượng dầu dễ bay hơi (15%-20%)và lượng dầu cố định (20%-30%)

CURCUMIN

Các chất màu vàng gọi chung là curcumin ■ Năm 1953-Srinivasan K.R

(J.Pharm.Pharmacol.l953,5,448-457) đã chứng minh bằng sắc kí trên cột silic rằng đó là 1 hỗn hợp :

-Curcumin chính thức ( còn gọi là curcumin I) chiếm 60% đây là một dixeton

-Curcumin n (Demethoxy curcumin) -Curcumin m (Bis-demethoxy curcumin) chiếm 14% Nếu dùng sắc kí giáy sẽ thấy các chất curcumin khác nữa nhưng với lượng nhỏ

CÁC CHẤT KHÁC

Ngoài ra còn tinh bột, canxi oxalat, chất béo Theo RR.Paris và H.Moyse (1967,11,78) củ nghệ chứa 8-10% H20 ,6-8% chất vô cơ,40-50% tinh bột

I.1.2 Một số hoạt tính sinh học của các hoạt chất :

Dịch chiết ether petroleum Chống lại sự viêm nhiễm

Bisdemethoxylcurcumin Chống lại sự oxi hóa

Dâu dễ bay hơi Chống lại vi khuân, chống lại vi nấm , động

vật đơn bào Chống lại sự viêm nhiễm,tiêu diệt

đông tụ Chống lại sự hình thành ung thư,chống virut, chống lại sự oxi hóa

1.1.3.Vi nấm, vi khuẩn khảo sát: [3]

CÁC LỌAI VI NẢM,VI KHUÂN KHẢO

nấm

Microsporum gypseum

Thường sồng trong đât,và lây bệnh sang

người.Các bệnh thường do M.gypseum gây ra

:nấm đầu mảng xám ,bệnh ở da nhẵn

Nấm da

Trichophyton mentagrop hytes

Thường sống trong da,tóc ,móng của người

Các bệnh thường do T.mentagrophytes gây ra

:Nấm đầu mưng mủ,nấm móng ,nấm bẹn,nấm

má ,chân

vận động viên

Vi

khuẩn

Gram dưong

Staphylococcus

albus

S.aureus là những cầu khuẩn gram dương,thuộc loài hiếu-yếm khí tùy ý S.aureus thường ký sinh ở mũi,họng khoảng 40-50% người có mang.Một số bệnh gây ra: nhiễm khuẩn ngòai da,nhi em khuẩn huyết,viêm da,viêm tai,

Streptococcus feacalis eacalỉs thuộc nhóm Streptococcỉ(liên cầu

khuẩn ) là những cầu khuẩn xếp thành chuỗi,uốn khúc dài ngắn khác nhau

Streptococcus là những vi khuẩn hiếu khí hay

kỵ khí tùy nhiệm,ngoài ra còn có một số kỵ khí

tuyệt đối.5 feacalis thuộc loại vi khuẩn thường

trú của ruột nhưng có thể là gây nhiễm khuẩn đường tiểu,tim mạch hoặc viêm màng não

Gram âm

Escherichia coli

E.coli thuộc nhóm vi khuấn đường ruột Enterobacteraceae,chúng có nhiều trong tự

nhiên,trong đường ruột của người và gia

súc E.coli có dạng trực hay cầu trực gram

âm.E.coli gây dung huyết lên men đường,gluc

0 s e ,lac to s e ,galac to s e ,lên men không đều sacharose,không lên men dextrin,glycogen

Pseudomonas aerugionsa

p.aerugionsa aerugionsa thuộc giống

Pseudomonas là những trực khuẩn gram

âm,hiếu khí tuyệt đối,có thể tiết ra sắc tố

p.aerugỉonsas là vi khuẩn gây bệnh cho

người.Vi khuẩn này thường sống trong thiên nhiên ở khắp thế giới,kể cả trong bệnh viện.Môi trường ẩm ướt là quan trọng nhất đối với vi khuẩn này Các loại bệnh có thể gây ra là :nhiễm khuẩn ngòai da,viêm tai ngoài,viêm xoang,viêm mắt,viêm đường ruột,viêm màng não,viêm nội tâm mạc,viêm phổi,viêm đường tiểu,nhiễm khuẩn huyết

1.2.Các công trình trong và ngoài nước về hoạt tinh sinh học của nghệ Curcuma

longa L.:

4

Neettiyath Kalathil và cộng sự đã nghiên cứu về các thành phần trong thẩn rễ,lá và hoa của nghệ Curcuma longa L với nguồn nghệ từ Ấn Độ và các thành phần đuợc so sánh với nghệ từ Nigieria, Bhutan, Việt Nam.[11] P.S.Negi và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu nghệ vàng trên một số chủng vi nấm và vi khuẩn.[10] G.K Jayaprakasha, L Jagan Mohan Rao* and K.K Sakariah đã nghiên cứu về thành phàn hóa học

và hoạt tính sinh học của nghệ vàng Curcuma longa L với nguồn nghệ từ Ấn Độ.[9]

Nhóm nghiên cứu của tác giả Phan Tống Sơn và cộng sự đã khảo sát thành phần tinh dầu nghệ bằng phuơng pháp chung cất lôi cuốn hơi nuớc thân rễ nghệ tuơi trồng ở Hải Hung [12] Nhóm tác giả Nguyễn Đinh Nga và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính sinh học của một

số tinh dầu thiên nhiên trong đó có củ nghệ vàng trên một số chủng vi nấm và vi khuẩn gây bệnh hiện nay[8]

Các nghiên cứu đuợc công bố truớc đây chỉ tập trung nghiên cứu riêng lẻ hoặc là chỉ tách curcumin, hoặc là chỉ tách tinh dầu từ củ nghệ vàng, chứ chua két hợp việc tách tinh dầu

và tách curcumin trong cùng một quy trình Ngoài ra, các quá trình tách curcumin và tinh dầu đuợc công bố truớc đây thuờng kèm theo giai đoạn loại béo bằng các dung môi hữu cơ, làm tăng sự phức tạp và tốn kém cho quá trình tách và tinh chế curcumin.Bên cạnh đó, các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của tinh dầu nghệ cũng nhu các hoạt chất khác trong nghệ đuợc thực hiện tại nhiều nơi trên thế giới nhung tại Việt Nam thì rất ít.Trong khi đó, các bệnh vi nhiễm

do vi nấm và vi khuẩn hiện nay đang ngày càng tăng nhanh và việc dùng các duợc phẩm thì tốn kém hơn nhiều so với việc dùng các hoạt chất sẵn có trong thiên nhiên.Từ đây, đua ra một huớng mới trong việc nghiên cứu tính chất và áp dụng các hoạt chất thiên nhiên vào chữa bệnh

PHẦN II: GIẢI QUYẾT VẤN ĐỀ

11.1 Nghỉên cứu quá trình chưng tách và xác định hoạt tính sinh học của tỉnh dầu nghệ Curcuma longa L

11.1.1 Mục đích :

Khảo sát quá trình chưng tách tinh dầu,tiến hành thu lấy các hoạt chất từ nghệ và xác định hoạt tính sinh học của chúng lên một số chủng vi nấm, vi khuẩn gây bệnh phổ biến hiện nay

11.1.2 Các bước tiến hành :

Từ mục tiêu đã đưa ra,đề tài được triển khai thành hai nội dung lớn :

*Khảo sát quá trình chưng tách tinh dầu và thu lẩy các hoạt chất :

Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian và địa điểm thu hoạch lên hàmlượng tinh dầu Khảo sát sự ảnh hưởng của áp hơi trong quá trình chưng tách

Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ngâm bột trước chưng

Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ EtOH trong hệ dung môi ethanol - nước (%) lên hàm lượng tinh dầu thông qua quá trình chiết tách bột nghệ

Khảo sát hàm lượng,thành phần,và tính chất hóa lý của tinh dầu

Bên cạnh đó,tiến hành thu lấy các hoạt chất có trong nghệ:

Tinh dầu: chưng cất lôi cuốn hơi nước Oleoresin: chiết bằng dung môi EtOH(ethanol) Curcuminoid và nhựa: kết tinh

*Khảo sát hoạt tinh sinh học của chúng trên một số chủng vỉ nấm và vi khuẩn:

Khảo sát tính kháng nấm trên các vi nấm sau:

Candida albicans ATCC 10231, Mỉcrosporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên các vi khuẩn sau:

Staphylococcus aureus, Streptococcus feacalis, Escherichia coli, Pseudomonas aerugionsa

11.2 Phương pháp nghiên cứu :

n.2.1.Quỉ trình thu lấy tỉnh dầu và các hoạt chất khác :

*Qui trình 1:

Curcuminoid*(CRUl)

01eoresỉn,nhựa,curcumỉn : liều lượng 10 ịil/đĩa

Tinh dầu Tiều lượng 2.5 |il/đĩa,5 Ịil/đĩa, 10 Ịil/đĩa

Nấm men,vỉ khuẩn : đo vòng kháng nấm và kháng khuẩn

Hình 2.1: Mô hình kết quả thử nghiệm tỉnh khảng nấm và khảng khuẩn

Đánh giá mức độ tác động của đường kính vòng tác dụng theo Manuanza và cộng sự :

dc : đường kính khóm nấm ở môi trường chứng (không chứa chất thử ) dt

đường kính khóm nấm ở môi trường có chứa chất thử

*Định lượng:

Điều kiện khảo sát:

Phương pháp pha loãng

Dung môi DMSO

Môi trường SDB lỏng (0.2 % Agar)

Nước muối sinh lý NaCl 0.85% có chứa 0.05% Tween 80

Môi trường SDB, nước muối sinh lý, dịch treo được nấu cách thủy ,sau đó cho vào các ống nghiệm (dịch treo) và erlen 100 ml (môi trường) Đem hấp tiệt trùng

10

* Chuẩn bị dịch nấm:

NĩiCI 0,85% cé ch.u;i

0 05% Tween 8Í.Í

11

*Các bước tiến hành:

c 5 M»piri'o 4 - Hiopn

Fli :I luãiiJỉ li ÍHI K S-lỉĩí

I' ■ ki llllẼệl 4 l«l |l llflliụ

I)ụj krl q|HM

II.3 Kết quả và bàn luận :

II.3.1 Khảo sát chọn nguyên liệu:

dầu:

*Điều kiện khảo sát:

Chưng lôi cuốn hơi nước có hồi lưu

Bột nghệ Bình Dương thu hoạch ở các thời điểm khác nhau

Thời gian chưng tách (phút) : thời gian lấy hết tỉnh dầu

Kết quả khảo sát được cho dưới bảng sau

Khối lượng bột (g) V tinh dầu(ml) V tinh dần /lOOGnlk

BN1 : bột nghệ được thu hoạch vào tháng 6

BN2 : bột nghệ được thu hoạch vào cuối năm

Độ ẩm của nghệ tươi rất lớn làm cho việc chuyên chở cũng như bảo quản nghệ tươi khó khăn hơn nhiều so với bột nghệ Đồng thời, để sản xuất một lượng lớn hoạt chất trong công nghiệp Nếu dùng nghệ tươi, ta phải dùng một lượng lớn hơn rất nhiều so với bột nghệ từ đó dẫn đến thiết bị cồng kềnh và tăng chi phí sản xuất Vì vậy, bột nghệ vẫn được sử dụng nhiều nhất trong công nghiệp hiện nay Ta nhận thấy, hàm lượng tinh dầu BN2 (5.1ml/100 g NLK) cao hơn rất nhiều so với BNl(2.95ml/100 gNLK) Điều này chứng tỏ, thời gian thu hoạch có ảnh hưởng tới hàm lượng tinh dầu Tinh dầu thân rễ nghệ được tạo ra trong các mô Te bào tiết

ra tinh dầu rồi giữ luôn trong lòng tế bào (mô tiết) [6 ] Các tế bào tinh dầu này được hình thành trong suốt quá trình phát triển của củ nghệ, và quá trình này chấm dứt khi thân rễ nghệ phát triển hoàn toàn Giai đoạn phát triển của nghệ được chia làm ba giai đoạn chính, giai đoạn cuối cùng là giai đoạn phát triển của thân rễ nghệ - đây cũng là giai đoạn lâu nhất [5] Hai giai đoạn trước chiếm khoảng 16-18 tuần Đây là một giai đoạn khá lâu nên nếu nhu ta thu hoạch nghệ quá sớm thì thân rễ nghệ chưa phát triển đầy đủ làm cho hàm lượng các hoạt chất không được tối đa Nên thu hoạch củ nghệ vào cuối mùa, lúc này hàm lượng tinh dầu là cao hơn cả

*Kết luận : chọn bột nghệ khô BN2 cho các quá trình khảo sát tiếp theo

n.3.1.3.Hàm lượng curcumỉnoỉd tổng :

Bảng 2.2.Ket quả hàm lượng Curcuminoid trong bột nghệ theo phương pháp

n.3.2.Kết quả khảo sát các thông số ảnh hưởng lên quá trình tách tinh dầu nghệ:

n.3.2.1.Chưng tách tinh dầu nghệ từ bột nghệ:

II.3.2.1.1 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của áp hoi trong quá trình chưng tách:

*Điều kiện khảo sát:

Phương pháp :Chưng lôi cuốn hơi nước có hồi lưu